Xác định serovar và mối quan hệ di truyền của các chủng xoắn khuẩn Leptospira phân lập từ lợn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
oOo







NGUYỄN HỒ DUNG NGHI





XÁC ĐỊNH SEROVAR VÀ MỐI QUAN HỆ
DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG XOẮN
KHUẨN LEPTOSPIRA PHÂN LẬP TỪ LN




ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành Công nghệ sinh học

Giáo viên hướng dẫn: TS. VÕ THÀNH THÌN
ThS. NGUYỄN THỊ KIM CÚC







Nha Trang – 06/2013
i
LỜI CẢM ƠN
Sau 3 tháng thực tập tại Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y
miền Trung, dưới sự hướng dẫn của thầy TS. Võ Thành Thìn và ThS. Nguyễn
Thị Kim Cúc cùng các anh, chị ở Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y
miền Trung và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ
Sinh học và Môi trường, trường đại học Nha Trang tôi đã hoàn thành cuốn luận
văn này.
Qua đây, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến TS. Võ Thành Thìn -
phó Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung và ThS.
Nguyễn Thị Kim Cúc – giảng viên Bộ môn công nghệ Sinh học, Viện Công
nghệ Sinh học và Môi Trường đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện
thuận lợi để tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp của mình.
Tôi cũng xin chân thành cản ơn các cấp lãnh đạo phân viện Thú Y Miền
Trung đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành thực tập, đến ban lãnh đạo trường Đại
học Nha Trang cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh
học và Môi trường đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho
tôi trong những năm học vừa qua.

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị Phạm Trung Hiếu, Nguyễn Thị
Thắm, Lê Đình Hải, Phạm Duy Hưng trong Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân
viện Thú y miền Trung đã trực tiếp giúp đỡ và chỉ dạy cho tôi hoàn thiện về một
số kỹ năng và thao tác trong phòng thí nghiệm và dành cho tôi những tình cảm
tốt đẹp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn Phan Thị Ngọc Ẩn, Nguyễn Thị Thu
Hằng đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Đặc biệt tôi xin chân thành
cảm ơn đến gia đình và các bạn sinh viên cùng lớp 51CNSH đã luôn ủng hộ,
động viên, giúp đỡ và đồng hành chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi trong suốt 4 năm
học và trong thời gian thực hiện đề tài này. Đấy thật sự là điều quý báu vô giá đối
với tôi.
Một lần nữa, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến tất cả.
Nha Trang, tháng 6 năm 2013
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Hồ Dung Nghi
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LEPTOSPIRA 2
1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 3
1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA 4
1.2.1. Đặc điểm cấu tạo và hình thái. 4
1.2.2. Đặc điểm nuôi cấy 5
1.2.3. Sức đề khángcủa Leptospira 5

1.2.4. Một số yếu tố độc lực 6
1.2.5. Các serovar Leptospira 7
1.3. Phương pháp xác định serovar Leptospira. 8
1.3.1. Phương pháp huyết thanh học 8
1.3.2. Phản ứng ELISA (Enzyme Liked Immunosorbent Assasy) 9
1.3.3. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IFAT) 9
1.3.4. Phản ứng vi ngưng kết (MAT) 9
1.4. Xác định một số đặc tính di truyền của các chủng xoắn khuẩn
Leptospira. 11
1.4.1. Xác định các serovar thuộc nhóm độc lực cao 11
1.4.2. Xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng xoắn khuẩn
Leptospira 12
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
2.1. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 14
2.1.1. Thời gian nghiên cứu 14
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 14
iii
2.1.3 .Đối tượng nghiên cứu 14
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14
2.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 14
2.3.1. Hóa chất, sinh phẩm. 14
2.3.2. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 16
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.4.1. Xác định các serovar Leptospira 17
2.4.2. Phương pháp xác định khả năng mang gen LipL32 18
2.4.2.1.Tách chiết DNA 18
2.4.2.2. Thực hiện phản ứng PCR 19
2.4.3. Phương pháp xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng
Leptospira 20
2.4.3.1. Chiết tách ADN mẫu 21

2.4.3.2. Thực hiện phản ứng PCR khuyếch đại gen 16s rRNA 21
2.4.3.3. Tinh sạch sản phẩm PCR 21
2.4.3.4. Thực hiện phản ứng PCR để giải trình tự gen 21
2.4.3.5. So sánh trình tự nucleotide trên gen 16s rRNA 22
2.5. XỬ LÍ SỐ LIỆU 23
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH SEROVAR CÁC CHỦNG LEPTOSPIRA 24
3.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ 27
3.2.1. Kết quả phát hiện gen độc lực LipL32 27
3.2.2. Kết quả xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng
Leptospira phân lập từ lợn 29
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34
4.1.KẾT LUẬN 34
4.2. KIẾN NGHỊ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35
PHỤ LỤC
iv
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số serogroup Leptospira thường gặp của các loài Leptospira 7
Bảng 1.2. Một số serovar Leptospira thường gặp gây bệnh ở vật nuôi 8
Bảng 1.3. Các serovar Leptospira sử dụng chủ yếu trong chẩn đoán huyết thanh 10
Bảng 2.1. Kháng huyết thanh chuẩn kháng Leptospira dùng trong nghiên cứu 15
Bảng 2.2. Trình tự nucleotide các cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 20
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR phát hiện gen LipL32 của Leptospira 20
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR 20
Bảng 2.5. Trình tự nucleotide của các cặp mồi dùng để giải trình tự
nucleotide trên gen 16s rRNA 21
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR để giải trình tự gen 22
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng PCR để giải trình tự gen 22
Bảng 2.8. Các chủng Leptospira tham chiếu từ ngân hàng gen 23

Bảng 3.1. Kết quả xác định serovar của các chủng Leptospira phân lập từ lợn 25
Bảng 3.2. Kết quả phản ứng PCR phát hiện gene độc lực LipL32. 29


v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Leptospira Icterohaemorrhagiae chụp dưới kính hiển vi điệntử 4
Hình 3.1. Phản ứng MAT xác định serovar của các chủng Leptospira 24
Hình 3.2. Kết quả so sánh tỷ lệ dương tính với các serovar của chủng
Leptospira 26
Hình 3.3. Kết quả PCR xác định gen LipL32 của các chủng Leptospira 28
Hình 3.4. Vị trí các nucleotide khác biệt giữa các trình tự gen 16s RNA các
chủng Leptospira 31
Hình 3.5. Phả hệ của các chủng Leptospira phân lập từ lợn 32













vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CSLD : Cơ Sở Dữ Liệu
EMJH : Ellinghausen, Mc Cullough, Johnson, Harris
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
IZSVe : Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
LPS : Lipopolysaccharide
MAT : Microscopic Agglutination Test
PCR: Polymerase Chain Reaction
1
LỜI MỞ ĐẦU
Ngành chăn nuôi là một trong những ngành đóng vai trò quan trọng đối
với một nước nông nghiệp như Việt Nam, đặc biệt là chăn nuôi gia súc. Ngành
chăn nuôi lợn với tổng đàn lợn đạt 27,8 triệu con, tổng lượng thịt cung cấp ước
tính đạt 3,2 triệu tấn (tính đến cuối năm 2011) [1], là nguồn cung cấp thịt chủ
yếu nhất cho thị trường cả nước.
Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn luôn phải đối mặt với nhiều khó khăn như
tình hình dịnh bệnh cũ và mới xảy ra quanh năm. Đặc biệt, bệnh Leptospirosis do
xoắn khuẩn Leptospira đã tồn mấy chục năm cho tới nay vẫn không kiểm soát
được các nguồn lây nhiễm, gây ra nhiều thiệt hại nặng nề do cơ chế gây bệnh và
sự phá hủy các tổ chức bên trong cơ thể của Leptospira đến nay vẫn chưa được
làm rõ. Bệnh với các triệu chứng lâm sàng như sốt, vàng da, viêm gan, thận, rối
loạn tiêu hóa, rối loạn sinh sản. Leptospira gây bệnh ở nhiều đối tượng gia súc,
vật nuôi, và kể cả con người với khả năng lây lan cao nên không chỉ gây thiệt hại
lớn cho ngành chăn nuôi mà còn ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Do đó, tiến
hành nghiên cứu về Leptospira là vô cùng cấp bách.
Mỗi loại gia súc đều có thể nhiễm một hay nhiều serovar xoắn khuẩn khác
nhau. Leptospira gây bệnh trên lợn có nhiều serovar, mỗi serovar có một đặc tính
riêng về tính kháng nguyên và hệ gen. Leptospira ở lợn khu trú một lượng lớn
trong thận và thải ra ngoài qua nước tiểu, đây là nguồn lây nhiễm nguy hiểm cho
người và vật nuôi. Việc xác định các serovar gây bệnh trên lợn từ mẫu thận và

mối quan hệ di truyền giữa chúng để từ đó có những nghiên cứu tiếp theo nhằm
tìm ra biện pháp phòng chống lại bệnh xoắn khuẩn trên lợn và ngăn chặn lây lan
qua người là vô cùng quan trọng và cấp thiết. Để giải quyết vấn đề trên, chúng tôi
tiến hành đề tài “ Xác định serovar và mối quan hệ di truyền của các chủng
xoắn khuẩn Leptospira phân lập từ lợn’’ với 2 mục tiêu chính sau :
+ Xác định serovar của các chủng Leptospira phân lập từ lợn.
+ Xác định mức độ tương đồng gen và mối quan hệ di truyền của các
chủng Leptospira phân lập từ lợn.
2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LEPTOSPIRA
1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Leptospira là loại xoắn khuẩn gây bệnh Leptospirosis đã được nghiên cứu
từ lâu trên thế giới. Leptospira được chia thành 2 nhóm là nhóm có khả năng gây
bệnh và và nhóm hoại sinh (saprophyte strain) không gây bệnh. Có 13 loài
Leptspira có khả năng gây bệnh là L. alexanderi, L. alstonii (genomospecies 1),
L. borgpetersenii, L. inadai, L. interorgrans, L. fainei, L. kirschneri, L.
licerasiae, L. noguchi, L. santarosai, L. terpstrae (genomospecies 3), L. weilii, L.
wolffi với hơn 260 serovar khác nhau. Trong đó 2 loài L. interorgrans và L.
fainei. Loài được xem là có độc lực cao nhất đối với người và động vật
[12][37][44]. Nhóm không có độc lực gồm các loài L. biflexa, L. meyeri, L.
yanagawae (genomospecies 5), L. kmetyi, L. vanthielii (genomospecies 4) và L.
wolbachii với hơn 60 serovar [12].
Năm 1886, nhà khoa học Đức Weil đã phát hiện ra bệnh Leptospirosis ở
người lần đầu tiên, nhưng đến năm 1915 các nhà khoa học Nhật Bản và Pháp
mới tìm thấy xoắn khuẩn phân lập từ chuột lang gây bệnh vàng da và chảy máu
khi gây nhiễm cho người và động vật là L. interograns [29].
Năm 1917, Noguchi đã tìm thấy trên chuột hoang ở Mỹ chủng Leptospira
có đặc tính hình thái và sinh học và miễn dịch học giống như chủng đã phát hiện

tại Nhật là L. icterohaemorrhagiae [35]. Năm 1918 các nhà khoa học Nhật phân
lập được xoắn khuẩn gây bệnh “sốt mùa thu’’ ở lợn là L. autumnalis.
Các yếu tố độc lực của Leptospira cũng được nghiên cứu. Năm 1997
Merien và cộng sự đã chứng minh được yếu tố độc lực của Leptospira chi phối
khả năng xâm nhiễm vào tế bào Vero và khả năng tiêu diệt tế bào lạ của chúng.
Đến năm 2000, Merien phát hiện ra loại protein liên quan đến độc lực này và chỉ
được tìm thấy trên các chủng Leptospira có độc lực [32]. Năm 2006, Bulach phát
hiện enzyme sphingomyelinase quyết định khả năng gây dung huyết của
Leptospira ở nhiều serovar khác nhau [17][40].
3
Về mặt di truyền, Fukunaga xác định được genome của Leptospira có kích
thước khoảng 3,9 – 4,6 Mb, có 2 hệ gen là 16sRNA và 23SrRNA [15][23]. Một
số gen đã được dòng hóa và phân tích chức năng như gen quy định quá trình tổng
hợp acid amin, rRNA, protein ở ribosome, RNA-polymerase, DNA repair, heat
shock protein, shingomyelinase, hemolysins, protein màng ngoài, quá trình sinh
tổng hợp LPS [12][30]. Gen LipL32 qui định protein gây độc LipL32 đặc trưng
cho các Leptospira nhóm có độc lực [18].
Nghiên cứu về cây phát sinh loài trên 2 gen LipL32 và 16s RNA của
Leptospiracho thấy có sự tương đồng cao giữa 2 cây phát sinh loài, điều này chỉ
ra rằng các chủng Leptospira có sự khác biệt về trình tự gen là kết quả của trôi
dạt di truyền. [18]
1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Tại Việt Nam, bệnh do Leptospira được Ragiot và Souchard phát hiện lần
đầu tiên trên người năm 1931 [2]. Nghiên cứu của Lý Thị Liên Khai và Nguyễn
Ngọc Hải cho thấy chuột là nguồn lưu trữ và lây nhiễm tự nhiên Leptospira đối
với gia súc và con người [5][6]. Theo Vũ Đình Hưng, các loại gia súc nhiễm
Leptospira với tỉ lệ rất cao, ở trâu 35,1 %, ở lợn 22, 9%, ở chó 26,47 %, đặc biệt
với công nhân chăn nuôi tỉ lệ nhiễm lên đến 56% [11]. Nghiên cứu của Vũ Đình
Hưng cho thấy gia súc thường mắc bệnh vào mùa mưa từ tháng 4 - 9 chiếm tỉ lệ
26,7 % [10]. Theo Nguyễn Văn Bình, tỉ lệ nhiễm của trâu bò ở các khu vực nội,

ngoại thành Hà Nội khá cao là 46,7 % và con cái tỉ lệ nhiễm cao hơn con đực [7].
Tại Đắc Lăk, nhóm nghiên cứu Hoàng Mạnh Lâm xác định tỉ lệ nhiễm
Leptospira trên gia súc là 35,3 % với sự lưu hành của 15 serovar Leptospira,
trong đó có 4 loại chưa công bố ở Việt Nam là L. djasiman, L. javanica, L.
panama và L. semaranga [4].
Theo Boqvist, tỉ lệ nhiễm Leptospira trên lợn nái phía nam là khá cao: L.
autumnalis 32 %, L. bratislava 29 % , L. icterohaemorrhagiae 27 %, L.
grippotyphosa 13 %, L. tarassovi 13 %, L. pomona 5 % [3]. Nghiên cứu của Võ
Thành Thìn và cs sử dụng phương pháp vi ngưng kết trên phiến kính (MAT), đã
xác định được tỷ lệ nhiễm Leptospira trên đàn lợn nái tại Khánh Hòa là 17,7%.
Tỷ lệ này phụ thuộc vào điều kiện chăn nuôi và mùa vụ tại địa phương. Có sự lưu
4
hành của 10 serovar Leptospira trên đàn lợn, tỉ lệ nhiễm cao nhất là các serovar
Pomona (51,2%), Panama (19,5%), Icterohaemorrhagiae, Autumnalis [8].
Các nghiên cứu trên cho thấy tỉ lệ gia súc nhiễm Leptospira ở Việt Nam là
rất cao, đặc biệt là trên lợn, gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi. Tuy nhiên,
cho đến năm 2012, chưa có nghiên cứu nào về mối quan hệ di truyền giữa các
chủng Leptospira gây bệnh trên lợn.
1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XOẮN KHUẨN LEPTOSPIRA
1.2.1. Đặc điểm cấu tạo và hình thái

Hình 1.1. Leptospira Icterohaemorrhagiae chụp dưới kính hiển vi điệntử
[40]
Về phân loại khoa học Leptospira được xếp vào [35] :
Giới: Monera
Ngành: Spirochaetes
Họ: Leptospiraceae
Giống: Leptospira
Leptospira có dạng hình xoắn khuẩn, đường kính khoảng 0,1µm, chiều dài
khoảng 6-10µm, hai đầu xoắn hoặc hình móc câu [21]. Leptospira có khả năng di

động mạnh theo kiểu xoáy và bật thẳng lò xo do cấu tạo ở mỗi đầu có một nội
roi. Màng trong của Leptospira gồm cytoplasmic liên kết chặt chẽ với lớp vỏ
5
peptidoglycan và được bao phủ bởi lớp màng ngoài gồm protein, lipid và
Lipopolysaccharide (LPS) [24]. LPS tạo nên tính kháng nguyên chủ yếu của
Leptospira, có đặc tính miễn dịch và cấu trúc tương tự như LPS của các vi khuẩn
gram âm nhưng độc tính thấp hơn [30]. Ngoài ra, các loại protein cấu trúc và
protein chức năng cũng góp phần tạo nên lớp màng ngoài của Leptospira, chủ
yếu là các lipoprotein [26].
Leptospira không thể quan sát được khi nhộm Gram, chỉ có thể quan sát
được dưới kính hiển vi quang học nền đen, kính hiển vi quang học phản pha,
hoặc theo phương pháp nhuộm bạc cổ điển Warthin – Starry.
1.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy tối ưu để Leptospira sinh trưởng: môi trường đặc hiệu,
hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ khoảng 28-30
o
C , pH từ 7,2 – 7,6. Trong điều kiện tối
ưu, thời gian thế hệ của Leptospira là 3 – 15 giờ nên thời gian nuôi cấy và phân
lập thường rất lâu, từ 2 – 30 ngày [21].
Môi trường nuôi cấy Leptospira bắt buộc phải có các chất dinh dưỡng sau:
acid béo mạch dài, vitamin B2, B12, muối amonium [21]. Môi trường đặc hiệu
cho Leptospira được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là EMJH (Ellinghausen, Mc
Cullough, Johnson, Harris) với thành phần chính là acid oleic, albumin huyết
thanh bò và polysorbate (Tween 80) [30]. Albumin huyết thanh bò có vai trò như
một chất giải độc và Tween 80 là nguồn cung cấp acid béo. Một vài chủng
Leptospira cần bổ sung pyruvate hoặc huyết thanh thỏ vào môi trường khi nuôi
cấy. Khi phân lập Leptospira từ mẫu bệnh phẩm, có thể bổ sung kháng sinh vào
môi trường như 5 – fluorouracil, gentamincin, nalidixic acid hoặc rifampicin [21].
1.2.3. Sức đề khángcủa Leptospira
Xoắn khuẩn là loài có sức chống chịu kém với các tác nhân môi trường

bên ngoài. Leptospira có sức đề kháng cao hơn so với các xoắn khuẩn khác, có
thể sống tự do trong môi trường đất, nước ngọt, nước mặn nhưng vẫn rất nhạy
cảm với các yếu tố bên ngoài như: ánh sáng, nhiệt độ, kháng sinhvà những thuốc
sát trùng thông thường [16][45][46].
6
Với nhiệt độ: ở 56
o
C xoắn khuẩn bị tiêu diệt trong 30 phút, ở 60
o
C xoắn
khuẩn chết ngay; ở nhiệt độ 20
o
C xoắn khuẩn chết trong 4 giờ. Nhưng ở nhiệt độ
thấp vi khuẩn có khả năng tồn tại trong một thời gian dài có khi tới hàng năm [22].
Với ánh sáng: dưới ánh sáng chiếu trực tiếp, xoắn khuẩn chết trong vòng
30 phút đến 2 giờ, với tia tử ngoại phải sau 4 giờ xoắn khuẩn mới bị tiêu diệt
hoàn toàn [16].
Với các chất kháng sinh: các xoắn khuẩn mẫn cảm với nhiều loại kháng
sinh như penicillin, amocicillin, ampicillin.
Với hoá chất và thuốc sát trùng: Leptospira bị tiêu diệt nhanh chóng bởi
hoá chất như: dung dịch xút 5%, cồn 20%, dung dịch phenol 0,5%, acid
chlohydric 2%, crezyl 5%, formol 0,25%, acid phenic 5%.
1.2.4. Một số yếu tố độc lực
Một số yếu tố độc lực của Leptospira đã được xác định. Các chủng
Leptospira có độc lực cao có khả năng đề kháng với bổ thể và bạch cầu trung
tính của hệ thống đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của vật chủ, chúng chỉ bị
tiêu diệt nhanh bởi kháng thể đặc hiệu có trong máu [19].
LPS của Leptospira có thành phần hóa học và đặc tính kích thích miễn
dịch giống vi khuẩn gram âm. Tuy nhiên, độc tính của chúng trên thỏ, trên chuột,
tương tác với tế bào lympho B yếu hơn so với LPS của vi khuẩn gram âm [38]

[43]. LPS có tính kháng nguyên rất mạnh và là kháng nguyên chủ yếu của
Leptospira.
Khả năng dung huyết của Leptospira có ở nhiều serovar khác nhau và có
ít nhất 7 gen sphA-like được phát hiện ở các chủng Leptospira có độc lực, bao
gồm cả gene sphH [17].
Lipoprotein bề mặt Loa22 cũng là một yếu tố độc lực quan trọng của
Leptospira, đóng vai trò chủ chốt trong cơ chế gâ
y bệnh của xoắn khuẩn này
[41].
Ngoài ra, gen hemO mã hóa cho enzyme gây độc cũng có vai trò trong quá
trình gây bệnh của Leptospira [33].
Protein bề mặt LipL32 là độc lực đặc trưng và mang tính kháng nguyên
của Leptospira, có khả năng bám lên lamini, collagen và fibronectin của vật chủ
và có tính bảo toàn cao ở các loài Leptospira gây bệnh [27] [28]. LipL32 có mặt
7
trong vật chủ suốt quá trình xâm nhiễm của Leptospira [18]. Cũng giống như
protein giải phóng bề mặt (Lig–protein có khả năng bám lên fibronectin của vật
chủ), LipL32 chỉ giải phóng mạnh trên bề mặt khi Leptospira nhân lên trong cơ
thể vật chủ, trên môi trường nuôi cấy nhân tạo LipL32 chỉ được giải phóng rất ít.
Do đó Leptospira thường mất khả năng gây bệnh mặc dù cấu trúc kháng nguyên
không thay đổi khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo [31] [34].
1.2.5. Các serovar Leptospira
Hiện nay đã phát hiện được trên 260 serovar khác nhau dựa vào cấu trúc
đặc hiệu của kháng nguyên LPS (Lipopolysaccharide) trên bề mặt tế bào và cấu
trúc di truyền của Leptospira [30].
Bảng 1.1. Một số serogroup thường gặp của các loài Leptospira [30]
STT Loài
Serogroup
1 L. interrogans
Icterohaemorrhagiae, Canicola, Ponoma, Australi

s,
Autumnalis, Pyrogenes, Grippotyphosa, Djasiman,
Hebdomadis, Sejroe, Bataviae, Ranarum, Luoisiana, Mini,
Sarmin, Panama, Cynopteri, Tarassovi, Ballum, Celledoni,
Manhao, Shermani, Hurstbrige.
2 L. noguchii
Panama, Autumnalis, Pyrogenes, Tarassovi, Batav
iae,
Lousiana, Australis, Shermani, Djasiman, Ponoma.
3 L. santarosai
Shermani, Hebdomadis, Tarassovi, Pyrogenes, Autumnalis,
Bataviae, Mina, Grippotyphosa, Sejroe, Ponoma, Javanica,
Sarmin, Cynopteri.
4 L. meyeri
Ranarum, Semaranga, Sejroe, Mini, Javanica.
5 L. wolbachii
Codice
6 L. biflexa
Semaranga, Andamana.
7 L. fainei
Hurstbrige.
8
L.
borgpetersenii
Javanica, Ballum, Hebdomadis, Sejroe, Tarassovi, Mini,
Celledoni, Pyrogenes, Bataviae, Australis, Autumnalis.
9 L. Kirschneri
Grippotyphosa, Autumn
alis, Cynopteri, Hebdomadis,
Australis, Ponoma, Djasiman, Canicola,

Icterohaemorrhagiae, Bataviae.
10 L. weilii
Celledoni, Icterohaemorrhagiae, Sarmin, Javanica, Mini,
Tarassovi, Hebdomadis, Pyrogenes, Manhao, Sejroe.
11 L. inadai
Lyme, Shermani, Icteroh
aemorrhagiae, Tarassovi, Tarassovi,
Manhao, Canicola, Panama, Javanica.
12 L. parva
Turneria
8

Các serovar gây bệnh thường mang tính đặc trưng loài như Canicola chủ
yếu gây bệnh ở chó, Bratislava ở ngựa và lợn, Hardjo ở bò, Australis và Pomona
ở lợn [14] [16] [19] [20] [25].
Bảng 1.2. Một số serovar thường gặp gây bệnh ở vật nuôi [12], [21],
[30], [39]
TT Vật nuôi Serovar
1 Bò
Hardjo, Pomona, Australis, Bratislava, Sejroe,
Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Canicola
2 Lợn
Bratislava, Australis, Pomona, Grippotyphosa, Canicola,
Tarassovi, Icterohaemorrhagiae
3 Chó
Canicola, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Pomona,
Copenhageni
4 Ngựa
Bratislava, Pomona, Grippotyphosa,
Icterohaemorrhagiae, Hardjo

5 Cừu Pomona, Hardjo

1.3. Phương pháp xác định serovar Leptospira
1.3.1. Phương pháp huyết thanh học
Trong chẩn đoán bệnh Leptospirosis, huyết thanh học là phương pháp phổ
biến nhất vì nó không chỉ xác định được vi khuẩn gây bệnh mà còn cho biết
serovar Leptospira nào gây bệnh. Đối với trường hợp cần xác định serovar của
các chủng Leptospira chưa biết, cần có huyết thanh chứa kháng thể chuẩn đặc
hiệu với các serovar đã biết. Có nhiều loại phản ứng huyết thanh khác nhau
nhưng đều dựa trên nguyên tắc cơ bản là liên kết đặc hiệu của kháng nguyên với
kháng thể.
- Phản ứng vi ngưng kết tan – MAT với kháng nguyên sống.
- Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IF - Immuno Fluorescence).
- Phản ứng ELISA.
Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học có ý nghĩa rất lớn trong thực tế,
nghiên cứu và trong điều tra cơ bản vì cách làm đơn giản và cho kết quả khá
9
chính xác. Bằng phương pháp này nó không chỉ cho biết serovar gây bệnh mà
còn phát hiện được những gia súc mắc bệnh nhưng không biểu hiện triệu chứng
lâm sàng.
1.3.2. Phản ứng ELISA (Enzyme Liked Immunosorbent Assasy)
Là phản ứng miễn dịch gắn enzyme được sử dụng để phát hiện kháng
nguyên Leptospira hoặc kháng thể kháng Leptospira tùy theo mục đích. Trong
trường hợp cần xác định serovar, dùng kháng thể biết trước để tìm kháng nguyên.
Kháng thể này liên kết đặc hiệu với các serovar Leptospira đã biết phổ biến gây
bệnh cho gia súc và người. Cố định kháng nguyên - kháng thể lên vi giếng. Nếu
có kháng nguyên tương ứng sẽ có kết hợp kháng nguyên - kháng thể không bị
rửa trôi. Cho kháng kháng thể có gắn enzyme tương ứng vào, nếu đã có kết hợp
kháng nguyên - kháng thể thì sẽ có tiếp kết hợp kháng nguyên - kháng thể -
kháng kháng thể, không bị rửa trôi. Cho cơ chất tương ứng vào, enzym sẽ phân

hủy cơ chất thành sản phẩm có màu, dùng phổ quang kế để định lượng phản ứng.
1.3.3. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IFAT)
Là phản ứng dựa trên nguyên tắc kháng nguyên - kháng thể, trong đó
kháng nguyên hoặc kháng thể kháng Leptospira được nhuộm màu huỳnh quang
(thường dùng Fluorescein isothiocyanat) có màu xanh lục, Rodamin có màu đỏ
gạch. Kháng nguyên hoặc kháng thể chẩn đoán (nghi ngờ) được cố định trên
phiến kính, nhỏ kháng thể hoặc kháng nguyên đã nhuộm màu huỳnh quang lên,
nếu tương ứng sẽ có phản ứng gắn kết kháng nguyên – kháng thể, rửa không trôi,
soi kính hiển vi huỳnh quang thấy phát sáng. Ngược lại nếu không tương ứng khi
rửa sẽ bị trôi, soi kính không thấy phát sáng. Đây là phản ứng cho kết quả nhanh,
chính xác được dùng nhiều trong chẩn đoán huyết thanh.
1.3.4. Phản ứng vi ngưng kết (MAT)
Nguyên tắc của phản ứng MAT là sự liên kết trực tiếp giữa kháng thể
kháng Leptospira với kháng nguyên là các chủng Leptospira sống tạo nên các
ngưng kết có thể phát hiện được dưới kính hiển vi.
Kháng nguyên của Leptospira chủ yếu là các protein màng ngoài như LPS
và lipoprotein LipL32. Trong đó, các epitopes LPS là các kháng nguyên chính
kích hoạt đáp ứng miễn dịch. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cho kháng nguyên
10
Leptospira phần lớn là kháng thể IgM và IgG [13]. Do đó các phương pháp huyết
thanh học thường sử dụng hai loại kháng thể này để chẩn đoán bệnh hoặc phát
hiện các serovar Leptospira.
Phản ứng MAT được sử dụng trong điều tra huyết thanh học toàn đàn,
kháng nguyên phải sống, không tự ngưng kết và có ít nhất từ 150 – 300
Leptospira trên một vi trường. Đối với chẩn đoán bệnh, huyết thanh chẩn đoán
được pha với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10 → 1/50 để thực hiện phản ứng MAT
định tính (tức là chỉ xác định xem trong huyết thanh có kháng thể Leptospira hay
không để loại bỏ những mẫu huyết thanh âm tính, chỉ giữ lại các mẫu huyết
thanh (+) để làm phản ứng MAT định lượng). Huyết thanh (+) được pha loãng,
sau đó chia ra các lỗ trên khay nhựa, số lỗ tương ứng với số Serovar đã có, nhỏ

tiếp các Serovar Leptospira tương ứng lên các lỗ khay nhựa, nếu có ngưng kết ta
có thể biết gia súc đó bị Leptospira do serovar nào gây ra. Nâng hiệu giá ngưng
kết của các serovar đó lên các mức: 1/800, 1/1600, 1/3200 để xác định tính chất
và mức độ của bệnh.
Đối với nghiên cứu phát hiện serovar của các chủng Leptospira đã có, cần
có bộ kháng thể chuẩn. Trong tổng số các serovar Leptospira, có 12 serovar gây
bệnh chủ yếu cho động vật và người. Mỗi serovar này lại mang tính kháng
nguyên đại diện cho một nhóm. Các serovar được sử dụng chủ yếu trong chẩn
đoán huyết thanh học hiện nay gồm 12 serovar Leptospira là:
Bảng 1.3. Các serovar sử dụng chủ yếu trong chẩn đoán huyết thanh.
1. L. australis 7. L. icterohaemorrhagiae
2. L. autumnalis 8. L. tarassovi
3. L. bataviae 9. L. poi
4. L. canicola 10. L. pomona
5. L. grippotyphosa 11. L. saxkoebing
6. L. hebdonadis 12. L. sejroe

11
Các serovar thường gặp như trên đã có bộ huyết thanh chứa kháng thể
chuẩn để sử dụng cho trường hợp phát hiện serovar các chủng Leptospira phân
lập từ động vật, người.
1.4. Xác định một số đặc tính di truyền của các chủng xoắn khuẩn Leptospira.
Leptospira là xoắn khuẩn gây bệnh tỉ lệ cao ở lợn. Sự đa dạng về chủng
loại và tính kháng nguyên của Leptospira gây khó khăn trong công tác phòng
chống bệnh. Vì thế việc đánh giá mức độ tương đồng giữa các chủng vi khuẩn
phân lập từ lợn là cơ sở cho việc lựa chọn chủng Leptospira điển hình để tiến
hành nghiên cứu tiếp sản xuất vaccine, thuốc đặc trị.
1.4.1. Xác định các serovar thuộc nhóm độc lực cao
Các chủng Leptospira phân lập từ lợn có thể thuộc nhóm có độc lực gây
bệnh hoặc thuộc nhóm hoại sinh không có độc lực. Nếu các chủng đều cùng một

nhóm chứng tỏ các chủng Leptospira trên lợn có quan hệ di truyền gần. Gen
LipL32 qui định tính độc lực của Leptospira và chỉ có ở nhóm có độc lực cao.
Dùng phản ứng PCR với mồi đặc hiệu được thiết kế trên gen LipL32 để kiểm tra
các chủng Leptospira phân lập từ lợn thuộc nhóm nào. Nếu phản ứng dương tính
tức chủng Leptospira đó thuộc nhóm có độc lực, nếu phản ứng âm tính chủng đó
thuộc nhóm không có độc lực.
LipL32 có khối lượng 32kDa, là một trong những loại protein có nhiều
nhất trong Leptospira, có tính kháng nguyên mạnh [28]. LipL32 có là lipoprotein
có trong cấu trúc màng ngoài của Leptospira, có tính bảo tồn cao cả về mặt di
truyền lẫn miễn dịch [45], do đó chúng triển vọng cao trong ứng dụng sản xuất
vaccine. Vì các đặc tính trên, gen LipL32 mã hóa cho protein LipL32 là gen tiêu
biểu để chẩn đoán bệnh do Leptospira bằng phương pháp PCR .
Toàn bộ cấu trúc gen LipL32 đã được xác định, chúng có 816 base, mã
hóa cho 1 đoạn polypeptide gồm 272 acid amine, trong đó chứa 1 tín hiệu peptide
có 19 acid amine gắn với 1 tín hiệu lipoprotein chỉ vị trí phân cắt
peptidase[37][28].
Một nghiên cứu trên các trình tự gen của 6 chủng Leptospira gồm: L.
kirschneri serovar grippotyphosa chủng RM52, L. interrogans serovar lai,
L.interrogans serovar pomona chủng RZ11, L. noguchii serovar fortbragg chủng
12
Fort Bragg, L. borgpetersenii serovar hardjo dòng 203, và L. santarosai serovar
Tropica. So sánh các trình tự DNA LipL32 6 chủng Leptospira, cho thấy mức độ
bảo tồn gen giữa các chủng rất cao, với mức tương đồng trình tự DNA trung bình
là 96,4% (khoảng 93,5-99,6%). Hầu hết các trình tự sai khác đều là gen im lặng,
cho thấy có áp lực tiến hóa đã tác động lên hệ gen của Leptospira để duy trì
protein LipL32. So sánh trình tự acid amine của 6 LipL32 trên cho thấy tỉ lệ
tương đồng acid amin trung bình là 97,8% (khoảng 95,2 - 98,.6%). Sử dụng các
trình tự trên để thực hiện phân tích cây phát sinh loài. Kết quả cho thấy có sự
tương đồng cao giữa 2 cây phát sinh loài thực hiện trên gen LipL32 và 16s RNA
của Leptospira, điều này chỉ ra rằng các chủng Leptospira có sự khác biệt về

trình tự gen là kết quả của trôi dạt di truyền [13][18].
1.4.2. Xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng xoắn khuẩn Leptospira.
Gen 16S và 23S rRNA là 2 gen có chức năng cần thiết cho sự sống của vi
khuẩn, vừa có vùng bảo tồn và vừa có vùng biến động ở các cấp độ khác nhau,
giúp cho việc định danh hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều
loài vi khuẩn. Các gen này đã được giải trình tự và lưu trữ trong các CSDL sinh
học trực tuyến.
Đối với hầu hết các loại vi khuẩn, phân tích trình tự gen 16s rRNA có thể
kết luận về giống hoặc loài, cũng như vị trí của chúng trong bảng phân loại và
mối quan hệ họ hàng giữa chúng, là một phương pháp phổ biến và hiệu quả.
Nghiên cứu trình tự 16s rRNA của 43 chủng, đại diện cho tất cả 17 loài
Leptospira cho thấy bộ gen Leptospira gồm 2 gen 16s RNA không liên kết chặt
với nhau [13]. Trình tự 16s rRNA của các chủng trên đã được giải mã và lưu trữ
trong ngân hàng gen. Chiều dài trung bình của các gen trên là 1430bp. So sánh
các trình tự gen cho thấy, các serovar trong cùng 1 loài có trình tự gen gần hoàn
toàn giống nhau (trung bình chỉ có 0.2 bases khác nhau trong số 1430 bases so
sánh). Cây phát sinh loài được phân tích từ 16s rRNA của 43 chủng trên có 5
nhánh, trong đó có 2 nhánh lớn là nhánh gây bệnh và nhánh không gây bệnh, tỉ lệ
tương đồng trình tự gen giữa các loài trong nhóm gây bệnh rất cao (≥ 98.6%),
điều này tái khẳng định mức độ bảo tồn cao của các loài xoắn khuẩn [13].
13
Những nghiên cứu lai DNA – DNA đã cho phép tập hợp các Leptospira
thành các loài cùng gen đơn bội, nhưng thiếu mối tương quan hệ thống giữa các
loài cùng gen đơn bội với những chủng huyết thanh (serovar) cho sự phân loại
huyết thanh học còn đang được sử dụng nhiều trong những nghiên cứu lâm sàng
và dịch tễ học [44]. Nghiên cứu này xác định được mối tương quan hệ thống giữa
các chủng huyết thanh phân lập từ lợn và quan hệ di truyền giữa chúng dựa trên
phân tích gen LipL32 và 16s rRNA.
Để xác định cụ thể mức độ quan hệ di truyền của các chủng Leptospira
phân lập từ lợn, cần so sánh các trình tự gen và tính toán mức độ tương đồng

giữa chúng. Hệ gen bảo tồn 16s RNA mang tính đặc trưng cao của loài, thích hợp
là đối tượng phân tích để xác định mức độ quan hệ di truyền. Giải trình tự gen
16s RNA của các chủng, sau đó tiến hành xử lý, so sánh và phân tích các trình tự
này bằng phần mềm BioEdit để cho ra kết quả mức độ tương đồng. Mức độ
tương đồng cao cho thấy các chủng có mối quan hệ di truyền gần và ngược lại.

14
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.1.1. Thời gian nghiên cứu.
Đề tài được tiến hành từ ngày 25/2/2013 đến ngày 31/5/2013
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Bộ môn Nghiên cứu vi trùng – Phân viện thú y miền Trung, Nha Trang –
Khánh Hòa.
2.1.3 .Đối tượng nghiên cứu.
Các chủng Leptospira phân lập từ lợn.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xác định serovar của các chủng xoắn khuẩn Leptospira
- Xác định một số đặc tính di truyền phân tử của các chủng xoắn khuẩn
Leptospira
+ Khả năng mang gen LipL32 mã hóa yếu tố độc lực Lipoprotein
+ Quan hệ di truyền của các chủng Leptospira
2.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.3.1. Hóa chất, sinh phẩm.
 Các hóa chất dùng trong tách chiết DNA: theo bộ Kit High pure PCR
template preparation do Roche (Đức) sản xuất.
o PBS
o Lysozyme
o Binding Buffer

o Proteinase K
o Isopropanol
o Inhibitor Removal Buffer
o Wash Buffer
o Elution Buffer
 Các loại hóa chất, sinh phẩm dùng phản ứng MAT:
o Nước muối sinh lí
15
o Bộ kháng huyết thanh chuẩn của 15 serovar Leptospira do Viện IZSVe
(Italia) cung cấp (bảng 2.1).
Bảng 2.1. Kháng huyết thanh chuẩn kháng Leptospira dùng trong nghiên cứu
TT Serogroup Serovar
1 Australis Australis
2 Bataviae Bataviae
3 Canicola Canicola
4 Icterohaemorrhagiae Copenhageni
5 Pyrogenes Pyrogenes
6 Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae
7 Grippotyphosa Grippotyphosa
8 Hebdomadis Hebdomadis
9 Javanica Javanica
10 Panama Panama
11 Tarassovi Tarassovi
12 Sejroe Hardjo
13 Autumnalis Autumnalis
14 Pomona Pomona
15 Australis Bratislava

o Môi trường nuôi cấy Leptospira ( EMJH ) dạng lỏng
 Các loại hóa chất, sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR.

o Nước
o GoTaq Green master mix (Promega, USA)
o Mồi xuôi và mồi ngược (IDT, USA)
o Đối chứng dương
o Đối chứng âm
o DNA Marker (100bp, Promega)
 Hóa chất dùng cho điện di
o Đệm TBE 10X
o Agarose
o Thuốc nhuộm ethidium bromide
16
2.3.2. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
Dùng cho phản ứng MAT
 Micropipette các loại
 Ống eppendorf các loại vô trùng
 Đầu típ các loại vô trùng
 Ống nghiệm 10ml vô trùng
 Găng tay cao su
 Multistepper
 Đĩa nhựa 96 lỗ đáy chữ U
 Nắp đậy đĩa 96 lỗ
 Phiến kính
 Tủ ấm Prolabo, Pháp
 Kính hiển vi điện tử nền đen Trung Quốc
 Buồng cấy an toàn sinh học cấp độ 2 Bio II A (Telstar Technologies)
Dùng cho phản ứng PCR và điện di
 Đầu típ các loại vô trùng
 Micropipette các loại vô trùng
 Ống eppendorf các loại vô trùng
 Găng tay chuyên dụng

 Máy li tâm lạnh Eppendor MiKro 22R (Hattich – Đức )
 Máy Block nhiệt Thermo block NB_305TB, N_BioTEX, Korea
 Máy vortex VWR_International
 Máy PCR PX2 (Thermo electron - USA)
 Máy điện di Apelex PS 304 minipac II
 Lò vi sóng
 Hệ thống chụp ảnh điện di Bioprint, máy tính và máy in Viber
Lourmat, Pháp
 Tủ lạnh SR-18AN, Sanyo, Nhật
 Tủ lạnh âm DAIREI, Nhật
 Cân phân tích 324S, Sartorius, Đức
 Kính hiển vi điện tử nền đen Trung Quốc
 Buồng cấy an toàn sinh học cấp độ 2 Bio II A (Telstar Technologies)
17
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1. Xác định các serovar Leptospira
Serovar của các chủng Leptospira được xác định bằng phương pháp vi
ngưng kết MAT (Microscopy agglutination test) với bộ kháng huyết thanh chuẩn
gồm 15 serovar (bảng 2.1).
Các chủng Leptospira phải được cấy chuyển 3-4 ngày trước khi thực hiện
phản ứng MAT để xác định serovar. Chúng được cấy chuyển trên môi trường
EMJH dạng lỏng, mỗi chủng được cấy chuyển lên 2 ống môi trường (1 ống dùng
để làm phản ứng, 1 ống dùng để cấy chuyển lần sau). Chuyển 0,5-1ml canh
khuẩn sang ống môi trường mới tương ứng, ủ ấm 30
o
C trong 3-4 ngày trong điều
kiện tối. Sau 3-4 ngày nuôi cấy, Leptospira đang vào pha tăng trưởng, mật độ
cao, phù hợp để làm phản ứng MAT.
Tiến hành phản ứng MAT
●

Chuẩn bị đĩa 96 lỗ: đánh dấu số đĩa và sơ đồ mẫu
●
Cho 50µl huyết thanh có chứa kháng thể chuẩn vào lỗ đĩa tương ứng
với từng serovar
●
Cho 50µl mẫu kháng nguyên vào lỗ tương ứng với từng serovar
●
Đối chứng dương 100%: cho 50µl huyết thanh đối chứng dương vào lỗ
tương ứng với từng serovar.
●
Đối chứng dương 50%: cho 75µl huyết thanh đối chứng dương vào lỗ
tương ứng với từng serovar.
●
Đối chứng âm: cho 50µl nước muối sinh lý vào lỗ tương ứng với từng serovar.
●
Đậy nắp đĩa và ủ ấm 30
0
C ± 2
0
C trong vòng 2 giờ.
●
Đọc kết quả: lấy 5-10µl hỗn dịch kháng nguyên-huyết thanh nhỏ lên
kính và đọc kết quả ngưng kết dưới kính hiển vi nền đen với vật kính x10 và x30.
Mẫu huyết thanh được đánh giá dương tính khi có sự ngưng kết giữa kháng
nguyên - Kháng thể ở mức độ 50% trở lên, xem dưới kính hiển vi thấy hình
ngưng kết đám mây.
●
Lưu ý: Phản ứng có giá trị khi đối chứng âm không có hiện tượng
ngưng kết; Đối chứng dương 100% có mức ngưng kết ít nhất là 50% và đối
chứng dương 50% có 50% Leptospira bị ngưng kết.

18
2.4.2. Phương pháp xác định khả năng mang gen LipL32
Gen LipL32 được xác định bằng phương pháp PCR [9]
2.4.2.1. Tách chiết DNA
a. Nguyên tắc
Mẫu DNA của Leptospira được tách chiết bằng bộ Kit High pure PCR
template preparation do Roche (Đức) sản xuất. Quy trình chiết tách được thực
hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mẫu sau khi xử lý được ly giải bằng cách
ủ với đệm ly giải và proteinase K.
- Các acid nucleic được gắn vào màng lọc của ống lọc sau đó ta rửa với
đệm Inhibitor Removal Buffer để loại các chất gây ức chế PCR
- Rửa loại bỏ muối, protein và các thành phần khác
- Acid nucleic sau khi được tinh sạch sẽ dùng đệm Elution tách ra khỏi
màng lọc.
DNA trong mẫu tách chiết được kết tủa trên màng lọc.
b. Quy trình tách chiết
Quy trình tách chiết DNA của Leptospira trong mẫu thận bộ Kit High
pure PCR template preparation:
 Bước 1: Lấy dịch mẫu
o Cho 200µl canh khuẩn Leptospira vào ống eppendorf mới
 Bước 2: Bổ sung 5µl Lysozyme (10mg/ml trong 10mM Tris-HCl, pH
8.0) vào ống chứa dịch mẫu, ủ ấm 37
0
C/15phút
 Bước 3: Bổ sung 200µl binding buffer và 40µl Proteinase K  trộn
đều ủ ấm 70
0
C/10 phút
 Bước 4: Bổ sung 100µl Isopropanol và trộn đều
 Bước 5:

o Chèn ống có lọc (ống nhỏ có lọc màu trắng) vào ống thu hoạch (ống lớn)
o Hút 500µl dung dịch mẫu cho vào ống lọc
o Ly tâm 8500 vòng/phút trong 1 phút
 Bước 6:
o Loại bỏ nước trong ống thu hoạch
o Bổ sung 500µl Inhibitor removal buffer vào ống lọc