Đánh giá khả năng phối hợp Enzyme Alcalase và Pepsin để khử Protein cho vỏ tôm trong quá trình sản xuất Chitin

LỜI CẢM ƠN
Sau 4 năm học tập tại trường và sau hơn ba tháng nghiên cứu, tiến hành thí
nghiệm ngoài sự cố gắng phấn đấu của bản thân để hoàn thành đề tài này
Em xin bày tỏ lòng biết ơn trân trọng nhất tới Ban giám hiệu Trường Đại học
Nha Trang, Ban chủ nhiệm Khoa Chế biến, các thầy cô trong khoa chế biến đã nhiệt
tình truyền đạt cho em những kiến thức trong những năm học vừa qua. Em xin bày
tỏ lòng biết ơn đến các thầy, cô phụ trách phòng thí nghiệm Hóa-Vi sinh thực phẩm,
cùng thầy cô bộ môn công nghệ chế biến, bộ môn quản lý chất lượng và an toàn
thực phẩm, bộ môn công nghệ lạnh, các anh chị trung tâm công nghệ sinh học và
Trung tâm ứng dụng công nghệ chế biến trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện
thuận lợi trong suốt thời gian thực tập
Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cô, Thạc sĩ Ngô Thị Hoài Dương, người
đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, cung cấp cho em
những tài liệu cần thiết và hữu ích cho quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài thuận
lợi, nhanh chóng và hoàn thành trong thời gian quy định.
Cuối cùng, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể gia đình, bạn bè là
những người đã chia sẻ, động viên em quá trình thực hiện đề tài.

Sinh viên
Nha Trang ngày 29 tháng 6 năm 2011
Nguyễn Thị Thanh Hoa

i

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN 1
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC HÌNH iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
LỜI MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài: 1

2. Mục đích của đề tài: 2
3. Tính khoa học và thực tiễn của đề tài: 2
4. Nội dung của đề tài: 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHITIN 3
1.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitin 3
1.1.1.1. Cấu trúc của chitin 3
1.1.1.2. Tính chất của chitin 4
1.1.2. Phương pháp sản xuất chitin và yêu cầu về chất lượng chitin [5][8] 4
1.1.2.1. Phương pháp sản xuất chitin 4
1.1.2.2. Yêu cầu về chất lượng của chitin 7
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHẾ LIỆU TÔM 7
1.2.1. Tình hình sản xuất tôm và tận dụng phế liệu còn lại 7
1.2.2. Đặc điểm của đầu và vỏ tôm [5] 9
1.2.3. Các hướng tận dụng phế liệu tôm 11
1.3. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE 12
1.3.1. Các loại Protease và nguồn thu nhận 12
1.3.1.1. Phân loại protease 12
1.3.1.2. Nguồn thu nhận enzym Protease 14
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng protease 16
1.3.3. Ứng dụng enzyme protease 18
ii

1.4. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ TẬN DỤNG PHẾ
LIỆU TÔM VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHITIN. 21
1.4.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin trên thế giới 21
1.4.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất chitin ở Việt Nam 23
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 28
2.1.1. Nguyên liệu vỏ tôm 28

2.1.2. Enzyme Protease 28
2.1.3. Nguyên liệu khác 29
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu 29
2.2.2. Bố trí thí nghiệm 30
2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm tổng quát 30
2.2.2.2. Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ tôm. 31
2.2.2.3. Xác định thành phần hóa học của dịch, bã ép sau khử protein bằng
Alcalase: 32
2.2.2.4. Xác định mức độ khử khoáng khi sử dụng HCl ở các nồng độ khác nhau và
chọn thời điểm bổ sung Pepsin 33
2.2.2.5. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ, thời gian và nhiệt độ đến khả năng khử
protein của Pepsin 33
2.2.3. Thiết lập quy trình sản xuất chitin sử dụng Alcalase kết hợp với Pepsin để
khử protein 35
2.2.4. Phương pháp xác định các chỉ tiêu 36
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu 36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37
3.1. Thành phần hóa học của phế liệu tôm thẻ: 37
3.2. Thành phần hóa học của dịch, bã ép sau khử protein bằng Alcalase: 37
3.3. Xác định thời điểm bổ sung Pepsin và nồng độ HCl. 38
3.3.1.Biến đổi pH trong quá trình khử khoáng 38
iii

3.3.2. Mức độ khử khoáng theo thời gian ở các nồng độ khác nhau 40
3.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ, thời gian và nhiệt độ đến khả năng khử protein
của Pepsin 41
3.5. Thiết lập quy trình sản xuất chitin sử dụng Alcalase kết hợp với Pepsin để khử
protein 47
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 49

4.1. Kết luận: 49
4.2. Một số đề xuất cần tiếp tục nghiên cứu: 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
PHỤ LỤC 52
Phụ lục 1. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Microbiuret.
52
Phụ lục 2. Xác định hàm lượng Protein theo phương pháp Biuret:
54
Phụ lục 3. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa cho công đoạn khử
protein bằng enzyme Pepsin 55













iv


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cấu tạo của chitin 4
Hình 1. 2. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006) 23

Hình 1.3. Quy trình sử dụng Enzyme Papain để sản xuất chitosan(Trần Thị Luyến,
2003) 24
Hình 1.4. Quy trình sử dụng enzym Flavourzyme trong công nghệ sản xuất chitin từ
phế liệu tôm (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2007) 26
Hình 2.1. Nguyên liệu vỏ tôm 28
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ tôm thẻ31
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần của bã sau thủy phân bằng
Alcalase 32
Hình 3.1. Sự biến đổi pH theo thời gian ở các nồng độ khác nhau 39
Hình 3.2. Khảo sát mức độ khử khoáng theo thời gian ở các nồng độ khác nhau 40
Hình 3.3. Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa chế độ thủy phân bằng enzyme theo
phương pháp đường dốc nhất của BoxWillson 46
Hình 3.4. Thiết lập quy trình sản xuất chitin sử dụng enzyme Alcalase và Pepsin 48
Hình 1.Công thức của phức Biuret 52
Hình 2. Đồ thị đường chuẩn Microbiuret 53
Hình 3. Đồ thị đường chuẩn Biuret 55
v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Yêu cầu về chất lượng của chitin 7
Bảng 1.2. Thành phần trọng lượng của vỏ tôm (%) 9
Bảng 1.3. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan sản xuất theo quy trình Papain
(Trần Thị Luyến, 2003) 25
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm theo qui hoạch thực nghiệm của công đoạn khử protein
bằng enzyme Pepsin 35
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng
enzyme Pepsin 35
Bảng 3.1. Thành phần hóa học của phế liệu vỏ tôm thẻ chân trắng (%) 37
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của dịch, bã ép sau khử protein bằng Alcalase 37

Bảng 3.3. Kết quả hàm lượng protein còn lại ở các chế độ khử protein bằng enzyme
Pepsin 43
Bảng 3.4. Thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng
enzyme Pepsin 43
Bảng 3.5. Thí nghiệm tối ưu hóa theo đường dốc nhất của công đoạn khử protein
bằng enzyme Pepsin 45
Bảng 3.6. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng trên các mẫu thí nghiệm 46
Bảng 3.7. Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng của mẫu Chitin thu được theo quy trình
đề xuất: 48
Bảng 1. Bố trí xây dựng đường chuẩn Microbiuret 53
Bảng 2. Bố trí xây dựng đường chuẩn Biuret 54
Bảng 3. Bảng bố trí thí nghiệm 56
Bảng 4.Các thí nghiệm ở tâm phương án 57
Bảng 5. Các thí nghiệm ở tâm phương án của công đoạn khử protein bằng enzyme
Alcalase 57
Bảng 6.Các số liệu dùng để tính toán 58
Bảng 7. Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa công đoạn thủy phân khử protein bằng
enzyme 59
Bảng 8. Các thông số tối ưu 60
1

LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài:
Ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sản xuất chitin-chitosan theo phương pháp hoá
học có sử dụng các loại hoá chất với nồng độ cao, thời gian xử lý dài không những
ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm mà còn ảnh hưởng tới chất lượng các chế phẩm
khác được sản xuất từ phế liệu giáp xác và đặc biệt là lượng hóa chất thải ra từ quy
trình sản xuất là rất lớn do đó ảnh hưởng tới môi trường và gây khó khăn cho quá
trình xử lý nước thải. Vì thế, việc nghiên cứu một quy trình kết hợp phương pháp
hoá học với phương pháp sinh học, cải tiến công nghệ theo hướng thân thiện môi

trường, ứng dụng công nghệ sinh học trong chế biến chitin-chitosan là xu thế hiện
nay nhằm nâng cao chất lượng chitin, chitosan, tận thu các thành phần có giá trị như
astaxanthin,protein… đồng thời giảm tối đa lượng hoá chất sử dụng là rất cần thiết
góp phần giảm chi phí sản xuất, nâng cao chất lượng sản phẩm.
Cùng với sự phát triển tiến bộ của khoa học kỹ thuật thì những năm qua ở
Việt Nam đã có nhiều đề tài nghiên cứu sử dụng enzyme protease vào công đoạn
khử protein quá trình sản xuất chitin-chitosan. Việc sử dụng enzyme này vào quá
trình sản xuất chitin-chitosan mang lại nhiều ưu điểm hơn phương pháp hóa học là
hạn chế lượng hóa chất sử dụng, thân thiện với môi trường, tận dụng được các thành
phần có giá trị không những thế nó còn cho sản phẩm có chất lượng tốt hơn. Tuy
nhiên vẫn còn nhiều vấn đề cần giải quyết, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử
dụng đơn lẻ một loại enzyme protease không khử được triệt để protein từ phế liệu
thủy sản và hàm lượng protein còn lại ở mẫu chitin khá cao (6-9%) và vẫn phải
dùng kết hợp với hóa chất. Do đó nếu sử dụng kết hợp 2 enzyme Alcalase và
Pepsine khử protein trong sản xuất chitin thì có thể thay thế hoàn toàn hoặc giảm đi
phần lớn lượng hóa chất sử dụng cần thiết, cho chất lượng chitin tốt hơn, đồng thời
tận thu các chất có giá trị trong dịch thải như protein, astaxanthin…do ít ảnh hưởng
bởi nồng độ hóa chất như theo phương pháp hóa học truyền thống.

2

Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của bộ môn Công nghệ chế biến-
khoa Chế biến- trường đại học Nha Trang, dưới sự hướng dẫn của cô thạc sĩ Ngô
Thị Hoài Dương, đề tài: “Đánh giá khả năng phối hợp enzym Alcalase và Pepsin để
khử protein cho vỏ tôm trong quá trình sản xuất chitin” em đã thực hiện
2. Mục đích của đề tài:
Xác định các điều kiện tối ưu để khử protein từ phế liệu tôm thẻ chân trắng
(Penaeus vannamei) bằng enzyme Alcalase phối hợp với enzyme Pepsin nhằm
giảm thiểu hóa chất sử dụng, giảm ô nhiễm môi trường, nâng cao chất lượng chitin.
3. Tính khoa học và thực tiễn của đề tài:

Thành công của đề tài sẽ được áp dụng tại các cơ sở sản xuất chitin với mục
đích tận dụng nguồn protein từ vỏ tôm, hạn chế sử dụng hóa chất nhằm giảm ô
nhiễm môi trường và sản xuất ra chitin có chất lượng cao và ứng dụng vào các lĩnh
vực đặc biệt như ứng dụng trong y học, mỹ phẩm…. Đề tài cũng là nguồn tài liệu
hữu ích phục vụ cho công tác nghiên cứu chuyên sâu về lĩnh vực này.
4. Nội dung của đề tài:
- Tổng quan về công nghệ sản xuất chitin
- Tối ưu điều kiện khử protein bằng Pepsin kết hợp với khử khoáng
bằng HCl sau khi xử lý với Alcalase
- Đề xuất quy trình sản xuất chitin sử dụng phối hợp Alacalase và
Pepsin từ vỏ tôm thẻ chân trắng
3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHITIN
1.1.1. Cấu trúc hóa học và tính chất của chitin
Chitin và chitosan là những polysaccharide mạch thẳng, chúng phổ biến
trong tự nhiên chỉ sau cellulose, chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Ở động vật
thủy sản, chitin tồn tại rất nhiều, đặc biệt là ở vỏ tôm, cua, ghẹ,… vì vậy, chúng là
nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất chitin và chitosan.
Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể. Nó có cấu trúc gồm nhiều phân
tử được nối với nhau bằng cầu nối hydro và tạo thành một hệ thống dạng sợi ít
nhiều có tổ chức. Trong tự nhiên rất ít gặp dạng tồn tại tự do của chitin, nó liên kết
dưới dạng phức hợp chitin-protein, chitin với các hợp chất hữu cơ,… khi tồn tại như
thế chitin có sự đề kháng đối với các chất thủy phân, hóa học và enzyme. Do đó nó
gây khó khăn cho việc tách chiết và tinh chế. Tùy thuộc vào đặc tính của cơ thể và
sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài, người ta có thể thấy sự
thay đổi về hàm lượng cũng như chất lượng của chitin.
1.1.1.1. Cấu trúc của chitin
Chitin là một polysaccharide nên có cấu trúc dạng chuỗi.

Trong đó : chitin : R : -NH-COCH
3
,
Chitin: chitin là một polysaccharide mạch thẳng, nó có cấu trúc tuyến tính
gồm các đơn vị N-acetyl-glucosamine nối với nhau nhờ cầu β-1,4glucoside.
Công thức phân tử: (C
8
H
13
O
5
N)
n

Phân tử lượng : m = (203,19)
n

Trong đó n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu:
Đối với tôm hùm : n = 700÷800,
Đối với cua : n = 500÷600
Đối với tôm thẻ: n = 400÷500
Công thức cấu tạo:

4

Hình 1.1. Cấu tạo của chitin
1.1.1.2. Tính chất của chitin
Chitin:
Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong kiềm, trong acid loãng và
các dung môi hữu cơ khác như ete, rượu. Chitin hòa tan được trong dung dịch đậm

đặc, nóng của muối thyoxyanat liti (LiSCN) và muối thyoxyanat canxi (Ca(SCN)
2
)
tạo thành dung dịch keo.
Chitin ổn định với chất oxy hóa như KMnO
4
, nước javen, NaClO, …người ta
lợi dụng tính chất này để khử màu cho chitin.
Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng 884÷890 cm.
Chitin là một polysaccharide nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao,
có tính hòa hợp sinh học và tự phân hủy trên da. Chitin kết tinh ở dạng vô định
hình, khó hòa tan trong dung dịch amoniac (NH
3
), không hòa tan trong thuốc thử
schueizer-sacrpamonia. Điều này có thể là do sự thay đổi nhóm hydroxy (-OH) tại
vị trí C
2
bằng nhóm acetamic (NHCOCH
3
) đã ngăn cản sự tạo thành các phức hợp
cần thiết.
Khi nung nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thì chitin sẽ bị khử mất gốc
acetyl tạo thành chitosan. Khi đun nóng chitin trong acid HCl đặc thì chitin sẽ bị
thủy phân tạo thành glucosamine 85,5%, acid acetic 14,5%.
1.1.2. Phương pháp sản xuất chitin và yêu cầu về chất lượng chitin [5][8]
1.1.2.1. Phương pháp sản xuất chitin
Mặc dù chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhưng nó không được tìm thấy
ở dạng tinh khiết. Chitin ở trạng thái tự nhiên thì liên kết với protein, lipid, sắc tố và
5

canxi . Vì vậy, nó cần phải được làm sạch trước khi sử dụng cho bất kỳ mục đích
thương mại nào. Phương pháp dùng để phân tách và tinh sạch chitin phải đảm bảo
lấy đi khoáng và tận dụng được các hợp chất có giá trị khác. Do đó, nhiều phương
pháp đã được áp dụng cho việc thu hồi chitin.
Hiện nay việc làm sạch chitin bao gồm hai bước chính: Đó là khử khoáng
(loại bỏ khoáng bằng acid hoặc là một tác nhân tạo phức) và khử protein (tách
protein bằng kiềm hoặc một enzyme protease).
Hai bước này có thể đổi vị trí cho nhau phụ thuộc vào phương pháp thu hồi
protein, carotenoid và hơn nữa là ứng dụng chitin. Chitin sử dụng như một chất hấp
thụ hay hỗ trợ enzyme nên khử khoáng trước, bởi vì bước này lấy đi muối khoáng
và bảo vệ cấu trúc chitin đảm bảo sự deacetyl polysaccharid khi xử lý kiềm nhẹ để
khử protein. Tăng cường mức deacetyl gia tăng các nhóm amino tự do tham gia vào
quá trình hấp phụ và gắn kết protein. Tuy nhiên, để thu hồi protein thì nên thực hiện
bước khử protein trước. Khi đó, sản lượng protein và chất lượng là lớn nhất . Sau
quá trình khử khoáng và khử protein, sản phẩm được tẩy màu bằng acetone hoặc
hydrogen peroxide. Bước này là không cần thiết và phụ thuộc vào yêu cầu của sản
phẩm cuối cùng. Có hai phương pháp chính để sản xuất chitin: Phương pháp hóa
học và phương pháp sinh học.
- Phương pháp hóa học: Quá trình khử khoáng được thực hiện bằng việc sử
dụng HCl hoặc acid hữu cơ khác hoặc kết hợp cả hai ở nhiệt độ phòng với cơ chế
như sau:
CaCO
3
+ 2HCl = CaCl
2
+ CO
2
+ H
2
O

Ca
3
(PO
4
)
2
+ 6HCl = 3CaCl
2
+ 2H
3
PO
4

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này là:
Nồng độ acid: Nồng độ acid quá thấp sẽ không khử được hết khoáng dẫn đến
sản phẩm còn nhiều tạp chất. Nồng độ quá cao sẽ gây đứt mạch chitin, giảm chất
lượng sản phẩm.
Tỉ lệ acid/nguyên liệu: Nếu quá nhỏ thì sẽ không khử hết khoáng, nếu quá
lớn sẽ ảnh hưởng xấu đối với mạch, tốn chi phí.
6

Nhiệt độ, thời gian xử lí: Hai yếu tố này cũng rất quan trọng, ảnh hưởng đến
chất lượng sản phẩm. Nếu thời gian xử lí dài và nhiệt độ cao thì sản phẩm bị nát sẽ
rất khó xử lí sau này, đồng thời sẽ ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm sau này.
Nếu nhiệt độ thấp và thời gian xử lí ngắn thì khoáng sẽ không bị loại triệt để.
Thông thường khi tiến hành ở nhiệt độ cao thì thời gian phải ngắn nếu có
điều kiện ta có thể xử lý ở nhiệt độ thấp thời gian dài thì chất lượng sẽ tốt hơn.
Quá trình khử protein được thực hiện với nhiều hóa chất như NaOH,
Na
2

CO
3
, KOH, K
2
CO
3
…tuy nhiên NaOH là được sử dụng nhiều nhất.
- Phương pháp sinh học: Trong phương pháp sinh học chỉ khác tại công đoạn
khử protein và deacetyl không sử dụng hoá chất mà có thể sử dụng hệ vi khuẩn,
nấm men hoặc các enzyme để loại bỏ protein một cách triệt để. Việc deacetyl được
thực hiện bởi enzyme deacetylase. Sản phẩm chitosan thu được có chất lượng cao
do không bị ảnh hưởng nhiều bởi hoá chất [5]
Việc sử dụng phương pháp sinh học cũng gặp phải rất nhiều khó khăn như
giá thành sản phẩm có thể sẽ cao tuỳ thuộc vào loại enzyme sử dụng, việc loại bỏ
hoàn toàn protein có thể đạt được bằng phương pháp hoá học nhưng không thể đạt
được bằng phương pháp sinh học. Vì vậy, người ta có thể kết hợp hai phương pháp
này nhằm khắc phục những nhược điểm của từng phương pháp. Hiện nay, một
trong những khó khăn trong phương pháp hoá học để sản xuất chitin là thể tích chất
thải có chứa các chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý quá lớn. Những chất này là
do trong công đoạn khử khoáng và khử protein sinh ra. Chính vì vậy, cần thiết phải
có các biện pháp xử lý trước khi thải ra môi trường và điều này làm cho giá thành
sản phẩm tăng lên. Quá trình sản xuất chitin bằng phương pháp hoá học có thể gây
nên sự thuỷ phân polymer (Simpson và cộng sự, 1994; Healy và cộng sự, 1994),
biến đổi tính chất vật lý (Gagne và Simpson, 1993) và gây ô nhiễm môi trường
(Allan và cộng sự, 1978). Điều này là do không xác định được bản chất hoạt động
của hoá chất cũng như sự khác nhau về hàm lượng chitin trong nguyên liệu. Ngược
lại, trong phương pháp sinh học thì thể tích chất không lớn, protein sau quá trình
thủy phân bằng enzyme có thể được thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia
7

súc, gia cầm, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được thu hồi, hơn nữa sẽ hạn
chế được việc xử lý môi trường. Vì vậy, muốn sản phẩm chitin có được sự đồng
nhất hơn về các đặc tính lý hoá thì chúng ta phải áp dụng những phương pháp xử lý
nhẹ hơn như việc sử dụng enzyme.
Legarraeta và cộng sự (1996) đã sử dụng enzyme Protease và vi khuẩn có
khả năng tạo protease để tách protein nhằm thay thế cho phương pháp hoá học. Quá
trình này giúp tận dụng tối đa giá trị của nguồn phế liệu và hạn chế ảnh hưởng đến
môi trường. Hall & De Silva (1994) đã đề xuất một phương pháp khử khoáng đơn
giản bằng việc sử dụng lên men lactic như là một phương pháp bảo quản phế liệu.
Phương pháp này là dạng ủ chua ban đầu được phát triển cho bảo quản phế liệu tôm
pandan trước quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt đới.
1.1.2.2. Yêu cầu về chất lượng của chitin
Tùy theo mục đích sử dụng và yêu cầu của khách hàng mà yêu cầu về chất
lượng của chitin cũng khác nhau.
Bảng 1.1. Yêu cầu về chất lượng của chitin[19]
Hạng mục Dùng trong công
nghiệp
Dùng trong y
dược
Dùng trong thực
phẩm
Hình dạng bên
ngoài
Dạng vảy, màu trắng
hoặc vàng nhạt
Dạng vảy màu
trứng
Màu trắng tinh
Độ ẩm < 10 % < 8 % < 10 %
Tro 8-12 % < 2 % < 1 %

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHẾ LIỆU TÔM
1.2.1. Tình hình sản xuất tôm và tận dụng phế liệu còn lại
Ở Việt Nam nguồn nguyên liệu tôm là rất dồi dào, được thu từ 2 nguồn chính
là đánh bắt tự nhiên và nuôi trồng. Đặc biệt, nuôi tôm đã phát triển mạnh trong
những năm gần đây và trở thành ngành kinh tế mũi nhọn. Diện tích nuôi tôm đã
tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm 2001 và 540.000 ha năm
2003. Năm 2002, giá trị xuất khẩu thuỷ sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đó xuất khẩu
tôm đông lạnh chiếm 47%, đứng thứ 2 sau xuất khẩu dầu khí. Năm 2004, xuất khẩu
8

thuỷ sản đạt giá trị 2,4 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả nước trong đó
tôm đông lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản. Năm 2006 kim ngạch
xuất khẩu thủy sản đã qua mốc 3 tỷ đạt 3,31 tỷ USD, tăng gần 600 triệu USD so với
năm 2005, trong đó mặt hàng tôm truyền thống chiếm vị trí đầu bảng xấp xỉ 1,5 tỷ
USD, chiếm 44,3 % tổng kim ngạch xuất khẩu. Năm 2007, tổng kim ngạch xuất
khẩu thủy sản đạt 3,75 tỷ USD tăng 12% so với năm 2006.
Mục tiêu xuất khẩu thuỷ sản đến năm 2010, Việt Nam phấn đấu đạt giá trị 4 -
4,5 tỷ USD. Ðịnh hướng đến năm 2020, chế biến xuất khẩu thủy sản tiếp tục là
động lực thúc đẩy phát triển nuôi trồng thuỷ sản, khai thác thuỷ sản và mang lại
nhiều lợi ích kinh tế ngành, nâng cao thu nhập và đời sống lao động nghề cá. Tôm
được dự kiến đạt khoảng 483 nghìn tấn nguyên liệu để phục vụ cho xuất khẩu
khoảng 390.000 tấn năm 2010. Theo thống kê của Trung tâm Nghiên cứu Chế biến
Thủy sản, Đại học Thuỷ sản thì lượng phế liệu năm 2004 tại Việt Nam ước tính
khoảng 45.000 tấn phế liệu, năm 2005 ước tính khoảng 70.000 tấn/năm. Trong vỏ
tôm tươi chitosan chiếm khoảng 5% khối lượng, trong vỏ tôm khô khoảng 20-40%
khối lượng (Trần Thị Luyến, 2004). Như vậy hàng năm có thể sản xuất gần 5000
tấn chitosan phục vụ sản xuất trong nước và xuất khẩu, mang lại hiệu quả kinh tế
cho ngành Thuỷ sản .
Nguyên liệu còn lại trong quá trình sản xuất tôm thường được gọi là phế liệu
tôm (PLT) là những thành phần phế thải từ các cơ sở chế biến tôm bao gồm đầu, vỏ

và đuôi tôm. Ngoài ra, còn có tôm gãy thân, tôm lột vỏ sai quy cách hoặc tôm bị
biến màu. Tuỳ thuộc vào loài và phương pháp xử lý mà lượng phế liệu có thể vượt
quá 60% khối lượng sản phẩm. Đối với tôm thẻ, lượng phế liệu đầu tôm chiếm 28%
và vỏ chiếm 9%, như vậy tổng lượng phế liệu vỏ đầu tôm thẻ là 37%. Lượng phế
liệu này có thể giảm ít nhiều bằng cách nâng cao hiệu quả lột vỏ nhờ các thiết bị và
công nghệ chế biến tốt hơn. Giảm lượng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải
pháp tái sử dụng chúng đang trở nên phổ biến như một phương cách giúp làm tăng
lợi nhuận cho ngành thuỷ sản.
9

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của phế liệu tôm từ 30-70%
(Watkin và cộng sự, 1982), trung bình khoảng 50% so với khối lượng tôm chưa chế
biến. Halanda và Netto (2006) cho rằng phế liệu tôm có thể chiếm 50-70% so với
nguyên liệu . Phần lớn tôm được đưa vào chế biến dưới dạng bóc vỏ, bỏ đầu. Phần
đầu thường chiếm khối lượng 34-45%, phần vỏ, đuôi và chân chiếm 10-15% trọng
lượng của tôm nguyên liệu. Tuy nhiên, tỉ lệ này tuỳ thuộc vào giống loài và giai
đoạn sinh trưởng của chúng [4] [5].
Bảng 1.2. Thành phần trọng lượng của vỏ tôm (%) [9]
Loại tôm Tôm vỏ bỏ đầu

Tôm thịt Đầu tôm Vỏ tôm
He 61.19 52.05 29.80 10.00
Thẻ 62.95 53.62 28.00 9.00
Sú 61.96 52.84 31.40 8.90
Rằn 58.23 48.60 33.90 10.40
Gân 59.30 41.45 33.14 11.27
Chì 57.71 47.43 31.85 11.07
Bộp 60.32 49.02 31.55 12.15
Rảo 58.68 46.49 33.20 12.20
Vàng 60.25 48.04 31.75 13.07

Sắt 50.47 39.15 42.38 11.62
Càng 40.22 31.61 51.95 8.56
Hùm 28.07 22.20 63.40 5.50
Mũ ni 51.52 30.74 52.02 12.57
1.2.2. Đặc điểm của đầu và vỏ tôm [5]
Lớp ngoài cùng của vỏ tôm có cấu trúc chitin-protein bao phủ, lớp vỏ này
thường bị hóa cứng khắp bề mặt cơ thể do sự lắng đọng của muối canxi và các chất
hữu cơ khác nằm dưới dạng phức tạp do sự tương tác giữa protein và các chất
không hòa tan.
Vỏ chia làm 4 lớp chính: Lớp biểu bì, lớp màu., lớp canxi, lớp không bị
canxi hóa.
10

Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hóa cứng do sự lắng đọng của canxi. Lớp
màu, lớp canxi hóa, lớp không bị canxi hóa chứa chitin nhưng lớp biểu bì thì không
- Lớp màu: Tính chất của lớp này do sự hiện diện của những thể hình hạt của
vật chất mang màu giống dạng melanin. Chúng gồm những túi khí hoặc những
không bào. Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh,
là con đường cho caxi thẩm thấu vào.
- Lớp biểu bì: Những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ
bởi Fucxin, có điểm pH = 5,1 không chứa chitin. Nó khác với các lớp vỏ còn lại, bắt
màu xanh với anilin xanh. Lớp biểu bì có lipid vì vậy nó cản trở tác động của acid ở
nhiệt độ thường hơn các lớp bên trong. Màu của lớp này thường vàng rất nhạt.
- Lớp canxi hóa: Lớp này chiếm phần lớn lớp vỏ, thường có màu xanh trải
đều khắp.
- Lớp không bị canxi hóa: Vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo bởi một
phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin – protein bền
vững không có canxi và puinone.
Thành phần sinh hoá của vỏ tôm [4]
Protein: Thành phần protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở hai dạng:

-Dạng tự do: Dạng này là phần thịt tôm từ một số tôm bị biến đổi được vứt
lẫn vào phế liệu hoặc phần thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của đầu tôm. Nếu
công nhân vặt đầu không đúng kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu
nhiều làm tăng định mức tiêu hao nguyên vật liệu, mặt khác phế liệu khó xử lý hơn.
-Dạng phức tạp: Ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với
chitin, canxi carbonate, với lipid tạo lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit
…như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm.
Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết với protein , khoáng, và những hợp chất
hữu cơ khác, chủ yếu là CaCO
3
là thành phần chính cấu tạo nên vỏ tôm. Chính sự
liên kết phức hợp này gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng.
Canxi: Trong vỏ, đầu tôm có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là
muối CaCO
3
, hàm lượng Ca
3
(PO
4
)
2
mặc dù không nhiều nhưng trong quá trình khử
11

khoáng dễ hình thành hợp chất CaHPO
4
không tan trong HCl gây khó khăn cho quá
trình khử khoáng.
Sắc tố: Trong vỏ tôm thường có nhiều loại sắc tố nhưng chủ yếu là
Astaxanthin.

Enzyme: Các enzyme chủ yếu là enzyme của nội tạng trong đầu tôm và của
vi sinh vật thường trú trên tôm nguyên liệu.
Ngoài thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn có các thành phần
khác như: nước, lipid, phospho,…
Như vậy, từ thành phần, tính chất nguồn phế liệu đầu, vỏ tôm nhận thấy đây
là nguồn nguyên liệu phong phú không chỉ sản xuất chitin-chitosan mà còn chứa
một lượng protein, astaxanthin,enzyme… có lợi cần được thu hồi.
1.2.3. Các hướng tận dụng phế liệu tôm
Vấn đề nghiên cứu tận dụng hợp lý có hiệu quả phế liệu tôm cần được quan
tâm. Nếu sử dụng tốt nguồn nguyên liệu này sẽ góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế,
vừa giảm được sự ô nhiễm môi trường do nguồn phế liệu thải ra, bảo vệ môi trường
đưa ngành thủy sản phát triển bền vững. Những nghiên cứu tận dụng phế liệu tôm
được ứng dụng phổ biến hiện nay là sản xuất chitin – chitosan và các dẫn xuất của
nó, đồng thời thu hồi chất màu axtaxanthin, protein, khoáng
Các nước ở châu Á như Thái Lan, Trung Quốc, Việt Nam và Ấn Độ việc chế
biến và xuất khẩu tôm phát triển nên khả năng sản xuất chitin và chitosan rất phong
phú. Theo số liệu thống kê của
Viện Công nghệ châu Á (AIT)
, sản lượng khai thác
tôm của các nước Đông Nam Á là 900.000 tấn, một nửa trong số đó là phế thải. Các
phế thải cho đến nay chủ yếu bỏ phí, chỉ một lượng nhỏ được xuất sang Nhật Bản
để sản xuất chitosan làm phụ gia thức ăn. Lượng chitin ở tôm ở các vùng nhiệt đới
nhiều hơn 30-60% so với tôm ở các vùng khí hậu ôn hòa và khí hậu lạnh
.

Hiện nay đi đầu trong lĩnh vực này là Nhật và Mỹ đã sản xuất theo thứ tự là
600 tấn/năm và 400 tấn/năm chitosan. Ngoài ra còn có các nước như Trung Quốc,
Ấn Ðộ, Pháp cũng sản xuất sản phẩm này nhưng với số lượng thấp (khoảng
2tấn/năm).
12

Ở Việt Nam, tháng 6 năm 2002, dự án sản xuất thử chất chitosan bắt đầu
được thực hiện tại trường Đại học Thủy sản Nha Trang. Quy trình sản xuất chất
chitosan của trường Đại học Thủy sản khá đơn giản. Vỏ tôm, cua, ghẹ được đưa vào
bể xử lý- chúng là nguyên liệu để làm ra chất chitin. Từ chitin qua xử lý thu được
chitosan rất có giá trị. Phần lớn phế liệu tôm ở Việt Nam đều được dùng làm
nguyên liệu để sản xuất chitin – chitosan. Thực tế đã có nhiều công ty chuyên sản
xuất các sản phẩm chitin - chitosan như: công ty Phương Duy, khu công nghiệp và
khu chế xuất Cần Thơ, công ty TNHH kỹ nghệ sinh hóa Quốc Thành Việt Trung -
những doanh nghiệp tiên phong trong xử lý phế liệu thủy sản. Hàng năm tiêu thụ
gần 30000 tấn phế liệu thủy sản.
Ngoài ra phế liệu tôm được sử dụng làm:
Sản xuất thức ăn chăn nuôi : Hiện nay ở nước ta chủ yếu là sử dụng phế liệu
tôm đông lạnh để sản xuất thức ăn chăn nuôi. Rất nhiều thức ăn chăn nuôi bán chạy
hiện nay có chứa bột tôm. Bột tôm được chế biến tốt có chứa acid amine tương tự
như acid amine trong đậu tương hay trong bột cá, bột tôm chiếm đến 30% thức ăn
chăn nuôi. Để sản xuất thức ăn chăn nuôi chất lượng cao thì phế liệu tôm sử dụng
là loại tốt và không bị phân hủy, do vậy việc xử lý và chế biến phế liệu tôm có ý
nghĩa rất quan trọng.
Sản xuất bột màu astaxanthin: Trong phế liệu tôm sắc tố này là một phần rất
quan trọng vì đây là một carotenoid có nhiều ứng dụng. Nó là chất có khả năng tạo
màu nên được sử dụng trong kỹ thuật nuôi trồng thủy sản, công nghiệp, thực phẩm
thay thế cho các chất màu hóa học đang sử dụng.
1.3. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE
1.3.1. Các loại Protease và nguồn thu nhận
1.3.1.1. Phân loại protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4).
Protease được phân chia thành hai loại: Endopeptidase và exopeptidase
* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành
hai loại:

13

- Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.
- Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:
+ Serin proteinase: Là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung
tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: Chymotrypsin và subtilisin. Nhóm
chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như Chymotrypsin, Trypsin, Elastase.
Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg,
subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và
thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.
Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như Papain, Bromelin, một vài
protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt
động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm
Pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: Pepsin, Chymosin, Cathepsin, Renin.
Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và
thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4
- Protease trung tính: pH 7-8
- Protease kiềm: pH 9-11

14

1.3.1.2. Nguồn thu nhận enzym Protease
a. Nguồn động vật
- Tụy tạng: Đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme
nhất.
- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ
phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi
trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được
nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiểm
pepxin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát
triển đầy đủ có khả năng tiết ra Pepsin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây
có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài
Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.
b. Nguồn thực vật
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được
từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa,
vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng
tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng
dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục
tiêu tiêu hoá. Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica).
c. Nguồn vi sinh vật
Enzyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm
nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và
một số loại nấm men.
- Vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm khoảng 59% enzyme sử dụng [5]. Protease của động vật hay thực vật chỉ
chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả
năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất

cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử
15

protein[5].
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất
(Nguyễn Trọng Cẩn và cộng sự, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease
hoạt động thích hợp trong vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và
có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein
thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các
protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm.
Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và
một số giống thuộc chi Clostridium.
Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ
20.000-30.000. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng
7-12
-Nấm: Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum), Các loại nấm mốc này có khả năng
tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ
yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có
khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho
mát
-Xạ khuẩn : Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus
Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách

chiết từ S. grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới
90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ), người ta
16

cũng tách được chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ, chế
phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S. fradiae
cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến
thịt.
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở
quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi
ích chính như sau:
 Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.
 Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc
nhiều lần quanh năm.
 Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định
hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).
 Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức
sản xuất.
Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây
bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.
Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có
trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng
hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó.
1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng protease
 Ảnh hưởng của nhiệt độ: Bản chất của enzyme là protein nên khi tăng hay giảm
nhiệt độ đều ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt
tính cao nhất ở một khoảng nhiệt độ nhất định. Thông thường, đa số nhiệt độ tối
thích cho enzyme nằm trong khoảng 40
o

C-50
o
C và nhiệt độ lớn hơn 70
o
C thì đa
số bị bất hoạt. Trong khoảng nhiệt độ tối thích đó, nếu nhiệt độ tăng 10
o
C thì tốc
độ thủy phân tăng lên từ 1,5 đến 2 lần. Nhiệt độ thích hợp của eyme có the thay
đổi khi có sự thay đổi về pH, cơ chất.
17

 Ảnh hưởng của pH: Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH. Mỗi enzyme
chỉ hoạt động trong vùng pH nhất định gọi là pH tối thích.
 Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc: Khi thủy phân, diện tích tiếp xúc giữa enzyme
protease và nguyên liệu cũng ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ thủy phân. Để tạo
điều kiện cho enzyme protease hoạt động tốt người ta thường xay nhỏ, đập dập,
cắt. Diện tích tiếp xúc càng lớn thì quá trình thủy phân càng dễ dàng và ngược
lại.
 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: Trong điều kiện thừa cơ chất, nếu càng tăng
nồng độ enzyme thì quá trình thủy phân cang diễn ra mãnh liệt. Khi nồng độ
enzyme bão hòa với nồng độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme bao nhiêu đi nữa
thì tốc độ thủy phân ít thay đổi.
 Ảnh hưởng của nồng độ các cơ chất: Khi enzyme kết hợp với cơ chất (vỏ, đầu)
sẽ tạo thành khớp trung gian giữa enzyme và cơ chất. Phức này sẽ kéo căng liên
kết peptid, chuyển hóa thành sản phẩm dịch đạm và giải phóng enzyme. Qúa
trình này cứ tiếp tục xảy ra cho đến khi cơ chất hết, nếu nồng độ cơ chất thích
hợp với nồng độ enyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn nhanh
chóng.
 Ảnh hưởng của thời gian: Thời gian thủy phân kéo dài hoặc rút ngắn đều ảnh

hưởng đến quá trình thủy phân. Thời gian thủy phân càng dài thì enzyme có điều
kiện cắt mạch triệt để dẫn đến biến đổi sâu sắc cơ chất. Nhưng thời gian thủy
phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển tạo ra nhiều sản phẩm
cấp thấp như NH
3
, H
2
S,…Đồng thời khi thời gian quá dài thì hiệu quả kinh tế
giảm. Còn thời gian thủy phân quá ngắn thì sự thủy phân protein chưa triệt để
dẫn tới hiệu suất thủy phan kém, gây lãng phí nguyên liệu và khó khăn cho công
đoạn khử khoáng, tẩy màu.
 Ảnh hưởng của tỉ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân: Nước là môi trường
thuận lợi cho hoạt động của enzyme và vi sinh vật. Do vậy quá trình này nếu bổ
sung ít nước thì sẽ hạn chế được sự hoạt động của vi sinh vật nhưng đồng thời
cũng ảnh hưởng tới hoạt động của enzyme, nhưng nếu bổ sung nước với tỉ lệ
18

quá cao, vi sinh vật hoạt động và phát triển phân hủy thành các sản phẩm thứ
cấp.
 Ảnh hưởng của bản thân nguyên liệu: Mỗi loài tôm khác nhau sẽ có hàm lượng
và thành phàn khác nhau do đó lựa chọn nguyên liệu là rất quan trọng trong quá
trình thủy phân.
 Độ tươi của nguyên liệu: Nó có vai trò quyết định tới quá trình thủy phân và
chất lượng của sản phẩm, độ tươi của nguyên liệu giảm thì chất lượng của chitin
tạo thành cũng kém.
1.3.3. ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE
 Ứng dụng trong xử lý phế liệu.
Ngày nay tốc độ ô nhiễm môi trường đang gia tăng, các phương pháp xử lý hoá
học và sinh học thông thường ngày càng khó đạt được mức độ cần thiết để loại bỏ
các chất ô nhiễm này. Do đó, những phương pháp xử lý nhanh hơn, rẻ hơn, đáng tin

cậy hơn được đưa vào áp dụng. Hiện nay người ta đã biết nhiều loại enzyme khác
nhau của thực vật và vi sinh vật, số lượng enzyme đã biết đạt tới con số hơn 3000
enzyme. Trong đó có enzyme Protease – một enzyme quan trọng trong xử lý
protein. Protease thuộc nhóm enzyme thủy phân protein được sử dụng rộng rãi
trong công nghiệp thực phẩm như trong chế biến cá và thịt. Protease có thể thủy
phân các protein có trong chất thải, để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn
khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi. Protease thủy phân các protein
không tan thông qua nhiều bước, ban đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt
các chuỗi polypeptit tạo thành các liên kết lỏng trên bề mặt. Sau đó, quá trình hoà
tan những phần rắn xảy ra với tốc độ chậm hơn phụ thuộc vào sự khuếch tán
enzyme lên bề mặt cơ chất và tạo ra những phần nhỏ. Chính vì tính chất trên mà
protease được sử dụng một mặt để tận dụng các phế thải từ nguồn protein để những
phế thải này không còn là các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, một mặt để xử lý
các phế thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi
không còn mùi hôi thối.
19

Lông tạo nên 5% trọng lượng cơ thể gia cầm và có thể được coi như là nguồn
protein cao tạo nên cấu trúc keratin cứng được phá huỷ hoàn toàn. Lông có thể được
hoà tan sau khi xử lý với NaOH, làm tan bằng cơ học và bằng các enzyme thủy
phân, như protease kiềm từ Bacillus subtilis tạo thành sản phẩm có dạng bột, màu
xám với hàm lượng protein cao có thể được sử dụng làm thức ăn. Protease ngoại
bào được tiết ra từ Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Pseudomonas
marinoglutinosa và Acromonas hydrophila có thể cố định trong canxi alginat để
thực hiện các phản ứng liên tục thu được sản lượng cao trong các phản ứng thủy
phân thịt cá [8].
 Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm từ phế liệu thủy sản.
- Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm từ phế liệu tôm, cua, ghẹ
Enzyme protease được dùng để thủy phân protein trong sản xuất chitin, astaxanthin,
bột đạm Phần lớn phế liệu tôm tại Việt Nam cũng như trên thế giới hiện nay đang

chủ yếu được sử dụng để sản xuất chitin – chitosan, một ứng dụng có ý nghĩa lớn.
Công nghệ sản xuất chitin, chitosan còn đang gặp nhiều bất cập khi các quy trình
sản xuất chitin-chitosan quy mô lớn tại Việt Nam chủ yếu là quy trình hóa học. Việc
sử dụng hóa chất với nồng độ cao dẫn đến lượng chitin-chitosan thu được chưa cao
và nhiều tạp chất. Mặt khác, các quy trình này chỉ tập trung vào việc thu nhận
chitin-chitosan chưa chú trọng đến việc tận thu các sản phẩm khác của phế liệu tôm
như protein, chất màu. Các hóa chất và chất hữu cơ chưa được tận thu thải ra gây ô
nhiễm môi trường.
Việc kết hợp sử dụng enzyme protease trong quá trình sản xuất chitin-
chitosan có ưu thế hơn so với phương pháp hóa học truyền thống. Nó giảm thiểu
lượng hóa chất sử dụng và thải ra môi trường. Mặt khác, quy trình cải tiến với sự
vượt trội về chất lượng chitin, chitosan thu được và thu hồi sản phẩm protein-
astaxanthin có giá trị dinh dưỡng và sinh học, làm hạn chế các chất hữu cơ chứa
trong nước thải, giảm thiểu chi phí xử lý môi trường. Điều này có ý nghĩa quan
trọng trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trầm trọng do các cơ sở chế
biến chitin-chitosan gây ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản