Khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng virus NIBRG-14 trên trứng gà có phôi trong sản xuất vắc xin cúm H5N1 ở quy mô công nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
oOo







PHẠM VĂN TÙNG


KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG
VIRUS NIBRG - 14 TRÊN TRỨNG GÀ CÓ PHÔI
TRONG SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H5N1 Ở
QUY MÔ CÔNG NGHIỆP




ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Giáo viên hướng dẫn:
TS. LÊ VĂN BÉ
ThS. LÊ PHƯƠNG CHUNG

NHA TRANG – 2013

i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án này, trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban
giám hiệu Trường Đại học Nha Trang và Ban giám đốc Viện Nghiên cứu Công
nghệ sinh học và Môi trường.
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Vắc xin và sinh phẩm Y tế
(IVAC) đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em trong thời gian thực tập vừa qua.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Bé - Viện trưởng viện Vắc xin và
sinh phẩm Y tế (IVAC), Ths. Dương Hữu Thái - phó Viện trưởng (trưởng phòng
Vắc xin Cúm - IVAC) và Ths. Lê Phương Chung - giảng viên Viện công nghệ
sinh học và môi trường (Đại học Nha Trang) đã tận tình hướng dẫn, động viên
em trong suốt thời gian thực hiện đồ án vừa qua.
Xin cảm ơn anh Đàm Xuân Cường, anh Nguyễn Giang, chị Nguyễn Thị
Thùy Đoan cùng toàn thể các cán bộ viên chức phòng Vắc xin Cúm - Viện Vắc
xin và Sinh phẩm Y tế đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em
trong suốt thời gian thực hiện đồ án vừa qua.
Cuối cùng, em xin cảm ơn cha mẹ, bạn bè và toàn thể quí thầy cô trong
Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường đã dạy dỗ và tạo điều kiện về vật chất
và tinh thần cho em trong suốt thời gian vừa qua.

Nha Trang, tháng 6 năm 2013
Sinh viên


Phạm Văn Tùng

ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
iv
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CÚM H5N1
3
1.2. TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 Ở NGƯỜI TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM
3
1.2.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở người trên thế giới hiện nay 3
1.2.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam 5
1.2.3. Tình hình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người ở Việt Nam 7
1.3. TÁC NHÂN GÂY BỆNH
8
1.3.1. Đặc điểm sinh học của Virus cúm A/H5N1 8
1.3.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ 10
1.3.3. Đường xâm nhập và lây bệnh của bệnh cúm A/H5N1 12
1.3.4. Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch 15
1.4. SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH CÚM A/H5N1.
19
1.4.1. Các công nghệ sản xuất vắc xin cúm 19
1.4.1.1. Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên trứng gà có phôi 19
1.4.1.2. Công nghệ sản xuất vắc xin cúm trên tế bào 20
1.4.1.3. Một số các phương pháp sản xuất vắc xin cúm khác 22

1.4.2. Sản xuất vắc xin cúm quy mô lớn tại Viện vắc xin và sinh phẩm y tế
(IVAC) 22
1.4.2.1. Điều kiện sản xuất: 22
1.4.2.2. Tóm tắt quy trình công nghệ 22
1.4.3.3. Phát triển quy trình công nghệ 24
1.4.3.4. Phát triển quy trình nuôi cấy 24

iii
Chương II: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
29
2.2. VẬT LIỆU
29
2.3. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ
29
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
30
2.4.1. Xác định các điều kiện tối ưu 31
2.4.2. Phương pháp gây nhiễm virus trên trứng gà có phôi 9 - 11 ngày tuổi 32
2.4.3. Phương pháp lấy mẫu dịch virus sau khi trứng đã gây nhiễm 34
2.4.4. Phương pháp kiểm tra chất lượng 35
Chương III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40
3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố: thể tích tiêm, thời gian, nhiệt độ đến quá trình
nuôi cấy virus
40
3.1.1. Kết quả đối với lô 1 40
3.1.2. Kết quả kiểm nghiệm đối với lô 2 42
3.1.3. Kết quả kiểm nghiệm đối với lô 3 44
Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47
1.

KẾT LUẬN
47
2.

KIẾN NGHỊ
47
TÀI LIỆU THAM KHẢO 48
PHỤ LỤC


iv
CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
EID50 : Egg Infection Dose 50 (Liều gây nhiễm 50%)
FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông lương thế giới)
HA : Haemagglutinin (Kháng nguyên ngưng kết hồng cầu – Kháng nguyên
HA)
HPAI : Highly pathogenic avian influenza (chủng virus cúm gia cầm độc lực
cao)
LM1 : Liquit Medium 1
LM2 : Liquit Medium 2
LPAI : Low pathogenic avian influenza (Chủng virus cúm gia cầm độc lực
thấp)
NA : Neuraminidase (Kháng nguyên neuraminidase)
NP : Nucleo Protein
NIBSC


: National Institute for Biological Standards and Control (Viện Quốc
gia về tiêu chuẩn và Kiểm định Sinh học, Anh)

OIE : Office International Epizoot (Tổ chức Thú y thế giới)
PBS : Phosphate Buffer Saline (Dung dịch đệm)
PR8 : Chủng virus cúm A/H1N1/ có nguồn gốc từ Puerto Rico
RNP : Ribo Nucleo Protein
WHO : World Health Organization - Tổ chức Y Tế Thế giới (TCYTTG)
WSL : Working Seed Lot (Chủng làm việc)




v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Lấy mẫu thử nghiệm với thể tích tiêm V = 0,1 ml 31
Bảng 2.2. Lấy mẫu thử nghiệm với thể tích tiêm V = 0,2 ml 31
Bảng 2.3. Lấy mẫu thử nghiệm với thể tích tiêm V = 0,3 ml 31
Bảng 2.4 : Sơ đồ phản ứng ngưng kết hồng cầu 36
Bảng 2.5. Cách pha loãng mẫu thử nghiệm thành các độ pha khác nhau 37
Bảng 2.6. Kết quả EID50 của chủng giống được xác định bằng phương pháp
Reed- Muench. 38
Bảng 2.7. Cách tính EID50 của liều gây nhiễm 39
Bảng 3.1. Kết qủa kiểm nghiệm HA đối với lô 1 40
Bảng 3.2. Kết quả kiểm nghiệm EID50 đối với lô 1 41
Bảng 3.3. Kết quả kiểm nghiệm HA đối với lô 2 42
Bảng 3.4. Kết quả thử nghiệm EID50 ở lô 2 43
Bảng 3.5. Kết quả HA thử nghiệm đối với lô 3 44
Bảng 3.6. Kết quả kiểm nghiệm EID50 đối với lô 3 theo ảnh hưởng
của nhiệt độ 45

vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở người từ năm 2003 đến nay. 4
Hình 1.2. Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1 5
Hình 1.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến 2012 6
Hình 1.4. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp
ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A . 8
Hình 1.5. Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào
chủ 13
Hình 1.6. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus
cúm A 15
Hình 1.7. Sơ đồ minh họa đột biến điểm của hiện tượng “kháng nguyên”
(antigenic drift) (A) và đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn
kháng nguyên” (antigenic shift) ở virus cúm A (B). 19
Hình 1.8. Quy trình sản xuất vắc xin cúm H5N1 23
Hình 1.9. Bằng kĩ thuật di truyền ngược chủng gốc NIBRG-14 được tạo ra từ 6 gen
của virus A/PR8/34(H1N1) và 2 gen của virus A/Vietnam/1194/2004
(H5N1), trong đó gen HA bị đột biến mất đoạn để giảm độc lực,
cho phép virus này tái tổ hợp này nhân lên bằng công nghệ phôi
trứng gà. 27
Hình 2.1. Sơ đồ lấy mẫu thử nghiệm 30
Hình 2.2. Sơ đồ xác định các điều kiện tối ưu 32
Hình 2.3. Hình ảnh về quá trình đánh dấu vị trí tiêm 33
Hình 2.4. Hình ảnh về quá trình đục lỗ điểm tiêm 33
Hình 2.5. Hình ảnh về quá trình tiêm chủng vào dịch niệu đệm của trứng 33
Hình 2.6. Hình ảnh về quá trình dán kín vị trí tiêm 33
Hình 2.7. Hình ảnh về quá trình cắt vỏ trứng tại vùng buồng khí 34
Hình 2.8. Hình ảnh về quá trình dùng pipette hút dịch niệu trong từng
trứng 34

1
LỜI MỞ ĐẦU

Từ trường hợp nhiễm virus cúm A/H5N1 đầu tiên được phát hiện tại Hồng
Kông tháng 5 năm 1997 đến nay, dịch cúm A/H5N1 trên người đã lan sang nhiều
quốc gia trên thế giới. Cho đến nay, vẫn chưa có một bằng chứng nào cho thấy có
sự lây truyền virus trực tiếp từ người sang người. Tuy nhiên, các chuyên gia
khẳng định việc virus cúm A/H5N1 lây nhiễm trực tiếp từ người qua người chỉ là
vấn đề thời gian. Điều này đã cảnh báo về nguy cơ của một đại dịch cúm
A/H5N1 trên người gần kề và buộc các nhà khoa học trên thế giới phải nhanh
chóng tìm ra phương thức phòng bệnh hiệu quả.
Vắc xin luôn được coi là phương thức hiệu nghiệm nhất trong việc phòng
chống, giảm tỷ lệ mắc bệnh và chết do virus cúm gây ra. Tuy vắc xin cúm đã
được sản xuất từ thập niên 60 nhưng chỉ tập trung ở các nước Châu Âu và Bắc
Mỹ. Với năng lực sản xuất vắc xin của thế giới hiện nay là 300 triệu liều/năm,
nếu đại dịch cúm trên người xảy ra thì lượng vắc xin này chỉ có thể đáp ứng cho
khoảng 10% dân số thế giới. Trước tình hình đó, Tổ chức Y tế Thế giới
(TCYTTG) khuyến cáo tất cả các nước, đặc biệt các quốc gia Châu Á, chủ động
nghiên cứu và sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 để có thể kịp thời cung ứng cho nhu
cầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng khi xảy ra đại dịch.
Hiện nay vắc xin cúm gia cầm H5N1 được sản xuất dùng trong công nghệ
nuôi cấy virus trên phôi gà 9 - 11 ngày tuổi. Việc xác định được liều virus gây
nhiễm, nhiệt độ nuôi cấy, thời gian thu hoạch thích hợp để có thể thu được dịch
niệu với hiệu giá virus cao và ổn định là yếu tố quyết định đến thành công và
đảm bảo tính kinh tế khi sản xuất vắc xin cúm.
Với ý nghĩa trên chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Khảo sát điều
kiện nuôi cấy chủng virus NIBRG - 14 trên trứng gà có phôi trong sản xuất
vắc xin cúm A/H5N1 ở quy mô công nghiệp.”
Mục tiêu của đề tài: Tìm ra điều kiện nuôi cấy thích hợp nhất virus

H5N1 trên trứng gà có phôi để đem vào thử nghiệm và ứng dụng trên quy mô
công nghiệp.

2
Nội dung nghiên cứu:
• Xác định các điều kiện thích hợp để nuôi cấy virus cúm H5N1: thời gian,
nhiệt độ, độ ẩm, liều gây nhiễm.
• Thử nghiệm và áp dụng điều kiện nuôi thích hợp vào quy trình sản xuất
vắc xin cúm trên quy mô 5000-10000 liều/mẻ


3
Chương I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CÚM H5N1
Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus
cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, có khả năng lan truyền từ động vật
sang người. Virus H5N1 thể độc lực cao (HPAI) vẫn đang là mối đe dọa cho
chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng. Chúng ta có thể khống chế dịch bằng cách tiêu
diệt và loại trừ các loài gia cầm bị nhiễm bệnh trong vùng dịch để cắt đứt đường
lây truyền. Virus cúm A/H5N1 trong giai đoạn từ 2003 đến nay là thể có độc lực
cao, với sự xuất hiện nhiều genotype khác nhau, đặc biệt là genotype Z, lan
truyền từ Nam Trung Quốc đến các nơi khác trên thế giới. Tính gây bệnh của
virus A/H5N1 thể độc lực cao không chỉ giới hạn ở chức năng điểm cắt protease
của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứng của sản phẩm đa gen và khả năng
tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính gây bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần
tính đến. Trong thời gian này, đặc biệt là trong 5 năm gần đây trên thế giới có
hàng ngàn công trình nghiên cứu về cúm A và cúm A/H5N1 thậm chí là nghiên
cứu phát triển công nghệ sản xuất vắc xin gây miễn dịch cho gia cầm và để chuẩn
bị cho đại dịch có thể xảy ra ở người. Về phương diện dịch tễ, tiến hóa, tạo biến

chủng, biến đổi kháng nguyên - miễn dịch, tính mẫn cảm và đề kháng với dược
liệu, khác với nhiều virus khác ở gia cầm, virus cúm A/H5N1 có xu hướng đột
biến nhanh để tạo nên nhiều biến chủng phân chia thành nhiều phân dòng khác
nhau và có tính thích ứng phổ rộng đối với vật chủ.
1.2. TÌNH HÌNH BỆNH CÚM A/H5N1 Ở NGƯỜI TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM
1.2.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở người trên thế giới hiện nay
Cúm A/H5N1 là một phân nhóm có khả năng gây nhiễm cao của virus
cúm gia cầm. Chủng này lần đầu tiên được phát hiện và ghi nhận tại Hồng Kông
vào năm 1997 khi nó gây bệnh trên người và gia cầm. Tên gọi phân nhóm H5N1

4
liên quan đến loại protein kháng nguyên trên vỏ virus: protein hemagglutinin
nhóm 5 (H5) và neuraminidase nhóm 1 (N1).
Kể từ cuối năm 2003 sự lan truyền cúm A/H5N1 do các loài chim di cư ở
Châu Á, Châu Âu, Trung Đông và Châu Phi trở thành mối quan tâm lớn của
TCYTTG cũng như nhiều quốc gia trên toàn thế giới. Từ năm 2003 đến ngày
06/3/2012 theo thông báo của TCYTTG đã có tổng cộng 594 người mắc bệnh
dương tính với cúm A/H5N1, trong đó 349 người tử vong (chiếm tỷ lệ chung
58,75%) .
Các quốc gia có số mắc và số tử vong cao là các nước Ai cập (163/57);
Indonesia (186/134) và Việt Nam (122/61).
Có 15 quốc gia ghi nhận cúm A/H5N1 ở người từ 2003 đến nay như hình 1.1

Hình 1.1. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở người từ năm 2003 đến nay.

Hầu hết những ca nhiễm cúm gia cầm H5N1 trên người qua điều tra dịch tễ
học cho thấy có liên quan đến tiếp xúc với gia cầm bị bệnh hoặc trung gian qua
thực phẩm chế biến từ gia cầm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp như: giết mổ,
vận chuyển, mua bán, cầm và sờ vào gia cầm nhiễm bệnh. TCYTTG đã chia dịch

5
cúm thành 6 giai đoạn, từ mức độ chỉ là nguy cơ nhỏ cho đến khi đại dịch bùng
phát và lan tràn. TCYTTG đánh giá hiện nay đang nằm ở giai đoạn 3 của dịch,
điều đó thừa nhận sự gây nhiễm trên người của virus H5N1 nhưng chưa có bằng
chứng về sự lây truyền virus từ người sang người [19], [24], [29].
Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1 như hình 1.2 [34]


Hình 1.2. Các giai đoạn phát triển dịch cúm A/H5N1
1.2.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam
Tại Việt Nam, ca bệnh đầu tiên vào năm 2003, cho đến đầu tháng 3/2012
ghi nhận có tổng cộng 122 ca, đến ngày 7/3/2012 ghi nhận thêm 01 ca nhiễm
cúm A (H5) là một bệnh nhân nam 31 tuổi, ở xã Ea Tyh, huyện Ea Kar, đây là ca
bệnh thứ 4 xuất hiện tại Việt Nam trong năm 2012 và là ca bệnh đầu tiên tại Đắk
Lắk từ trước đến nay đang được theo dõi và điều trị tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới
Tp. Hồ Chí Minh (ca đầu tiên tại Kiên Giang, ca thứ 2 tại Sóc Trăng, ca thứ 3 tại
Bình Dương)


6
Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến 2012 như hình
1.3 [34], [35] .

Hình 1.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở nước ta từ năm 2003 đến 2012
Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 trên người được
ghi nhận đồng thời với thời điểm có dịch cúm trên gia cầm. Mặc dù số mắc ít
nhưng tỷ lệ tử vong chung rất cao (58,75%) và chi phí điều trị rất tốn kém, do
vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để khỏi mắc bệnh.
Trước tình hình dịch cúm A/H5N1 có nguy cơ lan rộng ở gia cầm và lây

lan sang người, Chính phủ, Bộ Y tế, UBND các tỉnh đã có chỉ đạo các địa
phương tiếp tục theo dõi chặt chẽ tình hình dịch bệnh truyền nhiễm trong nước
và thế giới, tăng cường giám sát chặt chẽ các trường hợp mắc cúm tại các địa
phương thông qua hệ thống giám sát trọng điểm cúm quốc gia, tại các bệnh viện
và tại cộng đồng, phát hiện sớm các trường hợp mắc, sự biến chủng của virus,
tổ chức điều tra dịch tễ để xác định nguồn lây và xử lý kịp thời ổ dịch. Và vắc
xin được xem là phương pháp phòng bệnh hiệu quả nhất trong phòng chống các
bệnh do virus cúm A/H5N1 gây ra.

7
1.2.3. Tình hình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người ở Việt Nam
Trước tình hình dịch bệnh và những thông tin đầu tiên về đại dịch có thể
xảy ra bất cứ lúc nào, ngay từ năm 2005 đến nay các nhà sản xuất vắc xin tại
Việt nam dưới sự tài trợ của nhiều tổ chức quốc tế đang nỗ lực phấn đấu phát
triển công nghệ sản xuất vắc xin cúm nói chung và vắc xin cúm đại dịch nói
riêng. Có thể điểm qua như sau:
• Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số I thuộc bộ Y tế (Vabiotech) từ giữa
năm 2004 phát triển kỹ thuật sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người trên tế bào
thận khỉ tiên phát. Chủng sản xuất ban đầu sử dụng là một chủng tái tổ hợp từ
chủng virus A/Vietnam/1203/2004 với 1 chủng tái hợp từ chủng virus phòng thí
nghiệm do trường đại học Tokyo, Nhật Bản cung cấp. Hiện nay, loại vắc xin này
đã qua giai đoạn thử nghiệm lâm sàng pha III trên người tình nguyện. Tuy nhiên,
vì là công nghệ mới, vắc xin được sản xuất trong phòng thí nghiệm nên vắc xin
cũng chỉ dừng ở mức độ đề tài nghiên cứu.
• Viện Vắc xin và sinh phẩm Y tế (IVAC): Từ năm 2006 đến 2009, thực
hiện đề tài nhánh cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 trên
trứng gà có phôi”, Viện đã sử dụng chủng NIBRG-14 nghiên cứu sản xuất thử
nghiệm thành công ở qui mô phòng thí nghiệm các lô vắc xin cúm A/H5N1.
Chủng NIBRG-14 được tạo bằng kỹ thuật di truyền đảo ngược từ chủng virus
A/H5N1 hoang dại độc lực cao A/Vietnam 1194/2004 và chủng virus cúm

phòng thí nghiệm PR8. Chủng do Viện NIBSC –Vương quốc Anh cung cấp và
được sự công nhận của TCYTTG. Kết quả nghiên cứu cho thấy vắc xin cho đáp
ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm đạt yêu cầu theo khuyến cáo của
TCYTTG. Trên cơ sở thành công của đề tài, năm 2007, Viện đã được TCYTTG
chọn là một trong các cơ sở nằm trong chiến lược dự trữ vắc xin cúm đại dịch
cho toàn cầu và được tài trợ xây dựng một nhà máy đạt chuẩn GMP-WHO để
sản xuất vắc xin cúm với công suất 1 -3 triệu liều vắc xin/năm. Tiếp theo, năm
2011, Tổ chức PATH (Mỹ) đã tiếp tục tài trợ nguồn kinh phí để vận hành nhà
máy. Sản phẩm vắc xin cúm A/H1N1 sản xuất trên dây chuyền công nghệ của
nhà máy hiện nay đang được thử nghiệm lâm sàng trên người. Tiếp tục chiến
lược sản xuất vắc xin cho đại dịch, từ tháng 10/2011 đến nay nhà máy bắt đầu

8
sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 bằng chủng NIBRG-14, hướng tới thử nghiệm
lâm sàng dự kiến thực hiện vào năm 2013 cho loại vắc xin này. Nếu thử nghiệm
lâm sàng thành công, Vắc xin sẽ được đăng ký cấp phép sản xuất ở qui mô công
nghiệp với công suất 1-3 triệu liều/năm, đủ đáp ứng cho nhu cầu phòng chống
dịch cho các đối tượng có nguy cơ cao.
• Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu phát triển dạng vắc xin
nuôi cấy trên tế bào VERO, sử dụng chủng NIBRG-14. Tuy nhiên dạng vắc xin
này cũng mới chỉ dừng ở mức độ đề tài nghiên cứu.
1.3. TÁC NHÂN GÂY BỆNH
1.3.1. Đặc điểm sinh học của Virus cúm A/H5N1
Virus cúm A (còn gọi là virus cúm gia cầm, virus cúm gà) có tên khoa học
là Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại
chung (Basic Taxomomy) [22]. Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc
hình khối đa diện, đường kính 80-120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối
lượng phân tử khoảng 250 triệu Da [19], [24], [29].
• Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA;
70 - 75% là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate [11].

• Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và
lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand [11].

Hình 1.4. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp
ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A
Ghi chú:
- A: Các dạng hình thái khác nhau của virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử.

9
- B: Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (Hemagglutinin: phân tử kháng
nguyên HA, Neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA; PB2, PB1, PA:
ba dưới đơn vị phức hợp enzyme polymerase của virus).
- C: Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP
Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus,
bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ được
đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai
mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm có đường
kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất cấu tạo là
glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus [14]. Có
sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng
1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá
trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm [7], [8]. Vật chất di truyền (còn
gọi là hệ gen) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm ((-) ssRNA), gồm 8 phân
đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) nối với nhau thành một
sợi duy nhất bên trong vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tương ứng của virus,
trong đó phân đoạn M mã hóa cho 2 protein là M1 và M2, phân đoạn NS mã hóa
cho 2 protein là NS và NEP, phân đoạn PB1 mã hóa cho 2 protein là PB1 và PB1
- F2 [21] (hình 1.4).
Về danh pháp, nhóm virus cúm A được phân chia thành nhiều phân type
(subtype), các phân type này được phân biệt bởi sự khác nhau ở các đặc tính

kháng nguyên bề mặt (NA và HA), cho đáp ứng miễn dịch khác nhau giữa các
chủng virus ở cơ thể bị nhiễm [7], [8]. Có 16 phân type HA và 9 phân type NA
đã được phát hiện, sự tổ hợp giữa các phân type này, về lí thuyết, có thể tạo ra
hơn 254 biến chủng khác nhau, trừ chủng ban đầu [29]. Hiện nay, dữ liệu gen và
hệ gen của virus cúm A có thể được tìm thấy trong Ngân hàng gen [18], tại mạng
lưới chuyên gia cúm gia cầm của Tố chức Nông lương thế giới (FAO) và Tổ
chức Thú y thế giới (OIE) [22], [23]; và tại trang web của Trung tâm dữ liệu các
gen virus
(Influenza Sequence Database
). TCYTTG đã quy định thống nhất danh
pháp theo thứ tự kí hiệu: Tên serotype - Loài động vật bị nhiễm - Vùng địa lí
phân lập - Số hiệu đăng kí chủng virus - Thời gian phân lập - Loại hình phân type

10
[HA(H) và NA(N)]; ví dụ: A/Chicken/Vietnam/ HG4/2005(H5N1). Đối với các
virus được phân lập trên người bệnh, thì không cần ghi loài mắc trong danh pháp, ví
dụ: A/Vietnam/1194/2004(H5N1) [31].
1.3.2. Độc lực và tính thích ứng vật chủ
 Độc lực gây bệnh của virus cúm A
Tính gây bệnh hay độc lực của virus cúm A được chia làm hai loại:
Loại độc lực cao (HPAI), và loại độc lực thấp (LPAI), cả hai loại đều cùng
tồn tại trong tự nhiên [21].
• HPAI: là loại virus cúm A có khả năng gây tổn thương nhiều cơ quan nội
tạng trong cơ thể nhiễm, trên gia cầm chúng thường gây chết 100% số gia
cầm bị nhiễm trong vòng 48 giờ sau nhiễm, loại này rất nguy hiểm gây lo
ngại cho cộng đồng. Virus loại HPAI phát triển tốt trên tế bào phôi gà và
tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có trypsin [29].
• LPAI: là loại virus khi phát triển trong cơ thể nhiễm, có thể gây bệnh cúm
nhẹ không có triệu chứng lâm sàng điển hình và không làm chết vật chủ.
Đây là loại virus lây truyền rộng rãi và tạo nên các ổ bệnh trong tự nhiên

của virus cúm A, loại này có thể trao đổi gen với các chủng virus có độc
lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virus HPAI nguy
hiểm [29].
 Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1
Vật chủ tự nhiên của tất cả các chủng virus cúm A/H5N1 là chim hoang
dã (chủ yếu là vịt trời), đây là nguyên nhân lan truyền virus trong tự nhiên rất
khó kiểm soát. Virus cúm A có khả năng gia tăng biên độ vật chủ của chúng
trong quá trình lây truyền ở tự nhiên [21]. Nhờ đặc tính luôn thay đổi kháng
nguyên trong tự nhiên, virus cúm A có khả năng xâm nhiễm ở nhiều loài vật
chủ trung gian khác nhau như gia cầm, một số loài động vật có vú (hải cẩu, cá
voi, ngựa, lợn) và cả ở người, tạo nên tính thích ứng lan truyền “nội loài” như
gà - gà, hay “ngoại loài” như gà - lợn; gà - lợn - người (hình 1.6). Vịt (vịt trời)
và một số loài thuỷ cầm khác (ngỗng) luôn luôn là vật chủ tàng trữ nguồn virus
gây nhiễm [34]. Đặc điểm thích ứng vật chủ này là điều kiện thuận lợi cho virus
cúm A trao đổi, tái tổ hợp các phân đoạn gen, đặc biệt là các phân đoạn gen

11
kháng nguyên (gen “độc” HA và NA) giữa các chủng, tạo ra một chủng virus
cúm mới có khả năng thích ứng xâm nhiễm ở loài vật chủ mới của chúng đặc
biệt khi chúng vượt qua được “rào cản loài” dễ dàng thích ứng lây nhiễm gây
bệnh từ gia cầm sang người và giữa người với người [18], [19]. Trong lịch sử
các đại dịch cúm ở người, lợn thường là vật chủ trung gian chuyển tiếp giúp
cho virus cúm A biến đổi để dễ dàng lây nhiễm sang người gây nên bệnh dịch
[21], [35]. Ví dụ như: cúm A/H3N2 là kết quả tái tổ hợp tự nhiên của virus cúm
A/H2N2 của người và virus chứa gen H3 trong tự nhiên thông qua đồng nhiễm
trên lợn, gây nên đại dịch cúm châu Á năm 1968 [19], [24], [29].
 Sức đề kháng
Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân bất hoạt vật lí hay hóa
học. Các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 đến 7,9. Ở pH quá
acid hay quá kiềm, khả năng lây nhiễm của virus bị giảm mạnh [17]. Lớp vỏ

ngoài của virus bản chất là lớp lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm, dễ
bị phá hủy bởi các dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và các chất sát trùng:
formaldehyde, phenol, β-propiolacton, sodium hypochloride, acid loãng và
hydroxylamine. Virus bị bất hoạt dưới ánh sáng trực tiếp sau 40 giờ, tồn tại được
15 ngày ánh sáng thường, tia tử ngoại bất hoạt được virus nhưng không phá hủy
được kháng nguyên của virus. Tuy nhiên, virus cúm A dễ dàng bị tiêu diệt hoàn
toàn ở 100
o
C và ở 60
o
C/30 phút, tồn tại ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ thấp (trong
phân gia cầm), và tới hàng năm ở nhiệt độ bảo quản (−70
o
C). Trong phủ tạng gia
cầm (40
o
C), virus tồn tại 25 - 30 ngày, nhưng chỉ tồn tại 7 - 8 ngày ở nhiệt độ cơ
thể người (37
o
C), trong nước, virus có thể sống tới 4 ngày ở nhiệt độ 30
o
C [22],
[29].

12
1.3.3. Đường xâm nhập và lây bệnh của bệnh cúm A/H5N1
 Đường xâm nhập của virus vào tế bào chủ
Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân
lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa
của cơ thể nhiễm [22], [24], có những nét đặc trưng như sau:

• Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp
của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối
cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào
nhiễm (Hình 1.5).
• Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế
bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy
ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra
khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase. Thời gian
một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus
cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 giờ). Sự tạo thành các hạt virus
mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ
thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chương
trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ [29], [35].
• Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của
virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của
virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA - dependent RNA
transcription). Phức hợp protein - RNA của virus được vận chuyển vào
trong nhân tế bào [15].
• Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi
dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này
chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase.
Các sợi này không được adenine hóa (gắn thêm các adenine - gắn mũ)
ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức
hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào
tương tế bào. Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép
nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme

13
PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận
chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên

các protein của virus (Hình 1.5).
• Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển
gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là
hiện tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển
trở lại nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng
các RNP của virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các
“chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ
thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phóng
các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [22],
[23].
Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A ở tế bào chủ ở
hình 1.5 [11].

Hình 1.5. Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên
của virus cúm A ở tế bào chủ

 Phương thức lây truyền
Các chủng của virus cúm gia cầm có thể lây nhiễm cho nhiều loại động
vật khác nhau như chim, lợn, ngựa, hải cẩu, cá voi, hổ và người. Virus cúm có

14
thể lan truyền nhanh từ trại chăn nuôi này sang trại chăn nuôi khác bằng các cơ
chế cơ học qua các phương tiện vận chuyển, quần áo, giày dép Virus có nhiều
trong chất bài tiết như dịch mũi họng, phân gia cầm bệnh, bụi và đất. Tiếp xúc
trực tiếp với gia cầm bệnh hoặc đồ dùng, vật dụng bị nhiễm bởi phân gia cầm là
đường lây truyền chính. Virus có thể lây truyền qua không khí (qua các giọt nhỏ
dịch tiết đường hô hấp của gia cầm bệnh hoặc hít phải không khí có chứa bụi từ
phân gia cầm) hay qua ăn uống (nước, thực phẩm nhiễm virus ) và tiếp xúc với
dụng cụ và đồ vật nhiễm virus. Người có thể bị lây bệnh do tiếp xúc trực tiếp với
gia cầm bị bệnh qua chăn nuôi, vận chuyển, giết mổ, chế biến, ăn gia cầm và sản

phẩm của gia cầm bệnh chưa được nấu chín hoặc chế biến không hợp vệ sinh.
 Khả năng gây bệnh của virus cúm A
Virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm cao với biểu mô đường hô hấp,
gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp, và cũng có thể tác động gây tổn thương
nhiều cơ quan khác trong cơ thể của các động vật cảm nhiễm, do đó còn được
gọi là virus hướng đa phủ tạng [29], [24], [35]. Khả năng gây bệnh của virus
cúm A phụ thuộc vào độc lực và tính thích nghi vật chủ của từng chủng virus.
Thông thường chúng không gây bệnh hoặc chỉ gây bệnh nhẹ giới hạn ở đường
hô hấp của chim hoang dã và gia cầm nhiễm, nhưng một số chủng cường độc
(H5, H7, và H1, H2, H3) có thể gây bệnh nặng ở hầu hết các cơ quan trong cơ
thể, gây nên dịch cúm ở gia cầm và ở người do tính thích ứng thụ thể sialic của
chúng [28], [35]. Hầu hết các chủng virus cúm A nhân lên rất tốt trong phôi gà
sau lần cấy truyền thứ nhất, tuy nhiên các chủng cường độc phân type H5, H7
gây chết phôi gà ngay sau vài giờ, cả khi hàm lượng virus rất thấp chưa được
nhân lên nhiều, và có thể gây bệnh cúm thực nghiệm trên chuột lang, chuột
Hamster, chồn đất [19], [20], [35].
Sau khi bị nhiễm virus cúm A, cơ thể vật chủ sinh ra đáp ứng miễn dịch
chống lại virus để bảo vệ cơ thể, nhưng đáp ứng miễn dịch này có thể không có
tác dụng bảo vệ hoàn toàn cho những lần nhiễm sau, do virus cúm A luôn có sự
biến đổi kháng nguyên của nó trong quá trình lưu hành ở tự nhiên, và không có
đáp ứng miễn dịch chéo giữa các chủng virus cúm A [29]. Do đó, khi xuất hiện
những biến chủng virus cúm A có đặc tính kháng nguyên khác với các chủng

15
virus trước đó, cơ thể nhiễm sẽ không hoặc ít có đáp ứng miễn dịch bảo hộ thích
ứng với chủng virus cúm mới. Đây là nguyên nhân làm cho gia cầm và con người
thường bị mắc bệnh cúm nhiều lần trong năm, và các đợt dịch cúm xảy ra về sau
thường nặng nề hơn và có thể gây nên đại dịch cúm mới [35]. Khả năng gây bệnh
của biến chủng virus cúm mới giảm hoặc biến mất, khi cơ thể có được đáp ứng
miễn dịch đặc hiệu với biến chủng đó và chúng trở nên thích nghi lây nhiễm ở

loài vật chủ mới [35]. Ví dụ: virus A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2 là nguyên nhân
của các đại dịch cúm trên người trước đây và đã thích nghi lây nhiễm ở người
[21]. Tuy nhiên, các chủng này vẫn thường gây ra các vụ dịch cúm tản phát hàng
năm ở người, do khả năng biến đổi kháng nguyên của chúng [18]. Đây cũng
chính là nguồn virus trao đổi gen với các chủng virus cúm đang lưu hành ở gia
cầm, để thích ứng lây nhiễm gây bệnh cho nhiều loài khác ngay cả trên người
[29], [35].

Hình 1.6. Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ
của virus cúm A [35]

1.3.4. Đặc điểm kháng nguyên - miễn dịch
 Cấu trúc, chức năng của HA và NA
• Haemagglutinin
Haemagglutinin (HA) là một glycoprotein có cấu trúc trimer, dạng hình
cây mọc nhô ra từ màng lipid của virus với tán cây hình cầu nằm ở phía ngoài.
HA có khả năng gây ngưng kết (agglutinate) hồng cầu.

16
HA là kháng nguyên quan trọng nhất quyết định độc tính của virus nhờ
khả năng nhận biết và gắn vào thụ thể (receptor) của tế bào chủ. Khả năng này
phụ thuộc vào hai yếu tố:
- Hai dạng phân tử sialic acid (SA) trên thụ thể (receptor) của tế bào chủ:
N -acetylneuraminic acid và N - glycolylneuraminic acid.
- Hai kiểu liên kết với galactose: liên kết alpha - 2,6Gal hay liên kết alpha-
2,3Gal trên bề mặt của tế bào chủ.
HA virus cúm chim có ái lực với liên kết SA anpha - 2,3Gal, có nhiều ở
các tế bào biểu mô của ruột. Ngược lại, HA virus cúm người liên kết với liên kết
SA alpha -2,6Gal, các tế bào biểu mô của khí quản người phần lớn chứa liên kết
trên. Vì vậy virus tấn công cơ quan hô hấp của người, gây bệnh nặng và thường

dẫn đến tử vong.
Ở heo, các tế bào biểu mô của khí quản mang cả hai loại SA và hai loại
liên kết nêu trên. Vì vậy, loài heo trở thành vật chủ trung gian có thể bị nhiễm cả
hai loại virus cúm chim và cúm người. Điều này tạo điều kiện cho quá trình tái tổ hợp
tạo một biến chủng virus cúm có độc tính cao và lan truyền trong cộng đồng người.
Trong 16 type HA, đến nay chỉ có 3 phân type H1, H2, và H3 liên quan
đến các đại dịch đã xảy ra ở người. Gần đây các phân type H5, H7 và H9 được
xác định là có khả năng gây bệnh trên người.
• Neuraminidase
Tương tự như HA, neuraminidase (NA) là một glycoprotein, có một đầu
gồm 4 monomer hình cầu trên cùng mặt phẳng và một vùng kị nước gắn vào
màng virus có dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt virus cúm.
NA (hay còn gọi la sialidase) là enzyme có chức năng ngược với HA, nó
phân cắt sialic acid bằng cách cắt liên kết glycoside nối nhóm keto của acid sialic
với D-galactose hoặc D - galactosamine. Phản ứng này cho phép virus tiến qua
lớp niêm dịch để tới các tế bào của đường biểu mô hô hấp trong quá trình nhiễm
trùng. Ngoài ra, việc loại bỏ acid sialic của phân tử HA từ các virion mới được
tổng hợp giúp phóng thích các hạt virion ra khỏi tế bào bị nhiễm và gia tăng khả năng
nhiễm trùng.

17
Cho đến nay, trong 9 phân type NA, chỉ có N1 và N2 được xác nhận là
liên quan đến các vụ dịch ở người.
• Các phương thức biến đổi kháng nguyên
Có ba phương thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus cúm A [35].
• Hiện tượng lệch kháng nguyên
Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất là các đột biến điểm xảy ra
các phân đoạn gen/hệ gen của virus. Do virus cúm A kí sinh nội bào bắt buộc,
không có cơ chế “đọc và sửa bản sao - proof reading” trong quá trình phiên mã
và sao chép ở nhân tế bào đích. Sự thiếu hụt enzyme sửa chữa RNA dẫn đến các

enzyme sao chép phụ thuộc RNA sẽ có thể “gài” thêm (đột biến giãn nở), làm
mất đi hoặc thay thế (đột biến trượt - xóa) [35] một hay nhiều nucleotide mà
không được sửa chữa trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus [22], [35].
Tuỳ thuộc vị trí xảy ra các đột biến trong bộ ba mã hóa, mà có thể trực tiếp làm
thay đổi các amino acid trong trình tự của protein được mã hóa biểu hiện, dẫn
đến thay đổi thuộc tính của protein, hoặc được tích lũy trong phân đoạn gen xảy
ra đột biến (đột biến điểm). Tần suất xảy ra đột biến điểm rất cao, cứ mỗi 10.000
nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus cúm A) thì có 1
nucleotide sai khác [29], [35]. Như vậy, gần như mỗi hạt virus mới được sinh ra
đều chứa đựng một đột biến điểm trong hệ gen của nó, và các đột biến này được
tích lũy qua nhiều thế hệ virus sẽ làm xuất hiện một phân type virus mới có
những đặc tính kháng nguyên mới có thể bị sai lệch (Hình1.7).
Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân đoạn gen kháng nguyên NA
và HA, tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới, hoặc làm thay đổi cấu
trúc dẫn đến thay đổi đặc tính của protein đó, hoặc có khả năng glycosyl hóa
rất cao trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên, tạo ra một biến thể
virus mới thay đổi độc lực gây bệnh hay đặc tính kháng nguyên mới [29], [35].
• Hiện tượng trộn kháng nguyên
Hiện tượng trộn kháng nguyên (còn gọi là trao đổi hay tái tổ hợp) các
gen kháng nguyên (antigenic shift) chỉ có ở virus cúm, và rất ít ở một số
virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả năng biến chủng
rất cao. Hệ gen gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt của virus cúm A được 2

18
chủng virus cúm A khác nhau khi đồng nhiễm trong một tế bào trao đổi cho
nhau, để có thể xảy ra sự hoà trộn (reassort) hoặc trao đổi (swap) các phân
đoạn gen của hai chủng virus đó trong quá trình kết hợp lại RNA hệ gen, tạo
ra các trạng thái khác nhau của RNA hệ gen của các hạt virus mới từ hai
RNA hệ gen của những virus ban đầu. Kết quả là đã tạo ra thế hệ virus mới
có các phân đoạn gen kết hợp, và đôi khi giúp cho chúng có khả năng lây

nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực gây bệnh (Hình 1.7) [18], [35].
• Hiện tượng glycosyl hóa
Glycosyl hóa (glycosylation) là sự gắn kết của một chuỗi carborhydrate
(oligosaccharide) vào với amino acid asparagine (N) ở một số vị trí nhất định
trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay một số polypeptide khác của virus
cúm. Thông thường chuỗi oligosaccharide được gắn tại vị trí N – X - S/T (N =
Asparagine; X = amino acid bất kì, trừ Proline; S/T = Serine hoặc Threonine)
[14]. Đây là những vị trí được cho là gắn kết với các kháng thể được cơ thể sinh
ra do kích thích của kháng nguyên, nhằm bảo vệ cơ thể nhiễm. Hiện tượng lệch
kháng nguyên sinh ra đột biến điểm hình thành bộ mã của Asparagine, tạo tiền đề
cho hiện tượng glycosyl hóa xảy ra khi tổng hợp chuỗi polypeptide HA hay NA,
làm thay đổi biểu hiện đặc tính kháng nguyên của HA và NA, giúp cho virus
thoát khỏi tác động miễn dịch bảo hộ của cơ thể chủ và điều hoà sự nhân lên của
virus [4], [14], [35].
Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời
gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của
virus cúm A, khi đồng nhiễm trong một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau.
Đây cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay, mặc dù
virus này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng
gây bệnh được cho người, và rất có thể virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp (vay mượn)
gen HA hay NA, hoặc cả hai gen của các chủng virus cúm A đã thích nghi ở
người, để tạo ra một biến chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người,
gây ra nguy cơ của một đại dịch cúm mới và đặt ra một định hướng mới trong
phòng chống [18], [35].