Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng đồng hoá xyloza dùng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
TÊN ĐỀ TÀI:
PHẢN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ
KHẢ NĂNG ĐỒNG HÓA XYLOZA DÙNG TRONG SẢN XUAT
THỨC ĂN CHĂN NUÔI
MẢ SỐ: QT 00.16
CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI: TS. Kiểu Hữu Ả n h
HÀ NỘI, THÁNG 2 NẢM 2001
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
TÊN ĐỂ TÀI:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ
KHẢ NĂNG ĐỒNG HÓA XYLOZA DÙNG TRONG SẢN XUẤT
THỨC ĂN CHĂN NUÔI
MÀ SỐ: QT 00.16
CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI: TS. Kiều Hữu Ả n h
CÁC CÁN Bộ THAM GIA:
1. PGS. TS. Phạm Văn T ỵ
2. Th.s. B ùi T hị V iệt Hà
3. Đ ỗ M ừ ìh P hương
HÀ NỘI, THÁNG 2 NÁM 2001
I. BÁO CÁO TÓM TẮT
1. TÓM TẮT KẼT QUẢ ĐỂ TÀI ĐẠT Đ ược
Xylan là ihành pliắn chủ yếu của hemixenluloza ở thực vật. Sau xenluloza, xylan là loại
|H>lií>accai il (ni sinh phong phú nhất trong thiên nhiên. Trong thành tế bào thực vật, xylan có
ihê ợhiêiyi 30% họng liíợng khô. Dãy ià sán phẩm quang hợp mà hàng Iiăm cây xanh c!ẽ lại
chu Irái dãi, là dỏng biĩ Iluii khổng lổ nếu nhu con người không biết sử dụng, nhưng SC là
nguồn cac bon và ngụổn năng lượng vô tận nếu như con người biết cách khai thác, mà chú
>1 u nhò vào,nhóm vi sí,nh VỘI có khá Iiăiig phftn giải.
TVuỉig vài chục Iiãin gẩti ctíìy, ngượi ta đã chú ý đến các enzyni phíln giái xyiau cún vi

sill h V Ạ í: Những eiizym này được chú ý vì một mặt chứiigphân gải xylan cung cấỊi Iigiiỏn
Cíịcbon dế liêu và năng lượng cho chính các vi sinh vật sản sinh ra cluing, và qua đổ cung
câị) Iiguổn cacbon và năng lượng cho các si|ih vật khác, một mặt chúng tham gia vào quá
trình lõng lurởng, Iiuơng thành và chín của ngũ cốc và các loại quá. Ngoài ra, xylanaza CĨÌII“
gịúp cho các vi sinh vật XAm Iihập vào bên trong cây và quả. Mặt khác, các hệ Ihống en/ym
phân húy xylan có tiệm năng đáng kể trong cấc ứng dụng công nghệ sinh học.
Từ 30 chủng nấm sợi có hoạt tính xylanaza đựơc phân lập từ các vùng phụ cận ớ Hà
,N'>ịi. chúng tôi đã chọn ra được l chủng có hoạt tính CMC-aza và xylanaza mạnh nhất có ký
liiớu là Ap-146. KIiuAii lạc chủng Ap-146 phái Iriển nhanh trên môi inrờng Czapek ở Iihiệi (In
24-2ố“C. Kích ihiíớc kh11ÁII lạc d = 4-5cm. Trong 2 tuẩii nuôi cây, bề mặt khuấii lạc I0IIJ’ lựo
hơị hỏng và gỏ ghé, mép khuẩn lạc móng, trải rộng có màu từ trắng đến xám nhạt. () vùng có
các đầu bào tử phái triển mạnh sinh ríi từ sợi khí sinh thì mỏng mánh, từ sợi cư chất thì có
màu lục vàng sÃm. Bọng hình chai, có kích thước 5,5 - 7,7 f.im, hiếm khi có kích thước ỉ ÓI I
hon. Cuống bào lử có íì trên bọng. Thường lừ 5-6 cái, hiếm khi có từ 8-10 cái với kích ihưóc
5,5- 8,5j.i 111 X 2,8-3,3ị.ún, Ihế bình 5,5-6,5 X 2,0-2,5j.im. Conidi có dạng hình cáu có gai .với
kích lliước 2,8 - 3,5 [1111.
Dựa vào khoá phân loại K.B.Raper, D.I. Fenell " The genus Aspergillus", chủng này
Ũuik; xac.dịnh \ìì Aspergillus /Hjrvatlu'ciii.s.
Chủng Ap-146 sinh Irướng và lổng hợp enzym CMC-aza và xylanaza tối liên 11)01
nường CVapck có bố sung 5g CMC và 5g xylan với nhiệt đô nuôi 30°c, pH6, thời gian Iitli
luỹ cii/yni cao nliấl là 3 ngày.
Đã xây dựng được qui irình đơn eiản để sản xuất chế phẩm dùng trong chần
nuôi gia súc.
Đã thử nghiệm bước dầu trong chăn nuôi Gà và cho kết quả khả quan.
2. TÌNH HÌNH sử DỤNG KINH PHÍ:
Tổng kinh phí được cấp: 8.000.000đ
Tổng kinh phí đã chi: 8.000.000đ
Gồm các khoản mục:
- Thuê chuyên gia: 2.450.000đ
- Mua vật tư: 5.230.000đ

- Quản ly phí: 320.000đ
Tổng cộng: 8.000.000đ
Chủ nhiệm đề tài
TS. Kiều Hữu Ảnh
Cơ QUAN QUẢN LÝ ĐỂ TÀI
CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI
TRƯỎNG
Nguyễn Ngọc Long
I
XYLANOLYTIC ACTIVITY OF SOME
FILAMENTOUS FUNGUS STRAINS ISOLATED IN HANOI REGION
Xylan is a major component of plain Jvemicel 1 Lilose. Afler cellulose, il is the most
abundant renewable polysaccharide in nalmo. Xylan and cellulose are ihe predomiiuml
hemicellulosic polysaccharides found in I Ik- cell walls of land plains, in which they may
constitute more than 30% of the dry weighi Aside fiom terrestrial planls, inuiine iilgiic
also synthesize xylans of different chemical Nlriiclure.
Xylanoiylic enzymes of microorganisms have received a great deal of attention
ill the Iasi 10 years. These enzyme systems in c of imeiesi for several reasons. Oil I ho one
hand, Ihey are involved in providing sourccs of carbon and energy for llie organisms that
produce them and for hosts harbouring xylanase-producing organisms and they arc
involved in the growth, maturation, and ripening of cereals and fruits. Moreover,
xylanases appear to be involved in llie invasion of plants and fruits by palliogens. On Ihe
oilier hand, xylan-degrading enzyme sysk Ills have considerable potential in several
biotechnological applications.
In this study 30 filamentous fungus strains capable of degrading xylan and/or
cellulose were isolated from soil in I he suburbs of Hanoi some of which showed high
activity in attacking die both substrates. Among 1 he most actively enzyme-producing
strains, Ap-146 was selecled for further lesls. Morphological and CLillLiral chaiuclei istics
of this strain were identified and according 10 Rapei and Fennel (1965) il was classified
as Aspergillus parvuthecius.

The optimal conditions for growth iincl activity of Aspergillus jhu vathci ins
Ap-146 CMC-ase and xylanases during growth on Czapek medium added by 5 g CMC
and 5 g xylan were 30°c and pH6. The highest activities toward CMC and xylan reached
after tluee days of fermentation.
ll is noteworthy that corncob as a ỈI II Lital SLihslj ale exerted a slimulalory ei'fecl
on enzyme production by Aspergillus Ap-1-lỏ.
CHÚ NHIỆM ĐỂ TÀI
I. MỤC LỤC
■ ■
1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. 3
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 3
1.2. CẤU TRÚC CỦA XYLAN 5
1.3. CÁC ĐẶC TÍNH CỦA HỆ THÔNG ENZIM PHÂN HUỶ XYLAN 7
1.3.1. Các xylanaza 8
1.3.2. Các p - xylozidaza y
1.3.3. Các a - arabinozidaza 9
1.4. SẢN XUẤT ENZIM PHÂN GIẢI XYLAN 10
2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u 12
3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 13
3.1. NGUYÊN LIỆU 13
3.1.1. Hoá chất í 3
3.1.2. Cơ chất 13
3.2. PHƯƠNG PHÁP 13
3.2.1. Môi trường 13
3.2.2. Điểu c hế hemixenluloza 14
3.2.3. Chiết rút enzim 14
3.2.4. Xác định hoạt tính 15
Phương pháp khuếch tán trên thạch 15
3.2.5. Xác định sinh khôi 15
3.2.6. Xác định khả năng sinh trưởng của chủng Ap-146 trên m ôi trường 15

chứa các cơ chất tự nhiên
3.2.7. Xác định các điểu kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men ở chủng Ap- 15
3.2.7.J. Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đẩu 15
3.2.7.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu 16
32.7.2. Ảnh hưởng cùa nguồn Nitơ
3.2.7.3. Ảnh hưởng của nguồn cac bon tự nhiên
3.2.8. Động thái lên men 16
3.2.9. Thử nghiệm trong chăn nuôi gia cầm. 16
4. KẾT QUẢ NGHIÊN cứ u 17
4.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI 17
4.2. ĐẶC ĐIỂM NUÔI CẤY 17
4.2.1. Chọn m ôi trựòng 17
4.3. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ 1«
NĂNG SINH TỔNG HỢP CMC-AZA VÀ XYLANAZA
4.3.1. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy
4.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
4.4. ẢNH IIƯỞNG CỦA NGUồN CACBON 1 í>
4.5. ẢNH HƯỞNG CỦA NGUổN NITƠ 21
4.6. ẢNH IIƯỞNG CỦA THỜI GIAN NUÔI CẤY 21
4.7. KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CÁC NGUồN CACBON T ự NHIÊN CỦA 23
CIIỦNG AP-146
4.8. THỬNGHIỆM TRÊN GIA CẦM 24
5. KẾT LUẬN 27
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 28
7. BÀI BÁO
III. NỘI DUNG CỦA BÁO CÁO CHÍNH
1.TỔN G QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỂ
Xylan là thành phần chủ yếu của hemixenluloza ở thực vật. Sau xenluloza,
xylan là loại polisaccarit tái sinh phong phú nhất Irong tự nhiên. Trong thành tế

bào thực vật xylan có thể chiếm tới trên 30% trọng lượng khô. Trong rơm rạ, bã
mía, xylan chiếm 30%, trong gỗ của các cày lá kim - 8 -12% và trong gỗ của các
cây lá bán, 20 - 25%. Ngoài các thực vật sông trên cạn trong đó xylan chủ yếu có
câu Irúc dựa Irẽn bộ khung poly p-l,4-D-xyloza, tảo biển cũng tổng hợp xylan có
cấu trúc khác nhau dựa trên bộ khung poly p - i , 3 - D -x y l o z a . ộ m ộ j Sô' loài tảo lục
(|Chiolophyceae) và tảo đỏ (Rhodophyceue) thiếu hẳn xenluloza, xylan tạo nên
các cấu trúc sợi kết tinh cao.
Hàng loại vi sinh vật phân giải xenluloza cũng có khá năng phân giải
xyỉan. Từ khoảng hơn một thập ký nay, người ta đặc biệl quan tâm tới các enzim
phân giải xylan của vi sinh vật. Những enzim này được chú ý vì một số nguyên
nhân. Một mật, chúng tham gia vào việc cung cấp các nguồn cacbon và nãng
lượng cho các vi sinh vật sản sinh ra chúng, và cũng qua đó, cung cấp nguồn
cacbon và năng lượng cho các vật chủ chứa các vi sinh vậi sản sinh xylanaza.
Chúng tham gia vào quá trình tãng trưởng, trưởng thành và chín cua ngũ cốc và
các loại quả. Ngoài ra, xylanaza cũng tham gia vào sự xâm nhập của các vi sinh
vật vào bên trong cây và quả. Mật khác các hệ thống enzim phân hủy xylan có
tiềm năng đáng kể trong các ứng dụng cóng nghệ sinh học.
Trong vài thập kỷ vừa qua, công nghiệp thuý phân nhờ enzim đã được triển
khai ớ nhiều nước với tốc độ nhanh chóng. Cùng với các enzim thuỷ phân quan
trong khác, xylanaza đã được sán xuất với qui mô công nghiệp và ứng dung rộng
rãi vào các mục đích khác nhau.
Hướng sử dụng đó đươc Coughlan và Folan (1979) cu thế hóa như sau:
l. Chế biến thực phẩm :
Cải thiện độ tiêu hóa thức ăn.
Sản xuất các thực vật đơn bào!
Chiết rút các chất gây vị, dầu, dịch ép, protein từ rau và quả.
Thu nhận thạch từ rau câu.
Cải thiện độ hoà tan của các nguyên liệu trong công nghiệp lên men.
2. Chế biến thức ãn gia súc:
Tăng độ tiêu hóa của cỏ, rơm và các nguyên liệu chứa xenluloza khác làm

thức ăn gia súc.
Chế biến gỗ và các sản phẩm phụ cúa gỗ làm thức ăn gia súc.
3. Dược phàm:
Dùng làm chất trợ giúp tiêu hóa
Loại bồ các chất sợi không mong muốn.
4. Chống ồ nhiễm
Phân huỷ rác thải thực vật
5. Lẻn men:
Cung cấp cơ chất cho việc tổng hợp metan, etanol, glycerin, axit lactic
6. Sản xuất phân bón từ p h ế thải nông nghiệp.
Từ những tiềm năng ứng dụng của hệ enzim trên, trong nghiên cứu này
chúng tôi quan tâm tới việc xử ]ý các phụ phẩm nông nghiệp thành thức ăn chãn
nuôi dễ tiêu nhờ khả năng phân giải xenluloza và xylan của các chủng nấm sợi.
Hướng nghiên cứu này đặc biệt có ý nghĩa đối với lợn gà là những động vật dạ
dày hoàn toàn không có nãng lực dồng hóa xylan, xenluloza và một số
polisaccarit bển vững khác nhưng thức án cùa chúng chứ yêu lại là cám và các
phụ phấm nông nghiệp giàu xylan và xenluloza. Hệ enzim xenlulaza-xylanaza có
thế đóng góp trên cả hai phương diện : 1. nâng cao giá trị dinh dưỡng (trước hết là
hàm lượng protein) của thức ăn chăn nuôi, và 2. cái thiện độ tiéu hóa các cơ chất
khó tiêu cho dộng vật.
4
1.2. CẤU TRÚC CỦA XYLAN
Cấu trúc của xylan khá thay đổi, từ các chuỗi l,4-p-polixyloza đến các
heteropolisacarit phân nhánh mạnh. Tiếp đầu ngữ "hetero" nói lên sự có mật của
các đường khác với D-xyloza, chuỗi chính của xylan tương tự với của xenluloza
nhưng thay cho D-glucoza là các D-xyloza. Các nhánh gồm L-arabinofuranoza
liên kết vói vị trí cacbon số 3 của D-xyloza và các nhánh gồm axit D-glucoronic
hoặc axit 4-metil-D-glucuronic liên kết vị trí cacbon số 2. Cả hai nhánh đường
chuỗi bên đều liên kết với chuỗi chính bang liên kết a-glycozit. Mức độ phân
nhánh phụ thuộc vào nguồn Ihực vật. Xy lan cua một sô' loài gỗ đặc biệt là gổ

cứng, được axetil hóa, chẳng hạn xylan cứa gỗ bulô chứa > lmol axit axetic/2mol
D-xyloza. Phản ứng axetil hóa thường diễn ra ở vị trí cacbon số 3 hơn là ở vị trí
C2, song cũng gặp cả hiên tượng axetil hóa kép một gốc D-xyloza (hình 1).
H H H H H
Hình 1 Cấu trúc của xylan gỏ cứng
5
Giữa cấu trúc hóa học của xylan và nguồn gốc cây chủ cũng như vị trí irong
tế bào có mối liên quan với nhau. Do đó các nguyên liệu chứa xylan có thể có các
polyme xylan gần gũi vể cấu trúc nhưng khác nhau lì nhiều vể tính chất. Xylan
của ihục vật trên cạn thường có mặt với lý ỉộ khác nhau trong thành tế bào của tất
cả các mô lmhin hóa song cũng được tìm thấy cả ở những loài thực vật khác như
rêu, dương xỉ. Chúng thường là các thành phần cúa thành thứ cấp ở các mô có
chức năng cấu trúc nhưng phần nào cũng tồn tại trong vách sơ cấp của các tế bào
đang sinh trướng cũng như trong Ihành sơ cấp của hạt và củ ớ một số loài thực vật,
ở đó chúng có chức năng dự trữ. ớ tất cá các vị trí siêu cấu trúc khác nhau trong
ihành tê bào thực vật, xylan tương tác với các thành phần cấu trúc khác đặc biệt là
với các sợi nhỏ xenluloza, với các poỉime phi xenluloza và phổ biến nhất là với
linhin. Tương tác không cộng hóa trị giữa xylan với các polisacarit khác chủ yếu
là nhờ các liên kếr hidro, còn việc nối xylan, linhin và mộl số axit phenolic với
nhau thì do các liên kết cộng hóa trị đảm nhận.
Giống như hầu hếl các polisacaril có nguồn gốc thực vật khác, xylan thể
hiện tính chất đa dạng về độ trùng hợp và vể các phân tử thành viên, điểu này
tương ứng vói sự có mặt của chúng trong nhiều loài thực vật và sự phân bô' cúa
chúng trong các loại mô và tế bào. Tất cả các xylan của thục vật Irên cạn đểu
được đặc trưng bởi chuỗi chính l,4-f3-D-xylopiranozil mang một sô' lượng thay
đối các nhánh thay thế monosacarit trung tính hoặc monosacarit uronic hoặc các
oỉigosacarit chuỗi bên ngắn.
Từ chuỗi đơp giản l,4-P-D-xylopưanozil, tính phức tạp về cấu trúc của
xylan lăng lên theo số lượng của các monosacarit và oligosacarit thay thế gắn vào
chuỗi này.

6
1.3. ĐẶC Tín h c ủ a c á c Hệ THỐNG ENZIM PHÂN HỦY XYLAN
Do cấu trúc phức tạp của xylan, đế phân húy và cải biến nó cần có mộl sô
enzim khác nhau. Hai enzim glycanaza chủ yếu giải trùng hợp bộ khung
hemixenluloza là endo-l,4-p-xylanaza và enđo-l,4-P-mannanaza. Các
oligosaccarit nhỏ sau đó sẽ được thủy phàn tiếp nhờ l,4-P-D-xyloziđaza, 1,4 (3-
D-mannoziđaza và l,4-|3-D-glucoziđaza. Các nhóm bên được phân cắt bới a-L-
arabinozidaza, a-D-glucuroniđaza a-D-galactoziđaza. Các nhóm bên este hóa sẽ
được giải phóng nhờ axetyl xylan esteraza và axetyl galactoglucomannan esteraza
(hình 2)
Ac
Araf
a
1
M r
3 3
-4Xylp I -4Xyipi-4Xyip 1 -4Xyl(i 1 -4XyIp I -4Xyl|31 -4Xyip 1 -4Xyip I -4Xyl|3
ĩ 2
I
1
a
I
Ac
4Xyip 1 -4Xyip Ị -4Xyip 1 ■
2
I
__
1
a
E n d o-1 ,4 -P -x ylan aza (EC 3.2.1 .8)

p -xy lo sida za (EC 3.2 .1 .37 )
A cetyl estera za (EC 3.1.1.6) hoặc acety l x ylan esteraza
a-g lu cu ro n id az a (EC 3 .2.1.5 5)
a-L -ara b in o fu ran o sid a za (E C 3.2 .1.55)
MeGlcA
Hình 2. Vị trí tàn công cứa các enzim phân giãi xylan
1.3.1. Các xylanaza.
Ớ vị khuấn và nấm thường tổn tại 3 - 5 loại xylanaza. Chẳng hạn, Ohkoshi
và ctv (1985) nhận thấy Aeromonas sp. ưa kiềm tổng hợp 3 loại xylanaza;
Streptumyces sp cũng tạo Ihành 3 xylanaza khác nhau (Murao và civ, 1985). Các
xylanaza khác nhau có thê bắt nguồn tù những cái biến sau phiên dịch cúa cùng
một sản phẩm. Việc phán loại xylanaza cũng chưa thống nhất. Nếu dựa vào thứ tự
axit min của vị trí xúc lác có thế chia xylanaza Ihành hai loại: xylanaza có trọng
lượng thấp và xylanaza có trọng lượng cao. Xylanaza cũng có thể được phân loại
dựa vào sự khác nhau giũa các enzim llmý phân xylan và các enzim thuý phân
xylodextrin, giữa các enzim thuý phân theo cơ chế enđo- và exo-, giữa các enzim
tác dụng ưu tiên và không ưu tiên lên các vị trí thay thế trên chuỗi xylan.
Xylanaza của Trichoderma hoại dộng tối thích ớ nhiệt độ 45 - 65°c, pH 3,5 -
6,5, trong đó có 2 xylanaza bển ớ 50°c Irong một giờ và mội loại bển ở 60(,c
trong 20 phút. Trái lại, xylanaza lừ vi khnấn ưa nhiêl Thermostoga sp. có nhiệl tlộ
tối ưu là 105°c ở pH 5,5. Xylanaza chịu kiểm từ Bacilllls. sp có phạm vi pH tối
thích và dộ bển pH khá rộng, tới pH 10.
Xylanaza là các enzim dạng enđo (.liến hình, tác dụng lên chuỗi xylan ihco
kiêu iuỳ tiện, làm giám mức độ irùng hợp cùa cư chất và tách ru các oligome ngán
hơn, xylobioza và một phẩn xyloza. Kiêu tác dụng của xylanaza và các sản phấm
thuý phân thay đổi tuỳ theo nguồn enzim. Hai xylanaza nhỏ tinh chế từ một
ill ương phấm hemixenlulaza thể hiện hoạt tính phán giải xylan không hoà tan
hoàn toàn hơn xylan hoà tan và sán phàm của phán ứng là xylobioza. Hai
xyianaza từ A.niger thuỷ phân xylan hoà tan nhanh hơn xylan phân nhánh không
lioà lan, chúng không có hoạt tính lên xylan không hoà tan Ihiêu phân nhánh, điều

này chứng tỏ các xylan cần các điếm phân nhánh nầm gần chu lác dụng cúa
xylanaza. Các xylanaza khổng cát nhánh bị hạn chế tác dung dối với arabino-4-
melilglucuronoxylan. Tác dụng của xyl.maza cũng bị ánh hướng bới sự có mặi
cua các nhóm bèn axeúl.
Hiện nay việc nghiên cứu hemixcnluluza 1 ất được chứ ý. Các cơ chát tự
nhiên cải biến Ihường thích hợp cho VÍỘL xác đinh hoại lính phán giái xylan, mặc
8
du cac cơ chât tự nhiên cũng rất quan uọng. Việc xác định hoại lính cúa các
enzim cãt nhánh cẫn sự hợp tác của xylanaza. Hơn nữa hoạt tính xylanaza không
chi được đo VỚI một chế phẩm xylan do tính dị nguyên của các xylan tuỳ theo
nguồn gốc và chế phẩm.
1.3.2. Các p-xy!oziđaza
Các exo-l,4-p-D-xyloziđaza là những enzim thủy phân xylooligosaccarit
và xylobioza thành xyloza bang cách tách lần lượt từng gốc D-xyloza khỏi các
đẩu không khử. P-xylozidaza có mặt trong hầu hêt các hê thống enzim phân húy
xylan gặp ở vi sinh vật, song nấm là bọh sán sinh enzim này dưới dạng ngoại bào
mạnh nhất.
Các exo-l,4-(ì-D-xyloziđaza là nhũng enzim khá lớn có trọng lượng phân tử
vượt quá ỈOOkDa và thường bao gồm 2 dưới đơn vị. Hầu hết các p-xyloziđaza đều
chí ra hoạt tính cao nhất đối với xylobiozu, song không có hoạt tính đối với xylan.
Hoại tính đối với xylooligosaccarú giảm nhanh khi độ dài chuỗi lãng dần. Một sô'
[3-xyloziđaza cũng có hoạt tính Ị3-glucoziđaza. Một đậc điếm quan trọng của các
(3-xyloziđaza là chúng rất mẫn cảm với sự kìm hãm bới xyloza, diều này có thế
gây ánh hưởng quan trọng tới sản lượng cnzim trong quá Irình sản xuất.
1.3.3. Các a-arabinoziđaza
Các ot-arabinofuranozidaza là nhữnti enzim thủy phân các nhóm a-L-
a-arabinofuranozil của arabinan, arabinixylan và arabinogalactan. Sự sản
sinh các a-arabinozidaza ở vi sinh vật ihường có quan hệ với sự sản sinh các
enzim phân húy pectin và hemixenlulaza. a-arabinozidaza tinh khiết lừ
Aspergillus niger (Tagava và Kaji, 1969) có khá năng giái phóng L-arubinoza từ

L-arabino-D-xylan của lúa mì. Khi phản ứng diễn ra đã xuâì hiện mội chất kết tua
vó đinh hình gồm chú yếu D-xylan và một lương nhó arabmoza. Adiewartha và
clv (1979) đã tạo nên hàng loạt các arabinoxylun lừ aiabmoxylan bót mì linh
khiết bàng cách loại bỏ một phẩn các nhánh bén arubinozil nhà a-arabinoziduza.
Theo các tác giả này tác dụng hoà tan của các nhánh thay Ihế arabinozil khòng do
sự hidrat hóa (thuỷ hóa) tăng lên mà do khả năng của chúng ngăn cản sự kết vón
gian phân tử của các gốc xyloza không bị thay thế.
1.4. SẢN XUẤT ENZIM PHÂN GIẢI XYLAN.
Giá cả của enzim là một trong các yêu tò quyết định tính kinh tê của một
quá trình xúc tác sinh học và cồ thể giảm đi bằng cách tìm ra các điều kiện tôi
thích cho việc sản xuất enzim, bằng cách phân lập các biến chúng năng suất cao
và (có thế) bằng cách thiết kê nên các chủng sán xuất có hiệu quá nhờ kỹ xáo di
truyền. Muốn vậy cần phải hiểu các'Cơ chế điều chính sinh tống hợp enzim
Nhũng nghiên cứu về điều chính các enzim phân giải xylan chủ yếu tập trung vào
việc gây cảm ứng enzim dưới các điểu kiện khác nhau chứ không phải là việc điều
chỉnh gen. Ngoài ra, chỉ có hai enzim dược tập trung nghiên cứu là xylanaza và
xylozidaza.
Các enzim phân giải xylan có lẽ là nhũng enzim cảm ứng. Xylanaza và
xylozidaza được tạo thành mạnh mẽ khi sinh trưởng trên xylan và tổng hợp enzim
bị kiềm chế dị hóa bởi các nguồn các bon dễ đồng hóa như glucoza hoặc xyloza.
Xylan không thể xâm nhập vào tế bào, do đó tín hiệu dùng kích Ihích tống
hợp các enzim phân giải xylan phải là các chất có trọng lương phân tử thấp, ví dụ
xylobioza và xylotiioza. Các oligosacarii dược tạo thành nhờ sự ihuỷ phân xylan
trong môi Irường bởi mộl lượng nhỏ en/im được long hợp kiến trúc. Sự cám ứng
cũng có thể diển ra nhờ các alkyl và aryl P-D'Xylozit lổng hợp ớ Aspegillus sp.
hay nhờ metil p-D-xylozit ở nấm men. Các hợp chất này giúp cho sự lạo thành
các cnzim phân giải xylan khi vắng mạl xylan và xylooligosacaril. ớ nấm men
Candida íilbidus chí có metil p D-xylo/.il mới cảm ứng tống hợp xylanaza. Các
alkyl và aryl p-D-xylozit khác không có khá năng trẽn Ở nấm men hệ thống phân
giải xylan cũng có thể được cảm ứng bởi các izome của xylobioza.

Xylanaza ỏ nấm sợi có lẽ là enzim cám ứng hoặc dưới sư diều chính cúa
hiên tương giải kiềm chế. Những nghiên cứu vế điều chính ớ nám thường gặp khó
10
khãn do xylanaza và xenlulaza được tạo ihành đồng thời và do tính dặc hiệu chéo
đối với cơ chất của hai enzim trên.
Enzim phân giải xylan và enzirn phán giải xenluloza ớ mội sô nấm sợi có lẽ
chiu sự điêu chinh riêng rẽ. Khi sinh trướng trên xylan một số loài tổng hợp các
xylanaza đặc hiệu chỉ chứa ít hoặc không chứa hoạt tính xenlulaza. Nhưng khi
sinh trưởng trên xenluloza, xenlulaza đưưc tạo thành cùng với xylanaza, có lẽ do
xenluloza còn nhiễm một chút xylan hoặc do sụ giải kiếm chê do xenluloza
nguồn các bon được sử dụng chậm gây nen. Thí nghiệm với các chất cám ứng xác
định trọng lượng thấp ở T. reesei cũng cho kết quả tương tự, chắng hạn sophoroza
cảm ứng cả enđo-1,4 p-glucanaza đặc hiệu và không đặc hiệu, xenlobiohidrolaza
(exo-1,4 glucanaza) và rất ít xylanaza. Xylobioza chỉ cám ứng các xylanaza đặc
hiệu. Vì vậy để thu nhận hệ thống phân giải xylanaza không lẫn xenlulaza chi cẩn
nuôi vi sinh vật trên xylan không lẫn xenJuloza.
Tuy nhiên phương hướng trên không thể áp dụng cho mọi loại nấm. Chẳng
hạn, ở Schizophyllum commune việc sán xuất mạnh xylanaza gắn liền với việc
sản xuất xenlulaza.
Nấm sinh trượng yếu trên xylan khi vắng xenluloza. Khá nàng lạo thành hệ
thống phân giải xylan không lẫn xenlulaza được cần phải được làm sáng ló ớ các
chủng Aspergillus vì chúng thuộc sô bọn tổng hợp mạnh nhất xylanaza và
xylozidaza.
Một phương hướng có triển vọng khác đế thu nhận xylanaza không lẫn
xenlulaza là phân lập các biến chủng khuyết xenlulaza hoặc tạo các chủng lái tố
hợp thích hợp nhờ kỹ xảo di truyền.
Cần chú ý rằng xylan kích thích tổng hợp xenlulaza ớ Streptomyces
thivưgnscus và T. reesei. Còn chưa rõ dây có phải là do tác dụng đặc hiệu cúa
một sô đoạn xylan hay chí đơn thuần là một sự kích thích các tế bào bới inột
nguồn các bon dễ dàng chuyển hóa hưn \cnluloza.

Kỹ thuật ADN tái tổ hợp tạo điều kiện cho việc kiến trúc nên các chúng vi
sinh vật chứa bộ máy enzim chon lọc. Mục tiêu của kỹ thuật ADN lái lố hợp
11
trong việc chuyển-hóa sinh học xylan gỏm 2 hướng: (1) kiến trúc nên các chúng
sản xuất có hệ thống phân giải xylan khóng lẫn xenlulaza và (2) cải thiện các dặc
tính lên men của các vi sinh vật lên men xyloza quan trọng trong công nghiệp
bằng cách ghép vào các gen đọc mã chu xylanaza và xylozidaza sao cho có thê
diễn ra sự lên men xylan trực tiếp.
Tất cả các công trình ghép gen cho dến nay mới chi tập trung vào vi khuấn,
chẳng hạn gen xyianaza đã được tách ra lừ Bacillus sọ. và được biếu hiện trong £.
coli.
Ngoài việc đưa vào các gen mới, kỹ ihuật tạo dòng còn giúp cho việc khuếch
đại các gen được biểu hiện. Chẳng hạn, việc tống hợp xylanaza ớ B. subtilis được
nâng cao có hiệu quả khi dùng môt plasmit mang gen lừ B. pumilus. Chúng
chuyển nạp đã tạo thành mmọt lượng xylunuza ngoại bào nhiều gấp ba lần chúng
cho. Hơn nữa, enzim đã được tổng hợp theo kiểu kiến trúc chứng tỏ các yếu tố
điểu chỉnh của chủng cho dã vắng mặt ớ plasmil dùng trong chuyến nạp.
2. ĐÔI TƯỢNG NGHIÊN cứu
30 chủng vi nấm có hoạt tính phân giải xenluloza và xylan được phân lập từ
đất ngoại Ihành Hà Nội theo các phương pháp vi sinh vật học ihông thường, sau
đó được bảo quản tại sưu tập giống của Bộ mòn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, được ký hiệu từ
Ap-120 đến Ap-149.
Sau khi chọn được một chủng (chủng Ap-146) có dồng thơi hoạt lính của cá
hai loại enzim, chúng tôi dã sử dụng chúng này cho các nghiên cứu tiếp theo vể
các dặc điểm sinh học và phân loại, về ảnh hướng của các điểu kiện môi trường và
nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và hoạt tính enzim của nó và cuối cùng, tạo ra
một chế phẩm thô từ các phụ phẩm nông nghiệp và sơ bộ thử nghiệm trong chăn
nuôi gia cẩm ớ quy mô nhỏ.
12

3.1. NGUYÊN LIỆU.
3.1.1. Hóa chất
xylan: sigma (Mỹ)
CMC: sigma (Mỹ)
3.1.2. Cơ chất
Cám gạo, lõi ngỏ, rơm, bã mía, bã đứa, thức ãn chăn nuôi tống hợp comfeed
(Indonesia).
3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
3.2. PHƯƠNG PHÁP
3.2.1. Mói trường,
3.2.1.1. Môi ưưcmg phân lập và giữ giông.
- Môi trường Czapek (g/1).
NaNO, : 3.0
K2HP04 : 1,5
MgS04.7H20 : 0,5
KC1 : 0.5
FeS04.7H 20 : 0.1
Saccaroza ' ; 30
Thạch : 20
Nước 1 lít
pH : 7
- Đặc điếm phân loại: Được xác dinh theo Raper & Fennel [ 7 ]
13
- Xác định hoạt tính enzim iheo phương pháp khuếch tán ưén thạch: Đun
mồi trường (0.1% xylan , 1% thạch trong đệm xúrat 0.01 M, pH 6.5) đố vào hộp
Petri. Dùng khoan nút chai, đục lỗ để nhỏ enzim thô. Nhỏ dịch Lugol, 10 phút sau
đo vòng phân giải xylan.
Nghien cưu anh hưởng của các điểu kiên mỏi trường đên khả năng sinh
enzim được tiên hành khi lên men lắc 220v/ph ò mòi trường thích hợp Irong 3
ngày.

3.2.1.2. Môi trường lên men. Mối trường dịch chiết cám (Murao và
ctv.,1979).
Cân 10 g cám cho vào 100ml nước máy, đun sôi cách thuý Irong 10 phút.
Lọc và thu được dịch chiết cám, khử trùng 1 atm/ 30 phút.
- Môi Irường cám đặc,
Cân 10 g cám (hqặc bã mía, hoặc bã sấn, hoặc rơm) cho vào bình chứa
lOOml nước máy (khử trùng ở 1 atm/ 30 phút).
3.2.2. Điều chế hemixenluloza (Chen và ctv, 1979).
10 g rơm (đã phơi) + 100 ml NaOH (1-24%), giũ ớ 30 - 12Ơ’C /M 8 giờ, ép
rơm qua vải màn. Rửa rơm còn lại bang nước cất. Trộn các dịch lọc lại để thể tích
cuối cùng là 100 ml chỉnh pH dịch lọc tói 5 bằng HC1.
Thêm vào dịch lọc 150 ml etanol 95%, giũ' ớ nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
Giữ tủa và rửa bằng etanol 70% để loại linhin và các chất khác. Túa loại nước
bằng etanol 95% và etanol được loại nhò lọc và hong khỏ chân không ở 50°c. Sản
phấm khô là hemixenluloza.
3.2.3. Chiết rút enzim.
Với mỏi trường cám đặc: thêm nước câì vào cơ chất dã lên men theo ty lệ
1/10 (g/1), lắc mạnh rồi giữ ở nhiệt độ phong trong 2 giờ và lọc.
Với môi trường dịch chiết cám: lắc đểu môi trường đã lên men, rồi lọc.
Dịch thu được gọi là dịch enzim iho, thứ hoai lính enzim hãng phương pháp
khuếch tán trẽn thach (mục 3.2.4.1 ).
14
3.2.4. Xác định hoạt tính
3.2.4.Ấ. Phương pháp khuếch tân (rởn (hạch (Williams., 1983).
Đun each thuy hôn hợp gồm 0,1% xylan và 1% ihạch trong đệm xitrat
0,01 M,pH 6,5 rôi phận ra các đĩa Petri. Sau khi thạch đóng thì dục lỗ, rỏ vào mỗi
lô o.lml dịch enzim. £)ê các đĩa vào tủ lanh trong 18 giờ, rổi chuyến sang tú ám ủ
ở 28-30°C/ 2 h. Phát hiện vòng phân giải bằng thuốc thử Lugol (15 phút). Đo kích
thước vòng phân giải.
Hoạt tính enzim được tính theo kích thước vòng phân giái: D-d (mm) trong

đó: 1
D: đường kính vòng phân giải cơ chất tính từ tâm lỗ khoan thạch.
d: đường kính lỗ khoan.
3.2.5. Xác định sịnh khối.
Sinh khối của chủng Ap-146 được xác định theo phương pháp cân trọng
lưựng khô. Sau khi lên men, lấy 100 ml dịch.nuôi cấy lọc qua giấy lọc hoặc li tâm
lấy cận, loại bỏ muối lần lượt bằng HCI IM và nước cất, rồi sấy khô ở 80-l00°C
đến trọng lượng không đổi, cân trọng lượng.
3.2.6. Xác định khả năng sinh lrưởng của chủng Ap-146 trên mỏi
trường chứa các cơ chất tự nhiên
Chúng Ap-146 được cấy trên môi n ường cám đặc ở nhiệt độ phòng.
Số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trong ]g môi trường nuối cấy thể hiện
khả năng sinh trưởng của chủng trong điều kiện đó.
3.2.7. Xác định các điểu kiện ảnh hưởng đến quá trình lén men ó chủng
Ap-146
3.2.7. Ị. Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đấu.
Chúng Ap'146 dược nuôi irong moi trường dịch chiêì cám ớ các nhiệt độ
25 35 40, 45, 50 và 60"c, sau 3 ngà) xác dịnh hoạt tính xylanaza, CMC-a/a
trong dịch nuôi cấy (mục 3.2.6.1), xác định sinh khối .
15
3.2.7.2. Ảnh hưởng của pH ban đẩu
Nuôi chủng Ap-146 ở môi trường dịch chiết cám dược chính pH theo các
thang pH 4, 5, 6, 7; 8 và 9 bằng NaOH 0.1N và HC! 0,1 N, sau 3 ngày nuôi cây ớ
nhiệt độ 28 - 30° c đem xác đinh hoạt tính xylanaza và CMC-a^a trong dịch nuôi
cấy và xác định sinh khối
3.2.7.3. Ánh hưởng của nguồn các bon tự nhiên
Cấy chúng Ap-146 vào các bình chứa cư chất là cám, bã mía, bã dứa, lõi
ngô, rơm, bổ sung urê 2%, rỉ đường 2%, NaNO} 1%. Sau 5 ngày nuôi cấy, xác
định hoạt tính xylanaza và CMC-aza của dịch nuôi cấy.
3.2.8. Động thái lẻn men

Chủng Ap-146 được cấy đều vào 15 bình nón chứa mỏi trường dịch chiết
cám, pH 6 có thể tích như nhau và nuôi ớ 30°c. Cứ sau 24h lấy ra 3 bình để xác
định các thông số lên men. Lấy trị sô' trung bình giữa 3 giá trị.
3.2.9. Thử nghiệm trong chăn nuôi gia cám
- Gà con nuôi công nghiệp của các hộ gia đình ớ Xã Đặng xá, Gia Lâm, Hà
nội được sử dụng cho thí nghiệm.
_ Thí nghiệm được tiến hành tại nhà Anh Khưưng, Xã Đặng Xá - Gia Lâm -
Hà nội.
16
Tiong 30 chủng nấm sợi có hoạt tính xylanaza và xenlulaza, chúng tôi đã
lựa chọn được chủng Ap-146 vừa có khá nãng phân giải xylan vừa có khá năng
phân giải xenluloza dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHẢN LOẠI.
Khuẩn lạc phát triển nhanh trên môi trường Czapek ở nhiệt độ 24-26°C.
Kích thước khuẩn lạc d = 4-5cm. Trong 2 tuần nuôi cấy bề mật khuấn lạc lóng léo
hơi bông và gồ ghề, mép khuẩn lạc mỏng, trải lộng có màu từ trắng đến xám nhạt,
ớ vùng có các đầu bào tử phát triển mạnli sinh IU từ sợi khí sinh thì mỏng mánh,
lừ sợi cơ chấl thì có màu lục vàng sẫm. Bọng hình chai, có kích ihước 5,5 - 7,7
Ị.im, hiếm khi có kích thước lớn hơn. Sterigmata 2 tầng mọc hạn chế ở đính bọng.
Cuông bào tử có ít trên bọng từ 5-6 cái. Hiếm khi có từ 8-10 cái hên bọng, kích
thước 5,5- 8,5|i m X 2,8-3,3|_im, thể bình 5,5-6,5 X 2,0-2,5f-im. Conidi có dạng
hình cầu có gai với kích thước 2,8 - 3,5 1-im.
Dựa vào khóa phân loại của K.B. Raper và D.I. Fenell " The genus
AspergiHuắ', chủng này đựơc định tên là Aspergillusparvathecius.
4.2. ĐẶC ĐIỂM NUÔI CẤY
4.2.1. Chọn mỏi trường
Chủng Ap-146 được nuối cấy lắc 2007ph, ở 30°c trong bình nón dung tích
250 ml chứa 50ml các môi trường sau : Czapek, Khoai tây được bố sung 3%
saccaroza, nước chiết giá bổ sung 3% succaroza, Czapek - CMC / xylan ( thay
saccaroza bằng 5g.CMC hoặc xylan). Cấy 5 % giống, sau 3 ngày xác định hoại

tính CMC-aza, xylanaza và sinh khối (bảng 1).
4. KẾT QUẢ NGHIÊN cứu
i x l c c d ũ ỷ
Bảng 1. Khả nãng sinh CMC-aza và xylanaza của chủng Ap-146.
Môi trường
pH đầu
pH cuối
Hoạt tính enzim
(D-d, mm)
Sinh khói
(mg/ml)
CMC-aza
Xylanaza
Czapek
6.0
4.0
28 30 9.0
Czapek-CMC
6.0
4 1
35
34
8.8
Czapek-xylan
6.0 4.1 30
39
8.0
Khoai tây - đường
6.3
4.2 29

29.5
10
Nước giá đậu-đường
6.2 4.5 27 29 9.5
Kết quá ghi ở bảng 1 cho thấy sau 3 ngày lên men trên 5 mỏi trường, chủng
Ap-146 đểu sinh axit hữu cơ làm giảm pH. Hoạt tính enzim tương dối cao khi
nuôi trẽn môi trường Czapek, Xylan và xenluloza là các chất cảm ứng, nên khi bổ
sung chúng vào môi trường Czapek hàm lượng các enzim tương ứng tãng lên.
Chủng Ap-146 có khả nãng sinh CMC-aza và xylanaza khá mạnh nên
Irong các thí nghiệm sau chúng tôi đểu dùng mòi trường Czapek có bố sung 5g
CMC và 5g xylan để thu nhận cả hai enzim trẽn.
4.3. ẢNH HƯỞNG C ỦA CÁC ĐIỆU KIỆN MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ
NĂNG SIN H T ổ N G HỢP CM C-A ZA VÀ X YLA NA Z A
4.3.1. Ảnh hưởng của pH nuôi cấy
Chủng Ap-146 được nuôi cấy lắc 200v/pH ớ 30"c trên mỏi irường Czapek-
CMC-xylan dùng NaOH IN, HCI IN ciièu chinh pH lừ 3 đến 8 Sau 3 ngày xác
đinh lioal tính enzim CMC-aza và xylami/a (báng 2)
18
Bảng 2 Anh hưởng của pH đến sinh tổng hợp CMC-aza và xylanaza
của chủng Apl46
pH đầu
pH cuối
Hoạt tính enzim (D-d, min)
Sinh khòi
(mg/ml)
CMC'-ciza XyhintiZH
3
3.5
18 20
4.1

4
3.7
22 25 5.2
5 3.8
27 30 7.1
6
4.0 30 35 8.9
7
• 4.2
28 30
8.5
8 4.5
24
25
6.7
Qua bảng 2 có thể thấy hoạt tính CMC-aza và xylanaza lãng dần khi pH
lãng từ 3 đến 6 và cao nhất ở pH 6 sau đó giảm. Sự biến đống của hàm lượng sinh
khối cũng diễn ra tương tự
4.3.2. Ảnh hựởng của nhiệt độ
Vi nấm cũng được nuôi cấy ở đicu kiện trên nhưng với pH 6 và nhiệt độ
thay đổi từ 20° đến 50°c, Kết quả được trình bày ớ bảng 3. Các sô' liệu cho thấy
chủng Ap-146 phát triển tốt ở nhiệt độ 25 đến 35°c. Ớ 30°c cả sinh khôi lẫn hoạt
tính của cả 2 enzim đều đạt cao nhất. Đây là chủng ưa ấm vì ớ 50°c hầu như
không quan sát thấy sinh trướng.
4.4. ẢN H HƯỞNG CỦA N GUỒN CACB ON
Trong thí nghiệm này điều kiện len men như liên nhưng chủng nghiên cứu
được nuôi trên môi trường Czapek ở 30°c và pH6. Kếi quá ghi I.é.1 báng 4.
19
Bang 3. Anh hưởng của nhiệt (lộ tới sinh lòng hợp CMC-UZ11 và
xylanaza của chủng Ap-146.

Nhiệt độ
nuôi (°C)
pH cuối
Hoạt tính cnzim (D-d, mm)
Sinh khối
(nig/mỉ)CMC-aza
Xylanaza
20
5.1
20
19
6.3
25
4.3
28
28
8.5
30
4.0
30
33
9.0
35
4.0
29 29
8.0
40 .
4.8 22
23
5.7

45
5.5 10
15
3.8
50 6.0 0
2
0.5
Bảng 4 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh tổng hợp CMC-aza và
xylauaza của chủng Ap-146.
Nguồn
cacbon
Nồng độ
(% )
pH cuối
Hoạt tính enzim (D-d, mill)
Sinh khối
(mg/ml)
CMC-HZH Xyhmaza
Glucoza
3
4.0
26
27
9.4
Saccaroza
3
4.0
27
27 9.0
Tinh bột tan

1
4.5
28 29
9.0
CMC
' 0.5
4.1
30
29 8.9
Xylan
0.5
4.1
29
31
8.5
Đối chứng
0
4.1
10
12
3,5
20