NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ức CHẾ ENZYM α GLUCOSIDASE

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Tự NHIÊN
HUỲNH NGỌC NGHIÊM THỤY
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM a-
GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC Ở
AN GIANG VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT
CHẤT CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC
Oroxylum indicum (L.) Kurz
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 62 44 29 01
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS.Nguyễn Thị Thanh Mai
Thành phố Hồ Chí Minh-2011
Xin chân thành tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Mai, người cô đã định
hướng, truyền thụ những kinh nghiệm quý báo cho tôi,
người đã tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn
thành luận văn này.
Cán bộ Nguyễn Xuân Hải, người luôn nhiệt tình
giúp đỡ tôi trong lúc thực nghiệm, giải đoán cấu trúc
cũng như trình bày khóa luận.
Cán bộ Đặng Hoàng Phú, người đã hỗ trợ tôi rất
nhiều khi thực nghiệm.
Cảm ơn gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên,
chia sẻ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con thực hiện
đề tài.
Thành phố Hồ Chí Minh 9-2011.
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG DANH
MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC

SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU TỔNG QUAN
1.
1.1.1.
2. KẾT LUẬN
3. TÀI LIỆU THAM
KHẢO PHỤ LỤC
4. DANH MỤC CÁC BANG
5. •
6.
Bảng 1.1:
7.
Bảng 1.2:
8.
Bảng 2.1:
9.
Bảng 2.2:
10.
Bảng 2.3:
11.
Bảng 2.4:
12. Bảng 2.5:
13. Bảng 2.6:
14. Bảng 3.1:
15. Bảng 3.2:
16.
Bảng 3.3:
17. Bảng 3.4:
18.
19.
Tóm tắt ảnh hưởng của kiểu ức chế lên V

max
và K
m
20
Sự phân loại khoa học của cây núc nác 30
Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài 45
Thể tích các hóa chất trong quy trình thử hoạt tính 52
Thể tích các dung dịch khảo sát nồng độ chất nền 55
Tóm tắt dạng đồ thị các kiểu ức chế 55
Thể tích các dung dịch nghiên cứu động học 57
Tóm tắt cách xác định K; các kiểu ức chế 57
Bảng hiệu suất cao trích được của các mẫu cây thuốc nghiên cứu 65
Kết quả thử hoạt tính của chất đối chứng dương 66
Kết quả thử hoạt tính của 40 mẫu cây thuốc An Giang 66
Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase của các cao phân đoạn
20. Bảng 3.12: Bảng so sánh phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR của hợp chất (4) trong dung môi
21.
22.
23 Bản
g 3.26: Kết quả đo mật độ quang theo thời gian khảo sát 99
24. Bảng 3.27: Thể tích các dung dịch nền và giá trị mật độ quang đo được tương ứng
25
100
26. Bảng 3.28: Kết quả mật độ quang theo sự thay đổi nồng độ chất nền và chất ức chế
27
101

28 Bản
g 3.39: Bảng xử lý số liệu mẫu control và mẫu ức chế 102
29 Bản
g 3.30: Giá trị K
ht
/V
ht
ứng với các nồng độ ức chế khác nhau 103
30. DANH MỤC CÁC HÌNH
31.
32.
33. Hình 1.18: Các hợp chất carbasugar và pseudoaminosugar ức chế enzym a -
34.
35.
36. DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
37.
38.
39.
40. MỞ ĐẦU
41. Bệnh đái tháo đường với các biến chứng nguy hiểm như bệnh tim mạch, tai
biến mạch máu não, mù lòa, suy thận, đoạn chi đã trở thành nguyên nhân gây tử vong thứ
tư ở các nước đang phát triển. Trên thế giới cứ mỗi 10 giây đồng hồ lại có một người chết vì
những biến chứng của bệnh đái tháo đường cũng như có hai trường hợp mới được chẩn
đoán. Vì vậy, việc nghiên cứu các phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường đang được các
nhà khoa học quan tâm.
42. Trong các hướng điều trị bệnh đái tháo đường loại 2, hướng điều trị bằng
cách ức chế hoạt động của enzym a-glucosidase hiện đang được các nhà nghiên cứu quan
tâm vì có cơ chế đơn giản, an toàn. Tuy nhiên, những loại thuốc ức chế enzym a-glucosidase
đang sử dụng vẫn có nhiều tác dụng phụ, nên nhằm hạn chế những tác dụng phụ và đưa
thêm nhiều lựa chọn cho việc điều trị bệnh đái tháo đường, cần phải nghiên cứu thêm các

chất ức chế enzym a-glucosidase mới từ nhiều nguồn khác nhau.
43. Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính
ức chế enzym a-glucosidase, cũng như cô lập được nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính
ức chế mạnh. Trong khi đó, Việt Nam có nguồn cây thuốc dồi dào, phong phú, và trong dân
gian ta từ lâu đã lưu truyền nhiều bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường bằng cây cỏ, thế
nhưng chỉ có một vài nghiên cứu về vấn đề này. Tại sao ta không tìm hiểu xem trong nguồn
cây thuốc ấy, liệu có cây thuốc nào có hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase? Từ đó có thể
cô lập được những hợp chất mới có khả năng điều trị bệnh đái tháo đường từ thiên nhiên,
đóng góp cho sự phát triển của ngành hóa dược nước ta.
44.
45.
46. TỔNG QUAN
1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
1.1. Khái niệm
[5]
47. Bệnh đái tháo đường (hay còn gọi là tiểu đường) là một bệnh nguy hiểm đặc
trưng bằng mức đường (glucose) trong máu cao, nguyên nhân là do thiếu insulin có kèm
hoặc không kèm theo kháng insulin với các mức độ khác nhau.
48. Những người mắc bệnh không những có lượng đường trong máu cao, mà cả
trong nước tiểu nữa. Chính vì thế mà bệnh đái tháo đường có tên gọi chuyên môn là
Diabetes mellitus, theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là mật ong.
1.2. Phân loại
[5]
49. Một cách tổng quát, bệnh đái tháo đường được chia làm 2 loại chính: loại 1
và loại 2.
1.2.1. Bệnh đái tháo đường loại 1
50. Bệnh đái tháo đường loại 1 thường xảy ra ở trẻ em từ 10 tuổi trở lên và chiếm
10% trong số các trường hợp bị bệnh. Nguyên nhân là do cơ thể không sản xuất được insulin
vì hệ thống miễn dịch của cơ thể nhầm lẫn đã tấn công vào các tế bào của tuyến tụy làm cho
tuyến tụy không sản xuất ra insulin. Khi không có insulin, tế bào sẽ không chuyển hóa được

glucose làm cho lượng glucose trong máu tăng cao.
1.2.2. Bệnh đái tháo đường loại 2
51. Bệnh thường xảy ra ở người trên 50 tuổi, chiếm khoảng gần 90 % trong tổng
số trường hợp bị đái tháo đường. Đối với những người bị đái tháo đường loại 2, mặc dù cơ
thể vẫn sản xuất được insulin nhưng các tế bào không hoặc kém nhạy cảm với sự có mặt của
insulin. Lượng đường trong máu do không được chuyển hóa thành năng lượng nên giữ ở
mức cao. Khi đó, cơ thể phản ứng bằng cách tăng sản xuất insulin lên và gây quá tải cho
tuyến tụy. Theo thời gian, lượng insulin được tiết ra dần dần giảm.
-
1
1 -
52.
53. Bệnh đái tháo đường loại 2 còn có nguyên nhân tiềm ẩn trong cấu tạo gen,
điều này làm cho bệnh phát triển nhanh hơn. Nếu những người mang gen tiềm ẩn được phát
hiện sớm và có biện pháp phòng ngừa bằng cách ăn uống hợp lí thì bệnh có thể không xuất
hiện hoặc phát triển chậm, nhưng bệnh vẫn giữ ở dạng tiềm ẩn. Trong trường hợp ngược lại,
bệnh sẽ phát triển rất nhanh.
54. Ngoài ra, còn một vài trường hợp bệnh đái tháo đường khác như đái tháo
đường đôi và đái tháo đường thai kì.
55. Đái tháo đường đôi: Bệnh nhân có cả đặc điểm của đái tháo đường loại 1 và
loại 2. Phần lớn bệnh nhân khi mới được chẩn đoán có những biểu hiện giống như đái tháo
đường loại 2 nhưng trong vòng vài năm sau bệnh nhân cần insulin để kiểm soát đường
huyết. Các chuyên gia cho rằng đái tháo đường đôi là dạng diễn tiến chậm của đái tháo
đường loại 1.
1.
2. Hình 1.1: Phân loại bệnh tiểu đường
-
1
2 -
56. Đái tháo đường thai kì: Đây là dạng đái tháo đường xảy ra ở một số phụ nữ

mang thai và sẽ biến mất sau khi sinh. Phụ nữ mắc bệnh đái tháo đường thai kì có nhiều khả
năng phát triển thành đái tháo đường loại 2.
1.3. Tác hại
[5]
1.3.1. Các biến chứng cấp tính
57. Một số biến chứng cấp tính có thể xảy ra khi đường huyết quá cao hay quá
thấp, nếu không được điều trị sớm sẽ đe dọa đến tính mạng của nạn nhân. Các biến chứng
này bao gồm các loại sau:
58. Hạ đường huyết (hypoglycemia): bệnh nhân tiêm insulin sẽ gặp hiện
tượng đường huyết hạ thấp quá mức do lượng insulin cần thiết cho cơ thể quá cao. Hạ đường
huyết có thể được điều trị nhanh chóng bằng cách nạp đường vào cơ thể, ngược lại có thể
dẫn tới ngất xỉu.
59. Tăng lượng ceton trong máu: trong quá trình thủy phân chất béo sẽ
tạo ra sản phẩm phụ là ceton. Cơ thể không thể tích trữ lượng ceton quá lớn nên sẽ tìm cách
thải chúng ra ngoài qua nước tiểu. Khi quá nhiều ceton được tạo ra thì cơ thể không thể thải
hết tất cả qua nước tiểu mà tích tụ trong máu gây tăng lượng ceton trong máu. Đây là biến
chứng rất nghiêm trọng do thiếu hormon insulin và chủ yếu xuất hiện ở bệnh nhân bị tiểu
đường loại 1.
60. Tăng áp lực thẩm thấu: bệnh nhân đái tháo đường không được điều
trị sẽ mất rất nhiều dịch do đi tiểu nhiều, gây ra tình trạng cô đặc máu làm áp lực thẩm thấu
trong máu tăng cao. Biến chứng này thường gặp ở bệnh nhân đái tháo đường loại 2 và có thể
gây tử vong nếu không được điều trị.
61. Tăng acid lactic trong máu: là do sự tích tụ acid lactic trong cơ
thể,nếu có quá nhiều acid lactic trong cơ thể thì độ cân bằng sẽ bị
phá vỡ. Biến chứng này rất hiếm gặp và chủ yếu xuất hiện ở bệnh
nhân bị tiểu đường loại 2.
-
1
3 -
1.3.2. Các biến chứng mãn tính

62. Tăng đường huyết lâu dài sẽ đưa đến những biến chứng sau:
63. Bệnh võng mạc (retinopathy): biến chứng quan trọng nhất về mắt
với bệnh nhân đái tháo đường là bệnh võng mạc, có thể dẫn đến mù lòa. Đây là nguyên nhân
chính của các bệnh mù không bẩm sinh. Ngoài ra, điều này có thể dẫn đến một số bệnh về
mắt khác như cườm, liệt cơ vận nhãn.
64. Bệnh thận (nephropathy): biến chứng thận có thể dẫn đến khi mắc
bệnh tiểu đường là suy thận mãn tính. Bệnh nhân phải thường xuyên chạy thận nhân tạo.
Đây là nguyên nhân giải thích vì sao người mắc bệnh đái tháo đường thường chiếm đa số
trong những trường hợp lọc thận nhân tạo.
65. Bệnh thần kinh (neuropathy): Biến chứng thần kinh ngoại biên có
thể gặp phải với bệnh nhân đái tháo đường là tê và đau bàn tay, bàn chân, đôi khi làm chân
mất cảm giác. Điều này có thể dẫn đến bệnh nhân không hề biết khi bị thương tổn, từ đó gây
nên nhiễm trùng nghiêm trọng và giảm sức đề kháng. Đây là nguyên nhân mà những người
mắc bệnh tháo đường thường bị nhiễm trùng và lâu lành. Kết hợp với hai biến chứng trên là
tắc nghẽn mạch máu ngoại biên ở tay chân dẫn đến tay chân bị hoại tử phải cắt bỏ chi.
66. Bệnh tim mạch (cardiovascular diseases): nguy cơ mắc bệnh tim
của những người bị bệnh tiểu đường cao hơn gấp 2 đến 4 lần người thường. Đây là nguyên
nhân chủ yếu gây tàn tật và tử vong ở người bệnh đái tháo đường loại 2 ở các nước công
nghiệp hóa.
1.4. Phương pháp điều trị
[5] [36]
67. Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 1: với những người mắc
bệnh đái tháo đường loại 1, họ sẽ phải tiêm insulin thường xuyên
trong cả cuộc đời vì cơ thể họ không có khả năng tạo ra hormon
này. Insulin có nhiều loại nhưng nằm trong
-
1
4 -
68. hai dạng chính tùy theo tác dụng nhanh hay chậm: dạng tác dụng nhanh dùng
ngay trước bữa ăn để tăng lượng insulin trong cơ thể phù hợp với lượng carbohydrat sắp

nhập vào, dạng tác dụng chậm dùng vào buổi tối để giữ lượng đường trong máu không tăng
vọt trong nhiều giờ vào hôm sau.
69. Hiện nay, việc uống insulin dạng viên là không thể vì insulin trong môi
trường dạ dày sẽ bị phân hủy. Do đó, các nhà khoa học đang nghiên cứu bọc insulin trong
một vỏ nang thích hợp để thuốc có thể qua được dạ dày, giải phóng ra trong ruột non và
ngấm vào máu. Thời gian gần đây, ta thấy xuất hiện insulin dưới dạng bột, nó được đưa vào
máu bằng đường phổi. Qua nhiều năm nghiên cứu, người ta phát hiện được dạng thuốc bột
này có hiệu quả rất cao.
70. Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 2: phụ thuộc vào tình trạng của
bệnh nhân, phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường hoạt động.
Chỉ bệnh nhân đái tháo đường loại 2 mới dùng thuốc uống kết hợp với những chất đặc hiệu
nhằm làm giảm lượng đường huyết. Bệnh nhân có thể dùng riêng thuốc viên hoặc kết hợp
với phương pháp tiêm insulin.
71. Thuốc sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 chủ yếu chia 3 nhóm:
• Nhóm thuốc thúc tụy tạng tiết thêm insulin như nhóm sulfonylurea: glyburide
(Micronase, DiaBeta, Glynase), glipizide (Glucotrol, Glucotrol XL), glimepiride
(Amaryl); và nhóm meglitinide: repaglinide (Pradin).
• Nhóm thuốc giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn như nhóm biguanide: metformin
(Glucophage, Glucophage XR, Metformin XR); nhóm thiazolidinedione: glitazone,
rosiglitazone (Avandia), pioglitazone (Actos).
• Nhóm ngăn ruột bớt hấp thu chất đường khi ăn bằng chất ức chế enzym a-glucosidase:
acarbose (Precose, Glucobay), miglitol (Glyset).
72. Phương pháp ức chế enzym a-glucosidase trong điều trị đái tháo đường loại 2 được
ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu
-
1
5 -
73. hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của
insulin cũng như kích thích sự sản sinh insulin như các phương pháp khác.
74. 2. ENZYM «-GLUCOSIDASE

75. 2.1 Sơ lược về enzym
[2]
76. Enzym là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein và có trong
mọi tế bào sinh vật. Trong cuộc sống, nhờ có enzym mà xảy ra rất nhiều phản ứng hóa học
với một hiệu suất rất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, áp suất, pH.
77. Như vậy, enzym là một loại protein xúc tác các phản ứng hóa học. Trong các
phản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là chất nền, enzym sẽ biến đổi
chúng thành các phân tử khác nhau. Tất cả các quá trình trong tế bào đều cần enzym. Enzym
có tính chọn lọc rất cao đối với chất nền của nó. Hầu hết phản ứng được xúc tác bởi enzym
đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không được xúc tác. Có trên 4000 phản ứng sinh hóa
được xúc tác bởi enzym.
78. Hoạt tính của enzym chịu tác động bởi nhiều yếu tố. Tác nhân ức chế là các
phân tử làm giảm hoạt tính của enzym, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tử làm tăng
hoạt tính của enzym.
79. 2.2. Chất ức chế enzym
[2]
80. Chất ức chế enzym là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzym xúc
tác. Hoạt động của một enzym có thể giết chết một mầm bệnh hoặc điều chỉnh lại sự không
cân bằng trong chuyển hóa. Có nhiều loại thuốc ức chế enzym, chúng cũng được sử dụng
như là chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu. Không phải tất cả các phân tử liên kết với enzym đều là
chất ức chế enzym, những chất hoạt hóa liên kết với các enzym và làm tăng hoạt tính enzym
mà chúng liên kết.
81. Sự liên kết của một chất ức chế có thể ngăn chặn một chất nền đi vào tâm
hoạt động của enzym và gây trở ngại cho các phản ứng xúc tác của enzym đó. Chất ức chế
-
1
6 -
có thể liên kết với enzym thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Chất ức chế không thuận
nghịch thường phản ứng với enzym và thay đổi nó về mặt hóa học. Những chất ức chế đó
làm thay đổi dư lượng các acid amin quan trọng cần thiết cho hoạt động của enzym. Ngược

lại, chất ức chế thuận nghịch liên kết không đồng hóa trị và theo những kiểu khác nhau tùy
thuộc vào liên kết chất ức chế-enzym, phức enzym-chất nền, hoặc cả hai.
82. Chất ức chế thuận nghịch liên kết với enzym bằng các tương tác không đồng
hóa trị chẳng hạn như liên kết hydrogen, tương tác kị nước và liên kết ion. Nhiều liên kết
yếu giữa các chất ức chế và tâm hoạt tính mạnh mẽ và đặc biệt. Ngược lại, đối với các chất
nền và chất ức chế không thuận nghịch, các chất ức chế thuận nghịch thường không trải qua
phản ứng hóa học khi liên kết với enzym và có thể dễ dàng loại bỏ bằng cách pha loãng hoặc
thẩm tách.
83. Có 4 kiểu của ức chế enzym thuận nghịch, chúng được phân chia dựa theo tác
động của sự thay đổi nồng độ chất nền của enzym trên chất ức chế:
• Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition): chất nền và chất ức chế không liên kết với
enzym cùng một lúc. Điều này có thể là do chất ức chế có ái lực với tâm hoạt động
của một loại enzym nên xảy ra sự cạnh tranh giữa chất nền và chất ức chế cạnh tranh
vào tâm hoạt động của enzym. Đây là loại ức chế có thể được khắc phục bằng nồng độ
đủ cao của chất nền bởi vì những chất ức chế cạnh tranh thường có cấu trúc tương tự
như cấu trúc của chất nền thật.
• Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition): chất ức chế chỉ
84. chỉ kết hợp với phức enzym-chất nền mà không kết hợp với enzym tự do.
85. Đây là một dạng ức chế mà các liên kết của chất ức chế với enzym làm giảm
86. hoạt tính của nó nhưng không ảnh hưởng đến liên kết của enzym-chất nền.
Kết quả là mức độ của sự ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế.
• Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition): chất ức chế kết hợp với
enzym ở vị trí khác với vị trí kết hợp của chất nền tạo thành phức enzym-chất nền-
chất ức chế không bị chuyển hóa tiếp. Như vậy, enzym có thể đồng thời kết hợp cả
-
1
7 -
chất ức chế và chất nền. Chất nền và chất ức chế không cạnh tranh với nhau để kết
hợp với enzym và cũng không thể loại trừ tác dụng kìm hãm bằng cách tăng nồng độ
chất nền.

• Ức chế hỗn tạp (mixed inhibition): là chất ức chế không những liên kết với enzym tự
do mà còn liên kết với cả phức hợp enzym-chất nền tạo thành phức hợp enzym-chất
ức chế-chất nền nên không tạo được sản phẩm. Hiện tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào
nồng độ chất ức chế. Tốc độ ức chế cực đại đo được khi không có chất ức chế là cao
hơn khi có mặt chất ức chế.
2.3. Động học phản ứng xúc tác của enzym
[2]
87. Phản ứng do enzym xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzym,
bản chất và nồng độ các chất phản ứng (chất nền), nhiệt độ, pH của môi trường, các ion kim
loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác, Điều đáng lưu ý là các yếu tố hóa lý không chỉ ảnh
hưởng đến phản ứng enzym theo kiểu giống như các phản ứng hóa học thông thường mà còn
ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng thông qua tác dụng của chúng đối với cấu trúc phân tử
enzym.
2.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzym
88. Trong điều kiện dư thừa chất nền, nghĩa là [S] >> [E] thì tốc độ phản ứng phụ
thuộc vào [E], v = K[E] có dạng y = ax. Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vận tốc
phản ứng do enzym đó xúc tác.
89. Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất ức chế hay hoạt hóa thì
vận tốc phản ứng do enzym xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó.
-
1
8 -
90.
2.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất nền [S]
91. Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất: chỉ một chất nền S, E xúc tác tạo thành
một sản phẩm P
92.
93. Phức ES gọi là phức Michaelis- Menten.
94. Gọi v
1

là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.
95. Gọi v
-1
là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES tạo thành E và S.
Gọi v
2
là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm).
96. v1 =
k1[E][S] v
-1
= k
-1
[ES] v2
= k2[ES]
97. Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:
3.
4. Hình 1.2: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào
[E]
5.
6. Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phản ứng xúc tác enzym trường hợp có 1 chất nền
-
1
9 -
98. k-1[ES] + k2[ES] =
k1[E][S] (1)
99. (k-1+k2)[ES] = k1[E][S] (2)
-
2
0 -
100. Gọi E

o
là nồng độ enzym ban đầu, [E] là nồng độ enzym tự
do: [Eo] = [E] + [ES] => [E] = [Eo] - [ES] (3) Thay trị số [E] từ (3)
vào (2) ta có:
101. (k-1 + k2)[ES] = ki([Eo] - [ES])[S]
102. Nếu đăt K
m
= —
-1
—
—2
(K
m
: gọi là hằng số Michalis Menten) thì:
103.
k
i
104. [ E o ][S ]
105. K
m
— [ S ]
106. Mặt khác vận tốc phản
ứng tạo thành sản phẩm P:
107. Vo = k2[ES]
108. (với V
o
là vận tốc đầu của phản ứng mà lúc nồng độ sản phẩm chưa đáng kể
và sự tạo thành ES từ sản phẩm (E+P) có thể bỏ qua).
109. Thay [ES] bằng
giá trị ở trên ta thu được:

110. k
2
[ E o ][ S ]
111. K m — [ S ]
112. Qua đây ta thấy nồng độ enzym càng cao thì vận tốc phản ứng enzym càng
lớn. Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzym liên kết với chất nền, nghĩa là:
113. Vmax= k2[Eo] (5)
114. (với V
max
là vận tốc phản ứng cực đại khi toàn bộ khi toàn bộ E kết hợp với S
tạo thành phức ES).
115. Thay (5) vào phương trình (4) ta được:
116. [ S ]
117. Km — [S ]
118. Phương trình (*) gọi là phương trình Michaelis Menten.
119. K
m
là hằng số Michaelis đặc trưng cho mỗi enzym, đặc trưng cho cho ái lực
của enzym với chất nền, Km càng nhỏ thì ái lực của chất nền với enzym càng lớn, tốc độ
phản ứng càng cao vì vận tốc cực đại Vmax đạt ở giá trị nồng độ chất nền càng thấp.
[ ES ]
=
(4)
V„
=
7. (*)
o max
- 21
-
120. Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis là ở chỗ nó chính là giá trị của nồng

độ chất nền khi tốc độ phản ứng bằng ^ tốc độ tối đa. Thay V
max
và V
o
bằng cáccon số tương
ứng 1 và 0,5 vào phương trình trên, ta sẽ thấy rõ điều đó. Như vậy, K
m
được đo bằng đơn vị
nồng độ, tức mol/l.
121. Trên cơ sở phương trình Michaelis-Menten, bằng cách xây dựng đường biểu
diễn sự phụ thuộc của v
o
vào [S] và bằng đồ thị đó xác định tốc độ tối đa V
max
ta có thể tìm
thấy giá trị của [S], ở đó V
o
= V
max
/2, tức giá trị của K
m
(Hình 1.3).
122.
123. Khi tăng [S] thì vận tốc phản ứng v tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì v
đạt đến giá trị V
max
và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S]. Khi K
m
= [S]
124.

thì V
o =
1/2
Vmax
125. Năm 1934, Lineweaver và Burk, trên cơ sở của phương trình (5) đã nghịch
đảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối với việc nghiên cứu ức
hãm enzym. Phương trình (*) sẽ trở thành:
8.
9. Hình 1.3: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ
chất nền.
- 22
-
126. Phương trình này gọi là phương trình Lineweaver - Burk
— = x - 4 - + — (**)
V Vm a x [S] Vm a x
Hình 1.4: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng
vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-Burk
- 23
-
2.3.3. Ảnh hưởng của chất ức chế
127. Chất ức chế là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzym không còn
khả năng xúc tác biến chất nền thành sản phẩm.
2.3.3.1. Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)
128. Trong trường hợp ức chế cạnh tranh, chất nền và chất ức chế cạnh tranh nhau
để tác dụng lên trung tâm hoạt động của enzym.
129. E + s - —
E S — - E + p +
130. I
131. ' K,
132. E l

133. Hình 1.5: Kiểu ức chế cạnh tranh
134. Phương trình Michealis-Menton cho kiểu ức chế cạnh tranh:
135.
V
= VmJ S ]
136. ° K
m
+ K
ct
[ S ]
137. => Phương trình Lineweaverr- Burk khi có chất ức chế cạnh tranh:
138.
139.
140. Với Kc
t
là hằng số cân bằng của kiểu ức chế cạnh tranh.
141. Dựa vào phương trình (7) ta thấy: nếu nồng độ chất nền dư thừa, nồng độ
chất ức chế thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất ức chế, còn nồng độ chất nền thấp và
nồng độ chất ức chế cao thì lại có tác dụng ức chế hoàn toàn.
142. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo
Lineweaverr- Burk khi có chất ức chế cạnh tranh.
(6)
- 24
-
143.
144. Hình 1.6: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-
Burk
145. khi có ức chế cạnh tranh
146. Kiểu ức chế này cho thấy đường thẳng có nồng độ chất ức chế càng cao thì có
độ xiên lớn hơn và các đường thẳng cùng cắt trục tung ở một điểm là 1/V

max
147. Người ta thấy ức chế như vậy phần lớn giữa chất ức chế và chất nền có sự
tương đồng về mặt hóa học. Ví dụ: acid malic có cấu trúc gần giống với acid succinic nên ức
chế cạnh tranh enzym succinatdehydrogenase, là enzym xúc tác cho sự biến đổi acid
succinic thành acid fumaric.
148. Trường hợp đặc biệt của ức chế cạnh tranh là ức chế bằng sản phẩm. Trường
hợp này xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzym và choán vị trí hoạt động
ở phân tử enzym.
149. Xác định K
i
của kiểu ức chế cạnh tranh
150. Đối với kiểu ức chế cạnh tranh, ta có: K
c t
= K
m
[1 + — ] hay:
151.
K
i
152. K ct = ^ [ I ] + K m
153.
K
i
154. Lập đồ thị K
ct
theo [I], vẽ đường thẳng biểu diễn K
ct
theo [I] sẽ cắt trục hoành
tại - K (khi K
ct

= 0) (Hình 1.7).
10.
- 25
-