Nghiên cứu chiết tách, tính chất và biến tính polysaccharid (carrageenan) từ rong biển làm phụ gia chế biến, bảo quản thực phẩm

ĐẠI H Ọ C QU ỐC GIA H À NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
Hí**-Ỷ Ạ**** í):*********
BÁO CÁO TờiNG KÉT ĐỀ TÀ I
N G H IÊN CỬ U C H IÉ T T Á C H , T ÍN H C H Ấ T V À B IÉ N T ÍN H
P O L Y S A C C H A R ID (C A R R A G E E N A N ) TỪ R O N G B IẼ N LÀ M
PHỤ G IA C H É BIÉN, BẢO Q UẢN T H Ụ C P H Ẩ M
ĐÈ TÀI KHO A HỌC ĐẶC BIỆT CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA
MÃ SÓ: QG-07.08
Chủ trì đề tài: PGS. TS. Vũ Ngọc Ban
Các cán bộ tham gia:
1. GS. TSKH. Trần Đình Toại
2. PGS. TS. Phạm Hồng Hải
3. TS. Nguyễn Xuân Hoàn
4. ThS. Trần Nho Bốn
5. ThS. Nguyễn Thị Kim Dung
6. CN. Nguyễn Văn Lâm
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRUNG TẨM THÒNG TIN THƯ VIÊN
t)Ị /
HÀ NỘI-2009
BÁO CÁO TÓM TẤT
1. Tên đề tài: Nghiên cửu chiết tách, tính chất và biến tính polysacchíiriíl
(carrageenan) từ rong biên làm phụ gia chế biến, bảo quản thực pltâm
2. Chủ trì đề tài: PGS. TS. Vũ Ngọc Ban
3. Các cán bộ tham gia:
1. GS. TSKH. Trần Đình Toại
2. PGS. TS. Phạm Hồng Hai
3. TS. Nguvễn Xuân Hoàn
4. ThS. Trần Nho Bốn
5. ThS. Nguyễn Thị Kim Dung

6. CN. Nsuyễn Văn Lâm
4. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu: Nghiên cứu ứng dụns Carrageenan tách chiết từ rone biển làm chât phụ
gia chế biến và báo quan thực phàm.
Nôi clung: Nghiên cứu độ cứns và các chỉ tiêu vi sinh của giò lụa và bún khi thêm
• D O • c? '
Car. và Car.o với các hàm lượng khác nhau và so sánh với khả năng báo quản thực
phẩm của hàn the (là chất bảo quản không được phép sử dụng).
5. Các kết quả đạt đưọc:
Các kết quả khoa học:
Khảnơ định có thể sứ dụng Car. và đặc biệt là Car.o làm chât phụ sia ché
biến và bảo quản thực phâm (eiò lụa. bún) có hiệu quả để thay thế hàn the.
Các kết quả đào tạo:
+ Sô Thạc sĩ được đào tạo trong khuôn khô đê tài: 02
+ Số cứ nhân hoá học được đào tạo trono khuôn khố đề tài: 01
■ o
6. Tình hình kinh phí và tiên độ của đê tài
Đề tài được thực hiện theo đúng tiến độ đăng kí là 24 tháng
Kinh phí đưọc cấp tổng cộng trong 24 tháng là 60 triệu đồns, đến nay đã nhận được
đầv đủ và đã thanh quyêt toán.
KHOA QUAN LY
CHU TRI ĐẼ TẠI
HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN
f o / \ I ^^->*rrTWICU ĨKUỎNG
SUM M ARY REPORT
1. Title of the subject:
Study on t/ie isoỉation, properties, and mo(ỉification o f polysaccluirides (carrageeium)
from Seawed muking fo r íiiíỉSubstance fur the foo(lProcessing (intl Storage.
Code No: QG-07.08
2. Project leader: Asso. prof. Dr. Vũ Nsọc Ban

3. Participants:
Prof. Dr.Sc. Trần Đình Toại
Asso. prof. Dr. Phạm Hồng Hải
Dr. Nsuyễn Xuân Hoàn
MSc. Trần Nho Bốn
MSc. Nsuyễn Thị Kim Duna
BA. Nguyễn Văn Lâm
4. OBJECTIVE
Studying and Applying Carrageenan vvhich \vas separated from seavved making for aid
substance for the food processina and storage.
5. MAIN CONTENTS
Studying on hardness and microorgranism standards of “Lean pork paste” and "vermicelli''
vvhen added Car. and Car.o with different contents, from that to compare ability storaae of
vvhich vvith borax one. (the illigal storaae)
6. MAJOR RESƯLTS:
Scientinc results:
Aíĩìnning that, using Car. is good, especially Car.o for aid substance for the food processinơ
and storage (“Lean pork paste” and “vermicelli’’) beins hiơher effect than borax one.
Educational results:
Proịect has fmancially supported and educated 01 BA graduates in Chemistry, 02 MA
postgraduates specialized in Physical Chemistry.
7. Expenditure and Schedule
The project has finished on time (24 months)
The budget (60 million VND) has been fully received and completelv used as beinơ listed in
the balance sheet.
PACƯLTY OF CIIEMISTRY
PROJECT LEADER
HANOI ƯNIVERSITY OF SCIENCE
4
Danh muc các kí hiêu viết tắt

• •
Car.o Carrageenan oligosaccharide
Car.O(I) Carrageenan oligosaccharide thu được khi thủy phân Carrageenan
trong môi trường axit loãng với độ pH ban đâu = 3,5 - 4,0.
Car.O(íỉ) Carrageenan oligosaccharide thu được khi thủy phân Carrageenan
trong môi trường axit đặc với độ pH ban đâu = 1,0 - 1,5.
5
MỤC LỤC
Trang
MỎ ĐẦU 8
CHƯƠNG I. TỎNG QUAN 9
1.1. Tình hình nơhiên cứu và sản xuất Carraseenan trong nước và trên thế giới 9
1.2. Khái quát về Carrageenan 10
1.2.1. Cấu trúc của Carrageenan 10
1.2.2. Tính chất hóa lý 11
1.2.2.1. Độ tan 11
1.2.2.2. Độ nhót 11
1.2.2.3. Tươne tác °iữa Caưaseenan với protein 12
1.2.2.4. Tương tác hiệp lực của Carrageenan với các polysaccharide khác 12
1.2.2.5. Khả năng tạo sel 13
1.2.3. ứng dụns của Carrageenan 14
1.2.3.1. ƯI12 dụng trong côns nơhiệp thực phâm 15
1.2.3.2. ứ ns dụna tronẹ các lĩnh vực khác 15
1.2.4. Chiết tách Carrageenan 16
1.2.5. Carrageenan olvgosaccharide 17
1.2.6. Hoạt tính sinh học của Carrageenan và Carrageenan oligosacchariđe 18
CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 19
2.1. Nguyên liệu 19
2.1.1. Các chất chê biến và bảo quản thực phâm 19
2.1.2. Nguyên liệu và cách làm bún 20

2.1.3. Quy trình làm giò 21
2.2. Phương pháp nghiên cứu 21
2.2.1. Xác định độ cứng của tinh bột làm bún và của
2
ÌÒ lụa 21
2.2.2. Xác định các chí tiêu vi sinh 22
2.2.2.1. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí 22
2.2.2.2. Xác định tổng nấm men và nấm mốc 23
2.2.23. Xác định tổng Coliforms 23
2.2.3. Xác định hoạt tính khána vi sinh vật kiểm định 24
2.2.4. Phương pháp xác định khối lưọne phân tử polymer 25
6
2.2.5. Phương pháp phổ xác lập cấu trúc của polymer 26
2.2.5.1. Phương pháp ESI - MS 26
2.2.5.2. Phương pháp phố cộng hưởng từ hạt nhân 26
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu 26
CHƯƠNG III. KÉT QUẢ TH Ụ C NGHIỆM VÀ THẢO LUẶN 28
3.1. Nghiên cứu sử dụns Carrageenan làm phụ gia chế biến và bảo quản tinh bột
làm bún 28
3.1.1. Xác định khối lượng phân tử Carraơeenan 28
3.1.2. Xác định độ cứng của bánh tinh bột dùng để làm bún 29
3.1.3 Xác định chỉ tiêu vi sinh của bún 31
3.2. Nghiên cứu sử dụng Carrageenan olisosaccharide làm phụ gia chê biên và
bảo quản tinh bột làm bún 31
3.2.1. Thúy phân Carrageenan 31
3.2.2. Xác định khối lượng phán tử trung bình cúa Car.o (I) và Car.O(ỈI) 35
3.2.3. Kháo sát cấu trúc của sản phẩm thủy phân bằng phương pháp phổ 37
3.2.3.1. Phổ khối lượng 37
3.2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 42
3.2.4. Xác định độ cứns của bánh tinh bột với chất phụ gia là Car.o (I) và Car.o (II) 42

3.2.5. Hoạt tính sinh học 47
3.2.5.1. Các chỉ tiêu vi sinh vật 47
3.2.5.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 49
3.3. Nơhiên cứu sử dụns Carraơeenan và Carraseenan oligosaccharide làm chất
phụ gia, chế biến bảo quản giò 50
KÉT LUẬN 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 53
PHỤ LỤC 57
7
M Ở ĐẦU
Vùng biến nước ta có một nguôn tài nguyên rất phong phú và giàu có, đó là
các loài rong biển. Trong thành phần của rong biến có các polysaccharide tự nhiên,
có cấu trúc mạng lưới, có độ bền cơ học và độ nhớt cao, kết hợp với một số tính
chất đặc biệt như lchả năng tạo gel ở nồng độ thấp, rất dễ tạo màng nên được ứng
dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phâm, y tê, mỹ
phấm, dược phẩm trong đó việc sư cỈỊino tronu công nghiệp thực phâm chiêm một
vai trò đáng kê.
Một trong số các polvsaccharide có vị trí quan trọng hàns đâu trons chê biên
và báo quản lương thực, thực phâm đó là Carrageenan, vì bên cạnh những tính chât
ưu việt kế trên Carrageenan còn có tính kháng khuân, chông virut rât mạnh. Một tính
chất đặc biệt nữa của Carrageenan là khả năng tương tác của nó với protein và với
các polysaccharid khác như tinh bột. D o vậy, đã từ lâu nó được ứng dụng rộng rãi
trong công nghiệp chế biến sữa, thịt, trong sản xuât bánh kẹo, kem, phomat, bia,
rượu, trong chế biên thuỷ sản v.v
Trong đề tài này, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu sử dụng Carrageenan và
dạng có mạch phân tử ngăn của nó là Carrageenan olygosaccharide làm chất phụ gia
chế biến và bảo quản thực phẩm từ tinh bột, cụ thê là bảo quản bún và bảo quản giò
thay cho hàn the là chât bảo quản không được phép sử dụng. Mong muôn của chúng
tôi là giải quyêt được một nhu cầu cấp thiết hiện nay ở nước ta là tìm ra những chất
phụ gia chế biến, bảo quản thực phẩm đạt tiêu chuẩn và đảm bảo an toàn cho sức

khoẻ của con người.
8
CHƯƠNG I
TỐNG QUAN
1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất Carrageenan trên thế giói và ỏ nuóe ta.
Carraaeenan bất đâu được sử dụna hơn 600 năm trước đây. được chiết xuất từ rêu
ỉris h moss (Loài rong đỏ Ch ondnis crispu s) tại một ngôi làng trên bờ biên phía Nam Ireland
mang tên Carraghen. Vào nhữnơ năm 1930, quá trình tách chiết Carrageenan nguyên chât từ
rong biến đã được tiến hành ở MỸ. Sau chiên tranh thẻ giới lần thứ hai. do sự phát triên cua
ngành côna; nghiệp thực phàm, nhu câu vê Carrageenan trên thẻ giới đã băt đâu tăns lên.
Ngàv nay neười ta đã biết thêm nhiều loại rons biển có kha năng; san xuất
Carrageenan. Những nghiên cứu chi tiêt vê các loài rons này đã cho phép naười ta có thê
trồns chủns trên quy mô lớn và do đó đáp ứng được nhu câu nauvên liệu cho ngành côns
ìmhiệp sán xuât Carra°eenan.
Theo thốnơ kê, khoáng hơn 80% san lượng Carrageenan được sản xuất từ các côns,
tv của các quốc uia: Mỹ. Đức. Đan Mạch, Tây Ban Nha. Hiện nay côns nahiệp san xuất
Carraseenan không chi phát triển mạnh ở các nước Mỹ và Tây Âu mà còn đang phát triển
mạnh ở các quốc gia Châu A. Trong đó phải kế đên Tru ne Quỏc, Nhật Ban. Phillipin.
Indonesia
Hình 1. Hình ảnh một sô loài rong là nguyên liệu
san xuất Carrageenan.
Theo nơhiên cứu, Việt Nam có rất nhiều loài ronơ có hàm lượng Carraaeenan cao.
Đó là các loài như ronơ Hồng Vân Eitcheum a geỉetinae, rong Sụn Kappaphycus alvareii.
ronơ Cạo, rons; Đôns H ypnea [3].
Trorm những năm gân đây, đã có một sô côns trình, đẻ tài nghiên cứu về
Carrageenan từ rong Hông Vàn. Carrageenan nà\ được xác lập là K- Carraseenan. Sau khi
thu được những kết quả kha quan về nghiên cứu Carra°eenan. các nhà khoa học đã bưức
9
đầu nghiên cứu quy trình sản xuất và ứng dụng của Carrageenan ơ quy mô công nghiệp [2].
Khí hậu của nước ta rất thích hợp cho việc phát triến cây rons sụn nuuôn nouyên liệu chính

đế sàn xuất Carrageenan, nên chúns ta có điêu kiện thuận lợi lớn đê trons, tươna lai tiên
hành mờ nhà máy sán xuất Carrageenan. Còn hiện nay, các nhu câu sứ đụng, polvsaccharide
này'cho một số ngành sản xuất tiêu dùng vẫn còn phái nhập khau từ nước neoài.
1.2. Khái quát về Carrageenan.
1.2.1. Cấu trúc của Carrageenan [11,30,32].
Carrageenan là một polysaccharide của galactose RỌĨ là galactan. Đơn vị câu trúc của
Carrageenan là một disaccharide, được cấu tạo bỏ'i hai hợp phần. Đon vị hợp phần thứ nhất
có thể là vòna a (l-3)-D-galactose (đơn vị G), vòng Ị3(l-4)-D-salactose (đơn vị D) hoặc
vòniỉ j3(l-4)-3,6-anhydro-D-galactose (dơn vị DA) xen kẽ luân phiên nhau bãns, các liên kết
a( 1-3) và (3( 1-4). Đo'n vị cấu trúc cửa Carrageenan đưọc trình bày trên hình 2,3.
Carrageenan là một ealactan sulfat. Nsoài mạch polvsaccharide chính còn có thê có
các nhóm sulĩat được găn vào Carrageenan ở những vị trí và sỏ lượns khác nhau. Mỗi
galactan sulíầt là một dạna riêns của Carrageenan và có ký hiệu riêno. Ví dụ: X - . K I
V - carraseenan [9 ,16].
Theo “Đơn vị cấu trúc” có thế chia Carrageenan thành 2 nhóm :
- Nhóm không có liên kết 3,6 -anhydro-D-Galactose có đơn vị cấu trúc (G, D) như Ịi-
Carrageenan (Hình 2).
- Nhóm có liên kết 3,6-anhydro-D-Galactose có đơn vị câu trúc (G. DA) như K-
Carrageenan (Hình 3).
CHiŨH
CHịOỈOị-
r
CH,0H CH,
H ìn li 2: Đơn vị cấu trúc của
Ị.I- Carraseenan (G.D)
K- Carrageenan (G. DA)
Trono quá trình chiết tách, do tác độna của môi trường kiềm các Carrageenan có đơn
vị cấu trúc (G, D) dễ chuyển thành các Carrageenan có đon vị cấu trúc (G, DA). Các
11
-, V

X- Carraseenan dễ chuyến hóa thành K-, I, 0- Carrageenan tươna ứna. Các Carraseenan có
mức độ sultầt hóa khác nhau, thí dụ K- Carrageenan (25% SLiltầt). I- Carraaeenan (32%
sulíầt). h~ Carraseenan (35% sultat) [9]. Các sán phàm nay đã được thương mại hóa. chiếm
vị trí quan trọna trona thị trườne polysaccharide.
01' ~ 0 -
mu
koppa
0-
CH;CH CM.0S0,- CH.OH
■0, SO j í } i— —— 0 “0,sọ ỵ
kon >• /2 ÌL * . ‘Vi _ y ' K ::;c N
x"" L. _ f ' r
Cm .‘OI 1 Cl
Ị-CSO,
‘O r —
1 / °.f 0 . Ị.

0 ,
\
/
n Í3Ũ% - H
0 1 73*1 - RO,-
os;
nu oso,- lota nso,.
CH (>• CII
HOyj ' 0 o X
__
c,
■ỵ /
■ỌỈL iv, . /

r
i
30% - H
lambda theta
c su
//?//// Sự chuyên hóa của Carraeeenan.
Phần lớn các Carraeeenan có khối lượna phcìn tử từ 500 - 1000 kDa, troníỉ đó chúng
có thể chứa tới 25% thành phàn với khối lượng phân tử nhỏ dưới 100 kDa.
1.2.2. Tính chất líóa lý [11].
1.2.2.1. Độ tan.
Carrageenan tan trons nước, độ tan của nó phụ thuộc vào dạns câu trúc của
Carraseenan, nhiệt độ. pH, nồng độ của ion và các chất tan khác.
Nhóm Carrageenan có câu nôi 3,6-anhydro khônơ ưa nước, do đó các Carrageenan
này không tan trong nước. Nhóm Carrageenan khôns có cầu nối thì dễ tan hơn. Thí dụ như
X-Carrageenan khônơ có cầu nôi 3,6-anhydro và có thêm 3 nhóm sulíầt ưa nước nên nó tan
trons nước ớ điều kiện bất kỳ.
1.2.2.2. Độ nhớt.
Độ nhót của các dung dịch Carraaeenan phụ thuộc vào nhiệt độ. dạna câu trúc của
Carraoeenan, khối lượng phân tử và sự hiện diện của các ion khác trons duna dịch. Khi
nhiệt độ và lực ion cua dung địch tăng thì độ nhót của dunơ dịch siảm. Các Caưaseenan tạo
thành dung dịch có độ nhót từ 25 - 500 Mpa, riêng K-Carrageenan có thê tạo dun° dịch có
độ nhớt tới 2000 Mpa.
ỉ .2.2.3. Tương tác giữa Carrageenan vớiprotein [15.34,38].
Tương tác siừa Carraseenan với protein là một trons nhữnơ tính chât quan trọng của
Carrageenan và cũns là đặc trưng cho tất cả các chất tạo sel cũna như các chất khôna tao
eel. Sự cân bàng của tươns tác giũa Carrageenan-Carraseenan và Carraeeenan-protein xác
định lực của sel. Nếu tương tác aiiìa Carraseenan-protein Ễiiám thì lực sel mạnh hơn [38].
Phản ửns giữa Carrageenan và protein xảy ra nhờ các cation có mặt trong các nhóm
protein tích điện tác dụng với nhóm sulfat mang điện âm cua Carraaeenan và cỏ tính quyết
định đến độ bồn cơ học của sel. Vi cấu trúc của Carrageenan và protein dược quan sát băna

kính hiển vi điện tử quét [13].
Trons công nghiệp sữa, nhờ vào tính chât liên kết với các protein trone sữa mà
Carrageenan dược sử dụng (với nồng độ 0.015 - 0,025 %) làm tác nhân đê n°ăn chặn sự
tách lỏng và làm ổn định các hạt coca trong sữa sôcôla. Protein có mặt trong sữa bao gồm
hai dạna chính: Casein chiêm 80% và các dạne hòa tan 20%. Khá năng hiệp lực liên quan
đến tương tác của các Carrageenan tích điện âm với amino axit tích điện dương tại bề mặt
mixell của casein, ví dụ như giữa K- Carrageenan và K- casein (Hình 5).
H ìn h 5: Tương tác tĩnh điện giữa các nhóm
sulphat của Carrageenan và casein [23].
Trons dung dịch sữa loãng, K- Carrageenan tạo phức với các mixell casein gây kết tủa
chỉ khi nó có mật ở dạng xoắn lò xo. Sự tạo gel của hỗn hợp K- Carrageenan và sữa bao gồm
tươna; tác của mixell casein của sữa với một phần của phân tứ Carrageenan.
1.2.2.4. Tương tác hiệp lực của Carrageenan với cácpoỉysaccharide khác [8.11].
Nsoài tương tác với protein, K- Carraseenan còn tươns tác với các polysaccharide
khác, thí dụ như với ơalactomannan gum, đặc biệt với locust bean sum (LBG). Cơ chẻ của
tương tác trên được giá thiêt là xuât hiện các liên kêt cua vùne khuns xưưna cua
salactomanan với tập hợp xoăn kép của K- Carraseenan (hình 6).
12
Việc thêm galactomanan vảo gel K- Carrageenan làm tha}' đòi hình thái và tính chất
cơ học củạ y,el từ cứns. dễ vỡ thành sel đản hỏi. clôniỉ thời làm tăna dán
2
kê cườns dộ ael.
Vai trò của cation cũn? rất quan trọnơ trons sự tươna tác và hiệp lực đê tạo ael cúa hệ K-
Carraeeenan/LBG. Sự tạo
2
el cua hệ này chỉ xuât hiện khi K- Carraaeenan ơ dạna muối K".
còn khi K- Carrageenan ớ dạne muối Na+ và Ca2+ thi hệ khôna có khả năn
2
tạo ael mà các
cation này chì làm tăng độ nhớt.

H ìn h 6: Tưưng tác giữa Carra^eenan và ealactomannan.
Sự tạo gel của hệ K-Carrageenan/LBG tưonạ tự như sự tạo gel của K-Carrageenan
n°uvên chất, nhưn? ở nồns độ khòng nhỏ hơn 0,2M KC1 thì sự hiệp lực của hệ biến mất. Khả
năng hiệp lực của hệ K-Carrageenan/LBG phụ thuộc vào các yếu tố sau: nồn« độ của K-
Carrageenan, LBG. dạng và nồng độ của cation và mức độ thay thê của D-galactose theo dọc
khung xương galactomannan. Tỷ lệ tối ưu của K-Carrageenan/LBG là 4/1 trong đun
2
dịch KC1.
Ngoài ra, Carrageenan cũng có sự tươne tác với gelatin. Tương tác tĩnh điện của hệ I-
Carrageenan - gelatin sẽ dẫn đến sự ổn định của mạng lưới I-Carrageenan. Ngoài các tính chất
nêu trẽn, gel của Carrageenan có tính chất lưu biến khi thay đổi nhiệt độ, tức là có thể thay đổi
cấu hình. Như vậy, nhiệt độ là yếu tố vô cùn? quan trọns trong quá trình tạo gel.
ỉ .2.2.5. Kha năng tạo gel.
Carraơeenan có một tính chât vô cùna, quan trọns là tạo eel ớ nôna độ thâp (nhò hơn
0,5 %). ơ dạng ael các mạch polysaccharide xoăn vòng như lò xo và cũng có thê xoắn với
nhau tạo thành khuns xương khỏne, gian ba chiều vững chắc, bên trons có thê chứa nhiều
phàn tử nước (hay dung môi).
Từ dạng duna dịch chuyên sans dạng sel là do tirơna tác siữa các phân tứ polyme
hòa tan với các phân tứ dung; môi ờ bên tronơ, nhờ tương tác này mà gel tạo thành có độ bên
cơ học cao. Phần xoăn vòna lò xo chính là những mầm tạo
2
el, chúna lỏi kéo các phàn tử
dun° môi vào vùns liên kèt.
13
Sự hình thành gel có thể gây ra bới nhiệt độ thâp hoặc thêm các cation với một nô nu
độ nhất dịnh. Quá trình hình thành gel diễn ra phức tạp. được thực hiện theo hai bước:
- Bước 1. khi hạ nhiệt độ đen một aiứi hạn nào đỏ trong phân tứ Carras,eenan có sụ'
chuyển cấu hình từ dạns, cuộn ngẫu nhiên không có trật tự sang, dạng xoăn có trật tự. Nhiệt
độ của quá trình chuvển đối này phụ thuộc vào dạnơ và cấu trúc các Carraseenan. cũns như
phụ thuộc vào dạng và nồns độ của muôi thêm vào duns dịch Carraaeenan. Do đó. mỗi một

clạne Carraeeenan có một điểm nhiệt độ tạo gel riêng.
- Bu ức 2: gel của các polvme xoăn có thê thực hiện ớ các câp độ xoăn.
Trong trường hợp đâu. sự phân nhánh và kêt hợp lại sẽ xuất hiện câp độ xoan thôns
qua sự hình thành khône đây đủ của xoăn kép. theo hướng đó mỗi chuỗi tham ỵia vào xoán
kép với hơn một chuỗi khác.
Trong trường hợp thứ hai, các phần đã phát triển đầy đủ cúa đa xoan tụ hợp lại tạo
thảnh ơel. Còn dưới các điều kiện khône tạo ơel. ở các nôns độ polvme thâp sự hinh thành
và hợp lại của các xoắn sẽ dẫn đên tăng độ nhớt.
Qua đó, có thế mô tả cơ chế tạo gel như sau: trước hết là xuất hiện sự chuyển đối cấu
hình từ dạng cuộn sang xoăn ỉò xo, tièp sau là sự kèt họp các xoăn và tụ hợp lại có trật tự tạo
thành xoan kép - ael. Như vậy, sel là tập hợp các xoắn có trật tự hay còn ạọi la xoan kép.
CŨCOTÍIOT-'r- c
\ J J ^ ê"' b
í— ' L rim ln n li 'ị Ị ' Lnm L u ili p . H £
7~L

B ! < - M ị ị ị ì
Y tị ] 1 Gin Iiluệt \ (-n "hl“f '1 . , I j i
V l V; 'J
H ìn h 7: Tác dụn2 của nhiệt đối với cơ chế chuyển đôi từ dung dịch sans sel.
1.2.3. ửng (lụng của Carrageenan [7.10,11].
Carrageenan được sử dụng ơ nhiêu dạng khác nhau trons nhiêu sản phâm mà chúne
ta sử dụng hàng nơàv, nhât là trong lĩnh vực thực phẩm và bánh kẹo.
Các sàn phẩm có sử dụns; Carrageenan đã được dùns phổ biến trons nhiều thế kỷ.
Nhiêu nghiên cứu đã chírne minh độ an toàn của Carraơeenan. nó khôns eây độc, khône có
dâu hiệu gày viêm loét trên cơ thê và có thê sứ cỉụno trono thực phàm với một lượng không
2.1
ới hạn.
Tổ chức FDA (F o od and D rn g Adm inỉstratỉon) cua Mỹ đã xếp Carraseenan vào danh
mục các chât an toàn đôi với các sản plìâm thực phâm. Tính phô biên cùa Carraaeenan dược

thế hiện ờ 4 đặc điếm sau:
14
- Tham gia như một chất tạo đông đối với một số sán phâm như: kem. sữa. bư. pho mát.
- Làm bền nhũ tương, giúp cho duns dịch ớ trạng thái nhũ tươna cân băn” vứi nhau
mà không bị tách lớp.
- Có thể thay đổi kết cấu của sản phẩm với tính chất hóa lý, cơ học mona muốn, tạo
ra các sản phẩm đôns đặc có độ bên dai.
- Giúp ổn định các tinh thể trong các sản phẩm bánh, kẹo ngăn chặn đưừna và nước
đá bị kết tinh.
Chính vì vậy, Carrageenan được ứng dụns rộnơ rãi tronu các naành kinh tẻ quôc dân.
sóp phần đa dạng hóa các sản phẩm thực phẩm.
1 . 2 . 3 . 1 . ứ n g c ỉ ụ n % t r o n g c ô n g n g h i ệ p t h ự c p h â m [38.39].
* ứ n g d ụ n g t r o n g c ô n g n g h i ệ p s ữ a .
Carrageenan có khả năng liên kết với protein của sữa, làm cho hạt nhũ tươns sữa -
nước bền vững. Chính vì tính chất này mà Carrageenan không thế thiếu được trons côn
2
nghiệp chế biến sữa. Sữa nóng có chứa Carrageenan được làm lạnh sẽ tạo eel, siữ cho nhũ
tưona của sữa với nước được bên vững, khône bị phân lớp. Tạo
2
el chính là sự tươna tác
giữa các ion sulfat với các đuôi mang điện của các phân tử protein và các cation Ca2*. K~ có
mặt tron? sữa [39].
Mức độ tạo Rel với sữa của các Carrae,eenan cíinơ khác nhau: K-Carraaeenan và I -
Carrageenan khône tan trong sữa lạnh, do đó ael chi được tạo thành trona quá trinh chuyên
biên từ nóng sang lạnh. X - Carrageenan tan trong sữa lạnh, do đó không cân đun nóna vẫn
tạo nhù tương bên với sữa. Chính vi vậy, X - Carraseenan được ứng dụns nhiêu hưn trong;
côna nahệ chế biến sữa, làm bánh kẹo.
* ứ n g d ụ n g t r o n g c á c n g à n h t h ự c p h ả m k h á c .
Carraseenan được ứng dụng trons nhiêu lĩnh vực chê biên thực phâm khác nhau như:
kem, phomat, bánh pudding, si rô, đô uốne lạnh, mút ít đườns và sữa chua.

Các cônơ ty chế biển thịt cũna, sử dụng Carrageenan trong chê biến thịt vi
Carrageenan có khả năng tăng hiệu suât các sàn phâm băns cách giữ nước bèn trons sàn
phàm. Neoài ra, Carraaeenan còn được thêm vào bia hoặc rượu đê tạo phức protein và kết
lăns làm cho sản phàm được trons hơn.
1 . 2 . 3 . 2 . ư n g d ụ n g t r o n g c á c l ĩ n h v ự c k h á c .
* T r o n g m ỹ p h ă m v à t ì u i ô c đ á n h r ă n g .
Do các đặc tính tạo gel và khả năne tạo màng mà Carraeeenan còn có tác dụna để chế
tạo các sản phẩm: kem đánh răng ớ các vùns nhiệt đới. chất dưỡna tóc. nước aội dầu. kem
dưỡng da X - Carraseenan ờ nông độ 0.1 đèn 1% có the được dùns làm chất dườna da.
15
làm sạch cũng như làm sáns da. Trong kem đánh răng, Carrageenan dỏng vai trò như chât
liên kết dể truyền những tính chất lưu biến vào kem đồna thời tạo vẻ đẹp cho mỹ phàm.
* Trong y, dược học.
Carrageenan là chất nhũ hoá trong ngành dược phẩm để sản xuất các loại san phám
như: các loại thuốc dạng nhờn, nhũ tương để thoa lên các vết thương làm vết thươns mau
lành, chống đôn? máu. làm màng bao cho thuốc.
* ứ n g d ụ n g t r o n g k ỹ t h u ậ t .
Carrageenan được sử dụng để ổn định và ngăn chặn sự lắng các hạt màu của sơn
nước và mực, làm ổn định các chất không tan trono huyền phù mài mòn và men
2
ỏm sứ.
Trong côna nshệ khoan RÌêns dâu, Carrageenan được ứng dụna, đè làm tăna, độ nhớt
của dune, dịch khoan.
* Trong chẻ biên thủy sản.
Carrageenan được ứng dụng tạo lớp màng cho sản phám đông lạnh, làm giảm hao hụt
về trọng lượng, tránh sự mất nước của thịt gia cầm khi bảo quản đông. Ne,oài những lĩnh
vực ứng dụng trên, Carraạeenan còn được ứna dụna, tronơ các lĩnh vực khác như nông
nghiệp, công nshiệp.
1.2.4. Chiết tách Carrageenan [11].
Carrageenan được chiết xuất từ nhiêu loài rono khác nhau, với mỗi loài ronơ thi có

các đặc tính khác nhau nên phương pháp chiêt tách Carrageenan từ mỗi loài rong khác nhau
cũne khác nhau. Nhưna, vê neuyên tăc, chiêt tách Carraaeenan bao 2ÌỜ cũn2 2ồm nhữns
bước chính sau:
Lựa chọn và làm sạch nguyên liệu
Khử màu
- Chiết bàng nước (có thể có kiềm hoặc khôn?)
- Cô đặc
- Ket tủa với rượu hoặc với KC1
- Sấy
- Nohiền
Sản phẩm chiết, tách Carraơeenan từ mỗi loài rong khác nhau là khác nhau. Nói
chuno, mỗi loài chi chứa một dạng Carrageenan chủ yếu, có loài chỉ chứa chu yếu K- hoặc I
- hoặc X -Carrageenan. Cũng có loài chứa đạne hồn hợp lai hóa K / I - Carrageenan và
kèm theo một lượn? nhỏ : X - , V - Carraoeenan.
16
Khi nuhiên cứu về Carrageenan người ta cũng chú ý tứi dạng oligome của nó, vì đạniỉ
này có mạch phân tử ngắn nên có khả năng tưưng tác khá cao với protein và các
polvsaccharide.
Oligosaccharide của Carrageenan có thể thu được bàng phương; pháp thuý phãn
Carrageenan bằng axít hoặc bằng enzyme.
Carrageenan rất dễ bị axit và chất oxy hoá bẻ gãy các liên kết. Khi thuý phàn bằng
axít yếu, các liên kết Hlycoside a(l-3) bị phá vỡ, tạo thành các mánh carrabiose. Mánh
carrabiose chính là galactose nên gọi là galactobiose [35,37,41] (Hình 8).
Trong trường hợp thuỷ phàn bằng axít đậm đặc, lực ion lớn. không những liên kết
glycoside a(l-3) bị phá vỡ mà cả liên kết glycoside [3(1-4) cũng bị phá vỡ.
(5(1-4) fj( 1 - 4)
CH,
1.2.5. Carrageenan o/ygosaccharide [ 11.26].
CH ŨH
r— 0

X h )
ĩ
|J ( 1-3)
H
Chi, CH2OH
/Ị-\— 0 0 H H 0 / \ ~ 0 ,
\0 / H /ị L
-o
HÌ—
O.OH
H /
OH
H OH
H OH
H OH
0(1-3)
CH, OH ỹH2
HC/ ^ 0\ r ° n / T o 'ỌH
Kọ H -ỊxO' h
H

Ỵ H H j

1
ù Ai I w
H OH H ÓH
(3(1-4)
H ìn h 8: Thuỷ phân axit: liên kết glvcoside a(l-3) bị phá vỡ tạo thành galactobiose.
Khi thuỷ phân bằng enzyme, liên kết glycoside P(l-4) bị phá vỡ, sản phẩm được tạo
thành là neocarrabiose [37] (Hình 9). Khi thúy phân bằng enzvme, do có tính lựa chọn cao

nèn cần phải lựa chọn các enzyme cho phù hợp.
CH
CH
H O > )
H
o o H
N
H
H 0 / h
o H
o o H
H
o H
H
OH
a(1-3)
H ìn h 9: Neocarrabiose - sản phẩm thuỷ phân Carrageenan bằng enzyme, trong đó các
liên kết glycoside (3(1-4) bị phá vỡ.
17
ĐAI HOC QUỐC GIA HÀ NÔI
TRUNG TÀM THÒNG TIN THƯ VIÊN
d t /
1
Một số loại enzyme dùng dê thúy phân điều chế Car.o như Ằ-ccirrageenase tách tù'
Pseudomonas và một số chủng dưới đáy biên sâu, enzyme k-carrcigeenase từ Cytophagu
M CA-2, hoạt dộna như một endo-enzyme thủy phân liên kêt glvcoside p( 1 -4) giữa 3.6 -
anhydro-D- galactose và D-galactose [26,27].
Việc kiểm tra mức độ cắt mạch của Carraeeenan sau khi thuỷ phàn có thê thực hiện
thôn° qua việc xác định khối lượng phân từ của Carraaeenan. cấu trúc cùa các
oligosaccharide được xác định bàne, cách sử dụng các dữ liệu phổ khối và phố cộng hưởng

từ hạt nhân và phương pháp sắc kí [22,31.40]. Các phươna pháp này sẽ được trình bày cụ
thể hưn ở phần thực nghiệm.
1.2.6. Hoạt tínlì sinh học d ía Carrageenan và Carrageenan oỉigosaccharide [24.25].
Hiện nay, người ta đang chú ý rất nhiểu tới hoạt tính sinh học của Carrageenan cũng
như oligosaccharide của nó [16].
Carrageenan là một chất lành tính, không gây độc. có hoạt tính kháns một sô vi sinh
vật kiểm định, thí dụ đối với p.aeruginosa thuộc nhóm vi khuẩn Gr (-). Điêu này chứng tỏ
Carraueenan có thế được sứ dựní? tron? việc dẫn thuôc cũns như làm chât phụ sia chẻ biên
thực phẩm mà không gây độc.
Carraaeenan từ một sô loài ronơ Đỏ như G igartỉna skottsbergii, Stenogramme
interrupa có tính chất chông khán
2
trợ, hạn chẻ phát triên khôi huyẻt, chông huyêt khôi,
chốne đôns tụ [29], làm hạn chế u xơ, chống xơ vừa động mạch [28], làm giảm nguy cơ
tăns lượng đường trong máu đối với người bị bệnh tiêu đường [2,14].
Carrageenan có tính chất kháng khuẩn và chông nấm. Không những thế nó còn có tác
dụng chông; gây viêm nhiễm [20,23], làm giảm hoạt tính đại thực bào, chông nhân ban virus
hepatitis [21]. Nó còn có khả năng gây độc tế bào, do đó đang được nghiên cứu trong chông
ung thư [25,26].
Hoạt tính sinh học của polysacchariđe này càng được thê hiện rõ hơn đối với các
oligosaccharide của nó. Nhiêu nghiên cứu cho thâv olie,osaccharide cùa Carrageenan có hoạt
tính chông viêm rât cao [19J, có tác dụne làm giảm viêm nhiễm của hệ ruột [17].
Olisosaccharide của K- Carrageenan thu được từ Kappaphycus striatum có kha năn9, chống
lại ba chune tế bào KB. BGC và Hela là các chuns gây une thư đối với con naười [25].
Trẽn cơ sở nhữns tính chất đã được công bố của Carrageenan cũng như
oligosaccharide của nó, chúnơ tôi hy vong có thể nshiên cứu sử clụns Carraseenan và Car.o
làm chất chế biến và bảo quản thực phàm có hiệu quà, vừa diệt khuẩn, vừa lam tăng chất lư
ợn? thực phẩm.
18
CHƯƠNG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
Carrageenan trong đời sống được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Trong
Khuôn khổ đề tài, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của Carrageenan và các sản phẩm thu
dược sau khi thuỷ phân Carrageenan bằng axit HC1 ở các mỏi trường pH khác nhau (Car.O)
lên đối tượng là tinh bột gạo dùng để làm bím và giò lụa , nhăm đánh giá khả năng sử dụna,
chúng làm chất phụ gia, chế biến và bảo quản tinh bột và bảo quản giò thay thế cho hàn the
và một số chất bảo quàn khác như chitosan.
2.1. Nguyên liệu.
2.1.1. Các chất chế biến và bảo quản thự c phẩm .
Các chất chế biến và bảo quản thực phẩm được sử dụng trong để tài bao gồm:
Carrageenan, Hàn the, Chitosan (PDP).
Carrageenan được dùng trong để tài này lấy từ Phòng enzyme viện Khoa học và Cóng
nghệ Việt Nam, là sản phẩm được sản xuất từ rong Hồng Vân theo quy trình chỉ ra ớ hình 10.
Hàn the hay còn gọi là borax, có gốc hóa học là Natritetraborat. Hàn the là một chất
phụ gia không được phép sử dụng vì gây độc cho cơ thể con người, tan trone nước thành
chất không mùi vị, trong suốt, có tính sát khuẩn nhẹ nhưne rất độc. Các nghiên cứu về y học
cho thấy nếu sử đụng nhiều hàn the sẽ có một số tác hại sau: ở mức độ thấp: sử dụng 3-
5g/ngày: kém ăn, khó chịu toàn thân, ơ mức độ cao: trên 5g/ngày: gây chậm lớn. tổn
thương gan, teo tinh hoàn, giảm cân. Khi vảo cơ thể chỉ đào thải khoảng chừng 80% còn lại
sẽ tích tụ trong người vĩnh viễn, vì vậy nếu sử dụng hàn the ít trong một thòi gian dài cũng
nguy hiểm như dùng nhiều hàn the trong một lần.
Chitosan là dẫn xuât đê axetyl hoá của chitin, là chât không độc, hợp với cơ thê
người, tự tiêu huỷ được, có khả năng ức chế hoạt động của một số loại vi khuân, diệt được
một số loại nấm và có tác dụng tốt trong bảo quản các loại rau qua. các loại thực phẩm tươi
sống, đông lạnh
Các chất phụ gia này được cân với những lượng chính xác, đóng vào các túi nilon
sạch để thêm vào các mẫu tinh bột hoặc mẫu giò nghiên cứu.
19
Hình 10. Sơ đồ quy trình tách chiết Carra^eenan từ rong Hồng Vân.
2.1.2. Nguyên liệu và cách làm bủn.

Quy trình làm bún khá đa dạng, tuy nhiên trong mỗi làng nghể, mỗi gia đình làm bún
thú công đều có cách thức tương tự nhau.
Tronơ quy trình làm bún thì bước chọn nguyên liệu là rất quan trọng. Nguyên liệu để
làm bún phải là gạo tẻ được lựa chọn kĩ càng dể lấy gạo dẻo cơm. ngon. Gạo dược vo. đãi
sạch và được ngâm nước qua đêm. Sau đó đưa gạo đã nsâm vào máy xay nhuyễn cùns vứi
nước đè tạo thành bột sạo dẻo, nhão. Bột lại được ủ và chắt bỏ nước chua troniĩ khoáne 2 - 3
ngày nếu là mùa hè, còn mùa đông thi từ 4 - 5 nsàv. Sau đó được đưa lên bàn ép cho hết
20
nước thành các khối bột. Các quả bột lại tiếp tục được nhào trộn trons nước sạch trons máy
trộn cho dẻo rồi đưa qua màn lọc sạch sạn, bụi tấm để tạo thành tinh bột gạo.
Tinh bột gạo được nhào cho vào khuôn bún. Khuôn bún thường được làm bằng chát
liệu dạng ống dài, phía đẩu khuôn có một tấm kim loại dục các lỗ tròn, cỏna đoạn vát bún
thường được thực hiện bằng tay hoặc dùng cánh tay đòn để nén bột trong khuôn qua các lỏ.
Bột chảy đểu qua các lỗ khi khuôn bị vặn, nén. tạo thành sợi bún, rơi xuống nồi nước sôi đặt
sẵn dưới khuôn. Sợi bún sẽ được luộc trong nồi nước sôi khoảng vài ba phút đến khi nổi lẽn
bề mặt nước thì chín, và được đưa nhanh sang nồi nước sạch, nguội để các sợi bún tơi thành
từng sợi và không bị bết dính vào nhau.
Cuối cùng là công đoạn vớt bún trong nồi nước nguội và tạo hình cho bún theo mục
đích sử dụng sau đó để trên chõng bàn° tre cho ráo nước. Bún thành phẩm được đựng trên
các thúng tre có lót sẵn lá chuối, hong khô và ủ trước khi đem đi bán.
2.1.3. Quy trình làm giò
Trong qui trình làm giò thì bước chọn nsuyên liệu là rất quan trọn". Nguvên liệu để
làm giò phải là thịt lợn loại ngon, còn tươi, khi sờ vào miếng thịt phải có độ dinh.
Khi lợn vừa mổ xona. phải lây thịt đem đi tiến hành làm eiò ngav. Thời gian từ khi
mố xong lợn tới khi làm xong giò phai được thực hiện trong thời gian tối da là 1 giờ. Nếu để
quá lâu thịt sẽ bị cứns lại hay còn ơọi là thịt “chêt” thì eiò làm ra sẽ bị rã rời. không có được
độ dẻo của giò.
Thành phần của nauyên liệu làm ơiò bao gồm: 85 - 90% là thịt nạc và 10-15 % là
mỡ (ví dụ: trons 10 ke thịt đưa vào làm giò, có 8,5 - 9,0 kg thịt nạc + 1.0 - 1.5 k
.2

mỡ).
Thịt sau khi lấy về được rửa sạch, thái tới kích cỡ vừa phải, đưa vào cối xay, xay tói
khi đạt được độ mịn cần thiết. Trong quá trình xay, các eia vị và chất bào quản được đưa với
lượng thích họp. Thời eian xay thường từ 3 - 5 phút. Khi thịt được xay xong, đưa neay vào
khuôn để lên khuôn gói. Mỗi một mẫu giò được làm từ khuôn này có khối lượng là 1 kơ.
Thịt sau khi đã được lên khuôn đưa vào luộc, thời gian luộc là 30 - 40 phút tư khi
nước sôi. Giò sau khi luộc xons được tháo khuôn, để cho ráo nước. Nếu chưa dùns ngay có
thể bảo quán tronơ tủ lạnh.
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.2.1. Xác (ỉịiih độ cứng của tinh bột lùm bún và của giò lụa.
Về nguyên tắc, để xác định độ bền của một vật liệu người ta sử dụng phương pháp
nén, ép hay kéo vật đó theo một chiều nào đó tới khi mẫu bị phá hủy.
Đôi với bún cũns như siò, là một loại thực phẩm rất khó xác định độ dẻo dai. chúna
tôi tiến hành đánh
2
Ĩá chi tiêu này thônỉỉ qua việc xác định độ bền của khối tinh bột clùno để
làm bún hoặc của giò.
21
Chúng tôi coi một mẫu khối tinh bột hay một mâu giò có hình trụ là một vật liệu và từ
dó xác định độ bền nén ép thông qua các thông số lực nén noang và nén dọc. Nén dọc là nén
theo phương của trục đi qua tâm của hai đường tròn đáy. Nén ngans là nén theo phương
vuông ơóc với trục của hình trụ. Độ bên nén ép được xác định tại tổng cục tiêu chuẩn đo
lường chất lượng (Trung tâm kỹ thuật 1) trẽn máy nén ép vạn năng Instron (MỸ) với tốc độ
ép là 15 mm/phút. Việc nén được tiến hành cho tới khi vật liệu bị vỡ thì dừng lại. khi đó lực
nén sụt giám đột ngột và ghi lại giá trị lực nén.
2.2.2. Xác định các chỉ tiêu vi sinh [4,5,6].
Các mẫu bún và mẫu giò, sau khi được cho thêm các chất bao quản với hàm lượng khác
nhau sẽ dược đem đi xác định các chỉ tiêu vi sinh tại tổng cục tiêu chuán đo lường chất lượn?
Việt Nam (Trung tâm kỹ thuật 1). Các chi tiêu vi sinh quan trọng được xác định bao gồm:
2.2.2./. Xác cíịnlì tổng số vi khuẩn hiếu khí [5].

Trong các loại thực phẩm làm từ tinh bột hoặc từ thịt thì chỉ tiêu về tổng sô vi khuẩn
hiếu khí là rất quan trọng.
Nsuvên tắc của phương pháp là sử dụng kỹ thuật đổ đĩa. đếm khuẩn lạc trên môi
trường thạch sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 30 ± l°c trong thời gian từ 48 đến 72 giờ. Số
lượng vi khuẩn hiếu khí trong lg mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nshiệm dược tính tù' số
khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuối cấy theo các đậm độ pha loãnơ.
Đối với mỏi mẫu kiểm nshiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ. mỗi đậm độ cìùne 2
đĩa petri và 1 pipet vô khuẩn riêng. Sau khi được nuôi cấy vào mỏi trường thích hợp các đĩa
petri được đưa vào tủ ủ ấm ở nhiệt độ 30 ± l°c từ 48 đến 72 giờ.
Kết quả được tính như sau:
Chọn những đĩa có từ 15 đèn 300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 đậm độ pha loãns liên tiếp.
+ Nêu chênh lệch các giá trị của 2 đậm độ trên nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, tính số (N)
khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí cho lg sản phẩm băng cách tính trung bình cộng tổng số khuẩn
lạc của các đĩa trên:
x c
N = 7

T
(/?, +0,1/7
2).d
C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn.
nh n2: số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp.
D: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1.
+ Nếu chênh lệch các giá trị ớ 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần. lấy
2
Ìá trị cúa đậm
độ pha loãng thấp hơn để tính kết quả.
??
+ Nếu 2 đĩa của sản phẩm lóng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đáu cổ ít hon
15 khuán lạc, tính kết quá theo trung hình cộng của các khuẩn lạc đốm được ớ ca 2 đĩa tính

ra cho 1 g sản phẩm.
+ Nếu ở tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, đánh giá kết quá như sau: ít ho'n
1 vi khuẩn hiếu khí trong 1 g sản phẩm.
2 . 2 2 . 2 . X ú c đ ị n h t ổ n g n ấ m m e n v à n ấ m m ố c [6] .
- Nguyên tắc:
Để xác định tổng lượng nấm men và nấm mốc có trons tất cả các loại tinh bột và sản
phẩm thịt, ta sử dụng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 20°c đến 25°c trong vòng 5 ngày.
Đầu tiên mẫu được cấy sâu trong các đĩa thạch, sử dụng mòi trường nuôi cấy chọn lọc
chứa tronơ các đĩa petri, với mẫu cấy là một lượng mẫu thử quy định, nếu sản phàm ban đầu
dạng lỏng, hoặc một lượng dung dịch huyền phù ban đáu, nêu sản phẩm ớ dạng khác. Sau đó
ủ các đĩa chứa mẫu cấy trên trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ từ 20°c đến 25"c trono 3
ngày, 4 ngày hoặc 5 nsày. Cuối cùng, tính số lượng nấm men và nấm mốc có trone lg mẫu
từ sô khuẩn lạc thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng cho kết qua có ý nghĩa.
- Xứ lí kết quả: Số lượns vi sinh vật trono lơ sản phẩm (N) được tính theo công thức:
N =
___
ỉ £
___
(/7, + 0,1/7-;
).d
Trong đó:
LC: là tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa giữ lại.
N |: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng đầu tiên.
N2: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai.
D: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại.
2.2.2.3. Xác định tông Coliỷorms [4].
Coliíbrms là một trong các chi tiêu vi sinh vật eây ảnh hưởng lớn đên chất lượn?
lươn? thực, thực phẩm. Coliíorms thuộc họ vi khuẩn đường ruột, sône, trone ruột ne ười và
độn
2

vật máu nóng. Nó sây tiêu chảy, độc tô, xuât huyêt bao từ. nhiễm trùns đườnơ niêu.
• *— • J J 1 • ' * ■ o
viêm màng não ở trẻ em
-Nguyên tắc:
Cờy một lượng quy định mẫu thử dạng huyền phù ban đáu và các dạng pha loãns thập
phân liên tiếp của chúnơ trong một mỏi trường nuôi cấy đã chọn. Sau đó ủ ờ 35°c hoặc 37"c
trong 24 giờ. Đếm số khuẩn lạc đặc trưng trên các đĩa được chọn và biểu thị lượng Coliíorms
tron í 1 g mẫu.
- Tính kết quả
23
+ Nếu các đia chứa trong vòng từ 15 đến 150 khuẩn lạc đặc trưng. Số Coliíbrms trong
lg mẫu được tính theo công thức:
/7, + 0,1/7, xi
Trong đó:
Ic: Tổng các khuẩn lạc đặc trưng đếm được trên tất cả các đĩa.
N,: Số đĩa được giữ lại với độ pha loãng ban đầu.
N:: Số đĩa giữ lại với độ pha loãng thứ hai.
D: Hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng ban đầu.
+ Nếu các đĩa đều ít hơn 15 khuẩn lạc thì tổng số Coliform được tính theo cỏns thức:
X - ^
(nì + 0,1/7, )d
Làm tròn kết quả tới số hàng trăm và biểu thị kết quả dạng (n.lOx).
2.2.3. Xác định hoạt tính klĩáng vi sinh vật kiêm định.
Thứ hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiên hành theo phương pháp khuếch
tán trên thạch, sử dụng khoanh giấy lục đã tẩm chất theo nồng độ tiêu chuẩn. Nồng độ ức
chế tối thiếu (MIC) được tiến hành theo phương pháp Vanden Berrgher và Vlietinck trẽn vi
lượng 96 giếng. Kháng sinh kiểm định bao gồm: Am p ixilin, T etra cyliiì, Am photeriliiì B và
Nystatin.
Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm đại diện các nhóm:
Vi khuẩn Gr (-)

E .coli
p. ơeruginosa
Vi khuẩn G r(+)
B. subtilis
s. aitreits
Nấm mốc
A. niger
F. oxxsporum
Nấm men
c . albicans
s. cerevisiae
Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng: Trycase soya broth
(TSB) cho vi khuẩn. Sabouraud clextrose broth cho nấm. Các chúns kiểm định được hoạt
hoá trước khi tiến hành thử nghiệm môi trường dinh dưỡng dịch thể (24h với vi khuẩn và 48h
với nấm).
24
Các mẫu được hoà tan trong dung dịch DiVISO 100%; 4-10 thang nỏn° độ sẽ đưực
pha loãng ra từ dung dịch gốc rồi nhỏ vào phiến vi lượng. Vi sinh vật kiểm định sau khi hoạt
hoá dược hoà loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho có nồng độ 0,5 đơn vị McLanđ
(khoảng 10x vi sinh vật/ml) ủ trong tủ ấm ở 37° c trons 24 giờ cho vi sinh vật và II trong
30"c với 48 giờ cho nấm.
Quá trình được tiến hành tụi phòng Thử nghiệm hoạt tính sinh học thuộc Viện Hoá
học các hợp chất thiên nhiên. Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.4. Phương pháp xác định khôi lượng phân tử Carrageenan [1].
Như đã nói ở mục 1.2.5 Carrageenan dạnạ mạch phân tử ngan (Car.O) có thể thu
được nhờ thuỷ phân Carrageenan băng axit hoặc enzyme. Việc kiểm tra mức độ cắt mạch
của Carrageenan có thể thực hiện thông qua việc xác định khôi lượng; phán tử cúu
Carrageenan.
Trong bán luận văn này, khối lượng phán tứ của Carra°eenan được xác định bang
phương pháp đo độ nhớt, nhờ sử dụng hệ thức Mark - Houvvink:

[Ti] = K.M“
Trong đó:
K, u: Các hằng sô phụ thuộc vào ban chất của dung mỏi và nhiệt độ.
M: Khối lượng phân tử Carrageenan.
C: Nồns độ Carrageenan trong dung dịch (g/100 ml).
[r|]: Độ nhớt đặc trưng, là giới hạn của độ nhớt rút ơọn (ĩ]r/C) khi nổnơ độ của
dung dịch tiến tới 0.
[ĩll = lim (ĩ]r/C) c_ 0
ơ đây r|r là độ nhớt riêng, tỷ số giữa hiệu số thời gian chảy của dung dịch Carrageenan (t)
và thời gian cháy của duns môi (tn) với thời gian chảy của dung mỏi trons mao quản.
Tlr= (t - t0)/t0
Cụ thể cần pha chế các dung dịch Carraạeenan và Car.o có nông độ khác nhau. Sau
đó xác định thời gian chảy của dune môi và của các dung dịch nàv trong nhớt kế Ubélỏt để
xác định độ nhớt riêng r|r.
Lập đổ thị mối quan hệ giữa T|,/C và nồng độ (C). Bàng phương pháp ngoại suy trên
đồ thị ta thu được giá trị độ nhớt đặc trưng.
Với các giá trị K và a đặc trưng đã biết, ta sẽ xác định được khỏi lượn
2
phân tư trung
bình của Carrageenan và Car.o.
25
Phưưng pháp đo độ nhớt là phương pháp đơn giản về mặt thực nghiệm, đỏne thời cho
phép xác định khôi lượng phân tử trong khoáng lớn (M khoảng 104 đốn 10r’).
2.2.5. Phương pháp phô xác lập cáu trúc của Carrageenan oligosaccliaride [12,30].
Câu trúc của polvsaccharide nói chuna và cua Carraseenan nói riêng được xác lập
bằng 2 phươns pháp:
2.2.5.1. Pìiưưng pháp ESI — MS (Eỉectrosprciv ionisation-mass spectrometrv).
Phô khôi lượng có ý nghĩa quan trọna, trong việc xác định khối lượna, cấu tạo các
họp chất hoá học vì sự quan tâm trước tiên trono phổ khối lượna là siá trị chính xác cua số
khôi phân tứ hay ion.

Cơ sớ của phương pháp phổ khối lượng là sự bắn phá các phân tư họp chất trung, hoà
thành các ion phân tứ mang điện tích dương hoặc phá vỡ thành các mánh ion. các °ổc bàng
các phần tứ mang năns lượng cao.
Sự phá vỡ này phụ thuộc vào cấu tạo của hợp chất, plurơna pháp bắn phá và năna
lượng băn phá. Ion phân tứ và các ion mánh là các phần tử có khối lượng. Nếu 2ỌĨ khối
lượng cua một ion là m và điện tích của nó là e thì tỷ sô z = m/e được gợi là số khỏi.
Trong những năm gần đây, sự phát triển của kỹ thuật ESI đã mớ ra hướng mới trong
nơhiên cứu cấu trúc các polvsacchariđe bằng phương pháp khối phổ. và được sư dụng phô
biến trone lĩnh vực hóa sinh [12]. Phương pháp ESI - MS cho phép xác định khôi lượn
2
,
phàn tử của hợp chất và sự phân mảnh của Carraseenan và Car.o.
2 2 . 5 . 2 . P h ư ơ n g p h á p p h ổ c ộ n g h ư ở n g t ừ h ạ t n h ã n .
Phương pháp cộng hướns từ hạt nhân dã được sử dụns rộng rãi trong phán tích cấu
trúc và cấu hình của polvme trong dung dịch, dạng gel hoặc trạng thái rắn.
Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân dựa trẽn cơ sở tính từ tính của hạt nhân:
ụ = Ỵ Ị
Trong đó: // là momen từ hạt nhân. I là spin hạt nhân, y là hệ số từ hồi chuyến.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều, bao sồm 1H-(1)H COSY. 1H-(1)H TOCSY
và 13C-(1)H HMQC cho phép xác định càu trúc của trisulfat pentasaccharide. Phô cộng
hướns từ hạt nhân một chiều và phổ khối ESI - MS cho phép xác định rõ cấu trúc của các
dẫn xuất Carra°,eenan tetrasaccharide, pentasaccharide. heptansaccharide [15,18.23].
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu.
Kết qua thực nghiệm được xử lý theo phương pháp bình phươns tối thiểu trên máy
tính để tìm phươns trình hói quy mỏ tả sự tương hợp kết quá nhận được. Phán tích thống kê
được thực hiện theo cúc tiêu chuẩn Student và Fisher.
26