công nghệ lên men sản xuất rifamycin

LOGO
Tiểu luận môn học
Công nghệ lên men các hợp chất kháng sinh
Đề tài
công nghệ lên men sản xuất Rifamycin
/>Mycobacterium tuberculosis scanning
electron micrograph. Mag 15549X.
CDC.
Nội dung
Tài liệu tham khảo
Phương pháp mới
Công nghệ sản xuất
Cơ chế tác động
Giới thiệu Rifamycin
Giới thiệu Rifamycin
Rifmapicin

Rifamycin lần đầu tiên được tách chiết vào năm
1957 từ một canh trường lên men của
Streptomyces mediterranei

7 kháng sinh họ này đã được phát hiên có tên
rifamycin A, B, C, D, E, S, và SV
Cơ chế tác động
Cơ chế tác động
•
Rifamycin là kháng sinh dùng tại chỗ hoặc tiêm
•
Điều trị các nhiễm khuẩn gram âm và gram dương có nhạy
cảm với thuốc các nhiễm khuẩn ngoài da và các mô mềm,
vết thương, bỏng

•
Đặc biệt hiệu quả với mycobacteria
•
Các sản phẩm ks bán tổng hợp sử dụng để điều trị các
bệnh lao, phong và nhiễm khuẩn mycobacterium
Công nghệ sản xuất
Nhân giống
Nhân giống
Lên men
Lên men
Xử lý thu KS
Xử lý thu KS
Chọn giống
Chọn môi trường
Nhân giống
Chuẩn bị môi trường,
thiết bị
Lên men
Trích ly, Chưng
cất, Tẩy màu, Kết
tinh, Sấy
Nhân giống
Chọn giống
Chọn môi trường
Nhân giống
Streptomyces mediterranei (Amycolatoposis mediterranei)
Lĩnh giới: Bacteria
Giới: Eubacteria
Ngành: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales

Họ: Streptomycetaceae
Chi: Streptomyces
Loài: Streptomyces mediterranei
S. mediterranei thuộc ngành xạ khuẩn (Actinobacteria) là vi khuẩn nhân thật-Eubacteria phân bố
rất rộng rãi trong tự nhiên. S. mediterranei là vi khuẩn Gram dương, khuẩn lạc hình phóng xạ
(actino-) nhưng khuẩn thể có dạng sợi, phân nhánh như nấm (myces).
Môi trường

1l môi trường nhân giống: 4g chất chiết nấm men, 4g tinh chất mạch
nha, 4g glucose, 20g bột yến mạch, 20g agar, nước cất

Thời gian ủ 7-8 ngày-Nhiệt độ: 28oC-Độ ẩm tương đối: 40%-50%

Môi trường lên men: 12% glucose, 2% bột đậu nành, 1% peptone, 0,5%
bột cá, 0,8 % KNO3, 0,05% KH2PO4, 0,0001% CoCl2, 0,5 % CaCO3.
Lên men
Quá trình lên men phải bổ sung thêm glucose để hàm
lượng glucose tối thiểu còn lại trong dịch lên men là 1-
1,5%.
-Nhiệt độ lên men: 28
o
C, pH 6,6
-Thời gian lên men: 9 ngày
-Tốc độ khuấy trộn: 130 rpm
Nocardiamediter r anei
Nhân giống
Lên men
Môi trường
Môi trường
Môi trường

Xử lý thu kháng sinh
Trích ly
Tẩy màu
Trích ly
Chưng cất
Tẩy màu
Kết tinh
Sấy
RifamycinB
-Trích ly: Ethyl acetat (CH
3
COOCH
2
CH
3
), pH=2, 10
o
C
Có thể trích ly hai lần dung môi
-Chưng cất: thu hồi dung môi và cô đặc dịch sau trích
ly(nồng độ trước kết tinh ≥70%)
-
Tẩy màu bằng chất hấp phụ
-
Kết tinh: bổ sung Natri acetat 0,1%, cô chân không ở
nhiệt độ thấp 28
o
C, bổ sung mầm kết tinh(bột sản
phẩm)
-

Sấy: sấy chân không thùng quay đuổi hết dung môi và
đạt hàm ẩm chuẩn.
Một số chỉ tiêu sản phẩm của Rifamycin B:
-Yêu cầu sản phẩm đạt độ tinh khiết trên 99,5%
- Độ ẩm: 3-5%
-Tinh thể Rifamycin B dạng kim, có màu vàng, đồng đều.
- Đạt tiêu chuẩn quốc tế cho phép
Phương pháp mới
Nghiên cứu sản xuất kháng sinh Rifamycin
Phương pháp lên men gián đoạn sử dụng chủng cố định trong gel alginate và các hạt alginate
biến đổi

Trong lên men batch và fed- batch truyền thống hơn 50% thời gian lên men là sd cho tế bào phát
triển.

Lên men sử dụng các tế bào tự do dễ nhiễm toàn bộ, thất thoát lớn

kỹ thuật lên men sử dụng các TB cố định được cân nhắc

Phương pháp sản xuất kháng sinh sử dụng các tế bào cố định đã thành công, ứng dụng sản xuất
nhiều loại kháng sinh khác nhau: Rifamycin, Neomycin, cephamycin, oxytetracycline
Ưu điểm

Năng suất cao hơn

Dễ dàng thực hiện và dễ dàng tái sử dụng

Hạn chế khả năng nhiễm

Thời gian lên men giảm không ảnh hưởng đến năng suất kháng sinh tạo

thành
Vật liệu và phương pháp
Chủng VSV
Chủng vi sinh vật:
Amycolatopsis
mediterranei ATCC 21789
Nhân giống
Môi trường,
Nuôi trong các bình tam
giác
Nuôi lắc 48h/
30
o
C/200rpm
Chuẩn bị Gel
Gel alginate
Canh trường VSV
Tác nhân làm cứng
Lên men
Lên men gián đoạn sử
dụng các hạt gel có cố
định chủng VSV
Nhân giống
Thành phần: (g/l)
Glucose: 10
KH
2
PO
4
: 3

K
2
HPO
4
: 1,5
MgSO
4
.7H
2
O: 1
FeSO
2
.7H
2
O: 0,016
Zn acetate: 0,001
YE: 5

Điều chỉnh đến pH= 7 bằng NaOH, phân
bố vào các bình tam giác, 50ml/bình 
khử trùng

Nuôi lắc 48h/ 30
o
C/200rpm.

 Thu tế bào sinh dưỡng để cấy vào
các bình lắc trong kỹ thuật cố định
Chuẩn bị các hạt gel alginate


80ml nước cất+ 4g sodium alginate, trộn đều thanh trùng
121C/15’

Định trước trọng lượng tế bào lấy ra từ canh trường nuôi sau
96h/ 30
0
C( phần nổi phía trên)+ 20ml nước cất vô trùng

Trộn 20ml canh trường với 80ml dung dịch chứa gel ở trên

Nhỏ hỗn hợp vào dung dịch CaCl
2
3%

Làm đông ở nhiệt độ phòng, cất giữ qua đêm/ 5
0
C
Môi trường cho sản xuất rifamycin
Thành phần: (g/l)
Glucose: 40
KH
2
PO
4
: 3
K
2
HPO
4
: 1,5

MgSO
4
.7H
2
O: 1
FeSO
2
.7H
2
O: 0,016
Zn acetate: 0,001
YE: 5
Điều chỉnh về pH 7 bằng NaOH 1M, và phân bố vào các bình tam giác mỗi bình 50ml thanh
trùng
Gluocose được khử trùng riêng, và đc thêm vào môt trường nuôi cấy trc khi cấy.
Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng
KQ: Ảnh hưởng nồng độ alginate
•
3-4% hàm lượng rifamycin B& SV tăng
•
4-5% hàm lượng rifamycin B & SV giảm:
544-450mg/l; 534-363mg/l
•
3-5% CDW giảm từ 11.05- 8.2g/l
•
Kq cho thấy ở nđộ thấp hơn 4% cho hàm
lượng Rifamycin cao hơn
Ảnh hưởng của đường kính hạt gel
•
TN với nồng độ gel 4%

•
Đường kính hạt: 3- 3,7- 4,2 mm
•
Kq cho thấy tăng đường kính hạt từ 3-4,2mm- hàm
lượng Rifamycin B & SV tăng: 432,75- 565mg/l;
419,5- 589mg/l
•
CDW cũng tăng từ 7,95 - 10,7 g/l
•
Kết luận đk 4,2 là thích hợp nhất
Thời gian cố định tế bào trong gel
•
Thời gian nghiên cứu 72h- 168h
•
Hàm lượng 2 kháng sinh tăng khi tăng thời gian
lên 96h, CDW tăng
•
96-168h hàm lượng giảm 668-267,5; 542,5-
234.5mg/l, CDW giảm còn 5,7g/l – 168h
•
Lượng đường tiêu thụ nhiều nhất(96h)
Tác nhân làm cứng gel
•
ALG: alginate
•
AG: Arabic Gum
•
GLN: Gelan Gum
•
Kết quả cho thấy khi sử dụng

GLN thì hàm lượng Rifamycin B &
SV đều tăng so với việc sd chỉ
alginate
Tái sử dụng các hạt cố định