Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh vật diệt chuột = Static

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
TRƯNG TÂM NGIIIẾN c ứ u VI SINH VẬT HỌC ỨNG DỤNG
NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHAM
VI SINH VẬT DIỆT CHUỘT
• • •
ĐỂ TÀI CẤP ĐAI HỌC QUỐC CỈIA
M ã số: &ĩ. ^
Chủ trì đề tài: PGS. PTS. Phạm Văn Ty
Các thành viên tham gia: Thạc sỹ Nguyễn Hoài Ilà
Cử nhân Nguyễn Thế Hoà
TR
/ c tc 3.9
Hà Nội -1998
MỤC LỤC
1 Tóm lắt kết quá để tài la
2 Tóm tắt kêt quá đề tài tiếng Anh lc
3 Mớ đầu 1
4 Tổng quan tài liệu 2
5 Phương pháp nghiên cứu 9
6 Kết qiiíi và thno hirìn 12
7 Kêt IIIộ 11 29
8 Tài liệu tham khán 30
0 Phu lục 33
10 Phiêu đãng ký kôt quá ngliiổn cứu khoa học công nghệ 37
TÓM TẮT
Tén đề tài : Nghiên cứu tạo chẻ phẩm vi sinh vật diệt chuột
Đề tài cấp Đại học Quốc gia . Mã số QT.98.14.
Trong mấy năm gần đày ở Việt Nam cũng như các nước quanh vùng, nạn
chuột hoành hành và gây thiệt hại lớn cho sán xuất nông nghiệp và kho tàng.
Chuột còn là vật trung gian truyền bệnh dịch hạch cho người. Việc săn bắn thiên

địch ( mèo. chim, rắn) đã làm mất cân bằng sinh thái, làm chuột sinh sản quá
mức gây hậu quả nghiêm trọng cho nền kinh tế quốc dân.
Các biện pháp diệt chuột cổ điển không mang lại hiệu quả cao. Biện pháp
cơ học vừa tốn tiền mà không áp dụng được ỏ' phạm vi rộng. Việc sử dụng chất
hoá học lại rất độc cho người và môi trường. Biện pháp sử dụng vi sinh vật loại
trừ được các nhược điểm trên.
Năm 1897 Isatchenko đã tách được vi khuẩn Salmonella enteritidis có kha
năng gây bệnh cho chuột mà không gáy bệnh cho người và các động vật khác.
Cho đến nay đã 100 năm trôi qua chủng này vẫn ổn định đã được dùng đê sàn
xuất bà diệt chuột và chưa hề gây ra bất cứ hậu qua đáng tiếc nào.
Trong công trình này chúng tôi đã nghiên cứu các đặc điếm sinh học. các
điều kiện tối ưu đê sản xuất bả diệt chuột. Sán phẩm đạt 109 tê bào/g. Chú
112
,
Salmonella enteriditis var Isatchenco có thê sinh trưởng trong phạm vi pH rộng (
5.5- 8.0 ) và phạm vi nhiệt độ rộng 28 - 45"1. Đặc biệt ớ pH7 và 37"c sinh trườn
2
,
tốt nhất. Có thể sử dụng nguyên liệu đon gián giá đỗ 100g/l. đường kính 20g/l để
lên men. Với chất mang là thóc hấp có thê đạt số lượng 109 tế bào/g sau 48 giờ
nuôi. Chuột ăn 5g bả sẽ bị bệnh và chết sau 3-11 ngày. Chuột bị bệnh có thể lây
ra bẩy. Mồi Im cần đánh 2 kg.
Đn kê) hợp với công ty Vedan sản xuất thử 2 tấn ứng dụng tại Gia Lâm, Hà
Giang, Hò Bắc.
Đã ký 2 liợp dồng chuyển giao công nghệ với sở khoa học công nghệ Thái
Rình và Cao Bằng.
Cơ quan chù trì đề tòi Chủ nhiệm đề tài
PGS.PTS Phạm Văn Ty
Cơ quan quản lý đề tài
SUMMARY

Ti!le: StnclV on culturc conditons ỉind rat pnthogcnic' iibilitv of SalmotielỊa
eiìteritidis var Isatchenko H10 fbr procluction of ratsbane
!n the lasl fe\v years. rat (lisastei caused the destruction of agricultural
production and stores in Vietnam and nearby countries. Moreover, rats and mice
nre mtermndinte liost to sprcnđ plngue. Hunting of nnturnl enetny of rnt sncli as
cat. bird and snake make ecology unbalance which gives good conditions for
proliferntion of lat nncl causes tnany sevious problems for natural econorry.
Tinđilionnl nietliods donì gel high effect. Meclianical method is nol only
uneconomic hut also unnpplicahle in large scale. The chemical application is
toxic for nmii and destrovs enviroment.
Using the effective micTongnnisms can prevent these disaclvantages. In
1897. Isntchenko isolated Snlmonella entei it idis which showed strongly
pathogenic nhility, hut doiVt arrect on man and the other aninmls. For 100 yenrs ,
tliis strain hns heen used foi prodution of ratsbane and has heen never producing
any bad consequences so far.
We stiKÌiecl some chnracteiistics of this strain and optimal culture
condition for production of ratsbane. This prnduct contains 10° germs/g. The
optimal pH and temperature of the growth are 7 and 37 °c. respectively. Simple
mnterinl can be Iisecl fni íeimentation.
Rat vvhich \vas eaten 5g ratshane gets disease and dies after 3-1 I clays .
Tliis lal can spreađ disease over his herh. So 2 kg of rntsbane is used for a hectar.
TW
(1
lons of ratshane have heen produced, which is the result nf the cooporation
uilli YVdnn Vietnam companv
-V ; cl" ''bor Jind f~or
Dr- p h n m Vc> I
-1
T y
2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIÊU
2.1. Nguồn gốc chung Saỉmnneỉĩa enteriditis var., Isatchenko
Chủng Saỉmonella entericìitìs var. Isatchenko được [satchenko phán lâp
từ một ổ dịch bệnh lớn của chuột xám tại vùng Saint - Perterburg vào năm
18^7. Về phàn loai học chúng Isachenko được xếp vào chi Saìmoneìỉa do có
cùng nhóm huyêt thanh với Sdlnionrlla gọi tắt là vi khuán Isatchenko [4].
Chung này khác với Saỉmoììeììa enteriditis nhiễm trong thức ăn và có thể 2ây
bệnh đưcnig một cho n«ười. Đã nhiều nãrn trôi qua, các nhà khoa học chứng
minh rằng Saliiìoiielìa (’)ìtf’iì(Iitìs vay. Isatchenko không gây bệnh cho người
cũng như các đông vât Iiuòi và động vât hoang dã khác.
Tác dụng chính cua chung ísatchenko là loai gủv hènh đăc hiệu dôi vái
các loai chuột nhà và chuột đồn2. sâv ròi loan hè thòng tiêu hoá đan tới xnàt
huvèt đường ruột lổi làm cluiột clièr.
2.2. Sức đé kháng cùa chúng Isatchenkn
Chung Isatchenko khó sinh sán trong nước thường, rthưrtg có thế tổn tai
2 - 3 tuấn lễ trong phân. 2 - 3 tháng trong nước đá. Vi khuủn bị tiêu diệt ớ
50"c trona I giờ hoặc dun sôi 5 phút hay khứ trùng Paxtơ [1 ].
Với fenol 5%, thuý ngân clorua 1/500 có tác dụng phá huy hoàn toàn tê
bào. Nhung chúng lai đề kháng với một số hoá chất như: Tím cristal, xanh
briănơ, xanh malachit. nitrihyposunfit, muối mât với nồng độ vừa đu gày
độc cho Escherirhid < nli Dưa vào tính chất này người ta đã điều chè các
cáctnòi tiưòiig chọn lọc để kìm hãm sư phát triển cuả Esrherichia cnli và giúp
cho vi khuân Isatchenko phát triển [4].
2.3. c<f chẽ gày bệnh cùa vi khuíin Isatchenko
3
Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo thức ăn tới ruột non sau đó chui qua
thành ruột vào hach bach huyết của thành ruột và phát triển ở đó [1].
0 hach, một số vi khuẩn theo hệ thống bach huyết vào máu gAy nhiễm
trùng huyết rồi tới lách, một số vi khuẩn cư trú tại lách, từ đó tấn công ra máu
từng đợt [3]. Một số vi khuẩn bị dung giải, giải phóng nội độc tô gây ra một

loat triệu chứng. Độc tố tác động vào não gfty triệu chúng li bì của bệnh
thương hàn và gíty ra hiện tượng chênh ỉệch giữa mach và nhiệt độ. Độc tô' tác
đông vào dây thẩn kinh giao cám gây đầy hơi, đi rửa, gây chấm máu dưới da,
ơ.ìy simg loét hav hoai tử lionc pAy sung huvết trong ruột.
Từ máu vi khuẩn vào mát găp điều kiên rluiân lợi phát triển rồi theo ống
dần rnât ra ruột và đào thãi then phân.
Vi khuân còn theo đirờns tiết niệu và ctào thái ra ngoài nlnmg rất ít [4].
2.4. Klui nániỉ "ày bệnh thực nghiệm cùa vi khuân Isatchenko
Vi khuân Isntchenkn là chuna gàv hênh đặc hiệu cho chuột đồng và
chuột nhà.
Một sò nhà nghiên cứu còn thày: Vi khuẩn từ hè thông bach huyêt di
vào tuần hoàn máu. lai xuất hiên phía ngoài thành ruột và vào trong ruột gây
nên bênh nâng ơ các cơ quan nội tang và đường ruột của chuột [3].
IVIỘt sỗ nhà nshiẻn cứu khác còn thấy vi khuẩn xâm nhập vào hệ thông
bach huyèt. sau đó xàm nhập vào tuyến nước bot, amidan và vùng họng [4].
Từ khi vi kluiắn xâm nhập đến khi bắt đẩu xuất hiện triệu chứng bệnh
diễn ra 3 - 20 nơày. Thời kỳ
11
bênh trung bình 3-10 ngày, đổi với một số loài
chuột đổnơ hoăc chuột nhà thì thời kỳ này ngắn hơn khoáng 3 - 6 ngày. Vào
các thời kv tièp theo chuột suy yêu dần, cháy nước mắt, khó thờ, giảm trọng
lương, đi tiêu chay mât khá năng phán xa rồi chết [7].
2 5 Mộf so dặc tính niíi chuột nhà và chuột (tổng
7.5.1. Chuột nhà Ratlvs / ĩavipectiia [7].
4
2.5.1.1. Đác diêm
Thân hình thon nhỏ. đuôi dài hơn thân, tai dài gấp lai phu mắt. Bình
thuờng có 5 đôi vú. Lưng màu nâu sẫm lông lưng mểm màu hung đó. Giữa
lưng có xen lẫn nhũng lông dài màu đen làm thành môt dái thầm ờ giũa limơ.
Bung màu xám. màu săc măt bung thav đổi theo mùa trong năm và theo lứa

tllổi.
2.5.1.2. Sinh thái
Chuột nhà thường ớ chỗ cao ráo, đăc biệt thích ò' các khe tường, tre. bui
nưa. Chung còn núp trong các đống rơm rạ. đống cui, các đổng cAy còi. chuột
thích hò trên trân nhà. mái nhà. Chuột có thế đào hang dưới đất. Hang chuột
thường (lơn ui
,'111
có cua ra vào và tlurờng có 2 - 3 ngách thoát thAn. Rnn nahv
chuot 11211 I ro 11II to. han (têm ra kiêm ân.
CIhio! nhà chu YÒII hoạt dông vé đêm ờ những nơi vãng người. níurnự
ciiim có lúc kiêm .ín c;i Han nsày.
2.5./ ?. Thức án <11(1 cluint nhà
Chim! nhà ,
11
) tạp. cluing án ca thức ;Ì
!1
dộng vật và thưc vật. 0 thành
pho. chuột
.111
chu yèu là lương tlụrc. thưc phàm cua người. 0 ngoài mong
clniot ăn chu vè II các loai hoa màu dào bới được. Phản tích thức ăn trong da
dà\ chuột clổti thày có chứa thức ãn xanh (cây mắm. chổi cày. thân. !á có), Có
lẽ đo là thức án ho smm lượnc nước \à vitamin càn thièt cua chuột [5].
2.5.1.4. Sinh san cùa cìinòt nhà
Chuột nhà có cườns độ sinh sàn rất cao và đẻ quanh năm. Tý lê chuột
non ị'?r) cua các tháns trong nám nlnr sau:
1 h: í II
1
■>
~ỉ

4
5
6
7
8
9
10
1 1
12
uc
35
25
17
100 40
24 29
-
44.2 30 30 50
Sư có mật của chuột vừa dẻ và chuột non ờ mùa dông chứng ro chuột
sinh san ca trong mùa đông. Chuột đẻ 3 - 4 lần trong nám. Sn chuột đẻ lun thứ
I và 2 nhiều nhất, chuột đẻ lứa thứ 3 và thứ 4 rất ít. Trung bình chuột đẻ 3-12
con mỗi lứa. Tuổi thọ cua chuột nhà chí giới han trong một năm.
Ch
11
ộr nhà là loni lất tinh khôn và hay cánh giác nên diệt trừ chúng lất
khó. Thường chúng không ăn môi độc, và rất cánh giác vứi các loai bẫv. Vì
thê nên đât hẫỵ trên những nơi chuột buộc phải đi qua.
2.5.2. Chuột đổnẹ ỉóv Raítus haxaensis í6/
2.5.2.1 .Đác điếm
Thân hình thò. đuổi dài hơn thàn. tai ngắn hình hàu duc. bàn chân sau
Bình thương co 10 dôi vú. Lòng mềm mai khòng có ơai. ỊVIăt lưng vàng

xám có itièm nâu cánh gián, con non sám hơn chi trừ phàn (lâu nàu vàng.
2.5.2.2. Sinh thái
Cluiọt đong sòng ơ mộng. Hang chuột dơn gián thương chI có I cua ra
vào. Chuoỉ (.1(1112 án lap. lìong da đàv ph;\n tích thủv có bót sắn 40 - f)(ìc/r. thưc
vat xanh 4(1 - 60'-'í. Trone da ilàv con chua mot ít rhit Ki/i'í .
Khi ilmc ;
1
I
1
tluic \;il khan liièm chuột an tliịt ca dung loai va các loài
clniột khác.
2.5.2.3. Sinh sàn của chiiòt Iỉôtiiỉ lón
Trung hìnli mỗi lúa chuột dẻ lừ 3-14 con. Lứa thứ nhất 3 - 10 con. lứa
thứ 2 từ 10 -14 con. lứa thứ 3 từ 6 - 10 con cường đô sinh san cua chuot manh
vào các tháng mùa thu.
Cluiột dồng lớn thường hoat động ban đêm và gây hai đáng kể cho nòng
nghiệp, như căn đổ ma. ăn lá và hòng lúa. Chuột đào bới gãm các loai cu làm
chẽ! cày (sán. khoai), ngoài ra con đào hang trong dê. bờ (lạp. bớ ruộng, làm
thám lâu nước trong ruộng và dê.
2.5.3. Cliỉiot (ỉônạ bé Rattĩis Insea [61
2.5.3.1. Đác (tiêm
6
Chuột đồng bé than phủ lông mềm, râm, ít gai, lưng màu vàng đất, bung
trăng có diêm vàng nhạt. Ranh giới lưng, bung không rõ lắm. Đuôi chuột đồng
màu ní\i! tối. ngắn hơn ihfln honc hằng than, có 3 đổi vú.
2.5.3.2. Sinh thái
Chuột đồng bé cũng sông ở đổng ruộng như chuột dồng lớn thích ở gắn
bờ nước, có khi chuột còn vào nhà. Chuột thường đào hang dưới gôc cây, bờ
ruộng, thích dưa vào các tảng đa làm vách hang. Hang có 2 - 6 cửa. Đất do
chuột đào lacó dang viên nhỏ dễ nhân biết. Hnng có một số cửa bí mât, chỉ

đươc dùng khi cẩn táu thoát.
2.5.3.3. Thức ăn cùa chnòt đrìns; bé
Clniòt đồng bé ăn các loai rau. quả. củ. Trong da dày có chứa 60% sắn,
20v/r hạt co và 20% thịt.
2.5.3.4. Sinh sàỉi cùa chuột dồnq bé.
Khòna sinh sán nhiều như chuột đồng lớn. mỗi lứa (tẻ 5 -6
con. Sinh san tâp tnum vào lúc lúa làm đòng và giám đi sau vu gật.
2.6. Su phá hai cùa chuột (lổnự và chuột nhà.
(j nước ta chuột phàn bò à khắp mọi nơi. Trong nhũng nám gán dây nan
chuột phá hai mùn màng đang là mối lo lắng cùa nỏng dan các dịa phương.
Theo háo cáo cua cuc Khuyên nông Bộ nông nghiệp và phát triển nông thòn
thì sỏ thiệt hai do chuột sây ra tại các tỉnh miền Tây Nam Bộ lên tới 300 000
tân thóc/năm [8].
Vu đông xuân 1997 tai các tính, thành miền Bấc và miền Trung có
97 725 ha lúa và rau màu hi chuột phá hai. Trong đó. có 12 046 ha bi thiệt hai
năng, nhiều nơi bi rnât trắng [7].
Theo háo cáo mới nhất FAO (1993), trên phạm vi toàn cáu. hàng năm
chuột oây tốn thất lớn tới 33 000 000 tấn ngũ cốc. Riêng ờ Mỹ La Tinh thiệt
hại hàng nám từ 8 - 10% sán lượng ngũ cốc, mất hơn 1.5 ty đô la mỹ [61.
7
Nạn chuột phá hoai mùa màng đang là mối lo lắng đăc biệt của bà con
nông dân. Đây là một vấn đề nan giải đang được chính phủ quan tâm và ra chỉ
thị, cồng văn hướng dẫn, hoăc thành lộp ban chỉ đao và có chính sách khuyên
khích mọi người tham gia diệt chuột [7].
2.7. Các biện pháp phòng trừ chuột
0 nước ta nhiều biện pháp mang tính tổng hợp đã được sử dụng từ hạn
chê thức ăn. han chế sinh sản của chuột đến việc diệt chuột bằng các biện
pháp thu công, cơ học và sinh học.
2.7.1. Biên pháp thủ còng
Hai tháng đầu năm nay theo công báo của cuc Khuyến nông, các tinh

trong cà nước đã chi phí hơn 1.6 tỷ đồng để khuyến khích bà con đào hang
diệt chuột, hun khói và đã diệt được hơn 17,8 triệu con chuột. Tuy nhiên nêu
lạm dung biện pháp này sẽ ánh hường đến hè thống thuý nông.
2.7.2. Biện pháp cơ học
Dùng các loai hẩy. lưới chắn, vợt bắt. bẫy dính Biện pháp nàv chi có
hiệu quá dõi với chuột trong nhà. trong kho chứa nho. Còn trên diện tích lớn
thì không thuận tiện và tó ra kém hiệu quá.
2.7.3. Biên pháp hná học
Thường dùng các loai thuốc như: photpho kẽm, biorat, silico
fluruanatri Biện pháp hoá học không phù hợp với các vùng nông thôn vì có
rất nhiều loai gia cẩm, gia súc được chăn thả nên không thể rắc thuốc diệt
chuột. Biện pháp này nhanh nhưng hiệu quả không cao vì chuột dễ chán mồi.
Khi sư dung thuốc trong các lẩn sau thường gây rất độc với người, giết hai các
độns vật có ích và ơAv ô nhiễm môi trường
2.7.4. Biện pháp sinh Uoc
Biện pháp diệt chuột sinh học ià phát đông toàn dân nuôi mèo, nuôi
trăn, rắn và tăng cường còng tác vệ sinh môi trường [4]. Trong biện pháp sinh
8
học, đáng chú ý là sử dung chủng vi khuẩn đặc hiệu gây dịch bệnh nhân tao
và làm chết chuột trên pham vi lớn, nhưng lại tuyệt đối an toàn với nguời, với
vạt nuôi và các loại động vạt có ích khác.
2.8. Tình liình nghiên cứu diệt chuột bàng vi sinh vật
2.8.1. Trên thê giới
Các nhà khoa học Nga như Metnhicop, H.F. Gamalia và L.Dastier là
nhũng người đầu tiên đưa ra phương pháp sử dụng vi sinh để diệt chuột. Kết
quà nghiên cứu của các nhà khoa học Liên Xô đã mang lại hiệu quà rất lớn.
Tới 1953 ờ Liên Xô đã có 163 cơ sở nghiên cứu sản xuất và ứng dung chế
phấm vi sinh này [7].
Trái qua quá trình sử dụng thưc tiễn hơn 60 năm, chế phẩm vi sinh
mang tên Bai tocumai UI Liên Xô (cũ) đã được sản xuất và được thử nghiệm ở

nhiều nước trên thế giới. Từ 1980 đến nay chế phẩm vi sinh cũng được sán
xuất và sứ dung rộng rãi ờ Cu Ba và còn được xuất sans; một số nước vùng
Caribè và Chàu Mỹ La Tinh, mang tên thương phẩm là Biorat [6].
2.8.2. Tai Việt Nam
ớ Việt Nam việc nghiên cứu sử dung vi sinh vật diệt chuột đang được
tiên hành. Tuy nhiên nhũng công trình nghiên cứu đã công bố còn rất ít và
việc sán xuất bá chuột sinh học mới đang ở giai đoan thử nghiệm.
Từ những năm 1993 trờ lai đcìv, việc nghiên cứu vi sinh vât diệt chuột
đ a n ơ đươc tiên hành ờ mỏt số đơn vị như: Viện Bảo vệ thực vật, Viện Khoa
học kỹ thuật nông nghiệp, nhằm muc đích tạo ra được loại bả chuột sinh học
vừa có hiệu quà diệt chuột cao vừa tránh gfty ô nhiễm môi trường.
9
PHẦN 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Nguyên liệu
3.1.1. Chủng vi khuân
Chủng Sơlmonellơ enteriditis Isatchenko nhận được từ Bảo tàng giống
chuẩn của Trung tâm Nghiên cứu vi sinh vật học ứng dụng, ĐHKHTN.
3.1.2. Iỉoá chất
Pepton Trung Quốc
Đỏ phenol Trung Quốc
H2S04 Trung Quốc
3.1.3. Máy móc, dụnẹ cu
Sử dung máy móc, dung cu có tại Trung tâm nghiên cứu vi sinh vât học
ứng dung ĐHKHTN, ĐHQGHN.
Tưàm Osi-Pháp
Máv lắc òn nhiệt Osi Pháp
Tú cấy vô trùng Osi Pháp
Các dung cu thí nghiệm ống nghiệm, bình tam giác 50, 250 ml, đĩa Pet
ri do Trung Quốc sán xuất.
3.2. Phương pháp

3.2.1. Nuôi cấy và giữ giống Salmnneỉla enterỉditis Isatchenko
3.2.1.1. Mỏi trường 1: giữ giống, (g/ỉ)
Pépton 10
Cao thịt 3
NaCl 1.5
Agar 15
pH=7,0 Khử trùng 1 atm/30 phút
3.2.1.2. Môi trường 2: sản xuất, (g/1)
Giá đỗ 100*
10
Đường kính
pH=7,0
Khử trùng latm/30phút
20
(*) Giá đõ đun sỏi trong 30 phút lọc lấy nước trong
3.2.2. Phưong pháp nuôi cấy
Trong thí nghiệm có đếm khuẩn lạc, dùng pipet vô trùng hút 0,05 ml
huyền dịch vi khuẩn ở độ pha loãng thích hợp cấy gạt trên đĩa thạch chứa môi
trường 3.2.1.1, sau đó để tủ ấm 37°c. Sau 48 giờ quan sát khuẩn lạc.
Cììuán bị gìòng: vi khuẩn được cấy từ ống thach nghiêng vào bình tam
giác chứa mỏi trường 3.2.1.2 đã chọn lọc, nuôi cấy lắc 220 vòng/phút ở nhiệt
độ 37°c trong 24 giờ được giống cấp I. Cấy 1
%
giống cấp I chứa 0.5 X 10* tế
bào/ml vào môi trường lên men tiếp theo.
3.2.3. Phương pháp đếm sỏ ỉưọĩtg tế bào.
Vi khuủn đươc nuồi trên máy lắc ổn nhiệt 220 vòng/phút trong các bình
tamgiác chứa mòi trường 3.2.1.2. pH = 7.0. nhiệt độ 37°c. trong 48 giờ. Dùng
pipet vỏ trùng hút 0.05 huyền dịch vi khuẩn ở độ pha loãng 10 '* - 10"q cày gạt
trên mòi trường 3.2.1.1. Đăt tù ấm, sau 48 giờ lấy ra đếm khuẩn lạc.

3.2.4. Phưoĩtg pháp nhuộm Gram 16]
Gổm các bước:
Nhuộm tiêu bán bằng tím kết tinh (Crystal violet) trong 1 phút
Phủ Lugol trong 1 phút
Rứa nước
Tẩy cồn
Rửa nước
Nhuộm bổ sung bằng Saữanin hoặc Fuchsin Ziehl trong 1 phút.
Rửa nước
Làm khô, soi kính với vật kính dầu. Kết quả vi khuẩn Giam (4-) bắt màu
lam tím, vi khuẩn Giam (-) bắt màu dỏ hồng
3.2.5. Xac đinh anh hương cua điêu kiên nuôi cấy tới khả năng sinh trưỏTig
của vi khuân Isatclienko
3.2.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt đô.
Chủng vi khuán nghiên cứu được cấy vào bình tam giác chứa lOOml
môi trường 3.2.1.2. nuôi cấy trên máy lắc ổn nhiệt với các nhiệt độ: 20; 32;
37; 45; 50°c, pH = 7,0. Sau 48 giờ nuôi cấy đếm số lượng tê bào.
Từ kết quả thu được vẽ hình.
3.2.5.2. Ảnh liưởrtg của pH ban đẩu
Vi khuân nghiên cứu được cấy vào các bình tam giác chứa lOOml môi
trường 3.2.1.2. có điều chinh các độ pH ban đáu: 3.0; 5,5: 7,0; 8.0: 9.0.
Nuôi trên máy lắc ổn nhiệt 220 vòng/phút để tử ấm ờ nhiệt độ 37°c
trong 48 giờ. Sau dó đếm số lượng tế bào.
Từ kêt quá thu được vẽ đồ thi biểu diễn sư ảnh hưởng của pH ban đầu
lèn sinh tnrớna và phát triển cua vi khuân.
3.3. Phương pháp lẽn men bán vò trùng.
Vi khuẩn nghiên cứu dược cấy vào các bình tam giác chứa 100 ml môi
trường 3.2.1.2 nuôi 24 giờ. ờ 37nc. thu được giống cấp 1. lên men 72 giờ
trong bình dung tích 20 lít chứa môi trường 3.2.1.2. Không khí đưa vào qua
dung dịch CuSOị (I %) để khư trùng.

Dịch giỏng được cấy vào theo tý lệ 3 - 4% (thể tích của vi khuẩn giống
được cấy vào so với thể tích của môi trường trong chuông).
3.4. Thử hiệu lực của bả chuột vi sính vật.
Chiínơ tôi tiến hành thử hiệu lực của bả chuột vi sinh trên đối tượng
chuột đồng, chuột nhà và chuột nhắt trắng. Liêu lượng thư từ I - 5 gam/con
Quan sát các triệu chứng bệnh của chuột theo thời gian từng ngày cho đên khi
chuột chết.
12
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kiêm tra lại các đặc điểm hình thái, nuôi cấy và sinh lý, sinh hoá của
chủng Salmonella enteridiíỉs Isatchenko H10
Việc đưa một chùng vi khuẩn diệt chuột vào môi trường là một việc làm
cần phải hết sức thân trọng. Bởi vì nếu không đúng là Salmonella enteriditis
Isatchenko như đã thông báo thì có thể gây hâu quả khôn lường cho sức khoẻ
nhân dân và động vât nuôi. Do vậy chúng tôi phải xác định các đặc điểm sinh
học và đăc điểm phủn loại của chủng nghiên cứu để khẳng định tính an toàn
cúa chúng đã dùng.
4.1.1. Đăc diêm hình thái vá nuòi cấy
Chùn
2
vi khuẩn Salmoneììa enteriditis Isatchenko (lươc gọi tắt là H10
nhàn từ Báo ràng siống chuắn thuộc Trung tâm Vi sinh ứng dunơ - ĐHKHTN.
- Khi nuỏi cấy trcn mòi trường 3.2.1.1, khuẩn lac lồi, màu trắng xám,
trong, mật hóng, bờ dều.
- Tẽ hào ovan sần tròn, khòng tao bào tử. có tiêm mao do dó có khá
nâng di động.
- Khòng bất màu Gram
- Khi nuôi trong môi trường dịch thể không tao màng, tao căn
- Là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc.
4.1.2. Các đăc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng ỉsatchenko H10

Để xác định khá năng đồng hoá đường, chủng Isatchenko H I0 được cấy
vào ốnơ thạch nghiêng môi trường cơ bản chứa 0,5% một trong các loai đường
sau: mannitol, maltoza, saccaroza. ramnora, arabinoza, dextrin, adonit. lactoza
và glucoza.
c
13
Trong các đặc điểm sinh hoá, chúng tôi xác định: khả năng sinh H,s.
khá năng sinh ureaza, catalaza, oxydaza, khả năng sinh indol, đồng hóa xitrat.
phán ứng đỏ metyl, phản ứng Vorges Proskauer (VPỵ khá năng phan giải
xanh metylen.
Kốt quả ghi ờ bảng I cho thấy chủng Isatchenko H10 có khá năng đổng
hóa glucoza, mannitol, maltoza và dextrin. Không có khá nâng đồng hóa các
đường còn lai.
Chủng Isatchenko H10 có khả năng sinh H?s. nxydaza. đồng hóa xitrat,
phan ứng đó metvl dương tính và phăn giải xanh metylen. Không có khá năng
sinh urerư.íT. indol và phàn ứng vp flm tính.
13
Bảng 1. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của S.enterìditis Isatchenko H10.
Đặc cliổm
Ký hiệu chùng Isatchenko H10
Khả năng đồng hóa hydratcacbon
Gluco7.a
+
Mannit
+
Mant07.a
+
Saccarcv.a
Ramnoza
Arnbimva

Dextrin
+
Ađonit
.
Lalo/11
Đăc (liêm sinh lioá
KIkì 11 ã ne sinh H ,s
+
Kha nãnti sinh Urea/a
_
Phán ứníi Catnla/a
+
Khá nàng sinh oxytla/a
+
Khá nãnc sinh indol
-
Khả năng đổng hon xitrnt
+
Phàn i'mc do metyl (MR)
+
Phán ihie VoiíH-s ProskaikT
-
Pliủn uiài xanh mctvlcn
+
Chú thích: Dấu (-) không ró phản túĩg
D(íu { + )( (> phản tbiỊ>
Các dặc điểm tiên phù hợp với các dăc điểm dã còng bố về Saìmonelìn
entei uiitis var. ĩsatchenko.
4.2. Anh hư<mg một sô điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng và phát triển
cúa chúng Isntchenko H10

4.2.1. Anh hỉ tòng cùa pH ban dấu
pH là một trong nhimg yếu tô mỗi tnrờng có ảnh hưởng quan trọng đên
sinh tiương và phát triên cua vi khuẩn. Chúng tòi sừ dung mòi trườn ơ 3.2.1.2
có điền chính pH ban đầu khác nhau: 3,0 - 9,0, nhiệt độ nuôi cấy 37°c trên
máy lắc ổn nhiệt 220 vòng/phút.
Đêm sò lượng tê hào khi kết thúc kết thúc nuôi cấy.
Kẻt quá thưc nghiêm đươc trình hày n háng 2 và hình I.
nánỊỊ 2. Anh hirong cún plỉ l)i>n (lầu tới khả nĩíriỊ> sinh trương chủng
Isatchenko H 10
pH han dâu
Số lượng tê bào (
10 '/ml)
3.0
0.8
5.5
16.6
7,0
26.4
8.0
3.8
0.0
0.6
Kèt quá ờ báng 2 cho thấy với pH mỏi trường quá axit (pH = 3.0) hoác
quá kiềm (pH = 9.0) chung Isatchenko H10 sinh trưởng kém.
Ó pH từ 5,5 - 8,0 chung Isntchenko HI í) đểu sinh trường tốt. Đác hiệt ờ
pH = 7.0 vi khuân phát triển tôt nhât, dạt 26.4 ' lo ’ tê hào/ml. Tuy nhièn nhìn
chun^ (lều có khà năng sinh trường ờ phạm vi pH rộng tu 5.5 ctên 8.ọ.
16
Hình 1. Ảnh hưởng của pH ban đầu tới sinh trưởng của
chủng Isatchenko H10

3 5.5 7 8 9
pH bnn đáu
4.2.2. Ảnh hư(mg ciiíi nhiệt (lô
Cùng víVi thành phán dinh dưỡng, pH môi-trường nhiệt dỏ là vôu tổ ánh
hương lơn tới tỏc dò sinh tnrớna cua chung [satchenko HI n. Chung
[satchenko HIO dươc nuòi trên mòi tnrờng dich thế 3.2.1.2. có pH = 7.0 nuôi
trẽn máy lác 220 vòng/phút, ổn nhiệt với nhiệt độ khác nhau: 20; 28: 37: 45:
50°c. Sau 48 giờ tiên hành dêm số lượng tế bào.
Kẻt quà thưc nghiệm được trình bàv ờ bảng 3 và hình 2
Ọua bàng 3 cho thấy, ờ nhữns nhiệt độ khác nhau, số lượng vi khuẩn tao
thành là khác nhau. Chúng tôi nhàn thấy ờ nhiệt đô 50"c chung Isatchenko
H10 hoàn toàn không sinh trưởng được.
Kết quá còn cho thấy nhiệt độ tối ưu cho sư sinh trưởng cua chung
Isatchenko Hin là 37°c. Tuy nhiên phạm vi nhiệt độ thích hợp (28 - 45 C) cho
sư sinh trườnơ cua chung; ỉsatchenko H10.
Chúng tỏi chọn nhiệt độ 37°c ỉà nhiệt độ nuôi cấy chung ísntchenko
H10 trong nhĩmg thí nghiệm tiếp theo.
17
Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng của vi khuẩn
Isatchenko H10.
Nhiệt độ (°C)
Số lượng tế bào (x 109/ml)
20
0,6
28
10,4
37
30,2
40
13,0

45
8.0
50
0
Hình 2. Ánh lnnrnq cua nhiệt (lô tới sư sinh trướng cua
cluìnq Isatchenko H10
□ H10
Nhiệt độ ( C)
4.4. Ảnh hư<mg của nồng (tộ (lường và nước chièt giá (tó lên khá nang sinh
trướng cùa chúng Isatchenko H10.
'Ị -< ! * KT *
/C C 059
18
Mục đích của chúng tôi là tìm ra một môi trường có nồng độ đường và
nước chiết giá đỗ thích hợp cho sư sinh trưởng của chủng vi khuẩn H10.
Xac đinh số lượng tế bào tạo thành sau 48 giờ nuôi ở môi trường 3.2.1.2
trên máy lắc ổn nhiệt 220 vòng /phút, pH = 7,0, nhiệt độ 37°c.
Kết quả được trình bày ở bảng 4 và hình 3a, 3b.
Bảng 4. Anh hưởng của nổng độ đường và nước chiết giá đỗ lên khả
năng sinh trưởng của chủng Isatchenko H10
Số lượng tế bào (x 109/ml)
Đirờng(g/I) X.
50
100
150
200
5
4,8
26,2
26,4

28,2
10 7.4
28,0 28.8 28,0
20 9.2
28.6
29,0
28.4
30
5.0
22 9
22,0 0.9
Ghi chú: ** = Hàm lượng giá đỗ (g/1)
Kêt quà cho thấy giá đỏ là nguồn bổ sung vitamin và nitơ hữu cơ và
nguyên tô khoáng duy nhât đóng vai trò quan trọng trong thành phần môi
trường đơn giản, có ánh hưởng lớn tới khả năng phát triên của chung VI khuân,
Trong bàng 5 chúng tôi có thể thấy rõ ảnh hưởng của nồng độ đường và
siá đỗ qua việc phản tách các môi trường trong bảng .
Tronơ mòi trường khôns có giá đổ, ở tất cả các nồng độ đường thay
dổi từ 0 - 30 g/1 chủng vi khuẩn H10 hoàn toàn không sinh trường đươc.
Khi môi trường hoàn toàn không có đường, nhưng có giá đô từ 50 - 200g/l VI
khuắn H10 vẫn sinh trưởng được.
19
Kêt quả ờ bảng 5 cho thấy ở nồng độ đường 20 g/1 và gia đỗ 100g/l
chùng vi khuẩn H10 đat số lương 28.6 X 109 tếbào/ml.
Do vây chúng tôi dùng môi trường này cho những nghiên cứu tiếp
theo.
Hình 3a. Anh hưởng của hàm lượng giá đỗ ỉên sự sinh
trưởng của chủng Isatchenko H10
25-1
Hàm ! ượna aiá dỗ (g/l)

Hình 3h. Ảnh hương của nồng độ (lường và giá đỏ lên
khá năng sinh trưởng cùa chùng Isatchenko H10
0 0
B50
□ 100
□ 150
B 200
Nồng độ đường(g/l)
20
4.3. Nghien cưu động thái sinh trưởng của chủng Isatchenko H10 trong
điều kiện nuôi cấy sục khí đơn giản.
Tiong thí nghiệm này chúng tôi nuôi cấy theo phương pháp sục khí đơn
gian trong chuông thuy tinh. Môi trường được đun sôi để nguội, cho vào
chuông thu ỷ tinh 15-20 lít môi trường 3.2.1.2. Tỷ lệ giống được cấy là 2 -
3% chứa 0,5 X 10 tê bào/ml. Nuôi ở pH = 7,0, nhiệt độ 37°c, không khí được
thôi liên tục qua dung dịch CuS04 1%. Vòng dây dẫn khí bằng nhựa được đục
lô rất nhỏ và cách đều nhẳm tạo cho vi khuẩn tiếp xúc với không khí. Sau đó
kiểm tra sô lượng tê bào trong lml dịch nuôi từ 8 giờ đến 72 giờ (thời điểm
kêt thúc). Kêt quà được trình bày ờ báng 5 và hình 4
Bảng 5. Động thái sinh trưởng của chủng Isatchenko H10 khi nuôi sục
khí.
Thời gian (giờ)
Sô lượng tê bào (x loVml)
8
3.0
16
5,0
24
9,0
32

23.0
40
27,2
48
27,8
56
27.0
64
26.8
72
25.0
21
Kết quả ở bảng 5 cho thấy số lượng tế bào tăng dần theo thời gian và
đạt tới mức cao nhất sau 48 giờ nuôi (27,8 X 109/ml) sau đó giảm dần.
Kêt qua này cho thây chỉ băng biện pháp nuôi cấy đơn giản cũng có thể
đạt được số lượng vi khuẩn đáp ứng trong sản xuất bà diệt chuột ở các vùng
nông thôn.
Hình 4. Động thái sinh trưởng của chủng
Thời gian nuôi cây (giờ)
4.4. Nghiên cứu quy trình đơn giản sản xuất bả chuột sinh học
Muc tiêu cùa chúng tôi là tìm ra giải pháp thích hợp để sàn xuất gói
thuốc há chuổt sinh hoc đơn giàn, với giá thành rẻ, để phục vu cho sàn xuất
tại chỏ tai các vùng nồng thôn xa (hành phố nhưng vẫn đảm bảo được chất
lượng sán phắm.
Xuất phát rừ thuận lợi là những chủng vi khuẩn H10 có khả nâng sinh
trường trên nhiều nguổn nguyên liệu tư nhiên nên chúng tôi sử dung thóc làm
nguồn cơ chất chính. Thóc được hổ sung môi trường 3.2.1.2 theo tỷ lệ 1:1, khừ
trùng ớ 121 °C/45 phút. Sau đó đổ ra châu sạch, cấy giông vi khuẩn theo ty lê
3 - 4% (thể tích cùa dịch giông vi khuẩn so với khối lượng thóc). Đung vào túi
polvetylen. Sau 48 giờ nuôi cấy ờ nhiệt độ 37fc, pH =7.0. Kiểm tra so lương

vi khuẩn trên môi trường thạch 3.2.1.1.