Khảo sát điều khiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC








NGUYỄN DUY KHÁNH


KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO
TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis



LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC








KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO
TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis




LUẬN VĂN KỸ SƢ
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC



Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN DUY KHÁNH
KHÓA: 2002 – 2006



Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY









EXAMINE CULTURE CONDITION AND
SPORULATION OF Bacillus subtilis


GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY



Professor Student
Dr.NGUYEN NGOC HAI NGUYEN DUY KHANH
TERM: 2002 - 2006



HCMC, 09/2006

i

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường
Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh
học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học
tại trường.

Em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hướng dẫn dạy
dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khoá luận.

Em xin chân thành cám ơn TS. Lê Anh Phụng, BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan
đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận.

Em xin chân thành cảm ơn Phòng vi sinh, Khoa Chăn nuôi – Thú Y đã cho
phép và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại phòng.

Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 28 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong
thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Duy Khánh

ii
TÓM TẮT
NGUYỄN DUY KHÁNH, ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “KHẢO
SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ SINH BÀO TỬ VI KHUẨN Bacillus subtilis”.
Hội đồng hướng dẫn:
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Việt nam là một nước nông nghiệp có nghành chăn nuôi rất phát triển và có đóng
góp rất lớn vào sự phát triển kinh tế của đất nước. Vì vậy, vấn đề nâng cao năng suất,
chất lượng sản phẩm và cải thiện môi trường chăn nuôi rất được quan tâm ở nước ta
hiện nay. Xuất phát từ vấn đề này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khảo sát đặc điểm
của vi khuẩn Bacillus subtils, tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp và xử lí bào tử để
sản xuất chế phẩm sinh học nhằm cung cấp những thông tin để chọn lựa những điều
kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, từ đó sản xuất chế phẩm sinh học
cung cấp cho nghành chăn nuôi.
Qua quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã có những ghi nhận sau:
Khảo sát ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy lắc (15 phút lắc, 45
phút nghỉ) thì chế độ nuôi cấy lắc cho số lượng vi khuẩn cao hơn.
Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường khác nhau (TSB, TSB + 1% glucose,
TSB + 1% cao nấm men, TSB + 1% glucose + 1% cao nấm men) thì môi trường TSB
cho số lượng vi khuẩn thấp nhất, 3 môi trường còn lại là những môi trường phù hợp
cho Bacillus subtilis phát triển.
Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường (pH 7 và 7,5), thời gian (24,36 và 48 giờ)
và nhiệt độ nuôi cấy (nhiệt độ phòng, 37
o
C) thì ở pH 7, thời gian 48 giờ và nhiệt độ

nuôi cấy 37
o
C cho số lượng vi khuẩn lớn nhất.
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ (50, 70), pH (6, 9) và thời gian xử lí (3, 5 và 7
giờ) đến sự hình thành bào tử thì khi xử lí ở các nhiệt độ và pH này có sự ảnh hưởng
đến quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis.






iii
MỤC LỤC
Trang tựa
Lời cảm tạ ........................................................................................................... i
Tóm tắt ............................................................................................................... ii
Mục lục ............................................................................................................. iii
Danh sách chữ viết tắt ...................................................................................... iv
Danh sách các hình ............................................................................................ v
Danh sách các bảng .......................................................................................... vi
Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ......................................................................................... 1
1.2. Mục đích – Yêu cầu ........................................................................... 1
Phần 2. TỔNG QUAN ..................................................................................... 2
2.1. Đại cương về vi khuẩn Bacilus subtilis ........................................... 2
2.1.1. Lịch sử phát triển .................................................................... 2
2.1.2. Đặc điểm phân loại ................................................................. 2
2.1.3. Đặc điểm phân bố ................................................................... 2
2.1.4. Đặc điểm hình thái .................................................................. 2

2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy ................................................................... 3
2.1.6. Đặc điểm sinh hoá ................................................................... 3
2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên ........................................................... 4
2.1.8. Tính chất đối kháng của B. subtilis với một số vi sinh vật
gây bệnh ....................................................................................... 4
2.2. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis............................................... 5
2.2.1. Khả năng sinh bào tử................................................................ 6
2.2.2. Cấu tạo của bào tử .................................................................... 7
2.2.3. Thành phần hoá học của bào tử ................................................ 8
2.2.4. Sự nảy mầm của bào tử ............................................................ 9
2.2.5. Sức đề kháng của bào tử .......................................................... 9
2.3. Hệ vi sinh vật đường ruột và sự loạn khuẩn ................................... 10
2.3.1. Hệ vi sinh vật đường ruột ....................................................... 10
2.3.2. Vai trò của hệ vi sinh vật đường ruột ...................................... 11

iv
2.3.3. Sự loạn khuẩn ......................................................................... 12
2.4. Giới thiệu chung về probiotic ......................................................... 13
2.4.1. Định nghĩa .............................................................................. 13
2.4.2. Chức năng sinh học của probiotic .......................................... 13
2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa
vi khuẩn Bacillus subtilis .............................................................. 14
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................ 16
3.2. Vật liệu thí nghiệm .......................................................................... 16
3.2.1. Giống vi khuẩn ....................................................................... 16
3.2.2. Môi trường nuôi cấy ............................................................... 16
3.2.3. Hoá chất .................................................................................. 16
3.2.4. Thiết bị và dụng cụ .................................................................. 16
3.3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 17

3.4. Phương pháp thực hiện đề tài ......................................................... 17
3.4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .................. 17
3.4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtilis ........................................ 17
3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc)
và thời gian nuôi cấy đến số lượng vi khuẩn ............................. 17
3.4.2.2. Khảo sát môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp cho
vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển tạo sinh khối .................... 18
3.4.2.3. Khảo sát pH môi trường thích hợp cho nuôi cấy
vi khuẩn Bacilus subtilis .......................................................... 19
3.4.3. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis ............................. 20
3.4.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo bào tử của
vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................ 20
3.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự tạo bào tử của
vi khuẩn Bacillus subtilis ....................................................... 21
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 22
4.1. Khảo sát đặc điểm sinh học của Bacillus subtilis .................................... 22
4.1.1. Đặc điểm hình thái của Bacillus sutilis .......................................... 22

v
4.1.2. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis ......................... 22
4.1.3. Quan sát dăc điểm nuôi cấy Bacillus subtilis trên môi trường canh23
4.1.4. Tính chất sinh hoá ........................................................................... 23
4.2. Các thí nghiệm về Bacillus subtíils ......................................................... 25
4.2.1. Khảo sát chế độ (nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy lắc) và thời gian
nuôi cấy thích hợp ................................................................................. 25
4.2.2. Khảo sát môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp .................... 27
4.2.3. Khảo sát pH môi trường nuôi cấy vi khuẩn thích hợp .................... 29
4.2.4. Các thí nghiệm về bào tử Bacillus subtilis ..................................... 30
4.2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử
của Bacillus subtilis ......................................................................... 30

4.2.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử
của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................... 32
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 34
5.1. Kết luận.................................................................................................... 34
5.2. Đề nghị .................................................................................................... 34
Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................. 36
Phần 7. PHỤ LỤC ........................................................................................ 38













vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................. 3
Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử ........................................................................... 6
Hình 2.3. Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis ........................................................... 7
Hình 4.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi ở
độ phóng đại 1000 lần ..................................................................... 22
Hình 4.2. Đặc điểm khuẩn lạc của Bacillus subtilis trên môi trường TSA ..... 23
Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus subtilis trên môi trường thạch tinh bột ............. 23

Hình 4.4. Phản ứng lên men một số loại đường của
vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................ 25























vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis ..................................... 4
Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dưỡng của Bacillus subtilis 8

Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm 1 .......................................................................... 18
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm 2 .......................................................................... 19
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm 3 .......................................................................... 20
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm 4 .......................................................................... 21
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm 5 .......................................................................... 21
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của thời gian và chế độ nuôi cấy đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................... 25
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian nuôi cấy đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis................................................................... 27
Bảng 43. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................................... 29
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của
vi khuẩn Bacillus subtilis .................................................................... 30
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn
Bacillus subtilis ................................................................................... 32













viii
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy và thời gian đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis.............................................................. 26
Biểu đồ 4.2. Ảnh hưởng của thời gian và môi trường nuôi cấy đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................. 28
Biểu đồ 4.3. Ảnh hưởng pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy đến số lượng
vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................ 29
Biểu đồ 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành bào tử của
vi khuẩn Bacillus subtilis............................................................ 31
Biểu đồ 4.5. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành bào tử của vi khuẩn
Bacillus subtilis .......................................................................... 33
1

Phần 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, các loại chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đã và đang được sử dụng
ngày càng phổ biến. Đặc biệt là các chế phẩm từ vi khuẩn Bacillus subtilis.
Nước ta là một nước nông nghiệp, ngành chăn nuôi rất phát triển. Với mục đích
tăng năng suất chất lượng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng, bảo
vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các loại hoá chất độc hại và đặc biệt là nhằm
hạn chế dần việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, chế phẩm sinh học là một giải
pháp tối ưu để thực hiện mục đích này. Vì vậy, các nhà chăn nuôi đã rất chú ý đến vấn
đề sử dụng chế phẩm sinh học.
Chế phẩm sinh học chứa các vi sinh vật sống có lợi, người ta chọn lọc các vi
sinh vật có lợi có tính đối kháng cao để đưa vào đường ruột tạo sự cân bằng có lợi cho
hệ vi sinh vật đường ruột, khôi phục lại hoạt động bình thường, ức chế vi sinh vật có
hại cho vật nuôi. Ngoài ra, chế phẩm sinh học còn cải thiện lượng thức ăn ăn vào và
khả năng tiêu hoá, cung cấp chất dinh dưỡng…
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Ngọc

Hải, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào
tử vi khuẩn Bacillus subtilis”.
1.2. Mục đích – Yêu cầu
 Mục đích
Tìm hiểu điều kiện: nhiệt độ, thời gian, pH, môi trường nuôi cấy thích hợp và
nhiệt độ, pH xử lý bào tử để ứng dụng sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học.
 Yêu cầu
 Khảo sát đặc điểm của Bacillus subtilis: về hình thái khuẩn lạc, tế bào vi
khuẩn…
 Tìm điều kiện: nhiệt độ, pH, môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp.
 Tìm điều kiên: nhiệt độ, pH xử lý tạo bào tử.



2

Phần 2. TỔNG QUAN

2.1. Đại cƣơng về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát triển
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức
y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các bệnh sĩ
Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Việc sử dụng để điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 - 1957 khi Henry,
Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó,
“subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại
tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá.
Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi
trong chăn nuôi, y học, thực phẩm….
2.1.2. Đặc điểm phân loại

Theo khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
2.1.3. Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng
được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước….
Phần lớn chúng tồn tại ở trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng
10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất hoang thì Bacillus subtilis
rất hiếm.
Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển có sự tồn tại của bào tử và tế bào
sinh dưỡng Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996).
2.1.4. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G
+
, kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,8 –
3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, 8 - 12 lông.
Sinh bào tử nhỏ hơn vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 µm.
3

Phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng
chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ…(Tô Minh Châu, 2000).


Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis
(www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba..._)

2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy
Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37

o
C.
Nhu cầu O
2
: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển
trong môi trường thiếu oxy.
Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4.
Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều,
có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 - 5mm. Sau 1- 4 ngày
bề mặt nhăn nheo màu hơi sẩm.
Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sóng.
Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng
nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan đều khi lắc lên.
Dinh dưỡng cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác.
2.1.6. Đặc điểm sinh hoá
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, manitol, saccharose,
xylose, arabinosse.
Indol (-), nitrate (-), VP (+), H
2
S (-), NH
3
(+), catalase (+), amylase (+), casein
(+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+).

Dung huyết: một số dòng gây dung huyết ở dạng trên thạch máu ngựa và thỏ do
tác động của hemolysine.
4

Bảng 2.1. Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis

Phản ứng sinh hoá Kết quả
Hoạt tính catalase +
Sinh Indol -
MR +
VP +
Sử dụng citrate +
Khử Nitrate +
Tan chảy Gelatin +
Di động +
Phân giải tinh bột +
Arabinose +
Xylose +
Saccharose +
Mannitol +
Glucose +
Lactose -
Maltose +

(Theo Holt, 1992)

2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên
Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và L -
acid glutamic.
Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G
+
và G
-
.
Bệnh học: đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh.
2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây bệnh

Do Bacillus subtilis là vi khuẩn bắt buộc đường ruột nên ngoài khả năng chịu
đựng được acid dạ dày , các chất dịch tiêu hoá trong đường ruột. Chúng còn có khả
năng đấu tranh lại với các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột.
5

 Với các vi sinh vật gây bệnh
Môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số
lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh trạnh không gian sống giữa vi
khuẩn và nấm.
Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24h) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh
dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của
nấm bị ức chế.
 Với đồng loại
Các chuyên gia tại Đại Học Havard, Mỹ cho biết: khi chất dinh dưỡng bắt đầu
cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng cách chuyển sang tình trạng “ngủ đông”, hay
nghỉ ngơi trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực hiện điều đó bằng cách tạo ra
bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều năm, thậm chí hàng thế kỉ.
Tuy nhiên trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu nhận thấy ở giai đoạn rất
sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào Bacillus đã tạo ra kháng sinh để giết chết
những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá
vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang
hình thành bào tử tiêu thụ.
Theo các nhà nghiên cứu trên, quá trình tạo bào tử tiêu tốn một lượng lớn năng
lượng, phải mất vài giờ và khi đã bắt đầu thì không thể đảo ngược. Do đó, vi khuẩn sẽ
cố gắng tránh thời điểm đó càng lâu càng tốt.
Đặc biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt
những kẻ xung quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến
khi phải chuyển sang sống tiềm sinh (Nguyễn Thị Công Dung, 2004).
2.2. Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, nó giúp cho vi khuẩn vượt qua

những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích
hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi…. Mỗi vi khuẩn chỉ tạo
được một bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm để trở về dạng tế bào
sinh dưỡng.


6

2.2.1. Sự hình thành bào tử
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử
trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử trong
chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong
môi trường bị kiệt quệ, nhiệt độ…) (Tô Minh Châu, 2000).
Quá trình hình thành bào tử gồm các bước
1. Hình thành vách ngăn.
2. Sự tạo tiền bào tử.
3. Tạo lớp vỏ bào tử.
4. Sự tổng hợp các lớp vỏ bào tử.
5. Sự giải phóng bào tử.

Hình 2.2. Quá trình tạo bào tử
www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html

Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo thành tiền
bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát
triển và trở thành bào tử.
Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh dưỡng phân giải và bào tử được giải phóng
ra khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị trương ra. Sau
đó vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào

sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).


7

2.2.2.Cấu tạo của bào tử
Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hoá học cơ bản
như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và
có thêm một số thành phần mới. Phía ngoài của nguyên sinh chất được bao bọc bởi
nhiều lớp màng.



Hình 2.3. Cấu tạo bào tử Bacillus sutilis
www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html

Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, rất mỏng nhưng không thấm nước, cấu
tạo chủ yếu là lipoprotein.
Dưới lớp màng là vỏ, vỏ bào tử có nhiều lớp, bề mặt của các lớp này xù xì, thành
phần hoá học là protein và có sự tham gia của keratin đây là những lớp có khả năng
ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước, chúng có tác dụng
tăng cường khả năng bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợi.
Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất
đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở
trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương. 2004).
Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học, tính chất sinh lí.

8

Bảng 2.2. Sự khác nhau giữa bào tử và tế bào sinh dƣỡng của B. subtilis

Đặc tính Tế bào sinh dưỡng Bào tử
Cấu trúc Tế bào G
+
, điển hình Vỏ bào tử dày, khó thấm
nước
Thành phần hoá học
Canxi Thấp Cao
Protein Thấp hơn Cao hơn
Hoạt tính enzyme Cao Thấp
Đặc tính chịu nhiệt Yếu Cao
Đặc tính chịu bức xạ Kém Mạnh
Đặc tính chịu các chất
hoá học và acid
Yếu Cao
Khả năng bắt màu chất
nhuộm
Dễ nhuộm Phải sử dụng phương
pháp đặc biệt

2.2.3. Thành phần hoá học của bào tử
Các lớp bao và màng của bào tử có cấu tạo cơ bản là protein có chứa nhiều
glyxin, tyroxin và đặc biệt là cystein, ngoài ra còn có sự tham gia của keratin.
Nguyên sinh chất của bào tử có chứa nhiễm sắc thể, ribosome và enzyme chuyển
hoá ở trạng thái không hoạt động. Khi bào tử nảy mầm thì những enzyme này bắt đầu
hoạt động.
Bào tử có chứa một lượng lớn canxi, magie và acid dipicolinic. Acid này chiếm

từ 5- 12% khối lượng khô của bào tử (acid này không bao giờ có trong tế bào sinh
dưỡng, nó được hình thành trong quá trình hình thành bào tử và mất đi khi nảy mầm).
Lượng nước trong bào tử rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết.
2.2.4. Sự nảy mầm của bào tử (Nguyễn Lân Dũng và các cộng sự, 1998)
Quá trình chuyển bào tử từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn
được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử.
Quá trình này gồm 3 giai đoạn: hoạt hoá, nảy mầm và sinh trưởng:
9

 Hoạt hoá
Sau khi cho bào tử Bacillus subtilis tồn tại ở trạng thái nghỉ 7 ngày, ta xử lí ở
60
o
C trong 5 phút có thể xúc tiến quá trình nảy mầm. Sau khi xử lí nhiệt, ta chuyển
vào môi trường nuôi cấy thích hợp..
Có một số hoá chất đặc biệt có thể xúc tiến quá trình nảy mầm của bào tử. Ví dụ:
L-alanine, Mn
2+
, chất hoạt động bề mặt, glucose,…. Cũng có những chất lại có tác
dụng ức chế quá trình nảy mầm: D-alanine, natri bicarbonate…
 Nảy mầm
Protein có chứa nhiều cystein trong áo bào tử hoá xốp lên làm tăng tính thấm,
xúc tiến sự hoạt động của enzyme protease. Khi đó lượng protein trong bào tử áo giảm
xuống. Các cation bên ngoài co thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử và làm trương lớp vỏ
bào tử lên, sau đó làm tan ra và tiêu đi. Khi đó, nước bên ngoài sẽ xâm nhập vào lớp
lõi của bào tử, làm cho lõi trương to lên, các loại enzyme bắt đầu được hoạt hoá, bắt
đầu quá trình tổng hợp thành tế bào.
Trong quá trình nảy mầm các đặc tính chịu nhiệt, tính chiết quang…bắt đầu giảm
dần; lượng dipicolinate-canxi, acid amin, polipeptide dần dần mất đi; bắt đầu việc tổng
hợp DNA, RNA và protein trong vỏ bào tử. Bào tử chuyển thành tế bào sinh dưỡng.

Khi nảy mầm, bào tử có thể đâm ra theo phía cực hoặc đâm ngang. Lúc đó thành
tế bào còn rất mỏng và chưa hoàn chỉnh, do đó nâng cao khả năng tiếp nhận thêm
DNA ngoại lai để thực hiện quá trình biến nạp.
2.2.5. Sức đề kháng của bào tử
Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hoá học như: nhiệt độ, tia
cực tím, áp suất và chất sát trùng.
Sỡ dĩ bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố sau:
 Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm
biến tính protein khi tăng nhiệt độ.
 Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca
2+
và acid dipicolinic, protein của bào tử
kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao đối với
nhiệt độ.
 Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới
dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài.
10

 Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm
cho các chất hoá học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử.
2.3. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột và sự loạn khuẩn
2.3.1.Hệ vi sinh vật đƣờng ruột
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1987), ở ruột và dạ dày động vật khi mới sinh ra hoàn
toàn không có vi khuẩn, sau vài giờ từ khi chúng sinh ra mới thấy có sự xuất hiện của
một vài vi khuẩn và từ đó chúng bắt đầu sinh sản dần. Sau đó một vài vi khuẩn khác sẽ
theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hoá, sống và sinh sôi nảy nở ở đó, chúng sẽ
biến đổi ít nhiều nhưng cơ bản chúng vẫn tồn tại cho đến khi con vật chết.
Thành phần, số lượng của vi sinh vật đường tiêu hoá phụ thuộc vào tuổi tác của
gia súc, cách nuôi dưỡng, chăm sóc…ngoài ra còn có các điều kiện vật lí, hoá học của
môi trường đường tiêu hóa.

Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1970) và nhiều tác giả khác, có thể chia hệ vi sinh vật
đường tiêu hoá ra làm 2 nhóm:
 Nhóm vi sinh vật tuỳ nghi
Một số những vi sinh vật này là những vi sinh vật có hại, chúng thay đổi theo
điều kiện thức ăn, môi trường, đường tiêu hoá, khả năng đề kháng của cơ thể…như:
Samonella, Klebsiella, E. coli, Clostridium, Shigella, Staphylococus….
Đa số chúng thích nghi với môi trường pH trung tính đến kiềm. Dưới những điều
kiện môi trường thích hợp chúng phát triển, sản sinh độc tố xâm nhập phá vỡ tế bào
đường ruột, gây tổn thương thành đường ruột nguy hại cho gia súc gia cầm.
 Nhóm vi sinh vật bắt buộc
Đây là những vi sinh vật chịu được độ pH thấp, chúng phát triển tốt trong đường
ruột của gia súc, gia cầm và định cư vĩnh viễn ở đó. Đa số chúng có thể giúp cơ thể
động vật tiêu hoá thức ăn tốt hơn nhờ vào hệ thống enzyme của chúng và giúp cơ thể
phòng chống một số bệnh do vi sinh vật cơ hội gây ra.
Nhóm vi sinh vật bắt buộc gồm có:
 Vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus,
Streptococus lactic (hiện nay gọi là Lactococus lactis), Bacillus subtilis,
Bifidobacterium, Cellulosemonas…
 Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bouladii…
11

 Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor spp…
 Protozoa: Entodinium, Diploinium…
Ngoài ra, người ta cũng chia hệ vi sinh vật đường ruột ra làm 3 nhóm dựa vào số
lượng của chúng có trong đường ruột như
 Nhóm hệ phổ chính: chiếm tổng số trên 90% số lượng vi sinh vật đường
ruột như: Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacterioides…
 Nhóm hệ phổ vệ tinh chiếm dưới 10% bao gồm: nấm men, Clostridium,
Proteus, Samonella…
 Nhóm tuỳ nghi: chiếm 0,1% gồm: Clostridium, Samonella…

(Tô Minh Châu, 2000)
Hai nhóm vi sinh vật trên luôn ở trạng thái cân bằng động và cũng là điều kiện
cần thiết bảo đảm cho sức khoẻ vật chủ. Cũng có thể hai nhóm vi khuẩn khác nhau
tranh chấp cùng một chất dinh dưỡng có khối lượng rất ít trong ống tiêu hoá. Vi khuẩn
nào đồng hoá chất dinh dưỡng này tốt thì sẽ loại trừ vi khuẩn kia.
Một số vi khuẩn có thể làm thay đổi một số đặc điểm lí hoá của hệ thống tiêu hoá
như: độ pH, tiềm năng oxy hoá khử, nồng độ các chất chuyển hoá làm cho một số vi
sinh vật khác phát triển hoặc không phát triển được (Nguyễn Kiều Uyên Vi, 2004).
2.3.2. Vai trò của hệ vi sinh vật đƣờng ruột
Giúp cho quá trình tiêu hoá tốt hơn nhờ vào hệ enzyme.
Đa số các vi khuẩn có lợi trong đường ruột tham gia vào quá trình tiêu hoá, phân
giải tinh bột, đường, đạm và chất xơ thành những sản phẩm dễ hấp thu hơn.
Nhóm này gồm những vi sinh vật sinh một số enzyme có khả năng phân huỷ các
chất trên: amylase, protease, glucanase, cellulase… gồm các vi khuẩn Lactic, Bacillus
subtilis, Isotrichs, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger…
Theo Nguyễn Thị Vân Hương (1990), bổ sung chế phẩm Saccharomyces
boulardii vào khẩu phần gà thịt làm giảm được hệ số chuyển biến thức ăn trên 1 kg
tăng trọng, làm tăng sức kháng bệnh của gà làm giảm tỉ lệ chết, từ đó góp phần làm
tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi.
Đối với thú trưởng thành tiêu hoá chủ yếu nhờ enzyme thì sự xuất hiện của vi
sinh vật sản sinh enzyme cũng giúp thú tiêu hoá thức ăn tốt hơn. So với enzyme tổng
12

hợp, nguồn enzyme của các vi sinh vật tương đối lí tưởng, do có nhiều ưu điểm hơn so
với các nguồn từ động vật và thực vật như:
 Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất nhanh.
 Nguồn nguyên liệu dễ nuôi cấy, dễ kiếm và rẻ tiền.
 Các enzyme của vi sinh vật có hoạt tính cao.
Ngoài ra, có thể điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuôi cấy để đạt
được hiệu quả cao trong sản xuất (Trần Thị Minh Chiến, 2002).

2.3.3. Sự loạn khuẩn
Từ loạn khuẩn được Nissle đưa ra vào năm 1916. Ông cho rằng các vi khuẩn có
trong ruột người và gia súc luôn ở thế quân bình để đảm bảo cho sự tiêu hoá bình
thường của vật chủ.
Thế quân bình này dựa vào 2 cơ chế:
(1) Cùng tranh giành chất dinh dưỡng nào đó cần cho sự sinh trưởng của chúng.
(2) Chúng có thể tiết ra chất có tính kháng đối với các vi khuẩn khác.
 Các nguyên nhân gây loạn khuẩn:
Theo Tô Minh Châu (2004) thì có 3 nguyên nhân:
 Do kháng sinh có phổ rộng lâu ngày làm mất đi sự cân bằng của hệ vi sinh
vật đường ruột.
 Do yếu tố ngoại cảnh: thức ăn kém phẩm chất, thú bị stress, thay đổi thời
tiết, vệ sinh kém…
 Do yếu tố sinh lý của thú con: Sức đề kháng của cơ thể còn yếu…
 Cơ chế của hiện tƣợng loạn khuẩn
Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1977), khi cơ thể khoẻ mạnh, hai nhóm vi sinh vật bắt
buộc và tuỳ nghi luôn ở thế cân bằng có lợi nhờ cơ chế cạnh tranh sinh học. Khi một
trong hai hệ này mất cân bằng thì dễ gây ra sự rối loạn hệ vi khuẩn đường ruột. Thông
thường, hệ vi khuẩn tuỳ nghi lấn át hệ vi khuẩn bắt buộc.
Dưới tác động của một vài điều kiện bất lợi nào đó, làm cho sức đề kháng của cơ
thể giảm hoặc do dùng kháng sinh lâu ngày, trúng độc…làm cho hệ vi sinh vật đường
ruột bị thay đổi về số lượng, về các dòng vi khuẩn cũng như vị trí cư trú của chúng.
Từ đó, gây giảm độ tiêu hoá, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây thối hoạt động, gây
ra quá trình thối rửa, phân giải các chất trong ruột sinh ra khí CO
2
, H
2
S, CH
4
… Những

13

chất này sẽ phá huỷ các phản ứng bình thường trong dạ dày, ruột phá hoại quá trình
tạo men của thức ăn, gây ra những phản ứng trên ống tiêu hoá như: biểu mô niêm mạc
bị phồng lên, rộp ra và tróc đi tạo điều kiện cho thuận lợi cho sự xâm nhập của những
vi khuẩn gây hại.
Do đó để ổn định hệ vi sinh vật có lợi, đồng thời giúp cho vật nuôi sớm trở lại
trạng thái ban đầu thì việc bổ sung chế phẩm vi sinh vật có lợi cho đường ruột là một
vấn đề rất thiết thực cần được quan tâm.
2.4. Giới thiệu chung về probiotic
2.4.1. Định nghĩa
Thuật ngữ probiotic được đưa ra lần đầu tiên bởi Lilly và Stillwel (1965) để mô
tả những yếu tố kích thích sinh trưởng được sản sinh bởi vi sinh vật. Probiotic được
bắt nguồn từ nguồn gốc Hy Lạp với nghĩa “ tiền sự sống” (prolife)
Năm 1989, Fuller định nghĩa probiotic như là thức ăn bổ sung vi sinh vật sống có
tác động có lợi đến động vật chủ thông qua cải tiến cân bằng vi sinh vật của nó.
Năm 1992, Havenar và cộng sự chỉ ra rằng định nghĩa probiotic của Fuller bị hạn
chế ở những thức ăn bổ sung cho động vật qua đường ruột. Ông mở rộng định nghĩa
probiotic của Fuller như là một lứa cấy đơn hoặc hỗn hợp các vi sinh vật sống mà
chúng có ảnh hưởng có lợi đối với vật chủ bằng cách cải thiện những tính chất của hệ
vi sinh vật bản xứ.
2.4.2.Chức năng sinh học của probiotic
 Trung hoà độc tố, khử độc và phân huỷ một số thuốc có độc tính cao.
 Kích thích hệ thống miễn dịch.
 Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột
 Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống
enzyme
 Tổng hợp vitamine nhóm B và K ở manh tràng.
2.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn Bacillus subtilis
 Trong y học và chăn nuôi

Trong kháng chiến chống Pháp Bacillus subtilis được các giáo sư Đặng Đức
Trạch, Hoàng Thuỷ Nguyên (là các bác sĩ quân y) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm
Bacillus subtilis để đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy.
14

Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa vi khuẩn Bacillus
subtilis chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng ống và viên nang.
Năm 1962,Guy Albot phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng trong điều trị tiêu
chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn, trộn thêm với các vi khuẩn lên
men lactic khác chữa loạn khuẩn đường ruột rất hiệu quả.
1958 - 1960 bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm Bacillus
subtilis dùng trị bệnh đường ruột.
Khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế
phẩm Bacillus subtilis dùng điều trị bệnh tiêu chảy ở người.
Viện bào chế Pharimex Tp.HCM, Viện Pasteur Nha Trang đã nghiên cứu sản
xuất chế phẩm Bacillus subtilis.
1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyên Văn Hùng đã nghiên cứu sản xuất
chế phẩm Bacillus subtilis dạng viên nuôi cấy trên môi trường đậu tương, cua
đồng…hấp thu bằng tinh bột tan. Chế phẩm này dùng cho heo uống từ 0,5 - 1g/kg thể
trọng. Kết quả heo sau khi sử dụng chế phẩm Bacillus subtilis tăng trọng nhanh.
1982 Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm coli_subtly
(Escherichia coli và Bacillus subtilis) làm giảm tái phát do bệnh tiêu chảy gây ra ở lợn
so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt.
Nghiên cứu của Baker, Braude và Kon (1925), Hauser (1957) khi bổ sung kháng
sinh liều lượng thấp vào thức ăn thú nhận thấy: acid folic, acid patothenic, vitamin A,
vitamin B12 tích tụ trong gan cao.
Ngoài ra Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc, nấm
men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic…
 Trong nông nghiệp
Chế phẩm Bacillus subtilis được dùng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm

Rhizoetonia solani, Fusarium sp, Pyriculariaoryaze… và trong bảo vệ nông sản sau
thu hoạch.
Trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất thuộc bộ công nghiệp nặng
Tp.HCM, đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bactophyl từ Bacillus subtilis để phòng
trừ các loại nấm gây bệnh trên rau cải.