Sự hình thành peptide có hoạt tính sinh học trong sản phẩm sữa lên men

Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 5
1. GIỚI THIỆU
Peptide có hoạt tính sinh học (bioactive peptide/ biologically active
peptide) là những peptide mà ngoài giá trị dinh dưỡng chúng còn có một số ảnh
hưởng đặc biệt đến chức năng sinh lý của cơ thể. Tính chất này được quy định bởi
thành phần và thứ tự của các amino acid trong peptide. Mellander (1950) là người
đầu tiên đưa ra thuật ngữ peptide có hoạt tính sinh học khi ông nhận thấy các các
peptide bị phosphoryl hóa có nguồn gốc từ casein hoạt động như chất mang các
chất khoáng. Những nghiên cứu về peptide đã có những bước tiến đáng kể trong
vài thập niên gần đây. Những hiểu biết về tác dụng và cơ chế tác dụng của peptide
đã làm cho nó ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm lĩnh vực trong y dược.
Ngoài ra, peptide có hoạt tính sinh học còn được sử dụng trong các loại thực phẩm
chức năng, nhất là các thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ sữa.

Hình 1. Ảnh hưởng của các peptide có hoạt tính sinh học lên cơ thể

Người ta có thể thu nhận một số peptide bằng cách tách từ các nguyên liệu
tự nhiên, ví dụ: lấy insulin từ tuyến tụy của bò, heo…. Tuy nhiên việc này gặp rất
nhiều khó khăn, ví dụ: hàm lượng peptide mong muốn ở trong mô thì rất nhỏ; khó
khăn trong vấn đề thu gom và xử lý nội tạng động vật (bò, heo…); trong quá trình
tách lấy các peptide từ mô có thể nhiễm hoặc chứa những virus nguy hiểm…. Hiện
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 6
nay, người ta có thể thu nhận các peptide có hoạt tính sinh học- bằng nhiều
phương pháp: thủy phân protein (dùng enzyme trực tiếp hoặc thông qua quá trình
lên men của vi sinh vật), tổng hợp hóa học, kỹ thuật gen. Trong số đó, các peptide
có hoạt tính sinh học từ sữa thường được thu nhận bằng phương thuỷ phân và lên
men của vi sinh vật.
Gần đây, những cơ sở dữ liệu về trình tự của các amino acid trong peptide
có hoạt tính sinh học ngày càng được phát triển, từ đó ta có thể xác định những

peptide có hoạt tính sinh học tiềm ẩn trong protein. Ngoài ra, do chúng ta đã biết
được vị trí thủy phân của các enzyme thủy phân protein như pepsin, trypsin,
chymotrypsin, do đó sự giải phóng các peptide có hoạt tính sinh học trong quá
trình thủy phân nói chung là có thể dự đoán được.Việc nghiên cứu hệ thống thuỷ
phân của vi sinh vật cũng mở ra hướng mới trong sản xuất các peptide có hoạt tính
sinh học.
2. CÁC PEPTIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG NHÓM SẢN
PHẨM SỮA LÊN MEN
Mặc dù protein của các động vật và thực vật khác đều có chứa các peptide
có hoạt tính sinh học tiềm ẩn (nằm trong protein), nhưng hiện nay protein từ sữa
vẫn là nguồn cung cấp peptidee có hoạt tính sinh học chính. Sữa có nhiều chất có
hoạt tính sinh học và có tác động có lợi nhiều mặt lên cơ thể. Hầu hết protein của
sữa có rất ít hoặc không có hoạt tính sinh học khi ở trạng thái ban đầu, tuy nhiên
qua quá trình tiêu hóa hoặc thủy phân thì nó giải phóng ra rất nhiều peptide có
hoạt tính sinh học.
Trong thành phần của tất cả các casein có hàm lượng các amino acid không
phân cực khá cao (35-45%) như Val, Leu, Ile, Pro, Phe. Trong số đó hàm lượng
proline là khá cao: 17, 10, 35, 20 gốc proline trong một mol
1S

,
2S

,

,

-casein
(mỗi loại casein này có 199, 207, 209, 169 gốc amino acid trong phân tử). Sự có
mặt một lượng lớn proline trong phân tử casein làm cho phân tử casein có rất ít

Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 7
cấu trúc xoắn

và cấu trúc lá xếp

. Điều này làm cho casein dễ bị thủy phân
mà không cần phải làm cho nó bị biến tính trước (ví dụ bằng nhiệt hay acid).
Tuy nhiên casein lại chứa rất ít các amino acid chứa lưu huỳnh, điều này
làm giảm đi giá trị sinh học của nó.
1S

và

-casein không chứa cysteine hay
cystine, trong khi đó
2S

và

-casein chứa 2 gốc cysteine trong phân tử mà thông
thường tồn tại dưới dạng cầu disulphide.
Casein, mà đặc biệt là
2S

-casein có rất nhiều Lys, đây là amino acid rất
cần thiết mà trong nhiều protein thực vật có rất ít.
Bảng 1. Những peptide có hoạt tính sinh học từ potein sữa
Tên
Protein tiền thân

Hoạt tính sinh lý
Casomorphins
α-Lactorphin
β-Lactorphin
Lactoferroxins
Casoxins
Casokinin

Lactokinins
Antihypertensive peptides
Immunopeptides
Lactoferricin
Casocidin
Isracidin
Casoplatelins
Phosphopeptides
α-, β-Casein
α-Lactalbumin
β-Lactoglobuli
Lactoferrin
κ-Casein
α-, β-Casein

β-Lactalbumin
β-Casein
α-, β-Casein
Lactoferrin
α
S2
-Casein

α
S1
-Casein
κ-Casein
α-, β-Casein
Giảm đau cơ vận chủ
Giảm đau cơ vận chủ
Giảm đau cơ vận chủ
Giảm đau cơ đối vận
Giảm đau cơ đối vận
Kháng ACE (Angiotensin I converting
enzyme)
Kháng ACE
Chống chứng tăng huyết áp.
Ảnh hưởng lên hệ thống miễn dịch
Kháng vi sinh vật
Kháng vi sinh vật
Kháng vi sinh vật
Kháng vi sinh vật
Giữ khoáng
2.1 Sự hình thành các peptide có hoạt tính sinh học trong suốt quá trình
lên men
Các amino axit có mặt trong sữa giới hạn sự cung cấp dinh dưỡng cho LAB
(lactic acid bacteria) phát triển. Vì thế, LAB dựa vào hệ thống phân giải protein
phức tạp để đảm bảo sự phát triển tối ưu trong môi trường sữa. Hệ thống protein
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 8
phân giải được tạo nên do các proteinase, peptidase và hệ thống vận chuyển.
Những tế bào LAB điều khiển:
1. Proteinase nằm trong vỏ bao tế bào vi khuẩn phân hủy casein thành

oligopeptide.
2. Hệ thống vận chuyển cho phép duy trì sự giải phóng oligopeptide
3. Peptidase trong tế bào thủy phân oligopeptide thành peptide và axit amin
và được tế bào sử dụng.
Bước đầu tiên trong phân giải protein bao gồm proteinase giải phóng
peptide từ casein. Sau đó những peptide được giải phóng này sẽ được thủy phân
bởi peptidase tạo thành các axit amin và các peptide có mạch ngắn hơn và chúng
sẽ được vận chuyển vào trong tế bào bởi hệ thống vận chuyển.
2.1.1 Proteinase
Hầu hết proteinase có mặt trong vỏ bao tế bào. Proteinase Lactococcal là
protein rất lớn với phân tử lượng la 140.000 kDa và pH tối thích là 5.5-6.5. Chúng
được phân lọai thành những chất kìm hãm proteinase serin .
Proteinase được xếp peptide loại là PI ( khi ß_casein là protein chính bị
thủy phân bởi enzyme) hay là PIII (khi không chỉ β-casein bị thủy phân mà αs1-
casein cũng bị thủy phân bởi enzyme). Khi được tinh sạch, những enzyme này có
thể làm giảm một lượng casein và giải phóng ra rất nhiều oligopeptide. Khoảng
20% oligopeptide được giải phóng với kích thước và hàm lượng đủ nhỏ để hệ
thống vận chuyển của Lactococcus lactis di chuyển đi.
Các gen Proteinase được tìm thấy đã được mã hóa trên plasmid. Sự sinh sản
vô tính của proteinase gene ở Lactococcus và nó được chuyển thành Prt- L.lactis.
Sự biến hình của Lactis lại dẫn tới kết quả là nó được chuyển thành hình dạng
Prt+. Gen Proteinase prtP và prtM được mã hóa tương thích với protein 200 kDa
và lipoprotein 32kDa. Loại 2 bao gồm sự chuyển từ proteinase không hoạt hóa
thành sang dạng hoạt hóa trong suốt và sau khi di chuyển qua màng. Mã gen PrtP
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 9
cho tiền proteinase với một peptide ở cuối đoạn N, và một dãy màng bám chặt ở
cuối đoạn C. Cuối đoạn C của protein bao gồm lớp màng với cấu trúc xoắn anpha
kị nước. Nhiều aminoacid cơ bản tạo thành vùng cấu trúc xoắn cuối đầu C, và có
thể tin rằng vai trò của các amino axit liên quan tới sự tương tác với những nhóm

chỉ thị phosphate của lớp phospholipid tạo nên như một dấu hiệu ngừng vận
chuyển. Lactobacillus helveticus và Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus có hoạt tính
enzyme mạnh hơn Lactococcus. Hoạt tính của thành tế bào từ Lb. helveticus L89
được nghiên cứu bởi Martín-Hernández et al. Foucaud and Juil-lard đã minh họa
rằng cấu trúc peptide được tìm thấy sau 24 giờ lên men sữa. Giai đoạn cuối của
thời kì phát triển, hoạt tính của proteinase vẫn tồn tại ở pH thấp nhưng ở pH thấp
thì hệ thống vận chuyển không hoạt động nên những peptide ngừng được tiếp
nhận bởi tế bào.
Hoạt tính proteinase khác nhau rõ rệt trên từng mẩu của LAB và cũng gây
nên tác động chủ yếu lên mẫu peptide. Mỗi enzyme probiotic đều có đặc tính riêng
khác nhau giữa các loài, cũng như từ chuỗi này đến chuỗi khác trong cùng một
loài, góp phần giải phóng ra những peptide có hoạt tính sinh học tiềm năng. Vì vậy
bằng hoạt tính và những đặc điểm của proteinase nên chúng đã đóng vai trò trong
giai đoạn phát triển của những peptide trong sữa lên men và sự giải phóng của
những peptide có hoạt tính sinh học tiềm năng.
2.1.2 Peptidase
Vi khuẩn lactic điều khiển toàn bộ phạm vi rộng lớn của những enzyme
proteolytic bao gồm endopeptidase, dipeptidase. Đặc điểm hóa sinh của peptidase
này phản ánh vị trí trong tế bào của chúng. Aminopeptidase hoạt động trên những
oligopeptide được giải phóng bởi một proteinase bằng cách phân hủy phần còn lại
cũa những a.a ở cuối đoạn N. Aminopeptidase được cấu thành bởi PepN và PepC.
Mặt khác như PepA thì giải phóng ra phần còn lại glutamate cuối amino thì ít đặc
biệt hơn. Dipeptide và tripeptide có thể được phân hủy bởi peptidase đặc trưng.
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 10
Sự có mặt của peptidase từ proline thì cần thiết cho sự phát triển tối ưu của
LAB nhờ khả năng giảm bớt những oligopeptide giàu proline từ casein.
Aminopeptidase proline PIP và PepI đặc biệt cho dipeptide và tripeptide với phần
còn lại proline ở cuối đầu N được tách ra từ 2 chuỗi của LAB.
2.1.3 Sự vận chuyển peptide

Những oligopeptide và những peptide nhỏ thì được tiếp nhận bởi tế bào
bằng một hệ thống vận chuyển oligopeptide (OPP), hệ thống vận chuyển dipeptide
và tripeptide (PtpT và PtpP). Hệ thống OPP bao gồm 2 ATP gắn với những
protein (OppD và OppF); 2 protein OppB và OppC; và 1 protein làm môi trường
kết dính là OppA. Chỉ một số lượng giới hạn peptide được tạo ra nhờ proteinase
được vận chuyển bởi hệ thống vận chuyền oligopeptide.
Focaud và Juillard đã chú ý rằng dưới 25% casein (bắt nguồn từ những
peptide) được sử dụng để cung cấp cho sự phát triển LAB. Hầu hết những
oligopeptide này không thúc đẩy sự phát triển của LAB bởi vì chúng không được
vận chuyển vào tế bào. Thêm vào đó, kênh dẫn những peptide nhỏ thông qua OPP
được giới hạn bởi những kích cỡ của những peptide. Hệ thống vận chuyển của
LAB có thể khiến chúng tiếp thu được những oligopeptide có chiều dài lên tới 18
a.a, mặc dù ta chỉ tìm thấy những peptide có chiều dài 11 a.a là được vận chuyển.
Vì vậy, những peptide không được vận chuyển đã được xếp vào nhóm những
peptide có hoạt tính sinh học.
Để làm tăng lượng peptide có hoạt tính sinh học trong các sản phẩm sữa lên
men thì người ta cho lên men hoặc đồng lên men với chủng vi khuẩn lactic thủy
phân protein mạnh. Việc lựa chọn chủng vi khuẩn có ảnh hưởng tới việc giải
phóng peptide có hoạt tính sinh học. Chủng vi khuẩn không nên thủy phân protein
quá mạnh (nó có thể phá hủy sản phẩm) và cần có tính đặc hiệu phù hợp để có thể
giải phóng peptide có hoạt tính sinh học mong muốn. Các protease ở thành tế bào
vi khuẩn lactic có tính đặc hiệu rộng, nó thủy phân protein sữa, làm giải phóng
nhiều loại oligopeptide. Vi khuẩn lactic có thể vận chuyển các peptide có từ 18
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 11
amino acid trở xuống đi vào tế bào để sử dụng làm nguồn nitơ. Các peptide có
mạch dài hơn thì không được vận chuyển vào tế bào. Sau khi tế bào vi khuẩn bị
phân hủy thì những peptide này sẽ được thủy phân tiếp bởi các peptidase nội bào
của vi khuẩn lactic.
Nhiều vi sinh vật có hệ enzyme thủy phân protein mạnh, ví dụ 1 số loài đã

được nghiên cứu như: Lactococcus lactis, Lactobacillus helveticus, Lb plantarum,
Lb rhamnosus, Lb acidophilus, Streptococcus thermophilus và Lb. delbrueckii ssp.
bulgaricus… Hệ enzyme này bao gồm các enzyme ở thành tế bào và các enzyme
bên trong tế bào ví dụ: endopeptidase, aminopeptidase, tripeptidase và dipeptidase
(Christensen, Dudley, Pederson, & Steele, 1999).
Hiện đã có nhiều nghiên cứu báo cáo về sự giải phóng của các peptide có
hoạt tính sinh học từ protein của sữa nhờ vi sinh vật thủy phân (Gobbetti et al.,
2004; Gobbetti, Stepaniak, De Angelis, Corsetti, & Di Cagno, 2002; Korhonen &
Pihlanto-Leppa la, 2001, 2004; Mataret al., 2003), tuy nhiên hầu hết những báo
cáo này đều tập trung vao việc thu nhận các peptide có tác dụng làm giảm chứng
cao huyết áp, điều hòa hệ miễn dịch, chống oxi hóa. Hai trong số những peptidee
ức chế ACE được biết đến nhiều nhất là VPP và IPP, 2 peptide này đã được tìm
thấy trong sữa lên men bởi Lb.helveticus (Nakamura, Yamamoto, Sakai, Okubo et
al., 1995; Sipola, Finckenberg, Korpela, Vapaatalo, & Nurminen, 2002). So với
các vi khuẩn lactic khác thì khi lên men sữa với Lb.helveticus thì sản phẩm cho
thấy hoạt tính ức chế ACE cao và tác động làm giảm huyết áp rõ rệt. Gobbetti,
Ferranti, Smacchi, Goffredi, and Addeo (2000) đã chứng minh có sự tạo thành
peptidee ức chế ACE khi sử dụng 2 loài Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus và Lc.
lactis ssp.cremoris sau khi lên men sữa trong 72 giờ. Hai peptidee ức chế ACE
được tìm thấy Ser-Lys-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly Pro-Ile và Ser-Lys-Val-Tyr-Pro
cho thấy khả năng bền vững trong môi trường tác động bởi acid, kiềm, enzyme
thủy phân của hệ tiêu hóa hoặc trong điều kiện bảo quản ở 5-10
o
C trong 4 ngày.
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 12
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự thủy phân nhờ vi sinh vật có thể làm
sinh ra các peptide có khả năng điều hòa hệ miễn dịch (Gill, Doull, Rutherfurd, &
Cross, 2000). Khi sử dụng enzyme được tách ra từ Lactobacillus GG var. casei để
thủy phân casein, sau đó tiếp tục cho thủy phân bằng pepsin và trypsin, sản phẩm

thu được có tính chất điều hòa hệ miễn dịch, khả năng này thể hiện mạnh nhất khi
sử dụng
1S

-casein. Matar (2001) đã cho Lb.helveticus vào sữa, sau đó lấy sữa
này cho chuột ăn trong 3 ngày thì phát hiện lượng IgA tăng rất cao trong chất nhầy
ở ruột.
Bảng 2. Một vài ví dụ về các peptidee có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ
protein của sữa đƣợc giải phóng ra nhờ vi sinh vật

2.2 Phân loại theo chức năng
Dựa vào chức năng, người ta có thể chia peptide có hoạt tính sinh học từ
sữa thành nhiều loại:
Peptide ảnh hưởng đến hệ tuần hoàn
Peptide ảnh hưởng lên hệ thần kinh
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 13
Peptide liên kết với khoáng
Peptide điều hòa hệ miễn dịch
Ngoài ra còn có các peptide có các chức năng khác (ví dụ như làm co cơ,
chống đông máu…) nhưng các peptide này chỉ chiếm hàm lượng rất nhỏ hoặc có
ảnh hưởng không đáng kể nên không được đề cập đến trong bài.
Có những peptide có nhiều chức năng (ví dụ vừa ảnh hưởng lên hệ tuần
hoàn, vừa ảnh hưởng lên hệ thần kinh), nên sự phân loại trên cũng chỉ mang tính
chất tương đối.
2.2.1 Các peptide ảnh hƣởng lên hệ tuần hoàn
Trong loại peptide này, người ta thường quan tâm đến các peptide có khả
năng làm giảm huyết áp do hiện nay có rất nhiều người mắc bệnh cao huyết áp.
Angiotensin I converting enzyme (ACE- peptidyldipeptide hydrolase, EC
3.4.15.1) có liên quan đến hệ rennin-angiotensin, có liên quan đến huyết áp và

cũng liên quan đến cân bằng muối và nước. ACE chuyển angiotensin I thành
angiotensin II (một chất có khả năng làm co mạch máu (vasoconstrictor), đồng
thời phân hủy bradykinin (một chất có khả năng làm giãn mạch máu (vasodilator).
Chính vì vậy việc ức chế enzyme này sẽ dẫn đến việc chống lại hiện tượng cao
huyết áp.
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 14

Hình 2. Hệ renin-angiotensin, sự tương tác giữa các peptide có hoạt tính
sinh học với các cơ quan thụ cảm và những ảnh hưởng.
ACE hoạt động như một dipeptidyl carboxypeptidase, nó loại dipeptide từ
đầu C của cơ chất (có đầu C tự do). Nó ưu tiên kết hợp đối với cơ chất có các
amino acid kị nước ở 3 vị trí cuối, và có 1 ít ái lực đối với cơ chất có amino acid
có 2 nhóm carboxy ở đầu C (Glu, Asp) hoặc có Proline ở vị trí áp chót.
Người ta thấy rằng ACE có Glu, Tyr và Arg ở tâm hoạt động.
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 15

Hình 3. Mô hình tâm hoạt động của ACE và tương tác của nó với cơ chất
peptide (Bunning, 1987)
Chất ức chế ACE đầu tiên được phát hiện trong nọc rắn Bothrops jararaca
vào năm 1970. Trong nọc rắn này có các peptide ức chế ACE có từ 5-13 gốc
amino acid trong phân tử, trong số đó có peptide Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-
Pro-Pro là có hoạt tính cao nhất in vivo. Một peptide khác là bradykinin-
potentiating peptide 5a (BPP5a) Glu-Lys-Trp-Ala-Pro có thứ tự 3 amino acid cuối
ở đầu C rất phù hợp cho việc kết hợp với tâm hoạt động của ACE, tuy nhiên
peptide này lại dễ bị phân hủy trong điều kiện in vivo. Do đó, người ta đã thay thế
gốc Trp trong phân tử bằng gốc Phe để có được phân tử bền hơn nhưng vẫn có
hoạt tính ức chế ACE mạnh. Và cũng từ đó, hầu hết các thuốc ức chế ACE được
sử dụng đều có cấu trúc tương tự hay liên quan đến tripeptide Phe-Ala-Pro.

Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 16

Hình 4. Giả thuyết về sự tương tác của peptide với tâm hoạt động của ACE

Hình 5. Giả thuyết về sự tương tác của Captopril với tâm hoạt động của
ACE

Hình 6. Giả thuyết về sự tương tác của Enalaprilat với tâm hoạt động của
ACE
Hai hình trên cho thấy 2 loại thuốc ức chế ACE có cấu trúc tương tự như
peptide Ala-Pro và Phe-Ala-Pro. Captopril tương tự như Ala-Pro, trong đó Alanin
ứng với peptide được thay thế bởi nhóm có –HS (sulfhydryl) có khả năng tương
tác mạnh hơn ion Zn
2+
trong enzyme. Còn đối với Enalaprilat thì tương tự như
Phe-Ala-Pro nhưng Enalaprilat liên kết mạnh hơn với ACE nhờ nhóm carboxyl so
với nhóm carbonyl trong tripeptide. IC50 của Enalaprilat và Captopril lần lượt là
2.8 và 9.7 nM, tức là hoạt tính rất mạnh.
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 17
Các peptide ức chế ACE có nguồn gốc từ casein gọi là “casokinin” và từ
whey gọi là “lactokinin” .
Tính chất
Như trên đã nói, peptide ức chế ACE thường có 3 amino acid kị nước ở vị
trí cuối và nhất là gốc amino acid cuối cùng(đầu C). Gốc amino acid cuối cùng ở
đầu C thường là Pro, tuy nhiên nó cũng có thể là Lys hoặc Arg, 2 amino acid này
(ưa nước) tích điện dương ở nhóm

-amino. Người ta nhận thấy có mối liên hệ

giữa cấu trúc của peptide với khả năng ức chế ACE là hoạt tính ức chế ACE của
dipeptide có Pro ở đầu C thì cao hơn so với khi đầu C là Tyr, và Tyr > Phe. Khi
được đưa vào cơ thể thì peptide có Tyr ở đầu C có tác động chậm hơn nhưng kéo
dài hơn so với peptide có Phe ở đầu C (Suetsuna, 1998). Việc có các amino acid kị
nước trong phân tử và nhất là protein làm cho các peptide này có khả năng chống
lại sự thủy phân tốt hơn. Trp-Ala-Pro là peptide có cấu trúc thích hợp nhất cho
việc kết hợp với tâm hoạt động của ACE.
Bảng 3. Một số peptide có tác dụng làm giảm huyết áp đã được nghiên cứu
in vivo
Sản phẩm, nguồn
Peptide
Tham khảo
Sữa chua

-casein,

-casein, Val-
Pro-Pro /Ile-Pro-Pro
Hata et al. (1996)

Sữa chua
Val-Pro-Pro /Ile-Pro-Pro
Seppo et al. (2003)
Sữa chua
Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro
Mizushima et al. (2004)
Sữa chua (Dahi)

-casein
Ashar and Chand (2004)

Bảng 4. Ảnh hưởng ức chế ACE và giảm huyết áp của một số peptide thu
nhận từ quá trình thủy phân whey protein bởi một số enzyme
Mẫu

ACE inhibitory activity
(%)
Decreased SBP (mm Hg)
Whey protein (ban đầu)
0.0
-38 ± 2
pepsin
83.7
-47 ± 3
trypsin
56.7
-51 ± 4

- chymotrypsin
76.0
-40 ± 4
proteinase K
95.7
-55 ± 3
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 18
actinase E
55.7
-55 ± 4
thermolysin
98.6

-42 ± 4
papain
86.5
-47 ± 4
Mức độ giảm huyết áp sau 6 giờ sử dụng
2.2.2 Các peptide ảnh hƣởng lên hệ thần kinh
2.2.2.1 Khái niệm
Cho đến nay vẫn chưa có một định nghĩa chính xác về các peptide ảnh
hưởng lên hệ thần kinh (neuropeptide – NP). Người ta gọi tên các peptide này chủ
yếu là dựa vào kết quả những quan sát về ảnh hưởng của nó lên các hoạt động sinh
lý của cơ thể (tên gọi có tính chất lịch sử) hơn là do những hiểu biết chi tiết về cơ
chế tác động của chúng. Ví dụ, trong một thời gian khá dài, người ta biết CCK
(cholecytokinin) như là hormon ở hệ tiêu hóa, nhưng đến năm 1975 người ta lại
phát hiện nó có trong não của chuột, tác động đến hệ thần kinh chuột.
Những NP có tính chất tương tự như morphin (morphin có tác dụng làm
giảm đau, tạo cảm giác dễ ngủ) được gọi là “opioid peptide / opiate peptide – OP”.
Các OP có nguồn gốc từ protein thực phẩm được gọi là “exorphin”. Các OP có
nguồn gốc từ casein được gọi là “casomorphin”. Ví dụ:
- OP có nguồn gốc từ β-casein gọi là β-casomorphin, đây là một trong
những OP từ sữa đầu tiên được phát hiện (Smacchi, 1998).
- OP có nguồn gốc từ α-LA gọi là α-lactorphin.
- OP có nguồn gốc từ serum albumin gọi là serorphin.
Tuy nhiên, người ta cũng tìm thấy trong protein sữa một số peptide có tính
chất ngược lại (đối với hệ thần kinh) với các OP trên; những peptide này có từ sự
thủy phân
1S

-casein và

-casein và được gọi là “casoxin”, nó ảnh hưởng lên chất

thụ cảm loại

và

, nhưng khả năng ức chế của chúng thì kém hơn naloxone.


Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 19

2.2.2.2 Tính chất
Trong các exorphin thường có gốc tyrosine ở đầu N và có các gốc amino
acid chứa vòng thơm (như tyrosine và phenylalanine) ở vị trí thứ 3 hoặc thứ 4 (đối
với

-casein và 1 vài

-cn thì có 1 gốc arginine đứng trước tyrosine ở đầu N),
cấu trúc này giúp cho peptide kết hợp tốt với các cơ quan thụ cảm (receptor). Ví
dụ:
-

-casomorphin: peptide đoạn 60-69 trong

-cn (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-
Pro-Ile-His-Asn-Ser-OH) kích thích cơ quan thụ cảm kiểu

(

-type receptor)

(có tác dụng đối với các biểu hiện cảm xúc, mất cảm giác đau, hạn chế vận động
của ruột và hệ hô hấp).
-

-casomorphin: peptide đoạn 90-96 trong
1S

-cn (Arg-Tyr-Leu-Gly-
Tyr-Leu-Glu-OH) có tính chất kích thích cơ quan thụ cảm kiểu

(có tác dụng đối
với các biểu hiện cảm xúc và sự mất cảm giác đau). Ngoài ra còn có các đoạn khác
như 90-95, 91-96.
-

-lactorphin: đoạn 50-53 của

-LA (Tyr-Gly-Leu-Phe-OH) có tính chất
kích thích cơ quan thụ cảm kiểu

. Các OP này có tác dụng điều hòa các hành vi
cư xử, làm gia tăng hiện tượng mất cảm giác đau, kéo dài thời gian vận chuyển
của thức ăn trong ruột, gia tăng sự hấp thụ các amino acid, chất điện ly và nước;
kích thích tiết insulin và somastotatin (Meisel 1997b; Xu 1998).
-

-lactorphin: đoạn 102-105 của

-LG (Tyr-Leu-Leu-Phe-OH) có tính
chất kích thích cơ quan thụ cảm kiểu


. Tính chất tương tự

-lactorphin.
- Casoxin: các đoạn peptide từ 25-34, 35-41, 57-60 và 58-61 của

-cn .
Khi được đưa vào máu, những peptide này có thể đi tới não hay các cơ
quan khác và thể hiện những tính chất tương tự như thuốc phiện hoặc morphine.
Đó có thể là lý do khiến cho những đứa trẻ sơ sinh trở nên dễ ngủ sau khi uống
sữa.
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 20
Người ta đã làm thí nghiệm với các con bê sơ sinh cho thấy

-
casomorphin được vận chuyển nguyên vẹn qua thành ruột vào máu, sau đó nó gây
ảnh hưởng lên hệ thần kinh gây nên hiện tượng buồn ngủ và trầm tĩnh (Clare
2000).
2.2.3 Các peptide liên kết với khoáng
Phospho trong sữa có khoảng 900mg/lít, có thể phân thành các loại:
 Vô cơ: phosphate hòa tan và ở dạng dung dịch keo.
 Hữu cơ: trong phospholipid, casein và đường phosphate, nucleotide.
Casein chứa khoảng 0.85% phospho; trong đó
1S

,

và


-cn chứa tương
ứng là 1.1, 0.6, 0.16% phospho. Nếu tính theo mol thì
1S

,
2S

,

và

-cn chứa
tương ứng 8(9), 10-13, 5(4), và 1(2,3) mol phospho trong 1 mol phân tử protein.
Phospho có vai trò rất quan trọng trong sữa:
 Về mặt dinh dưỡng, nó có thể kết hợp với các chất khoáng như Ca
2+
,
Zn
2+
…
 Làm tăng tính hòa tan của casein.
 Làm tăng tính bền nhiệt cho casein.
 Có ảnh hưởng tới quá trình đông tụ để sản xuất phô mai.
Ở đây chúng ta quan tâm đến khả năng liên kết với khoáng của phospho
trong sữa.
Phospho liên kết hóa trị với protein khá bền vững. Liên kết này chỉ bị phá
vỡ khi có chế độ xử lý nhiệt cao, pH cao và sử dụng phosphatase. Phosphate chủ
yếu tạo liên kết ester với serine (và một ít với threonine) tạo monoester:
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 21

Sự phosphoryl hóa xuất hiện trong màng membrane của thể Golgi của tế
bào động vật hữu nhũ, được xúc tác bởi serine-specific casein kinase. Sau khi
được giải phóng, những peptide được phosphoryl hóa này (casein phosphopeptide)
liên kết với các ion, chủ yếu là Ca
2+
, một ít Zn
2+
, Fe
2+
, Cu
2+
, Mn
2+
.
Từ thứ tự các amino acid trong phân tử protein (casein) và từ các thí
nghiệm thực tế, người ta nhận thấy hầu hết CPP (calcium-binding
phosphopeptides) có chứa 3 nhóm serine phosphate và theo sau bởi 2 gốc glutamic
(Ser-Ser-Ser-Glu-Glu). CPP là 1 trong những chất bền vững nhất đối với sự thủy
phân của enzyme trong ruột, và hầu hết nó được tìm thấy dưới dạng phức với
canxi phosphate. Sự kết hợp với Ca
2+
tạo nên khả năng hòa tan cao hơn và do đó
Ca
2+
dễ dàng được hấp thu hơn. Từ đó, CPP có thể có tác dụng có ích cho việc
giúp xương cứng chắc. Ngoài ra, CPP cũng giúp làm giảm hiện tượng sâu răng
thông qua việc tái tạo canxi cho men răng và ức chế sự bám dính của các vi khuẩn
hình thành bựa răng. Do có tính chất này, chúng được ứng dụng để điều trị các
bệnh về răng và được cho vào trong kem đánh răng (Darragh 2002).

2.2.4 Các peptide ảnh hƣởng lên hệ miễn dịch của cơ thể
Cho đến nay thì người ta vẫn chưa hiểu rõ ràng cơ chế làm cho các peptide
có ảnh hưởng lên hệ miễn dịch của cơ thể (immunopeptide-IP). Một số peptide từ
sữa có thể ảnh hưởng đến cả hệ miễn dịch và sự sinh sản của tế bào.
Bảng 5. Một số peptide ảnh hưởng lên hệ miễn dịch của cơ thể có trong sữa
Nguồn gốc
Peptide

-cn
Đoạn 191-193: Leu-Leu-Tyr-OH;
đoạn 63-68: Pro-Gly-Pro-Ile-His (Pro)-
Asn-OH, đoạn 193-209
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 22
1S

-cn
Đoạn 194-199: Thr-Thr-Met-Pro-
Leu-Trp-OH

-LG
Đoạn 22-25: Leu-Ala-Met-Ala-OH;
đoạn 25-40, 78-83, 92-100

-LA
Đoạn 51-53: Gly-Leu-Phe-OH;
đoạn 1-5, 61-68, 75-80, 17-31, 104-109,
Ta nhận thấy trong các peptide này có chứa rất nhiều gốc amino acid không
phân cực (ưa béo) như: Leu, Phe, Ala, Val, Pro,Trp, Ile.
Các


-casokinin cũng có ảnh hưởng lên hệ miễn dịch (ngoài việc ức chế
ACE).
Năm 1989, Migliore-Samour và cộng sự đã phát hiện ra một số peptide có
nguồn gốc từ protein hòa tan (whey) khả năng kích thích thực bào ở người và đại
thực bào ở chuột bảo vệ cơ thể chuột chống lại việc nhiễm Klebsiella pneumoniae.
Chuột sử dụng các peptide từ sữa lên men bởi Lactobacillus helveticus cho thấy
rằng có sự gia tăng của IgA và giảm kích thước các khối u dưới da (Leblanc
2002). Kefir và tế bào tự do của nó (KF) có nhiều chất có thể phát huy tác dụng có
lợi trên hệ thống miễn dịch và ngăn ngừa một số loại ung thư. Quan sát cho thấy
chuột nhận được 2 ngày cho ăn với chu kỳ toàn bộ kefir đã làm giảm tăng trưởng
khối u, và cho ăn theo chu kỳ với KF cung cho thấy sự chậm trễ của sự phát triển
ung thư.
Số tế bào IgA + không biến đổi ở chuột được tiêm với một dòng tế bào khối
u (khối u điều khiển) trong một nghiên cứu gần đây (Bảng 6). Hai ngày của chu kỳ
chính của kefir hoặc KF gia tăng sản sinh các tế bào IgA + trong tuyến vú sau khi
tiêm khối u. Sự tăng không được quan sát thấy ở các loài động vật được nuôi bằng
sữa lên men mà không được tiêm khối u, chứng tỏ rằng việc tăng cường các tế bào
IgA + trong tuyến vú cần một sự kích thích mạnh mẽ như những kích thích gây ra
bởi các tế bào khối u. Vai trò sinh học của các tế bào IgA + đáp lại sự phát triển
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 23
khối u chưa được hiểu rõ. Nó đã được gợi ý rằng người ta có thể có thể ràng buộc
độc chất chuyển hóa sản xuất trong khi khối u phát triển.
Bảng 6. Ảnh hưởng của việc tiêm khối u, kefir và KF lên các tế bào IgA+,
CD4+ và CD8+ tế bào lympho T ở tuyến vú

Một số IP từ sữa cũng có khả năng làm giảm sự nhiễm trùng ở các bệnh
nhân giai đoạn đầu của bệnh AIDS (Meisel, 1998). Gần đây người ta đã chứng
minh được rằng trong quá trình thủy phân bởi các enzyme của hệ tiêu hóa, các IP

được giải phóng từ whey protein isolate (Mercier và cộng sự 2004). GMP và một
số peptide có từ nó đã được biết là có khả năng điều hòa hệ miễn dịch, ví dụ như
nó điều hòa việc sản xuất ra kháng thể IgG (Monnai và cộng sự 1998; Manso &
Lo pez-Fandino, 2004).
Trong nhóm peptide này, ta có thể nói đến một số peptide có khả năng
kháng khuẩn. Casecidin là một trong những peptide đầu thuộc loại này mà người
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 24
ta đã phát hiện được (có được khi cho thủy phân casein bởi chymosin ở pH trung
tính, là thành phần của
1S

-cn và

-cn, có phân tử lượng khoảng 4000-6000 Da).
Peptide này có khả năng ức chế một số vi khuẩn Gram (+) như Staphylococcus,
Sarcina, Bacillus subtilis, Diplococcuspneumoniae, và Streptococcus pyogenes
[10]. Peptide casocidin-I (đoạn 165-203 của
2S

-cn) có khả năng ức chế
Staphylococcus carnosus và E.coli. Peptide isracidin (đoạn 1-23 của
1S

-cn có
được nhờ thủy phân bởi chymosin và chymotrypsin) có khả năng ức chế
Staphylococcus aureus và Candida albicans.
3. HƢỚNG PHÁT TRIỂN
Hóa học tổ hợp đã đóng góp rất nhiều cho vấn đề nghiên cứu các peptide có
hoạt tính sinh học. Tuy nhiên có một hạn chế rất lớn đối với những peptide có giá

trị sinh học vì nhu cầu cuộc sống đòi hỏi một số lượng lớn. Và Primm đã giải
quyết được vấn đề này: từ các peptide sinh học có nguồn gốc tự nhiên, bằng
phương pháp sinh học và nhiều phương pháp khác, ông đã phát triển chúng với qui
mô công nghiệp áp dụng trong các lĩnh vực như y dược, hóa học chuẩn đoán và
thực phẩm nông nghiệp. Bằng cách đó, các peptide tiếp tục được cải tiến để đạt
được những tính chất tốt nhất dùng để chữa bệnh. Lợi thế lớn khi dùng peptide cải
tiến là do nó có giá trị sinh học rất cao và hạn chế được tính độc. Bên cạnh đó chi
phí tổng hợp cũng thấp hơn. Primm đã đưa ra các bước lựa chọn như sau:
 Phát hiện ra chuỗi nhỏ nhất gây ra ảnh hưởng sinh học bằng cách
kiểm tra và tổng hợp từ đoạn bắt đầu của chuỗi peptide.
 Phát hiện ra cấu hình hoạt động sinh học bằng cách xác định cấu tạo
và cấu trúc hoạt động liên quan.
 Sự sắp xếp của peptide chứa trong cấu hình đó bằng sự hỗ trợ của
máy tính.
 Tổng hợp hóa học
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 25
 Định giá giá trị sinh học và dược lý, sau đó lập lại bước 3 – 5.
Primm đã khai thác từ những hiểu biết về peptide hóa học hiện tại để phát
triển, sản xuất và bán độc quyền những peptide được áp dụng trong nhiều lĩnh vực
chữa bệnh như tìm được phân tử peptide mới dùng chữa bệnh HIV hay sự phát
triển các chất đối kháng neurokinin…
Hiện nay, người ta có thể thu nhận các peptide có hoạt tính sinh học bằng
nhiều phương pháp: thủy phân protein (dùng enzyme trực tiếp hoặc thông qua quá
trình lên men của vi sinh vật), tổng hợp hóa học, kỹ thuật gen.
Gần đây, những cơ sở dữ liệu về trình tự của các amino acid trong peptide
có hoạt tính sinh học ngày càng được phát triển, từ đó ta có thể xác định những
peptide có hoạt tính sinh học tiềm ẩn trong protein. Ngoài ra, do chúng ta đã biết
được vị trí thủy phân của các enzyme thủy phân protein như pepsin, trypsin,
chymotrypsin, do đó sự giải phóng các peptidee có hoạt tính sinh học trong quá

trình thủy phân nói chung và tiêu hóa nói riêng là có thể dự đoán được.
3.1 Phƣơng pháp tổng hợp peptide dùng enzyme
Trong phương pháp này, người ta sử dụng enzyme protease làm xúc tác cho
việc kết hợp các amino acid. Quá trình hình thành liên kết peptide nhờ xúc tác
protease có thể được phân thành 2 loại dựa trên thành phần nhóm carboxyl được
sử dụng:
 Tổng hợp điều khiển cân bằng (equilibrium – controlled synthesis –
ECS): nhóm carboxy tự do (ở trạng thái bình thường)
 Tổng hợp điều khiển động học (kinetically – controlled synthesis –
KCS): nhóm carboxy ở trạng thái được hoạt hóa, thông thường người ta sử
dụng dạng alkyl ester.
Về cơ bản, 2 phương pháp này khác nhau về năng lượng cần thiết để hình
thành liên kết peptide.
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 26
3.1.1 Tổng hợp điều khiển cân bằng
Quá trình tổng hợp này ngược lại với quá trình thủy phân liên kết peptidee,
do đó, tất cả protease đều có thể được sử dụng. Tuy nhiên nó có nhược điểm là cần
lượng lớn enzyme và tốc độ phản ứng chậm.
Trong quá trình thao tác thì cần phải điều chỉnh sao cho cân bằng dịch
chuyển theo hướng tạo ra liên kết peptide. Ta có thể thêm dung môi hữu cơ (có thể
hòa tan vào nước), tuy nhiên điều kiện này có thể làm giảm hoạt tính của enzyme.
Khi hằng số điện môi của môi trường giảm thì nó làm giảm tính acid của nhóm
carboxy và tính base của nhóm amino.
ECS xảy ra theo chiều hướng tăng dần nồng độ sản phẩm theo thời gian rồi
sau đó phản ứng đạt trạng thái cân bằng (như hình minh họa bên dưới).

Hình 7. Quá trình tổng hợp peptide điều khiển cân bằng
3.1.2 Tổng hợp điều khiển động học
So với ECS thì KCS cần ít enzyme hơn, thời gian để đạt được năng suất sản

phẩm tối đa được rút ngắn hơn và năng suất sản phẩm phụ thuộc vào tính chất của
enzyme được sử dụng và tính đặc hiệu của cơ chất.
Trong khi ECS kết thúc ở trạng thái cân bằng thì đối với KCS, nồng độ của
sản phẩm đạt đến cực đại rồi sau đó bị thủy phân dần.
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 27

Hình 8. Quá trình tổng hợp peptidee điều khiển động học.
Trong đó, R1-CO-X: nhóm carboxy được hoạt hóa

Hình 9. Mô hình của quá trình tổng hợp peptidee điều khiển động học
dùng xúc tác protease
EH: enzyme tự do; Ac-X: chất cho nhóm acyl (nhóm carboxy được hoạt
hóa); HX: nhóm bị loại đi; Ac-E: phức hợp acyl-enzyme; Ac-OH: sản phẩm thủy
phân; HN: chất nhận nhóm acyl; Ac-N: sản phẩm peptide
Hoạt tính amidase của hầu hết các protease thì thấp hơn hoạt tính esterase.
Enzyme có tác dụng như chất vận chuyển nhóm acyl tới nhóm amino hình thành
liên kết peptidee Ac-N, phản ứng này có sự cạnh tranh của nước. Tỷ lệ giữa tốc độ
phản ứng tổng hợp liên kết peptidee và thủy phân nó thì có ý nghĩa quan trọng tới
sự thành công của phương pháp này. Phương pháp này thường sử dụng serine và
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 28
cystein protease. Tuy nhiên, serine và cystein protease thì không phải là những
acyltransferase hoàn hảo, những phản ứng không mong muốn có thể xảy ra do sự
giới hạn của tính đặc hiệu của chúng.
Một yếu tố quan trọng làm hạn chế ứng dụng của KCS là sự thủy phân của
Ac-X ngay tại thời điểm bắt đầu phản ứng (như hình minh họa phía trên cho thấy)
và sự thủy phân của peptide sản phẩm. Những phản ứng không mong muốn này có
thể được hạn chế nhờ việc thực hiện một số biện pháp như: thay đổi môi trường
phản ứng (làm giảm hàm lượng nước trong môi trường bằng cách sử dụng dung

môi hữu cơ), enzyme, cơ chất….
Khác với phương pháp tổng hợp hóa học, phương pháp tổng hợp sử dụng
enzyme có thể bắt đầu từ đầu amino hoặc đầu carboxy bởi vì xúc tác enzyme tránh
được hiện tượng racemic hóa. Ngoài ra, phương pháp này còn có một số ưu điểm
như: không tốn nhiều thời gian; không có quá trình bảo vệ và khử các nhóm bảo
vệ; giảm việc sử dụng các dung môi và các chất hóa học (gây độc); có thể tái sử
dụng enzyme.
Hiện nay, lượng peptide tạo sản xuất ra nhờ phương pháp này vẫn còn rất
ít; hầu hết các peptidee được sản xuất nhờ phương pháp tổng hợp hóa học. Một vài
di- và tripeptidee có thể được tổng hợp với quy mô lớn bằng phương pháp tổng
hợp dùng enzyme, thậm chí là quá trình tổng hợp có thể được tiến hành liên tục.
Các di- và tripeptide này được sử dụng làm chất trung gian trong quá trình sản
xuất các loại dược phẩm. Ưng dụng trong công nghiệp của phương pháp ECS là
việc tổng hợp Z-Asp-Phe-Ome là tiền chất của aspartame.
3.2 Phƣơng pháp tái tổ hợp gen
DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều
nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ
thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài hoặc
của các loài khác nhau.
Báo cáo CNCB đồ uống & sữa GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 29
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp,
tinh vi, thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau:
 Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi tế
bào cho (ví dụ: tế bào của người) để cung cấp DNA.
 Bước 2: Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho. Bước này còn gọi
là phân lập gen.
 Bước 3: Cắt cả hai loại DNA ( DNA plasmid và DNA tế bào cho) bằng
cùng một loại enzym giới hạn (restriction enzym – RE).
 Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với DNA tế bào cho cũng

đã bị cắt bởi một loại enzym giới hạn như đã nêu trên.
 Bước 5: Bổ xung enzym nối ligase để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh.
 Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ (ví dụ vi khuẩn E.coli)
và nhân dòng.
 Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang DNA tái tổ
hợp và theo dõi hoạt động, biểu hiện của gen thông qua sản phẩm của
gen lấy rừ tế bào cho.
3.3 Phƣơng pháp tổng hợp hóa học
Liên kết peptide được hình thành từ sự kết hợp giữa nhóm carboxy của
amino acid thứ nhất với nhóm amino của amino acid thứ hai và loại đi một phân tử
nước.
Sự hình thành liên kết peptidee dưới điều kiện ôn hòa chỉ có thể xảy ra khi
nhóm carboxy của amino acid được hoạt hóa; đồng thời, amino acid còn lại tấn
công vào nhóm carboxy này (theo cơ chế ái nhân) và từ đó hình thành dipeptide.