Công nghệ lên men sản xuất sinh khối Vi sinh vật

I. NGUYÊN LIỆU LÀM MÔI TRƯỜNG VI SINH VẬT:
1. Vi khuẩn lactic
1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae.
Vi khuẩn lactic có dạng hình cầu hoặc hình gậy, đứng riêng lẻ hoặc tạo chuỗi,
thuộc vi khuẩn gram dƣơng (+).
Vi khuẩn lactic không di động.
Vi khuẩn lactic không tạo bào tử (tuy nhiên hiện nay ngƣời ta tìm thấy một số
giống trong họ vi khuẩn lactic có khả năng tạo bào tử).
Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn kị khí chịu dƣỡng.
Vi khuẩn lactic không chứa cytochrom và enzyme catalase.
Vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh.
Chúng phân giải H
2
O
2
để tạo ra nƣớc và O
2
để phát triển.
1.2. Sự phân bố:
Ít gặp trong đất và nƣớc,thƣờng phát triển trong những môi trƣờng có chứa
nhiều chất hữu cơ phức tạp nhƣ:
- Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thƣờng gặp Lactobacillus lactic,
Lactobacillus bulgarius, Lactobacillus helviticus, Lactobacillus casei, Lactobacillus
ferment,Lactobacillus brevis, Streptococcus diacetyllactis. Để tồn tại trong môi trƣờng
sữa vi khuẩn lactic tổng hợp ATP từ cơ chất lactose.
- Trên bề mặt thực vật và xác thực vật đang bị phân giải hay có Lactobcillus
plantanium, Lactobcillus delnikii, Lactobcillus ferment, Lactobacillus brevis,
Streptococcus lactis Chúng còn đƣợc tìm thấy trên các loại rau quả, trái cây.
- Trong ruột và các niêm dịch ở ngƣời và động vật có Lactobacillus acidophilus,

Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus salivanius, Streptococcus
pyogenes, Bifidobacterrium, Pneumococcus.
1.3. Phân loại vi khuẩn lactic
Dựa vào quá trình lên men đƣờng: có 2 loại
- Vi khuẩn lactic đồng hình: Streptococus lactic, Streptococcus cremoris,… Vi
khuẩn lên men lactic đồng hình sản sinh 85-95% acid lactic. Do thiếu porphyrin và
cytochrom, không có chuỗi vận chuyển electron nên chúng thu năng lƣợng bằng con
đƣờng lên men bắt buộc. Trong tế bào vi khuẩn có chứa enzymealdolase và
triosophotphatizomerase.
- Vi khuẩn lactic dị hình: Vi khuẩn lên men lactic dị hình sản sinh 50% acid
lactic, 25% cồn và 25% acid acetic. Nhóm vi khuẩn này gồm có các vi khuẩn sinh hƣơng
Streptococcus votrovorus, Streptococcus paracotrovorus, Streptococcus diactylactis, và
Lactobacillus brevis,Lactobacillus fermenti,


Bảng 1 : Các chi vi khuẩn lactic, kiểu lên men và sản phẩm chính

Chi và dƣới chi
Kiểu lên men
Sản phẩm chính
(Tỷ lệ phân tử)
Cấu hình của
acid lactic
Streptococcus
Đồng hình
lactat
L
(+)

Pediococcus

Đồng hình
lactat
DL và L
(+)

Lactobacillus
Đồng hình
lactat

Thermobacterium
Đồng hình
lactat
D
(-)
,L
(+),
DL
Streptobacterium
Dị hình
(tùy tiện)
Lactat : axetat
1 : 1
D
(-)
,L
(+),
DL
Betabacterium
Dị hình
Lactat : axetat : CO

2

1 : 1 : 1
DL
Leuconostoc
Dị hình
Lactat : axetat : CO
2

1 : 1 : 1
D
(-)

bifidobacterium
Dị hình
Lactat : axetat
2 : 3
L
(+)


Dựa vào hình thái: có 2 loại
- Cầu khuẩn lactic: Streptococcus
- Trực khuẩn lactic: Lactobacillus
Dựa vào tính mẫn cảm với oxi: có 3 nhóm
- Vi khuẩn lactic kỵ khí nghiêm ngặt
- Vi khuẩn lactic yếm khí tùy tiện: Pediococcus cerevisiae
- Vi khuẩn lactic vi hiếu khí (hiếu khí tùy tiện):
Dựa vào nhiệt độ phát triển tối ƣu: có 2 nhóm
- Vi khuẩn lactic ƣa ấm: 25-35 C

Ví dụ: Streptococus lactic, Lactobacillus casei, L. plantarum,…
- Vi khuẩn lactic ƣa nhiệt: 37-45 C
Ví dụ: Streptococus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, L. helvetcus,…

2. SINH KHỐI VI KHUẨN LACTIC
2.1. Mục đích thu nhận sinh khối vi khuẩn lactic
Trong thời gian trƣớc đây mỗi cơ sở sản xuất có phƣơng pháp và qui trình riêng
để nhân giống và bảo quản giống dùng cho sản xuất. Khi cần sử dụng ngƣời ta sẽ tiến
hành nhân giống qua nhiều giai đoạn theo nguyên tắc thu nhận một canh trƣờng vi sinh
vật thuần khiết. Hiện nay một số nhà máy chế biến thực phẩm và những nhà máy sản xuất
các sản phẩm trao đổi chất từ vi sinh vật vẫn đang sử dụng phƣơng pháp này nên giống vi
sinh vật đƣợc xem là độc quyền sở hữu của mỗi nhà máy.
Từ những năm 1980, trên thế giới phát triển mạnh một ngành công nghiệp mới,
công nghiệp sản xuất và cung cấp giống vi sinh vật. Các chế phẩm giống thƣơng mại bao
gồm đủ loại: vi khuẩn, nấm men, nấm sợi… Vi khuẩn lactic cũng không ngoại lệ, sinh
khối vi khuẩn lactic đƣợc thu nhận, bảo quản và cung ứng cho ngành công nghiệp sản
xuất các sản phẩm từ sữa.
Chế phẩm giống thƣơng mại có thể cấy trực tiếp vào môi trƣờng lên men hoặc
hoạt hoá chúng trên một môi trƣờng dinh dƣỡng trong một khoảng thời gian nhất định
trƣớc khi cấy.
2.2. Các loài vi khuẩn lactic dùng trong công nghiệp sản xuất sinh khối vi khuẩn
lactic
Quan trọng là sinh khối của vi khuẩn lactic lên men đồng hình.
Streptococcus thermophilus
Lactobacillus bulgaricus
Streptococus lactic
Streptococcus cremoris
Lactobacillus acidophilus
Nhóm vi khuẩn sinh hƣơng

a/ Lactobacillus acidophilus



Hình 1: Lactobacillus acidophilus

 Thuộc trực khuẩn, có kích thƣớc : rộng 0.6-0.9 µm, dài 1.5-6 µm.
 Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành những chuỗi
ngắn, thuộc nhóm vi khuẩn gram dƣơng (+) và có khả năng chuyển động.
 Chúng có khả năng lên men một loạt đƣờng nhƣ: glucose, fructose, galactose,
mannose, maltose, lactose, saccharose để tạo acid lactic.
 Chúng hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, arabinose, rhamnose,
glycerol, mannitol, sorbitol, dulcitol, inocitol.
 Trong quá trình lên men chúng tạo ra cả hai dạng đồng phân quang học của acid
lactic.
 Nhiệt độ phát triển tối ƣu là 45 C, pH 4-5.
b/ Lactobacillus bulgaricus


Hình 2: Lactobacillus bulgaricus

 Thuộc trực khuẩn có kích thƣớc rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, gram
(+).
 Chúng không có khả năng di chuyển.
 Có khả năng lên men đƣợc các loại đƣờng glucose, lactose, galactose.
 Không lên men đƣợc xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol, dextrin,
inulin.
 Chúng không có khả năng tạo initrit từ nitrate.
 Nhiệt độ phát triển 40-50 C, pH thích hợp 5.5-6.0.
c/ Streptococcus thermophilus

Hình 3: Streptococcus thermophilus

 Tế bào hình cầu hoặc hình trứng, đƣờng kính 0.7-0.9 µm, không chuyển động,
thƣờng kết thành chuỗi ngắn, gram (+).
 Phát triển tốt ở 40-45 C, pH 5.8-6.0. Không phát triển đƣợc ở 53 C và dƣới 20 C,
sống đƣợc ở 65 C trong 30 phút.
 Không phát triển đƣợc trong môi trƣờng sữa chứa 0.01% methylen blue, môi
trƣờng máu chứa 10% mật.
 Có khả năng lên men glucose, fructose,lactose, saccharose.
 Nhạy cảm với các chất kháng sinh 0.01µg/ml tetracycline hay 0.1µg/ml
chloremphen.
d/ Streptococcus cremoris



Hình 4: Streptococcus cremoris
 Cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tạo thành từng chuỗi rất dài, gram (+).
 Nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển là 30 C.
 Chúng không phát triển đƣợc ở nồng độ NaCl 4%.
 Khi lên men đƣờng tạo ra acid acetic, CO
2
, diacetyl.
 Chúng có khả năng tạo ra những chất kháng khuẩn

e/ Streptococcus lactic


Hình 5: Streptococcus lactic
 Thuộc chuỗi cầu khuẩn, gram (+).

 Nhiệt độ phát triển 10-45 C, tối thich ở 30-35 C.
 Có khả năng chịu đƣợc nồng độ NaCl 4%.
 Khi lên men đƣờng glucose, maltose, lactose, xylose, arabinose, saccharose,
trehalose, mannitol, salicin tạo ra acid lactic, CO
2
, acid acetic, diacetyl.
Chúng không có khả năng lên men đƣợc raffinose, insulin, glycerol, sorbitol
2.3. Giống vi sinh vật dùng cho sản xuất
Giống vi sinh vật là một trong bốn yếu tố quyết định năng suất sản xuất sản xuất
công nghiệp vi sinh vật. Cùng với chất lƣợng môi trƣờng, điều kiện lên men, các
phƣơng pháp thu nhận và tinh chế sản phẩm,giống vi sinh vật là khâu đầu tiên can
phải quan tâm đặc biệt.
Giống vi khuẩn lactic dùng cho sản xuất phải đáp ứng các yêu cầu sau:
 Giống có khả năng thích ứng nhanh, phát triển mạnh
 Giống có khả năng sinh sản cao.
 Giống có khả năng chống lại đƣợc đối với các điều kiện bất lợi.
 Giống dễ dàng tách khỏi môi trƣờng nuôi cấy
 Khả năng dễ bảo quản và bảo tồn đƣợc đặc tính di truyền trong suốt thời
gian bảo quản và sử dụng.
 Thời gian lên men ngắn, hiệu suất cao
3. MẬT RỈ:
Mật rỉ là thứ liệu trong công nghệ sản xuất đƣờng từ cây mía hay củ cải đƣờng.
Trƣớc đây mật rỉ ít đƣợc sử dụng trong công nghệ vi sinh. Sau này ngƣời ta thấy mậy rỉ
có rất nhiều ƣu điểm để tạo môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. Những đặc tính quan trọng
phù hợp với qua trình lên men của mật rỉ bao gồm :
- Chứa hàm lƣợng đƣờng cao.
- Ngoài đƣờng saccharose còn chứa rất nhiều chất hƣu cơ, vô cơ, các chất
thuộc vitamin và các chất kích thích sinh trƣởng
- Tuy nhiên rỉ đƣờng cũng có những đặc điểm không phù hợp với quá trình
lên men. Muốn sử dụng chúng cho quá trình lên men đòi hỏi phải có các quá

trình sử lý thích hợp. Các đặc diểm cần lƣu ý ở mật rỉ bao gồm:
Rỉ đƣờng có màu nâu sẫm. Màu này khó bị phá hủy trong quá trình lên men. Sau
lên men chúng bám vào sinh khối vi sinh vật và bám vào sản phẩm. Việc tách màu ra
khỏi sinh khối và sản phẩm thƣờng rất tốn kém và rất khó khăn.
Hàm lƣợng đƣờng khá cao (thƣờng nằm trong khoảng 40-50%). Lƣợng này chủ
yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men phải pha loãng với nồng độ thích hợp.
Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình lên men là hệ keo trong mật rỉ. Keo
càng nhiều, khả năng hòa tan oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật
càng kém. Do đó công việc quan trọng của nhất khi sử dụng mật rỉ là phải phá hệ keo
này.
Vì rỉ đƣờng là chất dinh dƣỡng khá lý tƣởng nên chúng rất dễ bị vi sinh vật xâm
nhập và phát triển. Nhƣ vậy chất lƣợng mật rỉ cũng dễ thay đổi theo thời gian bảo
quản
Thành phần hóa học:
Thành phần rỉ đƣờng dao động nhƣ sau:
- Nƣớc chiếm 15-20%, chất khô chiếm 80-85%.
- Trong đó, có 60% là đƣờng ( 40% là đƣờng saccharose, 20% là fructose và
glucose và 40% chất còn lại là chất phi đƣờng )
- Trong thành phần phi đƣờng có khoảng 30-32% hợp chát hữu cơ và 6-105
hợp chất vô cơ. Trong hợp chất vô cơ có:
K
2
O: 3,5% Fe
2
O
3
: 0,2% MgO: 0,1% Sulfat: 1,6%
CaO: 1,5% SiO
2
: 0,5% P

2
O
5
: 0,2% Clorit: 0,4%
- Trong những hợp chất hữu cơ gồm có các hợp chất chứ nitơ và không chứ
nitơ ở dạng amin nhƣ: acid aspactic, acid glutamic, leuin, izoleuxin. Nito tổng
số chiếm khoảng 0,3-0,5% ( ít hơn so với so với lƣợng nitơ có trong rỉ đƣờng
củ cải)
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 7
Bảng 2: Thành phần các chất trong rỉ đường

Các chất thành phần
Hàm lượng % trong rỉ đường
Saccharose
32
Chất hữu cơ phi đƣờng
10
Chất tro
8
Trong đó: K
2
O
3.5
CaO
1.5
MgO
0.1
SiO

2

0.5
SO
3

1.6
Cl
2

0.4
Na
2
O + Fe
2
O
3
+

Al
2
O
3

0.2
P
2
O
5

0.2
N tổng
5-2.2
N-amin
0.2-0.5














Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 8
Bảng 3: Thành phần vitamin trong rỉ đường mía

Các chất màu của rỉ đường mía bao gồm:
- Caramel: xuất hiện nhờ quá trình nhiệt phân saccharose kèm theo loại trừ
nƣớc và không chứa một chút nitơ nào. Khi pH không đổi, tốc độ tạo chất caramen tỷ lệ
thuận với nhiệt độ phản ứng.
-
Phức chất polyphenol-Fe
2+:
có màu vàng xanh, không bị loại hết trong giai
đoạn làm sạch và tồn tại trong mật rỉ

- Melanodin: đây là sản phẩm ngƣng tụ của đƣờng khử và acid amin mà chủ
yếu là acid aspartic. Sản phẩm ngƣng tụ quen biết nhất là acid fuscazinic đóng vai trò
quan trọng làm tăng độ màu của rỉ đƣờng.
- Melanin: đƣợc hình thành nhờ phản ứng oxy hóa khử các acidamin thơm
nhờ xúc tác của enzym polyphenol oxydaza khi có mặt của oxy và Cu
+2
.
- Các acid amin thơm thƣờng bị oxy hóa là tiroxin và brenzcatechin. Các
melanin thƣờng bị loại hết ở giai đoạn làm sạch nƣớc đƣờng nên chỉ tìm thấy một lƣợng
rất nhỏ trong rỉ đƣờng.
- Chất keo: đƣợc hình thành bởi potein và pectin. Các chất này ảnh hƣởng rất
nhiều đến sự phát triển của vi sinh vật tạo thành màng bao bọc quanh tế bào, ngăn cản
Vitamin
Hàm lượng (mg%)
Thiamin
0.5
Riboflavin
0.12

Pyridoxin
0.9
Nicotinamit
1.5
Acid pantotenic
7.0
Acid foleic
0.02
Biotin
0.15
Inozit
500.0
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 9
quá trình hấp thụ các chất dinh dƣỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra
ngoài. Ngoài ra keo là nguyên nhân chính tạo ra một lƣợng bọt lớn trong môi trƣờng nuôi
cấy vi sinh vật, giảm hiệu suất sử dụng thiết bị.

Vi sinh vật trong rỉ đường mía.
Có rất nhiều vi sinh vật trong rỉ đƣờng mía . Đa số chúng có từ nguyên liệu, một
số nhỏ từ không khí, nƣớc, đất vào dịch đƣờng. Loại nào chịu đƣợc tác dụng nhiệt hay
tác dụng của hoá chất thì tồn tại. Ngƣời ta chia rỉ đƣờng thành 3 loại tuỳ theo số lƣợng vi
sinh vật tạp nhiễm.

Bảng 4: Phân loại rỉ đường theo số lượng vi sinh vật tạp nhiễm.

Loại rỉ đƣờng
Số lƣợng VSV trong 1g đƣờng
Đánh giá và xử lý

I
100000
Rất tốt, không cần xử lý
II
100000- 1000000
Trung binh, cần thanh
trùng
III
1000000- 5000000
Nhiễm nặng cần xử lý
nghiêm ngặt

Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 10

II. QUI TRÌNH THU NHẬN SINH KHỐI VI KHUẨN LACTIC

Mật rỉ
Xử lý
Chuẩn bị
Môi trƣờ ng
Thanh trùng

Nuôi cấy
Sấy phun
Ly tâm
Đóng gói
Nhân giống
Giống
VSV
Sản
phẩm
Mật rỉ
Xử lý
Chuẩn bị
Môi trƣờng
Thanh trùng
Nuôi cấy
Sấy thăng hoa
Ly tâm
Đóng gói
Nhân giống
Giống
VSV
Sản phẩm
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 11
III. GIẢI THÍCH QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ:
1. Xử lý mật rỉ:
1.1 Pha loãng sơ bộ:
a. Mục đích: chuẩn bị cho quá trình acid hóa.
b. Biến đổi:

Hóa học: giảm nồng độ chất khô.
Vật lý: giảm độ nhớt.
Hoá lý: tăng độ hoà tan các chất.
c. Thực hiện:
Pha loãng với nƣớc theo tỉ lệ V
mật rỉ
: V
nƣớc
= 1 : 3
1.2 Xử lý dịch pha loãng:
Truớc tiên, ta phải tẩy màu và tách các keo có trong mật rỉ
1.2.1. Acid hoá:
a. Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men và tiêu diệt vi sinh vật
b. Biến đổi:
Hóa học: đƣờng saccharose chuyển thành glucose và fructose dƣới sự xúc tác
của acid; pH giảm về 2.8-3.0
Hóa lý: hệ keo bị phá vỡ
Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt do nhiệt độ cao và pH thấp.
c. Thực hiện:
Lƣợng acid sunfuric đậm đặc thêm vào là 5% khối lƣợng dung dịch. Trong giai đoạn
này, ta đun dung dịch đến 90-95
o
C trong 6 giờ. Sau đó ta tiến hành ly tâm thu dịch trong.
d. Thiết bị và thông số công nghệ:
- Nồi phản ứng


.

Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 12

1- Ống nối để nạp chất tải nhiệt;
2- Ống chảy tràn sản phẩm;
3- Ống quá áp;
4- Đầu nối ống nạp nguyên liệu;
5- Cửa quan sát;
6- Cửa thoát chất tải nhiệt;
7- Cửa vào của chất tải nhiệt;
8- Cửa ra của sản phẩm;
9- Cửa thoát chất tải nhiệt
Hình 6:Nồi phản ứng dạng đứng
Nồi phản ứng bằng thép hay bằng gang tráng men dùng để tiến hành các quá trình
hoá - lý khác nhau.
Nồi phản ứng - máy trộn là một thiết bị dạng xilanh đứng có thể tích từ 0,1 ÷ 100
m
3
hoặc hơn, có áo hơi.Bên trong thiết bị có cơ cấu đảo trộn dạng tuabin hở.
Khi sử dụng các thiết bị có áo hơi dạng bán ống thì áp suất làm việc cho phép đến
1,6 MPa, còn trong áo hàn phẳng không nhỏ hơn 0,4 MPa. Nƣớc máy hay nƣớc tuần
hoàn, nƣớc muối, hơi nƣớc bảo hoà hay chất tải nhiệt hữu cơ có nhiệt độ cao có thể cho
vào áo hay vào ruột xoắn.
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 13
Nồi phản ứng - máy trộn có thể tháo rời hay hàn cố định với các bộ phận đáy elip

và nắp. Trên thiết bị có các khớp nối để nạp các chất tải nhiệt, chảy tràn sản phẩm, để nối
ống quá áp, nối khớp đầu ống nguyên liệu, khảo sát chất liệu, các khớp nối để nạp và thải
chất tải nhiệt và sản phẩm, van an toàn, nhiệt kế. Sau khi nạp vào thiết bị một lƣợng nƣớc
nhất định.Tiến hành đun nóng môi trƣờng đến một nhiệt độ đã cho bằng phƣơng tiện điều
chỉnh tự động.
Tần số trộn của máy khuấy 0,2 ÷ 0,33 vòng/s, phụ thuộc vào dạng cơ cấu trộn
và các tính chất của các cấu tử đem trộn.
Khi thiết kế máy trộn dạng tuabin, số vòng quay 3 ÷ 3,3 vòng/s, dạng khung 0,33
÷ 1 vòng /s.
Dẫn động máy trộn đƣợc thực hiện nhờ động cơ điện qua hộp giảm tốc.
1.2.2. Ly tâm thu dịch trong:
a. Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men
b. Biến đổi:
Hóa học: tạp chất bị loại bỏ, giữ lại chất hòa tan
Hóa lý: tách pha rắn khỏi pha lỏng
Vật lý: tăng độ trong, giảm khối lƣợng riêng dung dịch
c. Thiết bị và thông số công nghệ:



Hình 7:Thiết bị ly tâm lọc
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 14

Thiết bị ly tâm lọc hoạt động theo nguyên tắc: khi hệ thống quay với tốc độ cao
tạo ra lực ly tâm mạnh và đẩy các thành phần pha lỏng và rắn ra sát thành thiết bị nhƣ
hình vẽ, thành thiết bị có gắn vải lọc để các cấu tử chất hoà tan đi qua và giữ lại các thành
phần pha rắn.

2. Chuẩn bị môi truờng:
Khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy, ta phải chú ý những đặc điểm sau đây:
Các nguyên vật liệu làm môi trƣờng nhất thiết phải cung cấp đầy đủ các thành
phần dinh dƣỡng cho các quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật, đồng
thời duy trì đƣợc thế oxy hóa–khử, áp suất thẩm thấu và tạo đƣợc sự ổn định
của pH thích hợp của môi trƣờng.
Thành phần nguyên vật liệu phải đƣợc cân đo chính xác và pha chế theo đúng
trình tự hƣớng dẫn.
2.1.Nhu cầu dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy
Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dƣỡng rất phức tạp, không một đại diện nào thuộc
nhóm này có thể phát triển trên môi trƣờng đơn giản chỉ chứa glucose và NH
4
+
mà chúng
đòi hỏi hàng loạt các vitamin nhƣ lactoflamin, thiamin, acid pantothenic, acid nicotinic,
acid folic, biotin và các acid amin. Vì thế ngƣời ta thƣờng nuôi cấy chúng trên một môi
trƣờng phức tạp chứa một lƣợng tƣơng đối cao nấm men, cao thịt và nƣớc chiết cà chua.
2.1.1. Nhu cầu dinh dƣỡng cacbon:
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng đƣợc rất nhiều các loại carbonhydrate khác nhau từ
glucose, fructose, maltose đến saccharose Các nguồn cacbon này dùng để cung cấp
năng lƣợng tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào. Vì vậy đây là nguồn thức ăn
cacbon có ý nghĩa quan trọng nhất đối với sự sống của tế bào vi sinh vật. Trong quá trình
lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các acid amin nhƣ
acid glutamic, arginine hay tyrozyne làm nguồn cung cấp năng lƣợng. Khi đó diễn ra quá
trình decacboxyl và tạo CO
2
.
Nguồn cacbon tốt nhất là các loại đƣờng có tính khử ở liều lƣợng nhỏ. Nếu khi
nhân giống ngƣời ta dùng một loại đƣờng thông thƣờng hiếm khi đƣợc dùng làm nguồn
cacbon thì khi đƣa vào sản xuất vi khuẩn có thể phát triển hiệu quả trên chứa loại đƣờng

này mà không làm ảnh hƣởng đến khả năng lên men đối với các nguồn cacbon thông
thƣờng.
2.1.2. Nhu cầu dinh dƣỡng nitơ:
Nguồn nittơ dễ hấp thụ đối với vi sinh vật là NH
3
,NH
4
+
.Sau khi đồng hóa gốc
NH
4
+
trong môi trƣờng sẽ tích lũy các anion vô cơ (SO
4
2-
,HPO
4
2-
,Cl
-
…) làm hạ
thấp rất nhiều trị số pH của môi trƣờng,ta phải điều chỉnh pH của môi trƣờng nuôi
cấy.
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 15
Đa số vi khuẩn không có khả năng sinh tổng hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa
nitơ từ nguồn dinh dƣỡng vô cơ. Vì vậy, để đảm bảo cho sự phát triển của mình, vi khuẩn
lactic phải dùng nguồn nitơ có sẵn trong môi trƣờng dƣới dạng các acid amin. Tuy nhiên
để vi khuẩn phát triển bình thƣờng thì ngoài nguồn nitơ của acid amin thì vi khuẩn lactic

còn cần những chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nhƣ cao thịt, cao nấm men, peptone,
cazein
2.1.3. Nhu cầu về vitamin:
Vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển của mình và các vitamin này
đóng vai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của chúng. Rất ít vi khuẩn lactic có
khả năng tổng hợp vitamin, phần lớn chúng cần nhiều loại vitamin nhƣ riboflavin,
thiamin, acid pantothenic, nicotinic, biotin Nhu cầu vitamin chịu ảnh hƣởng của nhiều
yếu tố nhƣ nhiệt độ nuôi cấy, pH, nồng độ CO
2
ban đầu, thế oxy hoá khử và thành phần
của môi trƣờng.
Bảng 5: Vitamin và các chất sinh truởng cần thiết cho sự sinh truởng
của các vi khuẩn lactic

Chất
Vi sinh vật điển hình
Acid p-aminobenzoic
Lactobacillus plantarum

Acid folic
Lactobacillus arabinosus
Lactobacillus casei
Streptococcus faecalis
Acid 5-focmyl-5,6,7,8-tetrahidrofolic
Leuconostos citrovorum
Streptococcus faecalis

Locovorin
Lactobacillus casei
Acid nicotinic

Lactobacillus arabinosus
Leuconostoc menssenteroides
Streptococcus faecalis
Riboflavin
Lactobacillus casei
Streptococcus lactic

Acid pantothenic

Lactobacillus casei
Leuconostoc menssenteroides
Streptococcus faecalis
Panteterin.pantetin

Lactobacillus acidophyllus
Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus casei

Acid lipoic

Streptococcus lactic
Streptococcus faecalis
Lactobacillus fermenti
Thiamin

Streptococcus lactic
Lactobacillus plantarum
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 16

Biotin

Leuconostoc menssenteroides
Streptococcus faecalis
Lactobacillus arabinosus
Bioxitin
Lactobacillus casei

2.1.4. Nhu cầu về các muối khoáng:
Để đảm bảo cho sự sinh trƣởng phát triển, vi khuẩn lactic cần rất nhiều hợp chất
vô cơ nhƣ P, S, Mg, Ca, Zn, Mn, Fe, Na, Cl. Đối với lactobacillus thì Mn
2+
, Mg
2+
, Fe
2+

có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh ra acid lactic.
- Các nguyên tố đa lƣợng: là những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi
phỉa cung cấp với liều lƣợng lớn
- Các nguyên tố vi lƣợng: là những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi
phải đƣợc cung cấp với liều lƣợng rất nhỏ.
- Các nguyên tố khoáng:
+ P : chiếm tỉ lệ cao nhất trong các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật, có
mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế bào ( acid nucleic,
phophoprotein, photpholipid…)
+ S : là khoáng quan trọng trong tế bào vi sinh vật trong một số acid amin
(xixtrin,xixtein, metioin), một số vitamin (biotin, tiamin…)
+ Mg : nguyên tố vi sinh vật đòi hỏi với lƣợng khá cao, tham gia vào nhiều phản
ứng enzyme có liên quan đến quá trình photphoryl hóa.

+ Ca : có vai trò quan trọng đáng kể trong việc xây doing cấu trúc tinh vi của tế
bào,vai trò cầu nối trung gian giữa các thành phần quan trọng của tế bào sống.
+ Zn : tham gia vào nhiều quá trình enzyme, có tác dụng đáng kể trong việc
hoạt hóa các enzyme.
+ Mn : chứa trong một số enzyme hô hấp, có vai trò trong việc hoạt hóa một số
enzyme.











Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 17
Bảng 6: Thành phần môi trường nuôi cấy

Casein peptone, tryptic digest
10.00
g/l
Cao thịt (Meat extract)
10.00
g/l
Cao nấm men (Yeast extract)
5.00

g/l
Glucose
20.00
g/l
Tween 80
1.00
g/l
K
2
HPO
4

2.00
g/l
CH
3
CO
2
Na (Acetat Natrium)
5.00
g/l
(NH
4
)
2
citrate (Citrat
ammonium)
2.00
g/l
MgSO

4
x 7 H
2
O
0.20
g/l
MnSO
4
x H
2
O
0.05
g/l
Điều chỉnh sao cho pH
khoảng 6.2 - 6.5.




 Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến sự sinh trƣởng và phát triển của
vi khuẩn lactic
Sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic chịu tác động của các yếu tố môi
trƣờng nhƣ:
Nhiệt độ:
-Hoạt động trao đổi chất là kết quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này
phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ nên yếu tố ảnh hƣởng sâu sắc đến các quá trình sống
của tế bào
-Các tế bào sinh dƣỡng của vi khuẩn lactic bị chết ở nhiệt độ cao, protein bị biến
tính
-Nhiệt độ thấp có thể làm bất hoạt quá trình vận chuyển các chất hòa tan qua màng

tế bào chất do thay đổi hình không gian của một số permeaza chứa trong màng hoặc
ảnh hƣởng đến việc hình thành và tiêu thụ ATP cần cho quá trình vận chuyển chủ
động các chất dinh dƣỡng.
- Mỗi loài vi sinh vật có khoảng nhiệt độ tối thích khác nhau. Vi khuẩn lactic có thể
phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ từ 15 - 50 C và đƣợc phân thành hai nhóm:
Nhóm ƣa ấm (mesophilic): phát triển ở nhiệt độ trung bình,nhiệt độ phát
triển tối ƣu là :25-35 C
Nhóm ƣa nhiệt (thermophilic): thƣờng phát triển ở nhiệt độ tƣơng đối cao
37-45 C
pH: có ảnh hƣởng rất lớn đến sự sinh trƣởng và phát triển của các vi khuẩn
lactic. pH tối ƣu cho sự sinh phát triển của chúng nằm trong khoảng 5.5-6.5.
Quá trình lên men bị ức chế mạnh tại pH dƣới 4.5.
Oxy: vi khuẩn lactic thuộc loại vi hiếu khí , hàm lƣợng oxy nhiều sẽ là một
chất độc đối với vi khuẩn lactic.
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 18
Độ ẩm: nƣớc là môi trƣờng cho các phản ứng trong tế bào do đó độ ẩm là một
yếu tố quan trọng cho sự phát triển của vi khuẩn lactic.
Áp suất thẩm thấu: màng tế bào chất của vi khuẩn là màng bán thấm. Khi
nồng độ muối trong môi trƣờng nuôi cấy cao (trên 2%) sẽ ức chế sự phát triển
của vi khuẩn lactic.
3. Thanh trùng môi trƣờng
Môi trƣờng sau khi đƣợc pha chế sẽ qua thanh trùng nhiệt để tiêu diệt, ức chế vi
sinh vật và hoạt tính enzyme trong môi trƣờng, tạo điều kiện cho giống phát triển.
Theo lý thuyết, nếu nhiệt độ thanh trùng càng cao với thời gian càng dài thì mức
độ tiêu diệt và vô hoạt enzyme càng cao, tuy nhiên giá trị dinh dƣỡng của môi trƣờng sẽ
bị giảm:
o Vitamin bị phân huỷ.
o Một phần đƣờng khử và acid amin tham gia phản ứng Maillard làm

giảm hàm lƣợng cơ chất cacbon và nguồn nitơ của môi trƣờng
Trong thực tế, tuỳ thuộc vào giống VSV, thành phần hoá học của môi trƣờng và
mức độ nhiễm VSV trong các nguyên liệu pha chế môi trƣờng mà các nhà sản xuất sẽ đề
xuất chế độ thanh trùng với giá trị nhiệt độ và thời gian thích hợp, thƣờng áp dụng chế độ
thanh trùng dao động trong khoảng 80 - 90 C trong 30 - 60 phút.

 Phƣơng pháp thực hiện: thiết bị ống lồng ống
 Thông số công nghệ
nhiệt độ 85-90
0
C


a. Cấu hình nhiều kênh ; b. Cấu hình nhiều ống
Hình 8 : Thiết bị trao đổi nhiệt dạng ống
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 19

4) Nhân giống
a. Yêu cầu
Số lƣợng tế bào trong môi trƣờng nuôi lên giá trị cao nhất, trong khoảng thời
gian ngắn nhất, với những chi phí thấp nhất về nguyên liệu và năng lƣợng.
Sinh khối thu đƣợc phải có hoạt tính lên men cao, tỷ lệ tế bào chết càng thấp
càng tốt.
Trong quá trình nhân giống cần đảm bảo cho giống đƣợc thuần khiết, điều này rất
quan trọng vì nếu giống có lẫn các vi sinh vật lạ thì trong quá trình lên men sẽ gây hƣ
hỏng và làm sản phẩm không đạt yêu cầu và đôi khi còn có hại cho ngƣời tiêu thụ.
b. Cơ sở khoa học của quá trình nhân giống
Chọn môi trƣờng với thành phần cơ chất thích hợp để nuôi vi sinh vật.

Chọn phƣơng pháp và các điều kiện nuôi tối ƣu (pH, nhiệt độ, sự cung
cấp oxi, ) cho quá trình tăng sinh khối của giống.
Mục đích: tăng số lƣợng VSV
c. Tiến hành nhân giống
Để cấy giống, một lƣợng canh trƣờng vi khuẩn xác định đƣợc cho vào môi trƣờng
dinh dƣỡng đã đƣợc xử lý nhiệt sau khi điều chỉnh đến nhiệt độ thích hợp. Để ngăn chặn
những bất thƣờng trong canh trƣờng, điều quan trọng nhất là lƣợng giống cấy, nhiệt độ
nuôi cấy và thời gian nuôi cấy phải đƣợc giữ không đổi trong suốt tất cả các giai đoạn.
 Trong PTN:
Giống đƣợc nhân trong các bình cầu. khi nhiệt độ khỏang 37 – 40
o
C, cho
canh trƣờng lỏng vào, tỷ lệ 5% thể tích. Giữ ở 40 – 45
o
C, sau 8 -10h, giống
đạt yêu cầu. có thể dùng nhân giống tiếp tục ở các thể tích lớn hơn.












Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Trang 20
SƠ ĐỒ TỔNG QUÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI SINH VẬT CHO SẢN XUẤT



Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 21
 Trong phân xưởng
Vi khuẩn lactic đã đƣợc nuôi cấy riêng ở phân xƣởng nhân giống. Khi lƣợng
giống đảm bảo về số lƣợng tế bào( khoảng x*10
6
tế bào/1ml), tiến hành lên men.
5. Nuôi cấy:
Ngƣời ta chuyển giống vào thùng lên men với tỷ lệ giống là 2.5- 3%. Trong sản
xuất lactic, ngƣời ta thƣờng sử dụng các loại vi khuẩn lactic đồng hình , trong đó vi
khuẩn lactic lactobacillus đƣợc sử dụng nhiều hơn cả.
- Đối với vi khuẩn này ,ngƣời ta thƣờng duy trì nhiệt độ trong suốt quá trình lên men
là 40
0
C , pH duy trì ở 5-6, thời gian lên men 1-8 ngày, tuy nhiên,những điều kiện lên men
trên có thể thay đổi tuỳ theo giống vi khuẩn lactic mà ta sử dụng để sản xuất.
- Trong quá trình lên men ngƣời ta tiến hành khuấy trộn liên tục môi trƣờng. Nhiều
trƣờng hợp, ngƣời ta tiến hành thổi khí, khi thổi khí lƣợng acid lactic tạo ra cao hơn nhiều
so với không thổi khí.
a. Phƣơng pháp thực hiện:
Dùng thiết bị lên men bề sâu, gián đoạn:
Thiết bị lên men có thể tích 63 m
3
: Dạng thiết bị lên men này là một xilanh

đứng đƣợc chế tạo bằng thép X18H10T hay kim loại kép có nắp và đáy hình nón.
Tỷ lệ chiều cao và đƣờng kính bằng 2,6 : 1. Trên nắp có bộ dẫn động cho cơ cấu
chuyển đảo và cho khử bọt bằng cơ học; ống nối để nạp môi trƣờng dinh dƣỡng,
vật liệu cấy, chất khử bọt, nạp và thải không khí; các cửa quan sát; cửa để đƣa vòi
rửa; van bảo hiểm và các khớp nối để cắm các dụng cụ kiểm tra.
Khớp xả 16 ở đáy của thiết bị dùng để tháo canh trƣờng. Bên trong có trục
6 xuyên suốt. Các cơ cấu chuyển đảo đƣợc gắn chặt trên trục. Cơ cấu chuyển đảo
gồm có các tuabin 8 có đƣờng kính 600 ÷1000 mm với các cánh rộng 150 ÷ 200
mm đƣợc định vị ở 2 tầng, còn tuabin hở thứ ba đƣợc gắn chặt trên bộ sủi bọt 13
để phân tán các bọt không khí. Bộ sủi bọt có dạng hình thoi đƣợc làm bằng những
ống đột lỗ. Ở phần trên của bộ sủi bọt có khoảng 2000 ÷ 3000 lỗ theo kiểu bàn cờ.

Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 22

1- Động cơ; 2- Hộp giảm tốc; 3- Khớp nối; 4- Ổ bi; 5- Vòng bít kín;
6- Trục;7- Thành thiết bị ; 8- Máy khuấy trộn tuabin; 9- Bộ trao đổi nhiệt
kiểu ống xoắn; 10- Khớp nối; 11- Ống nạp không khí; 12- Máy trộn kiểu cánh
quạt; 13- Bộ sủi bọt; 14- Máy khuấy dạng vít; 15- Ổ đỡ; 16- Khớp để tháo; 17-
Ao; 18- Khớp nạp liệu; 19- Khớp nạp không khí
Hình 9 : Thiết bị lên men với bộ đảo trộn cơ học dạng sủi bọt có sức chứa 63 m
3


Động cơ - bộ truyền động làm quay trục 6 và các cơ cấu đảo trộn 8, 12, 14. Sử
dụng bộ giảm tốc và bộ dẫn động có dòng điện không đổi để điều chỉnh vô cấp số
vòng quay trong giới hạn 110 ÷ 200 vòng/ phút.
Thiết bị lên men đƣợc trang bị áo 17, gồm từ 6 ÷ 8 ô. Mỗi ô có 8 rãnh đƣợc
chế tạo bằng thép góc có kích thƣớc 120×60 mm. Diện tích làm việc của áo 60 m

2
.
Bề mặt làm việc bên trong 45 m
2
gồm ống xoắn 9 có đƣờng kính 600 mm với số
vít 23 khi tổng chiều cao của ruột xoắn 2,4 m.
Thiết bị lên men đƣợc tính toán để hoạt động dƣới áp suất dƣ 0,25 MPa và
để thanh trùng ở nhiệt độ 90-95
0
C, cũng nhƣ để hoạt động dƣới chân không. Trong
Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 23
quá trình nuôi cấy vi sinh vật, áp suất bên trong thiết bị 50 kPa; tiêu hao không khí
tiệt trùng đến 1 (m
3
/phút). Chiều cao cột chất lỏng trong thiết bị 5 ÷ 6 m khi chiều
cao của thiết bị hơn 8 m.
Để tiện lợi cho việc thao tác và tránh những sai lầm cần dán vào thiết bị sơ
đồ chỉ dẫn thao tác .
Để đảm bảo tiệt trùng trong suốt quá trình (giữ đƣợc hơi), các trục của cơ
cấu chuyển đảo phải có vòng bít kín. Các vòng bít kín đƣợc tính toán để hoạt động
ở áp suất 0,28 MPa và áp suất dƣ không nhỏ hơn 2,7 kPa, nhiệt độ 30 ÷ 250
0
C và
số vòng quay của trục đến 500 vòng/ phút. Nhờ các vòng đệm này mà ngăn ngừa
đƣợc sự rò rỉ môi trƣờng hay sự xâm nhập không khí vào khoang thiết bị ở vị trí
nhô ra của trục.
Vòng bít kín khi tiếp xúc với môi trƣờng làm việc đƣợc chế tạo bằng thép
X18H10T và X17H13M2T, cũng nhƣ bằng titan BT-10. Thời gian hoạt động ổn

định của các vòng này không nhỏ hơn 2000 h khi tuổi thọ 8000 h. Độ đảo hƣớng
kính cho phép của trục trong vùng đệm kín không lớn hơn 0,25 mm, độ đảo chiều
trục của trục không lớn hơn 0,25
0
.






Công nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 24

1- Hơi vào;
2- Không khí tiệt trùng vào;
3- Không khí tiệt trùng hay hơi vào vùng bít kín;
4- Thoát hơi hay không khí tiệt trùng tới bộ sủi bọt;
5- Hơi hay không khí tiệt trùng vào thiết bị ở phần trên;
6- Thải hơi hay không khí tiệt trùng tới bộ lấy mẫu thử nghiệm;
7- Thải hơi hay không khí tiệt trùng;
8- Cơ cấu ống nhánh có van điều chỉnh bằng khí động học;
9- Nạp hơi hay không khí tiệt trùng vào thiết bị ở phần dưới;
10- Tháo nước ngưng;
11- Ap kế; 12- Van; 13- Ống tháo; 14- Van khoá; 15- Van lấy mẫu;
16- Nạp hơi hay không khí tiệt trùng khi lấy mẫu; 17- Đoạn ống để nối áp kế kiểm tra;
18, 25- Các áp kế; 19- Van để nạp vật liệu cấy; 20- Nạp canh trường;
21, 23- Nạp dung dịch chuẩn;
22- Thải hơi hay không khí từ vùng bít kín; 24- Ống nhánh để nạp dung dịch chuẩn;

26- Cung cấp khí thải từ thiết bị; 27- Cung cấp nước; 28- Van rót;
29- Van để rót nước từ áo; 30- Van để nạp nước lạnh;
31- Ống nhánh để nạp nước lạnh; 32- Lược; 33- Ap kế;
34- Van an toàn; 35- Cảm biến nhiệt độ;
36, 37- Các dụng cụ thứ cấp để đo nhiệt độ và độ pH;
38- Cảm biến pH met; 39- Thiết bị lên men; 40- Cơ cấu để làm sạch không khí

Hình10 . Sơ đồ chỉ dẫn thao tác của thiết bị lên men
 Thông số công nghệ
- pH 4.5
- nhiệt độ 30-32
o
C
Cơng nghệ sản xuất sinh khối vi khuẩn lactic
CBGD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn
Trang 25
b. Các biến đổi xảy ra trong quá trình nuôi cấy
 Các biến đổi sinh học
Giai đoạn thích nghi (pha lag):
 Vi khuẩn chưa có sự phân chia nhưng có sự tăng rõ rệt về thể tích và
khối lượng tế bào do quá trình tổng hợp các chất, trước hết là các chất
cao phân tử (protein, enzyme, acid nucleic…) diễn ra mạnh mẽ.
 Hình thành các enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp cơ chất và các
enzyme nằm trong quá trình chuyển hoá glucide.
Giai đoạn tăng trưởng (pha log):
 Vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo cấp luỹ thừa, nghóa là sinh khối
và số lượng tế bào tăng rất nhanh.
 Ở giai đoạn này xảy ra hàng loạt các biến đổi quan trọng để tạo sinh
khối tế bào: sự tổng hợp enzyme tiếp tục được xúc tiến, sự chuyển hoá
các hợp chất cacbonhydate, sự chuyển hoá các hợp chất chứa Nitơ…

Giai đoạn ổn đònh:
 Quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra
bằng số tế bào cũ chết đi, do đó số lượng tế bào không thay đổi.
 Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất.Cho nên khi giảm
nồng độ cơ chất thì tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật giảm.Do đó việc
chuyển từ pha log sang pha ổn đònh diễn ra dần dần.
 Nguyên nhân tồn tại củïa pha ổn đònh là do sư tích lũy các sản phẩm độc
hại của trao đổi chất và việc cạn các chất dinh dưỡng.ï

Hình 11 : Sự biến đổi của sinh khối theo thời gian trong phương pháp
nuôi cấy tónh