Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và vi nấm có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô lạc ở mức độ cao

Kho¸ luËn tèt nghiÖp
PHẦN 1 - MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Là một nước nông nghiệp đang phát triển như nước ta, các nông sản và
các sản phẩm từ chăn nuôi đóng một vai trò rất quan trọng. Lạc và ngô là hai
nông sản, ngoài việc sử dụng làm thực phẩm, chúng chủ yếu còn được làm
thức ăn trong chăn nuôi. Với điều kiện khí hậu nóng ẩm của nước ta thì lạc và
ngô lại là nguồn cơ chất lí tưởng cho nấm mốc phát triển. Khi phát triển trên
ngô, lạc nấm mốc đã sử dụng các chất dinh dưỡng, gây ra tổn thất về lượng
cũng như về chất của hạt. Không những thế, một số loài nấm mốc khi phát
triển chúng sinh ra các loại độc tố khác nhau và được gọi chung là mycotoxin.
Nguy hiểm hơn, những độc tố này có khả năng theo thức ăn vào cơ thể, gây
độc cho con người và động vật kinh tế.
Việc sử dụng các biện phòng trừ độc tố nấm mốc đã được khuyến cáo
sử dụng. Tuy nhiên, sự nhiễm nấm mốc và các độc tố nấm mốc nói chung và
sự nhiễm aflatoxin trên ngô lạc ở mức độ cao quá giới hạn cho phép là không
thể tránh được. Chính vì vậy cần phải có những biện pháp khử nhiễm độc tố
nấm mốc, đặc biệt là aflatoxin bởi độc tính và nguy cơ gây ung thư của nó.
Trên thế giới hiện nay, việc nghiên cứu để tìm ra những pháp làm giảm
lượng độc tố aflatoxin trong lương thực nói chung và trong ngô, lạc nói riêng
đã và đang được các nhà khoa học rất quan tâm.
Ở nước ta, từ những năm 1970 Nguyễn Phùng Tiến và cộng sự [9] đã
nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc trên thóc ở kho bảo quản lương thực miền
Bắc Việt Nam và một số lương thực như đậu, đỗ, lạc... , Đặng Hồng Miên [5]
cũng đã nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc aflatoxin trên lạc.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
1
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Nguyễn Thùy Châu và cộng sự [1] đã nghiên cứu tình hình nhiễm độc
tố nấm mốc trên ngô gạo và các biện pháp phòng trừ.
Một số công trình của Đậu Ngọc Hào về sự nhiễm nấm mốc và

aflatoxin trên thức ăn gia súc và các biện pháp khử độc tố aflatoxin bằng
NH
4
OH cũng đã được nghiên cứu và công bố [7].
Nguyễn Thùy Châu và cộng sự [1] cũng đã nghiên cứu khử aflatoxin
trên ngô bằng NH
3
và Ca(OH)
2
, kết quả cho thấy tác dụng khử aflatoxin bằng
hai hóa chất rất rõ rệt và hiệu quả cao. Tuy nhiên, việc khử nhiễm aflatoxin
bằng các hóa chất như NH
3
có giá thành cao và để lại mùi khó chịu cho nông
sản bị xử lý.
Để khắc phục nhược điểm này, trong những năm qua, nhiều công trình
nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin bằng biện pháp sinh học đã được nhiều nhà
khoa học tập trung nghiên cứu và đã thu được một số kết quả hứa hẹn.
Để góp phần vào việc nghiên cứu khử nhiễm aflatoxin bằng biện pháp
sinh học, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài :
“Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và vi nấm có khả năng
khử aflatoxin nhiễm trên ngô lạc ở mức độ cao”.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Tìm được một số chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopus
delemar có hoạt tính khử nhiễm aflatoxin ở mức độ cao và khả năng ứng dụng
chúng trong khử nhiễm aflatoxin trên ngô và trên lạc.

1.2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập một số chủng Flavobacterium aurantiacum từ một số mẫu
đất thu thập ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam.
- Phân lập một số chủng Rhizopus delemar từ một số mẫu nông sản,
thực phẩm như quýt, xoài, gạo mốc, bánh men thuốc bắc.
- Xác định hoạt tính khử aflatoxin của các chủng Flavobacterium
aurantiacum phân lập được.
- Xác định hoạt tính khử aflatoxin của các chủng Rhizopus delemar
phân lập được.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
3
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
PHẦN 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đại cương về độc tố nấm mốc
Độ tố nấm mốc (hay còn gọi là mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu
trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp
của các nấm mốc và gây ngộ độc với động vật có vú, cá và gia cầm [14].
Ngoài tự nhiên có rất nhiêu loài nấm khác nhau phát triển trên các sản
phẩm ngũ cốc, hạt bông, lúa mì và nhiều loại hợp chất hữu cơ. Tuy nhiên, chỉ
có một vài loài nấm có thể sinh độc tố và ảnh hưởng đến gia súc, gia cầm và
con người. Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại giữa
kiểu gen (genotype) và điều kiện phát triển của nấm mốc. Độc tố nấm là sản
phẩm của sự chuyển hóa thứ cấp trong quá trình phát triển của nấm mốc [6].
Quá trình trao đổi thứ cấp được hiểu là quá trình tạo thành các chất mà vai trò
sinh lý của chúng chưa được rõ,chưa thật cần thiết cho sự tồn tại của chính tế
bào đó. Sự chuyển hóa thứ cấp thường xảy ra ở cuối giai đoạn phát triển của
tế bào nấm mốc.
Tính độc của những loài nấm lớn nhất định đã được biết đến từ lâu,
nhưng đến năm 1960 Bệnh độc tố nấm mốc mới được nghiên cứu sâu. Khi đó,
cả thế giới bàng hoàng bởi hơn 100 000 con gà tây ở nước Anh đã chết vì

bệnh X khi ăn lạc bị nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus.
Những số liệu có giá trị về các mycotoxin và các bệnh về mycotoxin đã
được thu nhận từ lĩnh vực thú y học. Nghiên cứu về động vật thực nghiệm đã
cho thấy tính độc của mycotoxin là rất lớn.
Bệnh nấm mốc ở người và động vật đều không có khả năng lây lan vì
chúng do tác nhân độc tố (hóa học ) gây ra.Tuy nhiên, hầu như tất các sản
phẩm thực vật đều có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
4
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
mycotoxin tiếp theo, và vì thế nó có khả năng nhiễm trực tiếp cho thực phẩm
của con người. Khi gia súc ăn các thức ăn có nhiễm mycotoxin, chúng không
chỉ chịu tác dụng trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, và
như vậy tạo sự nhiễm mycotoxin tiếp theo cho con người.
Độc tố nấm mốc đã thu hút sự quan tâm của toàn cầu bởi chúng đe dọa
đến sức khỏe con người và động vật cũng như sự thiệt hại nghiêm trọng về
kinh tế [8]. Điều này đã được chứng tỏ bằng nhiều hội nghị, hội thảo quốc tế ,
tạp chí và các bài nghiên cứu dành cho vấn đề có tính cấp thiết này.
Cho đến nay có trên 300 loại độc tố nấm đã được phát hiện và nghiên
cứu. Nhưng chỉ có 20 loại mycotoxin có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm
trọng và thường liên quan đến an toàn thực phẩm.
2.2. Độc tố aflatoxin
Năm 1961, Butler là người đã xác định được loài nấm Aspergillus
flavus tiết ra độc tố gây bệnh X ở gà tây và ông đặt tên là aflatoxin là viết tắt
của Afla và toxin.
Trong các mycotoxin thì aflatoxin được phát hiện sớm nhất và được
nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện.
Các aflatoxin gồm bốn hợp chất của nhóm bis-furanocaumarin, là sản
phẩm trao đổi chất, tạo bởi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus
được đặt tên là B

1
, B
2
, G
1
, G
2
. Các aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm
thực vật.
Các công thức cấu tạo của một số aflatoxin và các chất trao đổi liên
quan đến aflatoxin B
1
, G
1
và aflatoxin B
2
, G
2
là dẫn xuất dihydro của các hợp
chất mẹ. Các aflatoxin M
1
và M
2
là các chất trao đổi hydroxylat hóa của B
1
và
B
2
theo thứ tự, chúng có công thức cấu tạo như sau:
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH

5
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là
chữ viết tắt của Blue (màu xanh nước biển), và G là chữ viết tắt của Green
(màu xanh lá cây). Aflatoxin B
1
và B
2
trong sữa bò được chuyển hóa và gọi là
aflatoxin M
1
và aflatoxin M
2
(M là chữ viết tắt của Milk). Trong bốn loại
aflatoxin, aflatoxin, aflatoxin B
1
được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, sau đó là
G
1
, còn B
2
và G
2
tồn tại ở nồng độ thấp hơn.
Các aflatoxin phát quang mạnh khi ở dưới ánh sáng cực tím sóng dài.
Điều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kì thấp(0,5 ng hay
thấp hơn trên một vết sắc kí bản mỏng). Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thực
hành cho tất cả các phương pháp hóa lý cho việc phát hiện và định lượng.
Aflatoxin M
1

ở nồng độ 0,22mg/l có thể phát hiện được trong sữa lỏng.
Các aflatoxin được hòa tan trong các dung môi phân cực nhẹ như
cloroform và metanol, đặc biệt tan nhiều trong dimetylsulfoxit (dung môi thường
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
6
OCH
3
O O
O
O
O
Aflatoxin B
1
Aflatoxin M
2
OH
OCH
3
O O
O
O
O
Aflatoxin B
2
O
O
O
O O
OCH
3

Aflatoxin M
1
OH
OCH
3
O O
O
O
O
O O
O O
OCH
3
OO
Aflatoxin G
1
O O
O O
OCH
3
OO
Aflatoxin G
2
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
được sử dụng như phương tiện trong việc áp dụng các aflatoxin và các động vật
thực nghiệm). Tính tan của aflatoxin trong nước giao động từ 10 -20 mg/l.
Các aflatoxin rất bền ở nhiệt độ cao, khi được làm nóng trong không
khí. Tuy nhiên nó tương đối không bền khi được để trong không khí dưới tia
cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng và đặc biệt hòa tan ở các dung môi có độ
phân cực cao. Các aflatoxin ít hoặc không bị phân hủy phá hủy điều kiện nấu

bình thường và làm nóng khi thanh trùng. Tuy nhiên, lạc rang đã làm giảm
đặc biệt lượng các aflatoxin và các aflatoxin có thể bị phá hủy hoàn toàn với
việc xử lí mạnh bằng amoniac hay hypochlorit.
Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng cảm với việc
thủy phân trong môi trường kiềm. Đặc tính này là quan trọng trong quá trình
chế biến thực phẩm vì quá trình xử lí kiềm làm giảm sự nhiễm aflatoxin của
các sản phẩm. Tuy nhiên, nếu xử lí kiềm là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản
ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu.
Moreau và cộng sự khi nghiên cứu tính chất của aflatoxin đã đưa ra
những kết quả sau:
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
7
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Bảng 2.1. Tính chất hóa lý của một số aflatoxin
Aflatoxin
Công
thức phân
tử
Trọng
lượng
phân tử
Nhiệt độ nóng chảy
* ** ***
Huỳnh quang
B
1
C
17
H
12

O
6
312 268-269 265-270 252-266 Xanh lam
B
2
C
17
H
14
O
6
314 286-289 305-309 280-283 Xanh lam
G
1
C
17
H
12
O
7
328 244-246 247-250 246-247 Xanh lục
G
2
C
17
H
14
O
7
330 229-231 237-240 Xanh lục

M
1
C
17
H
12
O
7
328 299 Xanh lam tím
M
2
C
17
H
14
O
7
320 293 Tím
Ghi chú: * Kết quả của Townsend
** Kết quả của Stubblefield và cộng sự.
*** Kết quả của Beljaars.
2.2.1. Sự tạo thành aflatoxin do các nấm mốc
Sự tạo thành aflatoxin chủ yếu được thấy ở hai chủng A.flavus và
A.parasiticus. Các chủng tạo aflatoxin của A.flavus là rất phổ biến và thường
được phân lập từ các nguồn khác nhau như lạc, hạt bông, hạt gạo, lúa... Theo
số liệu của Schoroder và Boller (1976), có từ 20-98% các chủng phân lập của
A.flavus có khả năng tạo aflatoxin. Ngoài hai loài A.flavus và A.parasiticus
còn có một số loài khác cũng có khả năng sinh aflatoxin nhưng yếu hơn như
A.nominus (Samson 2001, Varga etall 2003) và A.bombycis (Varga et all
2003).

Sản lượng aflatoxin thường tỉ lệ với trọng lượng với hệ sợi nấm tạo
thành khi nuôi cấy: khi số lượng hệ sợi nấm đạt giá trị tối ưu thì sản lượng
aflatoxin lớn nhất, nhưng giảm sút nhanh chóng bắt đầu từ lúc hệ sợi nấm tự
phân giải. Sự sản sinh aflatoxin trong điều kiện nuôi cấy thông thường bắt đầu
từ lúc hình thành các cơ quan mang bào tử đính của A.flavus, nó tăng dần đến
giai đoạn sinh bào tử mạnh mẽ.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
8
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh độc tố aflatoxin như
chủng nấm mốc, nhiệt độ, hoạt độ của nước, các yếu tố môi trường…
Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích, và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 12
o
C,
27
o
C và 40 – 42
o
C theo thứ tự. Một số chủng nấm mốc bị mất hoạt tính sau
nhiều lần cấy chuyển liên tiếp trên môi trường không thích hợp, nhưng khả
năng sinh độc tố cũng có thể tăng khi chủng nấm mốc được cấy chuyển trên
môi trường thích hợp. Môi trường có bổ sung nấm men hoặc pepton hoặc là
các axit amin cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5 – 5,4; nhiệt độ
26 – 28
o
C) là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành độc tố aflatoxin.
2.2.2. Sự nhiễm aflatoxin trên ngô và lạc.
Cho tới nay, sự có mặt của aflatoxin được phát hiện trên nhiều loại
nông sản, thực phẩm của trên 50 nước ở hầu hết các châu lục. Aflatoxin đã
làm thiệt hại kinh tế cho nghành trồng trọt và chăn nuôi rất lớn [9]. Theo đánh

giá của FAO, hiện tại ước lượng có khoảng 25% tất cả các loại ngũ cốc bị ảnh
hưởng bởi độc tố nấm mốc [10]. Mặc dù aflatoxin được tìm thấy trên nhiều
loại lương thực, thực phẩm khác nhau nhưng hầu hết sự nhiễm tập trung được
xác định trên lạc và trên ngô là chủ yếu.
* Tình hình nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc trên thế giới
Những nghiên cứu của Ablas K. và cộng sự [13] cho thấy sự nhiễm
aflatoxin trên ngô do nấm Aspergillus flavus gây nên là vấn đề nghiêm trọng ở
các vùng trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ. Trong 3 năm nghiên cứu
từ 2000 đến 2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A.flavus trên ngô hạt
năm 2000 dao động từ 0 -100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm
lượng aflatoxin trong ngô dao động từ 0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb).
Mức nhiễm aflatoxin phân bố ngẫu nhiên trong ngô ngoài đồng không tương
quan với với sự nhiễm A.flavus. Tuy nhiên, 84% A.flavus phân lập từ các hạt
ngô có khả năng tạo aflatoxin. Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B1
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
9
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
(mức trung bình 400μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxin B1 (mức
trung bình 133μg/kg) đã được tìm thấy ở Uganda và 97% mẫu ở đảo Cebu,
Philippin trung bình 213μg/kg [18]. Theo Goto và cộng sự [12], 80 -85% số
mẫu ngô thu thập từ các kho bảo quản trong mùa mưa 1984 – 1985 ở Thái
Lan đã nhiễm aflatoxin B1 với liều lượng 6,30 – 1310 ppb.
Còn đối với lạc, trong năm 1973, nghiên cứu về lạc bóc vỏ ở nước Mĩ
cho thấy 15% của 361 mẫu có aflatoxin giới hạn từ vết đến 50μg/kg. Stoloff,
Krof và Hald đã tìm thấy aflatoxin ở 86,5% của 52 mẫu của các sản phẩm lạc
nhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, một mẫu có 3,465μg/kg. Các
aflatoxin đã tìm thấy ở 41% số mẫu của tất cẩ các mẫu bơ lạc được kiểm tra
năm 1967-1968, có aflatoxin với giá trì 155μg/kg và giá trị trung bình 500μg/
kg.
* Tình hình nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở Việt Nam

Ở nước ta cũng đã có một số tác giả nghiên cứu về mức độ nhiễm
aflatoxin trên ngô, lạc. Nguyễn Thùy Châu và cộng sự đã nghiên cứu và thấy
rằng mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô miền Nam và miền Bắc Việt Nam là
tương đối cao, từ 73,3% đến 95,8% trong đó hàm lượng aflatoxin trung bình
cao nhất là 63,8 ppb và hàm lượng aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25%
ppb đối với các tỉnh khác nhau [3]. Đậu Ngọc Hào [6] xác định tỉ lệ nhiễm
aflatoxin B1 trong 168 mẫu nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi, tỉ lệ
nhiễm trên ngô hạt là 33%, ngô bột là 74,2%, khô lạc là 84,7%. Theo kết quả
nghiên cứu của Viện y tế cộng đồng TPHCM gần 95% thức ăn gia súc có
chứa aflatoxin B1, bên cạnh đó thực phẩm sử dụng cho con người cũng có
chứa loại độc tố này (68% mẫu lạc và các sản phẩm từ lạc) [8]. Ngoài ra còn
có Đặng Hồng Miên nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên lạc [5].
2.2.3. Độc tính của aflatoxin
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
10
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Aflatoxin là một độc tố rất độc, nhất là aflatoxin B1. Cơ quan chịu tác
động của aflatoxin lớn nhất là gan. Trong cơ thể động vật, aflatoxin gắn với
ARN và AND thành dạng liên kết, cản trở việc sinh tổng hợp ADN, ARN và
protein, gây đột biến dẫn đến ung thư và làm suy giảm hệ miễn dịch. Sự liên
kết của aflatoxin với protein làm vô hoạt các enzym, thay đổi tính chất của ty
thể, lạp thể, suy giảm quá trình hô hấp mô bào [11].
Tình trạng nhiễm độc mãn tính aflatoxin đã dẫn đến ung thư gan ở
nhiều loài chuột, cá hồi, vịt và khỉ. Ngoài ra còn thấy u ở thận, túi mật, tụy,
bọng đái, xương của động vật thí nghiệm [12]. Elis và Dipaolo đã chứng minh
rằng việc tiêm aflatoxin B1 vào chuột theo đường bụng với liều 4μg/kg thể
trọng đã gây cho thai chuột bị quái thai hoặc chết [báo cáo tổng kết]. Với
những con vật bị nhiễm độc aflatoxin mãn tính chúng thường kém ăn, chậm
lớn, có thể sút cân, tổn thương ở gan, gan bị tụ máu có vùng chảy máu và hoại
tử, tăng sinh biểu mô ống dẫn mật. Ở hàm lượng thấp tuy không gây chết

nhưng aflatoxin đã mở đường cho các bệnh truyền nhiễm xâm nhập do nó tác
động làm suy giảm đáp ứng miễn dịch dịch thể, đáp ứng miễn dịch tế bào và
cả sức đề kháng chung của cơ thể [27]. Aflatoxin có thể tác động tương hỗ
với sự thiếu vitamin, thiếu protein, nhiệt độ không thuận lợi và các yếu tố
truyền nhiễm để gây hại.
2.2.4. Ảnh hưởng của aflatoxin đối với sức khỏe con người
Hiện nay, vấn đề thực phẩm bị nhiễm aflatoxin đang là mối quan tâm
của nhiều nhà khoa học vì nó đe dọa đến sức khỏe của con người. Aflatoxin
liên quan tới bệnh ung thư gan nguyên phát ở người. Nhiều tài liệu nghiên
cứu về ung thư tế bào gan chứng minh đó là bệnh chung của các vùng có
lương thực bị nhiễm nấm mốc A.flavus mà chất độc là nhóm aflatoxin. Bảng
2.3 dưới đây cho thấy mối tương giữa tỉ lệ người bị mắc bệnh ung thư gan với
hàm lượng aflatoxin có trên thực phẩm.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
11
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Bảng 2.2. Tỉ lệ dân số bị ung thư gan và hàm lượng aflatoxin trung bình
có trên thực phẩm (Theo Alain Reilly, 1993)
Tên nước hoặc vùng
Hàm lượng
aflatoxin trong
thực phẩm (μg/kg)
Tỉ lệ người mắc
ung thư gan
trên 10
5
người/năm
Vùng cao Kenya
Songkha (Thái Lan)
Thảo nguyên vùng cao (Thụy Sỹ)

Vùng cao trung bình Kenya
Thảo nguyên cao trung bình (Thụy Sỹ)
Vùng thấp Kenya
Thảo nguyên vùng thấp (Thụy Sỹ)
MôZămbic
0,1
0,2
0,2
0,2
0,3
0,3
1,5
7,8
1,2
2,0
2,2
2,5
3,8
4,0
9,2
13,0
2.2.5. Giới hạn aflatoxin cho phép
Trước thực trạng nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao cũng như
tính độc của aflatoxin đối với động vật kinh tế và ảnh hưởng của nó đối với
sức khỏe con người, nhiều quốc gia trên thế giới đã có những quy định giới
hạn aflatoxin nhiễm trong lương thực, thực phẩm (bảng 2.4):
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
12
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Bảng 2.3. Giới hạn aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA

Nước
Giới hạn aflatoxin
tối đa cho phép
Loại thức ăn
Mỹ
20 ppb
Bột ngô sử dụng làm thức ăn cho gia súc,
gia cầm ở tất cả các giai đoạn khác nhau
20 ppb
Hàm lượng tối đa cho phép trong thức ăn
cho gia súc, gia cầm hoặc trong nguyên liệu
bột ngô
Châu Âu 5 ppb Thực phẩm sử dụng cho người
Canada 15 ppb
Thực phẩm chế biến từ lạc bao gồm tổng số
tất cả các loại độc tố aflatoxin B
1
, B
2
, G
1
, G
2
Úc 15 ppb Thực phẩm chế biến từ dầu đậu tương và lạc
Nhật
10 ppb Cho tất cả các loại thực phẩm chứa B
1
100 ppb
Cho các loại nguyên liệu chế biến thức ăn
chăn nuôi

Trung Quốc
5 – 20 ppb Ngũ cốc, đậu tương và dầu thực vật
10 – 50 ppb Trong các loại thực phẩm khác
Châu Á
30 ppb Tất cả các loại lương thực, thực phẩm
120 ppb Trong các sản phẩm từ lạc
Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã ra quy
định về hàm lượng tối đa aflatoxin B
1
và hàm lượng tổng số các aflatoxin
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
13
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
(B
1
+ B
2
+ G
1
+ G
2
) được tính bằng mg trong 1kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh
cho gia súc, gia cầm (ppb).
Bảng 2.4. Quy định về độc tố aflatoxin B
1
và aflatoxin
tổng số của Việt Nam
Loại vật nuôi Aflatoxin B
1
Tổng số các

aflatoxin
Gà con từ 1 – 28 ngày tuổi < 20 <30
Nhóm gà còn lại <30 <50
Vịt con từ 1 – 28 ngày tuổi Không có <10
Nhóm vịt còn lại <10 <20
Heo con theo mẹ từ 1 – 20 ngày
tuổi
<10 <30
Nhóm heo còn lại <100 <200
Bò nuôi lấy sữa <20 <50
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
14
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
2.3. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin
Vì sự nguy hiểm có thể liên quan tới sức khỏe của con người và cộng
đồng do sự nhiễm các aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc, các nhà
khoa học đã cố gắng tìm kiếm các phương pháp để loại trừ hay phá hủy các
aflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm.
Vấn đề phòng ngừa sự nhiễm aflatoxin có thể là đưa những biện pháp
kiềm chế có lợi và có hiệu quả nhất. Nó có thể làm giảm số lớn những tổn thất
lương thực do nấm mốc gây ra. Song những biện pháp như vậy là rất khó thực
hiện trong thực tế vì nó phụ thuộc vào các điều kiện khí hậu và các thay đổi
cần thiết trong thực tiễn bảo quản và thực tiễn nông nghiệp. Các thực nghiệm
với lạc đã tiến hành ở Tây Phi chứng minh ảnh hưởng của thực tiễn nông
nghiệp về sự nhiễm aflatoxin. Thậm chí những phương pháp nông nghiệp tiến
bộ đã cho thấy một thực tế là sự nhiễm aflatoxin trong lạc ở mức độ thấp là
không thể tránh được.
Vì những biện pháp phòng ngừa cực kỳ khó thực hiện trong thực tế,
cho nên cần tìm những biện pháp kiềm chế khác để đạt được các thực phẩm
và thức ăn gia không có aflatoxin có thể ăn được. Các phương pháp khử

aflatoxin bao gồm phương pháp vật lí, phương pháp hóa học và phương pháp
sinh học.
2.3.1. Phương pháp vật lí
* Các qui trình phân loại
Phương pháp sử dụng rộng rãi nhất là loại trừ chọn lọc các phần bị
nhiễm của sản phẩm. Nói rộng ra vấn đề này là khả năng áp dụng phụ thuộc
chủ yếu vào tính chất vật lý của sản phẩm. Các quy trình phân loại dựa trên
các đặc tính như màu và kích thước của hạt… đã được sử dụng một cách khá
thành công đối với lạc ăn. Phương pháp này dựa trên sự định vị aflatoxin ở
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
15
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
phần tương đối nhỏ của các hạt, với sự thiếu hụt rất dễ nhận ra ở kích thước
và hình dạng của hạt. Tuy nhiên, do cái gọi là tổn thất “lột vỏ” thì những biện
pháp này không thể nói là hiệu quả 100%.
* Các quy trình chiết suất bằng dung môi
Việc chiết suất aflatoxin bằng dung môi có một số thuận tiện:
- Aflatoxin có thể bị loại trừ hoàn toàn một cách căn bản trong điều
kiện thuận lợi.
- Ít có khả năng tạo những sản phẩm khác có hoạt tính sinh lý đa dạng
từ aflatoxin.
- Trong nhiều trường hợp, việc chiết suất có thể tiến hành với việc thu
hồi dung môi mà không bị mất mát chất dinh dưỡng.
Nhưng việc chiết suất bằng dung môi có một số bất lợi:
- Cần phải có thiết bị chiết suất dung môi đặc biệt;
- Sẽ chiết suất luôn một số thành phần hòa tan cùng aflatoxin;
- Giá thành của việc chiết suất cao;
- Có thể mất mùi của sản phẩm xử lý.
Để tìm được dung môi có thể thích hợp cho tất cả các sản phẩm là một
nhiệm vụ khó. Các yếu tố khác như giá của dung môi và hiệu suất thu hồi

chúng cũng là vấn đề. Thêm nữa, độc tính của dung môi, dư lượng của chúng
và cuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy dễ nổ và điểm
sôi của dung môi.
Các aflatoxin có thể được chiết suất bằng các dung môi như cloroform/
nước, aceton/nước. Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin đơn độc mà
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
16
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
không loại trừ dầu. Còn các nhóm dung môi như hydrocacbon dầu hỏa/nước
loại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin.
Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ
thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan –
etanol - nước, và hexan –aceton - nước. Hệ thống bao gồm 54% aceton, 44%
hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được
tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% -
15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40μg/kg.
2.3.2. Phương pháp khử độc tố bằng hóa chất
Nhiều hóa chất có thể khử aflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự
nhiên. Những hóa chất này bao gồm: chlorin, ozon, axit hydrochloric, peroxit
benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin. Các hóa chất dùng cho
việc khử độc tố phải thỏa mãn các tiêu chuẩn sau:
- Phải phá hủy hay khử aflatoxin;
- Nó phải không tạo ra hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc tố
hay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng;
- Phải phá hủy các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi chúng
có thể tái nhiễm lại sản phẩm;
- Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban
đầu.
Tuy nhiên, nhiều hóa chất khảo sát đã không thỏa mãn tất cả những tiêu
chuẩn trên, và mặc dầu chúng phá hủy các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng

kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay
các sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
17
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Một số quá trình xử lý bằng hóa chất có hiệu quả trong việc phá hủy
aflatoxin thỏa mãn những tiêu chuẩn trên. Những hóa chất này bao gồm
hydrogen peroxit hay những hóa chất tương tự, hypochlorit, dimetylamin hay
metylamin và amoniac. Trong số này, hydrogen peroxit , natri hydrixit và
natri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử aflatoxin từ các sản
phẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn. Trong khi đó,
dimetylamin hay các amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt có
dầu hay ngô.
Việc xử lý aflatoxin trên ngô và khô lạc bằng amoniac đã được áp dụng
rộng rãi trong việc xử lý các thức ăn gia súc nhiễm aflatoxin ở nhiều nước. Về
cơ chế, ở nhiệt độ cao, có thể trong điều kiện áp suất xảy ra sự thoái biến
aflatoxin B1 bởi amoniac.
Ở nước ta, Nguyễn Thùy Châu đã nghiên cứu công nghệ khử độc tố
aflatoxin B1 trên ngô và khô lạc bằng hóa chất. Kết quả cho thấy NH
3
nồng
độ 6% hoặc Ca(OH)
2
có tác dụng khử 90% độc tố aflatoxin [1]. Nhưng giá xử
lý bằng hóa chất này có giá thành cao, đặc biệt việc khử độc tố bằng amoniac
đã để lại mùi khó chịu cho ngô và khô lạc nên khó áp dụng rộng rãi trong thực
tế ở Việt Nam.
2.3.3 Khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học
Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được
khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao

quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi.
Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện
pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi
phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được
chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
18
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được
định nghĩa như sự phân giải bằng enzym hay chuyển hóa sinh học của các độc
tố nấm mốc.
2.3.3.1. Khử nhiễm aflatoxin bằng Flavobacterium aurantiacum
Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Claude Morro, Cotty
Pitter đã cho thấy vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum có khả năng phân
hủy aflatoxin. Nó có khả năng phân hủy aflatoxin một cách không trở lại cả ở
môi trường rắn và môi trường lỏng. Khả năng loại trừ aflatoxin B
1
của vi
khuẩn này từ các thực phẩm đã được chứng minh ở các loại dầu thực vật, lạc,
ngô, bơ lạc và sữa lạc. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng yếu tố có vai trò
quan trọng việc phân giải alflatoxaflatoxinin B
1
bằng chất chiết của
Flavobacterium aurantiacum có thể là protein với các tính chất enzym. Khả
năng sử dụng chất chiết protein thô từ Flavobacterium aurantiacum được tinh
chế trong công nghiệp thực phẩm đã được Cộng đồng Châu Âu và cơ quan
Quản lí thực phẩm và thuốc của Mĩ đề nghị như các biện pháp loại trừ
aflatoxin từ các thực phẩm bị nhiễm.
2.3.3.2. Khử nhiễm aflatoxin bằng Rhizopus delemar
Zhu C.R. và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng khử nhiễm aflatoxin của

Rhizopus delemar bằng thực nghiệm trên chuột nhắt có nhiễm aflatoxin.
Aflatoxin B
1
được đưa và nước uống của chuột nhắt cái ở liều 126 μg trong
một tuần và toàn thể liều thử là 3,4 mg trong thời gian 27 tuần. Chất chiết của
Rhizopus delemar đã được đưa đồng thời vào nhóm chuột này bằng việc trộn
dung dịch aflatoxin B
1
. Chuột được giết riêng biệt vào các tuần tuổi 18, 30,
38, và 52. Các ổ bệnh thay đổi tế bào gan và các mô ung thư đã được định
lượng bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử và bằng các phản
ứng enzym. Ở nhóm chuột ăn thức ăn nhiễm aflatoxin B
1
, tai biến ung thư gan
là 71%. Ở nhóm chuột ăn thức ăn có Rhizopus delemar cùng với aflatoxin B
1
,
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
19
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
các ổ bệnh phát triển quá mức và các ổ bệnh có triệu chứng bệnh học enzym
đã giảm ở tất cả các thời gian lấy mẫu chuột để thử và không có con chuột
nào xuất hiện triệu chứng ung thư gan. Kết quả thực nghiệm này cho thấy
rằng Rhizopus delemar có khả năng ức chế mạnh tác dụng độc và tính gây ung
thư gan của aflatoxin B
1
. Nấm Rhizopus delemar có thể được sử dụng như
biện pháp tiện lợi và hiệu quả để kiểm soát sự nhiễm độc do aflatoxin. Từ kết
quả nghiên cứu này, Rhizopus delemar đã được Cộng đồng Châu Âu khuyến
cáo sử dụng như một tác nhân sinh học để khử nhiễm aflatoxin trong thức ăn

gia súc nói chung và khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc nói riêng.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
20
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
PHẦN 3 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu
* Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã thu thập 40 mẫu đất của các
tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Hà Tây, Hưng Yên để phân lập vi khuẩn
Flavobacterium aurantiacum.
* Để phân lập các chủng Rhizopus delemar có khả năng khử aflatoxin,
chúng tôi đã thu thập:
- 8 mẫu bánh men thuốc bắc tại các chợ của các tỉnh Hà Nội, Hưng
Yên, Nam Định, Bắc Ninh
- 7 mẫu xoài tại các chợ của Hà Nội
- 6 mẫu quýt tại các chợ của Hà Nội
- 4 mẫu gạo mốc
3.1.2. Môi trường
* Môi trường M
1
:
5 gram pepton
2 gram cao thịt
0,2 gram cao nấm men
3 gram NaCl
20 gram aga
1000 ml nước máy
pH = 7,2-7,4
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
21

Kho¸ luËn tèt nghiÖp
Đun cho tan chảy aga, thử pH = 7,2-7,4 rồi chia vào các bình tam giác,
khử trùng 1atm trong 30 phút.
* Môi trường PDA:
200g khoai tây gọt vỏ, thái hạt lựu và đun sôi 10 phút với 4500ml nước.
Sau đó lọc qua lớp vải mỏng, thu được dịch chiết khoai tây.
1000 ml dịch chiết khoai tây
20 gram glucoza
20 gram aga
Đun cho tan chảy aga, thử pH = 6 rồi chia vào các bình tam giác, khử
trùng 1atm trong 30 phút.
* Môi trường Sabouraud:
40 gram glucoza
20 gram pepton
20 gram aga
1000 ml nước máy
pH = 5,5 – 5,8
Đun cho tan chảy aga, thử pH = 5,5 – 5,8 rồi chia vào các bình tam
giác, khử trùng 1atm trong 30 phút.
3.1.3. Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin
* Na
2
SO
4
khan (Trung Quốc)
* NaHClO, Nhà máy hóa chất Việt Trì
* Các dung môi cloroform, hexan, aceton, axetat chì (Trung Quốc)
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
22
Kho¸ luËn tèt nghiÖp

* Các chuẩn độc tố aflatoxin B
1
(Sigma)
* Silicagel 60 F
245
, Merck, Cộng hòa liên bang Đức cho sắc ký lớp
mỏng
3.1.4. Dụng cụ thí nghiệm
* Buồng sắc ký lớp mỏng (chromatography tank ), Thụy Sỹ
* Máy nghiền đồng thể polytron, Cộng hòa liên bang Đức
* Giấy lọc Whatman N
o
1, Chemapoli, Tiệp Khắc
* Kính hiển vi Olympus có gắn máy chụp ảnh Nhật
* Phễu chiết
* Ống hút tự động 0,2ml và 0,1ml Trung Quốc
* Bơm tiêm vi lượng Hamilton
* Máy cô chân không
* Đèn cực tím 254 nm – 366nm Camag (Thụy Sỹ)
* Máy đánh sóng siêu âm
* Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh
* Máy cất quay chân không (Đức)
* Tủ cấy vô trùng (Đức)
* Nồi hấp tự động (Đài Loan)
* Máy đánh vovtex
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
23
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
3.2. Phương pháp
3.2.1. Phương pháp lấy mẫu đất

Chọn những ruộng lúa hay ruộng rau có đất màu mỡ. Dùng dao gạt bỏ
10cm lớp đất bề mặt, lấy khoảng 20g đất cho vào túi nilon, buộc kín miệng
túi. Mẫu đất phải được đánh số thứ tự, địa điểm lấy mẫu và ngày lấy mẫu.
3.2.2. Phương pháp phân lập
3.2.2.1. Phương pháp phân lập Flavobacterium aurantiacum
Cân 1g đất cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước cất đã khử trùng.
Đánh tan trên máy đánh Vovtex 200 vòng/phút trong 30 phút. Dùng pipet hút
1ml lần lượt sang các ống nghiệm khác cũng có 9ml nước cất đã khử trùng để
độ pha loãng đạt 10
-5
thì dừng lại. Lấy 200 μl ở độ pha loãng 10
-4

và 10
-5
vào
các hộp petri đã đổ môi trường M
1
. Dùng que chang thủy tinh trang đều cho
tới khi mặt thạch khô thì dừng. Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30
o
C, sau 2
ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường M
1
thạch
nghiêng.
3.2.2.2.Phương pháp phân lập Rhizopus delemar
- Phân lập Rhizopus delemar từ bánh men thuốc bắc : mẫu bánh men
thuốc bắc được nghiền nhỏ. Cân 1g mẫu đã được nghiền nhỏ cho vào ống
nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước cất đã khử trùng. Đánh tan trên máy đánh

Vovtex 200 vòng/phút trong 30 phút. Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang các
ống nghiệm khác cũng có 9ml nước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10
-5
thì dừng lại. Lấy 200 μl ở độ pha loãng 10
-4

và 10
-5
vào các hộp petri đã đổ
môi trường PDA hoặc Sabouraud. Dùng que trang thủy tinh trang đều cho tới
khi mặt thạch khô thì dừng. Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30
o
C, sau 2
ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường PDA (hoặc
môi trường Saubauraud) thạch nghiêng.
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
24
Kho¸ luËn tèt nghiÖp
- Phân lập Rhizopus delemar từ các mẫu hoa quả : vỏ hoa quả được cắt
thành những mảnh nhỏ. Cân 1g mẫu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml
nước cất đã khử trùng. Đánh tan trên máy đánh Vovtex 200 vòng/phút trong
30 phút. Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang các ống nghiệm khác cũng có 9ml
nước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10
-5
thì dừng lại. Lấy 200 μl ở độ
pha loãng 10
-4

và 10
-5

vào các hộp petri đã đổ môi trường PDA (hoặc môi
trường Sabouraud). Dùng que trang thủy tinh trang đều cho tới khi mặt thạch
khô thì dừng. Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30
o
C, sau 2 ngày lấy ra quan
sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường PDA (hoặc môi trường
Saubauraud) thạch nghiêng.
3.2.3. Phương pháp định loại Flavobacterium aurantiacum
Để định loại F.aurantiacum chúng tôi dựa vào khóa phân loại của
Bergey [14]. Chúng tôi tiến hành các phản ứng sinh lý như xác định khả năng
di động, sắc tố tế bào, khả năng chịu muối, nhu cầu về NaCl; các phản ứng
sinh hóa như khả năng thủy phân gelatin, khả năng thủy phân casein, khả
năng thủy phân tinh bột, khả năng thủy phân celluloza, các khả năng lên men
đường glucoza, lactoza, saccaroza, maltoza.
3.2.4. Phương pháp định loại Rhizopus delemar
Để định loại các R.delemar, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng
Rhizopus phân lập trên môi trường Sabouraud trong 24 giờ, sau đó tiến hành
xác định các đặc điểm hình thái và cấu trúc vi học của R.delemar theo khóa
phân loại của Laurone [26].
3.2.5. Phương pháp làm tiêu bản quan sát F.aurantiacum
Sử dụng phương pháp nhuộm Gram. Lấy một giọt nước cất vô trùng
nhỏ lên lam kính. Dùng que cấy vòng bắt khuẩn lạc để lấy mẫu. Hòa mẫu vào
giọt nước và dàn đều mẫu trên lam kính. Hơ nhẹ lam kính trên ngọn lửa đèn
NguyÔn ThÞ Minh Ch©u líp: 04-02 Khoa CNSH
25