Đồ án môn học Công nghệ thực phẩm Tổng quan tài liệu về ứng dụng biosensor trong kiểm soát chất lượng thực phẩm

TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 1
LỜI MỞ ĐẦU
Trong công nghệ thực phẩm, thiết bị phân tích thích hợp không chỉ kiểm soát và đo
lường các thông số quan trọng của sản phẩm mà còn kiểm soát toàn bộ quá trình. Phân
tích thực phẩm gồm nhiều lĩnh vực, bao gồm xác định vấn đề dinh dưỡng (calories, hàm
lượng béo, carbohydrate, protein, vitamin, và chất khoáng), hàm lượng vi sinh vật (vi sinh
vật gây bệnh như Samonella, Listeria, Campylobacter, Escherichia coli O157, Yersina,
Shigella hay Vibrio; vi sinh vật gây hư hỏng như Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,
Faecal streptococci, Clostridium perfringens, hay Pseudomonas,…); gia vị thực phẩm
(aspartame, saccharin, benzoate, sorbate, ascorbate, và sulphure dioxide) hay dư lượng
thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ. Bên cạnh xác định được thành phần và đặc tính của thực
phẩm, phương pháp phân tích cũng cho biết được các biến đổi hóa học xảy ra trong quá
trình thu hoạch, chế biến, và bảo quản. Tuy nhiên, khó khăn trong phân tích không chỉ vì
có nhiều thành phần cần xác định mà còn vì có nhiều chất khác che lấp mất chất cần phân
tích.
Một thiết bị phân tích tốt phải thỏa mãn: độ chọn lọc cao, độ nhạy cao, độ tin cậy
cao, thời gian phân tích ngắn, ổn định, đơn giản, chi phí thấp, nhỏ gọn, dễ tự động hóa.
Biosensor có vai trò quan trọng trong chế biến thực phẩm, kiểm tra chất lượng, an toàn vì
nó đạt khá đầy đủ các tiêu chuẩn trên.
Trong bài báo cáo này, em sẽ trình bày về những ứng dụng của biosensor trong
kiểm soát chất lượng thực phẩm.
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 2
MỤC LỤC
PHẦN 1 Error! Bookmark not defined.
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR 4

1.1 Khái niệm về biosensor 4
1.2 Đặc điểm – Yêu cầu về biosensor 5
1.3 Phân loại biosensor 5
1.4 Nguyên tắc và cấu tạo của các loại biosensor 6
1.4.1 Biosensor đo điện thế 6
1.4.2 Biosensor đo cường độ dòng điện 8
1.4.3 Biosensor đo nhiệt 8
1.4.4 Biosensor áp điện: 10
1.4.5 Biosensor quang 11
1.4.6 Biosensor enzyme 13
1.4.7 Biosensor miễn dịch: 13
1.4.8 Biosensor vi sinh vật 13
1.5 Cách sử dụng biosensor 14
1. 5.1 Xác định trực tiếp trong môi trường mẫu. Phương pháp gián đoạn 14
1.5.2 Flow injection analysis (FIA) 14
1.6 Các lĩnh vực ứng dụng của biosensor 16
PHẦN 2 17
ỨNG DỤNG CỦA BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN THỰC PHẨM 17
2.1 Kiểm soát chất lượng rượu vang 17
2.1.1 Biosensor xác định hàm lượng glucose 17
2.1.2 Biosensor xác định ethanol 24
2.1.3 Biosensor xác định glycerol 30
2.1.4 Kiểm soát đồng thời ethanol, glucose, glycerol 30
2.2 Kiểm soát chất lượng của cá 35
PHẦN 3 40
ỨNG DỤNG CỦA BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH 40
VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM 40
3.1 Biosensor quang 41
 Biosensor dựa trên hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt 41
3.2 Biosensor áp điện 47

3.3 Biosensor điện hóa 50
PHẦN 4 55
ỨNG DỤNG BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH THUỐC TRỪ SÂU TRONG THỰC PHẨM
55
4.1 Phương pháp ức chế enzyme 55
4.2 Phương pháp sử dụng enzyme thủy phân 58
4.2.1 Biosensor đo điện thế 59
4.2.2 Biosensor đo quang 60
4.2.3. Biosensor đo cường độ dòng điện 61
PHẦN 5 62
ỨNG DỤNG BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH 62
THUỐC KHÁNG SINH (ANTIBIOTIC) TRONG THỰC PHẨM 62
5.1 Phân tích dư lượng β-lactam trong sữa 62
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 3
5.2 Phân tích streptomycin và dihydrostreptomycin trong sữa, mật ong và thịt heo 66
PHẦN 6 68
ỨNG DỤNG BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH 68
KIM LOẠI NẶNG TRONG THỰC PHẨM 68
6.1 Biosensor phát hiện kim loại nặng dựa vào tính ức chế enzyme 69
6.2. Biosensor sử dụng protein 71
PHẦN 7 74
KẾT LUẬN 74
PHẦN 8 75
PHỤ LỤC 75
TÀI LIỆU THAM KHẢO 81
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh

SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 4
PHẦN 1
GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BIOSENSOR
1.1 Khái niệm về biosensor
Biosensor là một thiết bị phân tích nhằm chuyển tín hiệu từ phản ứng hóa học hoặc
đáp ứng sinh học thành tín hiệu điện. Cấu tạo biosensor gồm cơ quan tiếp nhận có bản
chất sinh học (bioreceptor) gắn với bộ chuyển đổi hóa lý (physico-chemical transducer).
[1]
 Biorecptor có chức năng nhận biết chất cần phân tích và chuyển đổi nó thành sản
phẩm, đồng thời sinh ra những tín hiệu hóa lý mà transducer có thể nhận dạng và định
lượng được
Bioreceptor có thể là enzyme, kháng thể, acid nucleic, DNA, RNA, vi khuẩn, sinh
vật đơn bào, mô hay cơ quan cao hơn. Việc lựa chọn thành phần này tùy thuộc vào chất
cần phân tích.
 Transducer: tác dụng của transducer là nhận dạng tín hiệu từ bioreceptor và
chuyển nó thành tín hiệu điện.
Transducer có nhiều dạng, tùy thuộc vào thông số cần đo như sự thay đổi điện hóa,
quang, khối lượng (mass), nhiệt độ,…Nếu tính chọn lọc của biosensor là do thành phần
sinh học quyết định thì transducer sẽ quyết định độ nhạy của biosensor.
.

Hình 1.1: Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của biosensor: bioreceptor (a) chuyển cơ chất (S)
thành sản phẩm (P). Transducer (b) chuyển sản phẩm phản ứng thành tín hiệu điện. Bộ
khuếch đại (c) nhằm khuếch đại tín hiệu điện của transducer. Bộ vi xử lý tín hiệu (d). Màn
hình hiển thị (e).
Việc kết hợp mỗi loại bioreceptor với mỗi loại transducer đã tạo ra những loại
biosensor khác nhau. Thực tế, hai thành phần này phải tương thích với nhau để có thể ra
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh

SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 5
được tín hiệu điện. Ví dụ: sử dụng transducer đo nhiệt độ trong khi phản ứng chuyển hóa
chất phân tích không xảy ra sự thay đổi enthalpy thì sẽ không có tín hiệu điện ở đầu ra.
1.2 Đặc điểm – Yêu cầu về biosensor
Để định lượng, biosensor phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả năng
lặp lại, khả năng tái sử dụng, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính và thời
gian đáp ứng tín hiệu tốt [1].
Các phép đo có khả năng lặp lại tốt nếu như hai loạt kết quả thu được tương tự
nhau được thực hiện bởi cùng người phân tích, sử dụng cùng một loại biosensor trong
cùng một mẫu phân tích.
Phương pháp đo có khả năng tái sử dụng cao nếu các kết quả trước có thể đạt được
khi tiến hành phân tích lặp lại lần hai.
Tính chọn lọc của biosensor thể hiện ở khả năng nhận ra một hợp chất đơn trong
hỗn hợp các cấu tử của mẫu, khả năng này phụ thuộc vào cơ quan thụ cảm sinh học và bộ
biến năng. Một biosensor có tính chọn lọc cao nếu như thành phần tạp chất của mẫu thấp.
Tính nhạy cảm của biosensor thể hiện ở sự thay đổi về lượng thì sẽ gây ra sự thay
đổi về tín hiệu trả lời: a = s m
trong đó a: Độ dao động về biên độ của dòng ra
m: Độ dao động về biên độ của dòng vào
s: Độ nhạy cảm của biosensor, đặc trưng cho mức độ phù hợp của biosensor
trong một ứng dụng cụ thể.
Đối với biosensor đo bằng điện thế thì biên độ của tín hiệu trả lời tỷ lệ thuận với
logarite của nồng độ chất phân tích. Theo định luật Nernst: a = s (logc).
Vùng tín hiệu tuyến tính thu được là một đường cong hiệu chỉnh của tín hiệu trả lời
với nồng độ khác nhau của chất phân tích. Đường cong chỉ thật sự có ý nghĩa nếu tiến
hành hiệu chỉnh cả hai loạt nồng độ tăng và giảm. Đường cong hiệu chỉnh gọi là tốt nếu
như tín hiệu trả lời ổn định theo thời gian.
Thời gian đáp ứng khá dài bởi bản chất của đường cong hiệu chỉnh, nó cho biết
một phương pháp đo cho tín hiệu trả lời nhanh hay chậm khi thay đổi nồng độ.

1.3 Phân loại biosensor
Có 2 cách phân loại biosensor:
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 6
- Dựa vào nguyên tắc chuyển đổi các tín hiệu sinh học của transducer, người ta
chia biosensor thành 4 loại:
 Biosensor điện hóa gồm 2 nhóm nhỏ như biosensor đo cường độ dòng điện
(amperometric biosensor) và biosensor đo điện thế (potentiometric biosensor).
 Biosensor đo nhiệt (thermometric biosensor).
 Biosensor áp điện (piezoelectric biosensor).
 Biosensor đo quang (optical biosensor hay photometric biosensor).
- Dựa vào loại bioreceptor gắn trên transducer, người ta chia biosensor thành 3
loại:
 Biosensor enzyme (enzyme-based biosensor);
 Biosensor miễn dịch (Immunological biosensor);
 Biosensor vi sinh vật (Microbial biosensor).
1.4 Nguyên tắc và cấu tạo của các loại biosensor
1.4.1 Biosensor đo điện thế
Biosensor này hoạt động dựa trên nguyên tắc xác định sự khác nhau về điện thế
giữa điện cực đo (probe electrode) và điện cực so sánh (reference electrode) để từ đó suy
ra được nồng độ chất phân tích do tín hiệu thu được tỉ lệ với nồng độ logarithm của nồng
độ (theo định luật Nerst).
Transducer của biosensor gồm điện cực đo và điện cực so sánh.
1.4.1.1. Điện cực đo
Điện cực đo nơi xảy ra phản ứng oxy hóa khử, tạo ra điện thế phụ thuộc vào hoạt
độ của ion cần phân tích. Thông thường điện cực đo được phân ra làm 2 loại: điện cực khí
và điện cực màng.
 Điện cực khí: là một hệ gồm một kim loại trơ (thường là Pt, Au, ) tiếp xúc đồng thời

với khí và dung dịch chứa ion của khí này. Thông dụng nhất là điện cực hydro, điện
cực oxy, điện cực clo.
 Điện cực màng chọn lọc ion: thông thường là các bán pin có lớp màng phân cách
dung dịch cần phân tích với một dung dịch chuẩn ở bên trong. Điện cực thủy tinh đo
pH là điện cực màng chọn lọc ion thông dụng nhất, dùng để kiểm soát nồng độ ion H
+
(pH) hay các cation hóa trị 1. Phần cuối của điện cực là một bầu thủy tinh có thành
mỏng và có thành phần đặc biệt. Bên trong bầu thủy tinh chứa dung dịch H
+
có nồng
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 7
độ xác định. Nhúng vào dung dịch H
+
là dây dẫn Pt hay kim loại Ag phủ AgCl. Toàn
bộ bộ phận trên được đặt trong ống bảo vệ. Bằng việc thay thế thành phần của thủy
tinh sao cho điện thế màng không phụ thuộc vào giá trị pH, thường sử dụng Al
2
O
3
và
B
2
O
3
ta có thể tạo ra các điện cực màng thủy tinh dùng xác định các cation hóa trị I
như Na
+

, K
+
, NH
4
+
…Nếu điện cực thủy tinh đo pH được phủ một lớp màng kị nước
thấm khí thì đầu đo sẽ xác định được các khí hòa tan hoặc các ion có thể chuyển
thành khí hòa tan. Các khí như CO
2
, NH
3
, H
2
S có thể khuếch tán qua màng và làm
thay đổi pH của dung dịch tùy thuộc vào nồng độ khí.
1.4.1.2 Điện cực so sánh
Điện cực so sánh là điện cực không tham gia phản ứng với bất kỳ thành phần nào
trong dung dịch cần khảo sát, phải thuận nghịch và tuân theo phương trình Nerst, phải có
điện thế không đổi theo thời gian và có thể lấy lại giá trị thế ban đầu sau khi có dòng điện
nhỏ chạy qua… Điện cực chuẩn thường là điện cực kim loại loại hai (kim loại M phủ một
lớp hợp chất ít tan MA của kim loại đó và được nhúng vào trong dung dịch muối có chứa
anion A có nồng độ xác định). Thông thường người ta thường sử dụng 2 loại điện cực
Calomel và điện cực Ag/AgCl làm điện cực so sánh.
 Điện cực Calomel: được tạo thành bởi kim loại Hg tiếp xúc với dung dịch chứa
muối Hg
2
Cl
2
bão hòa và KCl có nồng độ xác định (bão hòa hay 1M).
 Điện cực Ag/AgCl: được sử dụng rộng rãi để làm điện cực chuẩn thay cho

điện cực calomel. Nồng độ dung dịch KCl sử dụng là bão hòa hay 3.5M.
Chú thích:
a) Màng bán thấm
b) Thành phần sinh học
c) Màng thủy tinh
d) Điện cực thủy tinh đo pH
e) Điện thế giữa điện cực đo và điện cực so sánh
g) Dung dịch HCl
f) Điện cực đo Ag/AgCl
h) Điện cực so sánh

Hình 1.2: Cấu tạo của một biosensor enzyme đo điện thế
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 8
Ứng dụng của biosensor đo điện thế: dùng để đo nồng độ ure trong máu và nước
tiểu, đo nồng độ glucose, amino acid, amydalin, penicillin, adenosine, acetylcholine, kim
loại nặng, dư lượng thuốc trừ sâu, tổng chất độc (total toxicity), đo nồng độ anti-
dinitrophenol, anti-digoxin,
1.4.2 Biosensor đo cường độ dòng điện
Nguyên tắc hoạt động của biosensor đo cường độ dòng điện là xác định cường độ
dòng điện chạy qua mạch đo khi đặt một hiệu điện thế cố định giữa hai điện cực (điện cực
đo và điện cực so sánh). Khi đó cường độ dòng điện hàm của mật độ các hạt tích điện
trong dung dịch và điện thế đặt giữa hai điện cực. Bằng cách đo cường độ dòng điện, ta có
thể suy ra được nồng độ của các chất cần phân tích.
Cấu tạo transducer gồm điện cực so sánh thường là điện cực Ag/AgCl và điện cực
đo. Điện cực đo hiện nay đang được sử dụng rộng rãi là điện cực oxy và điện cực
hydroperoxyde.

Hình 1.3: Cấu tạo của một enzyme-based biosensor đo cường độ dòng điện đơn
giản (điện cực clark)
Ứng dụng của biosensor đo cường độ dòng điện: xác định nồng độ glucose,
polysaccharide, alcohol, lactate, amino acid,
1.4.3 Biosensor đo nhiệt
Hầu hết các phản ứng xúc tác sinh học là tỏa nhiệt, lượng nhiệt sinh ra (tính được
từ sự thay đổi enthalpy) thường tỉ lệ với hàm lượng chất cần phân tích, do đó dựa vào
lượng nhiệt này ta có thể đo được nồng độ chất cần phân tích.
Khi nhiệt lượng tỏa ra càng lớn thì độ nhạy phát hiện càng lớn. Do đó để tăng nhiệt
lượng tỏa ra, có thể cố định đồng thời 2 hoặc 3 enzyme (cũng có thể lên tới 4-5 enzyme).
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 9
Qua nghiên cứu ta thấy cứ 0.1 mM cơ chất chuyển hóa hoàn toàn thành sản phẩm
sẽ tạo ra 100 kJ/mol. Các thiết bị này phải luôn được đặt trong hệ thống cách nhiệt để giữ
môi trường ổn định nhiệt độ.
Các thiết bị có thể nhận dạng được sự thay đổi nhiệt độ là cặp nhiệt điện và nhiệt
điện trở.
1.4.3.1 Cặp nhiệt điện (thermocouples)
Cấu tạo của nó gồm hai dây dẫn nối với nhau nhờ mối hàn. Sức điện động E của
mạch phụ thuộc vào bản chất của dây dẫn và vào nhiệt độ T
1
, T
2
. Thông thường nhiệt độ
của một mối hàn được giữ ở giá trị không đổi và biết trước, gọi là nhiệt độ chuẩn T
1
=
T

ref
. Nhiệt độ của mối hàn thứ hai khi đặt trong môi trường nghiên cứu sẽ nhạy cảm với
sự thay đổi nhiệt độ của môi trường gây ra do phản ứng xúc tác bởi enzyme.
Ưu điểm: Kích thước nhỏ nên có thể đo nhiệt độ ở từng thời điểm và tăng vận tốc
đáp ứng, không phải kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ
Nhược điểm: độ nhạy với sự thay đổi nhiệt độ trong phản ứng enzyme khá thấp.
Nó được ứng dụng chủ yếu trong y học để đo nồng độ các chất trong máu.
1.4.3.2 Nhiệt điện trở (thermistor)
Nguyên lý hoạt động của nó là đo điện trở của kim loại, do điện trở đó thay đổi khi
nhiệt độ thay đổi.
Một ví dụ về phương pháp sử dụng enzyme – nhiệt điện trở:

Hình 1.4: Cấu tạo của biosensor đo nhiệt : a. Ống mao dẫn; b. Lớp vỏ áo nhiệt; c.
Thiết bị trao đổi nhiệt; d. Lớp cách nhiệt; e. Nhiệt điện trở so sánh; f. Cột chứa
enzyme; g. Nhiệt điện trở đo; h. ống mao dẫn; i. Nguồn điện.
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 10
Cơ chất được đi vào thiết bị trao đổi nhiệt rồi qua cột enzyme để phản ứng với
enzyme và giải phóng ra nhiệt, nhiệt độ giải phóng ra sẽ được đo bởi nhiệt điện trở so
sánh. Kết quả đo được sau đó đi ra qua bộ xử lý để thu nhận tín hiệu.
Mối quan hệ giữa điện trở và nhiệt độ được xác định theo phương trình:

Trong đó R
1
: điện trở của nhiệt điện trở so sánh, R
2
: điện trở của nhiệt điện trở đo,
T

1
: nhiệt độ của mẫu sau khi qua bộ phận gia nhiệt, T
2
: nhiệt độ của mẫu sau khi qua cột
enzyme, B: Hằng số nhiệt độ của nhiệt điện trở.
Sự thay đổi điện trở giữa thermistor đầu vào và đầu ra sẽ được chuyển thành độ
chênh lệch điện thế thông qua cầu cân bằng Wheatstone.
Ưu điểm của biosensor sử dụng nhiệt điện trở là nó đơn giản, được sử dụng khá
phổ biến, độ nhạy với sự biến đổi nhiệt độ phản ứng (nhất là trong phản ứng enzyme) lớn
hơn so với cặp nhiệt điện, có thời gian đáp ứng nhanh và kích thước nhỏ gọn. Tuy nhiên
khi sử dụng biosensor kiểu này có thể gây sai số lớn nếu không đảm bảo hằng số nhiệt độ
của nhiệt điện trở giống nhau ở thermistor so sánh và thermistor đo.
Ứng dụng của biosensor đo nhiệt thường dùng trong công nghệ sinh học để định
lượng ADP, ATP, glucose,…
1.4.4 Biosensor áp điện:
Nguyên lý của loại biosensor này là dựa vào sự dao động của các tinh thể. Các chất
điện môi tự nhiên như thạch anh, tuamalin, hoặc nhân tạo như liti sulfat, thạch anh tổng
hợp… dao động khi chịu tác động của từ trường. Tần số dao động của tinh thể phụ thuộc
vào độ dày và sự biến dạng của tinh thể, mỗi tinh thể có một tần số dao động đặc trưng.
Tần số dao động này thay đổi theo sự hấp thụ hay nhả hấp thụ từ bề mặt tinh thể, thông
thường nó sẽ tăng khi có tạp chất hấp thu lên trên bề mặt của tinh thể. Đo tần số dao động
sẽ biết được nồng độ của cơ chất cần đo.
Tần số dao động được tính theo công thức:

trong đó: F: Chênh lệch tần số dao động (Hz),F
o
: tần số dao động cộng hưởng của tinh
thể (MHz) m: chênh lệch khối lượng của chất hấp thu (g), A: diện tích bề mặt hấp thu
(cm
2

).
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 11
Với công thức trên, có thể ước lượng rằng khi tần số cộng hưởng của tinh thể sử
dụng là 9MHz thì độ nhạy của phép đo là 400 Hz/µg. Tinh thể thạch anh có tần số cộng
hưởng 9Mhz thưòng được sử dụng nhất, nó rộng khoảng 15 mm và dày 0.15 mm, có hình
dĩa, khối vuông hay tam giác. Trên mỗi mặt của tinh thể được phủ lớp kim loại mỏng dày
từ 0.3 – 1 mm, lớp này sẽ đóng vai trò là điện cực, đó có thể là vàng, bạc, nhôm hay
niken, cuối cùng là lớp mỏng bioreceptor được gắn lên bề mặt của điện cực.
Điện cực điện áp được dùng để đo amoniac, methane, lưu huỳnh dioxit và cơ chất
phosphate hữu cơ. Ta có thể dùng nó để xác định nồng độ formaldehyde nhờ
formaldehyde dehydrogenase hay xác định dư lượng thuốc trừ sâu vô cơ phospho vốn
kìm hãm enzyme xholinesterase.
Ưu điểm của nó là cho thời gian đáp ứng nhanh, nhỏ gọn và rẻ tiền. Tuy nhiên nó
không được dùng để phân tích mẫu dạng lỏng, dễ bị hư hỏng do độ ẩm không khí.

Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo của enzyme-based biosensor điện áp
1.4.5 Biosensor quang
Nguyên tắc hoạt động của biosensor quang như sau: Dung dịch phân tích được tiếp
xúc với màng và khi phản ứng ở bioreceptor xảy ra thì sẽ có hiện tượng ánh sáng bị hấp
thụ hoặc phát ra ánh sáng màu. Người ta có thể xác định được hàm lượng các chất của
mẫu phân tích thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng hoặc sự phát quang ánh sáng của
các chất tạo thành do phản ứng xúc tác bởi enzyme.
Cơ sở của kiểu điện cực quang là sự kết hợp các sợi dẫn ánh sáng với phép trắc
phổ quang, phép trắc huỳnh quang, hoặc phép đo phản xạ quang. Nó có khả năng chỉ báo
những thay đổi của các thông số quang học, chẳng hạn như sự hấp thụ ánh sáng, chiều dài
bước sóng hoặc chỉ số phản xạ trong môi trường đo bao quanh sợi dẫn. Những thiết bị
này gắn vào hoặc là sợi đơn hoặc là chùm sợi kép để ánh sáng tới và chùm tia sáng được

đo.


TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 12
1.4.5.1 Điện cực đo phản xạ quang
Điện cực này hoạt động theo nguyên tắc: năng suất phản xạ từ mặt phản xạ tuân
theo phương trình: ,%
0
0
I
I
RR 
trong đó R- năng suất phản xạ, R
0
-hằng số phản xạ của môi trường chuẩn, I-cường độ
của tia tới, I
o
- cường độ của tia phản xạ.
Mối quan hệ giữa R với nồng độ chất hấp thụ màu theo phương trình:


R
RK
C
2
1
2





trong đó C-nồng độ chất hấp thụ, K-hằng số hấp thụ, e- hằng số tán sắc
Kĩ thuật này được dùng để định lượng glucose trong máu nhờ thuốc hiện màu MBTH (3-
methyl-2-benzotiazolinon) và DMAB (3-dimethyl-aminobenzoic acid). Hai enzyme
glucoxydase (GOD) và peroxydase được cố định bằng cách hấp thụ lên bề mặt tấm nền đã
phủ thuốc nhuộm. Khi mẫu phân tích tiếp xúc với tấm nền thì phản ứng xảy ra như sau:
Glucose
m
aãu
+ O
2
GOD
Acid Gluconic
+
H
2
O
2
+
+
MTBH
DMAB
MTBH-DMAB (maøu xanh)
peroxydase
H
2
O

2

Nếu H
2
O
2
có nồng độ cao thì phải dùng enzyme catalase. Mẫu phân tích sau đó
được đem đo năng suất phản xạ ở bước sóng thích hợp và từ đó sẽ tính được hàm lượng
glucose.
Với biosensor dựa trên nền tảng của sự phản xạ toàn phần (total internal reflection
– TIR) thì bề mặt dây dẫn được phủ kháng thể, sẽ tiếp xúc với mẫu phân tích. Khi sóng
ánh sáng đi đến lớp màng nhạy thì chỉ có một phần nhỏ sóng ánh sáng bị hấp thụ vào
trong môi trường, còn tất cả chúng bị phản xạ lại nhiều lần và dần dần nguồn sáng bị suy
giảm. Dựa vào lượng ánh sáng phản xạ, ta có thể tính được hàm lượng mẫu phân tích.

Hình 1.2: Biosensor dựa trên hiện tượng phản xạ toàn phần
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 13
1.4.5.2 Điện cực đo phát quang
Nguyên tắc hoạt động của điện cực này là: cơ chất tác dụng với enzyme cố định để
tạo thành sản phẩm có khả năng phát ra ánh sáng màu. Đo ánh sáng màu đó ở một bước
sóng nhất định sẽ suy ra được nồng độ cơ chất.
Dựa vào đặc tính này, người ta thường sử dụng nó để xác định các vi khuẩn trong
thực phẩm. Khi các vi khuẩn tác dụng đặc hiệu với ATP và D-luciferin dưới tác dụng của
enzyme luciferase sẽ tạo thành oxyluciferin, AMP. Pyrophosphate, CO
2
và ánh sáng vàng
đo được ở bước sóng 562nm. Từ đó xác định lượng vi khuẩn có mặt trong thực phẩm.

1.4.6 Biosensor enzyme
Biosensor enzyme là biosensor sử dụng enzyme làm bioreceptor. Enzyme này sẽ
xúc tác cho phản ứng chuyển cơ chất thành sản phẩm mà transducer có thể định tính và
định lượng được. Nồng độ chất phân tích sẽ được xác định dựa vào tín hiệu transducer có
được. Enzyme sử dụng có thể ở dạng hòa tan trong dung dịch hoặc ở dạng màng cố định
lên transducer. Tất cả các loại transducer nhắc đến đều có thể gằn với màng enzyme.
1.4.7 Biosensor miễn dịch:
Biosensor miễn dịch là biosensor sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên làm
bioreceptor. Nguyên tắc hoạt động của nó là dựa vào tín hiệu sinh ra khi có sự tương tác
giữa các kháng nguyên – kháng thể.
Mỗi kháng thể là một protein hình chữ Y, gồm 4 chuỗi polypeptide, trong đó có
hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ liên kết với nhau bởi các cầu disulfite. Một phần cấu trúc
của các chuỗi là cố định, nhưng các phần đầu mút của hai nhánh chữ Y lại biến đổi và tạo
nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng với các chất hóa học khác gọi là kháng
nguyên. Kháng nguyên là các “chất lạ” có bản chất protein hay hydrat cacbon.
Phản ứng kháng nguyên – kháng thể được xác định bằng nhiều cách, trong đó có
kĩ thuật ELISA (enzyme linked immunosorben assay: kĩ thuật hấp thụ miễn dịch có gắn
enzyme).
1.4.8 Biosensor vi sinh vật
Biosensor vi sinh vật tạo thành khi gắn vi sinh vật với transducer co thể phát hiện
(dò tìm và nhận biết) được quá trình trao đổi chất. Vi sinh vật có hệ enzyme tác động đến
sự chuyển hóa sinh học. Ưu điểm khi dùng vi sinh vật làm bioreceptor là khi cố định vi
sinh vật lên transducer, không cần phải tách chiết hay tinh sạch như enzyme, và do
enzyme được duy trì ở môi trường tự nhiên nên tránh được vấn đề như tái sinh cofactor.
Vi sinh vật được cố định bởi phương pháp vật lí như cố định trong gel, hay màng thẩm
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 14
tách. Transducer có thể là điện cực đo điện thế hay điện cực đo cường độ dòng điện vì có

sẵn màng thấm khí kị nước (teflon hay silicone). Vi sinh vật được cố định nằm giữa màng
này và màng thẩm tách. Ngược lại với biosensor enzyme, khi vi sinh vật được cố định thì
biosensor này phải được giữ ở canh trường cơ bản để giữ hoạt tính.
Mặc dù biosensor vi sinh vật có nhiều ứng dụng to lớn nhưng việc chế tạo nó lại
gặp nhiều khó khăn. Nó phải đáng tin cậy, độ lặp lại cao, và duy trì được hoạt tính của hệ
enzyme. Sự phát triển của vi sinh vật rất khó kiểm soát do nó còn phụ thuộc vào nhiều
thông số hóa lí khác. Hơn nữa, màng dùng để cố định vi sinh vật không đủ cứng để chứa
số lượng vi sinh vật ngày càng tăng dẫn đến sự rò gỉ tế bào ra ngoài môi trường.
1.5 Cách sử dụng biosensor
1. 5.1 Xác định trực tiếp trong môi trường mẫu. Phương pháp gián đoạn
Đặt mẫu trong tế bào đo (measuring cell) để biosensor được hoạt động trong điều
kiện bình thường (đặc biệt là pH và nhiệt độ).
Điện cực so sánh, như điện cực calomel chuẩn (SCE) được đặt kế bên điện cực đo
(ví dụ điện cực enzyme). Điện cực so sánh có thể kết hợp với điện cực làm việc, như
trường hợp điện cực thủy tinh cảm biến pH. Các điện cực nối với millivolt kế
(millivoltmeter) để đo điện thế hay với potentiostat để đo cường độ dòng điện. Hệ thống
nối với recorder kiểm soát độ ổn định của biosensor và quá trình tiến tới trạng thái ổn
định của đường cong đáp ứng. Recorder có thể thay bằng bộ xử lý dữ liệu thể hiện đường
cong đáp ứng và liên hệ trực tiếp với nồng độ chất phân tích, do đó làm tăng tốc độ đo.
Trong phương pháp này, nếu thể tích mẫu đem phân tích quá nhỏ, sự tiêu thụ cơ
chất bởi biosensor enzyme có thể gây lệch đường cong đáp ứng. Phép đo trực tiếp trong
môi trường mẫu thường chỉ sử dụng khi thiết kế biosensor, nghiên cứu thời gian đáp ứng
và dựng đường chuẩn. Nhược điểm: không thể đo liên tục, và thường đo bằng thủ công.
1.5.2 Flow injection analysis (FIA)
Khi chất phân tích là chất lỏng đang chảy thì FIA được sử dụng. Hợp chất có thể
tách khỏi những yếu tố gây nhiễu trước đó, tùy thuộc vào tính đặc hiệu của detector.
Phương pháp tách thường thực hiện bằng kỹ thuật sắc ký, như HPLC. Tuy nhiên, khi
biosensor có độ chọn lọc cao thì không cần tách. Nếu thể tích mẫu rất lớn, hợp chất có thể
được xác định trực tiếp như chất lỏng đang chảy. Cách khác, mẫu được tiêm trực tiếp với
lượng nhỏ vào chất lỏng mang chảy liên tục mà không cần phân đoạn không khí (air

segmentation), đây là nguyên tắc cơ bản của FIA. Bọt khí không được thêm vào dòng
chất mang của FIA, mặc dù nó cần phối trộn các chất trước. Mẫu lỏng được cho vào
thông qua injection valve, loop với lượng thể tích biết trước và chuyển đến biosensor.
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 15
(a) Xác định cơ chất:
Xác định cơ chất của phản ứng enzyme bằng biosensor kết hợp với FIA thường
đơn giản. Cơ chất chỉ đơn giản được tiêm vào dòng chất mang qua van tiêm (injection
valve). Cơ chất được phát hiện và xác định khi nó tiếp xúc với biosensor.
Hệ thống FIA gồm có 2 bơm điều khiển bằng máy tính (để vận chuyển chất mạng
và inject mẫu), injection valve với loop (lần lượt nhận mẫu và chất mang), biosensor,
detection cell, và linking tubes có đường kính trong 0.5 – 1 mm.
Không giống như phương pháp gián đoạn, đường cong đáp ứng không bao giờ
được tới đường thẳng (ứng với trạng thái ổn định) nhưng lại có dạng peak với chiều cao
tương ứng với nồng độ chất phân tích. Nồng độ trong mẫu được xác định bằng cách so
sánh với dung dịch chuẩn biết trước (dung dịch này được inject vào cùng điều kiện).
FIA có ưu điểm là làm việc với lượng mẫu nhỏ (25 – 200µl) và tốc độ bị giới hạn
bởi thời gian đáp ứng của biosensor. Nếu tốc độ mẫu đi qua biosensor được xem là hằng
số, thì đáp ứng của biosensor nhanh sẽ làm cho chiều cao peak cao hơn trong FIA, cải
thiện được tín hiệu.
(b) Xác định chất ức chế:
Việc xác định chất ức chế của phản ứng enzyme cần sự có mặt của cơ chất. Có 2
khả năng:
- chất ức chế được tiêm (inject) vào dòng chất mang chứa cơ chất
- hay cơ chất được tiêm vào dòng chất mang chứa chất ức chế.
Phương pháp thứ nhất chỉ thực hiện khi phản ứng ức chế nhanh (ví dụ, sự ức chế
urease bởi fluoride ion) và có nhược điểm là tiêu thụ cơ chất nhiều.
Phương pháp thứ hai: được sử dụng rộng rãi hơn vì tính ức chế thường chậm, đặc

biệt ức chế không thuận nghịch. Phương pháp này làm thuận tiện quá trình “ủ” enzyme
khi có mặt chất ức chế và phản ứng hoạt hóa của nó bằng chất hoạt hóa. Hệ thống này
thường đòi hỏi ít cơ chất hơn, kinh tế hơn. Kỹ thuật này thường áp dụng đo
organophosphate (azinphos, bromophos, dichlorovos, fenitrothion, malathion, paraoxon,
và parathion) và carbamate (carbofuran và carbaryl) với detection limit là 0.5 – 275 ppb.
Hệ thống cũng được dùng khi xây dựng đường chuẩn. Đầu tiên, cho chất mang
(không có chất ức chế) đi qua detection cell để có peak so sánh tương ứng với tín hiệu cao
nhất. Một loạt dung dịch với nồng độ chất ức chế khác nhau để đạt được tín hiệu tương
ứng với phần trăm ức chế.
Phần trăm ức chế được tính:
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 16

1
% 100
o
o
E E
I x
E


với E
o
là chiều cao peak so sánh trước khi có chất ức chế và E
1
là chiều cao peak sau khi
có chất ức chế.

1.6 Các lĩnh vực ứng dụng của biosensor
Từ những cuộc nghiên cứu mở đầu của Clark và Lyon “làm thế nào để điện điện
hóa thông minh hơn’’ vào năm 1962, Updike và Hicks năm 1967, biosensor ngày càng
phát triển và được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong lĩnh
vực y học, công nghệ thực phẩm và môi trường.
Trong y học, đa số biosensor sử dụng là biosensor enzyme, nó được dùng để phát
hiện và chẩn đoán bệnh tật. Ngày nay nó còn là công cụ hữu hiệu để chăm sóc sức khỏe
tại nhà với rất nhiều tính năng tốt. Điển hình nhất là biosensor đo nồng độ glucose trong
máu cho người bệnh tiểu đường, hoặc biosensor đo nồng độ ure trong máu dành cho
người mắc bệnh thận có ý nghĩa quan trọng. Nó là một loại thiết bị cầm tay với loại chip
chế tạo trên cơ sở của điện cực chọn lọc ion và điện cực đo dòng điện, kích thước nhỏ, dễ
mang theo, tiện sử dụng, giúp cho người bệnh có thể sử dụng ở bất cứ nơi nào khi cần.
Trong lĩnh vực môi trường, biosensor tỏ ra là một công cụ hữu hiệu để đo các chất
độc hữu cơ, vô cơ trong nguồn nước để có biện pháp xử lý nước thích hợp như kim loại
nặng, các loại thuốc trừ sâu, vi sinh vật, chỉ số BOD,… Biosensor vi sinh vật là hay sử
dụng nhất với thời gian phân tích khá ngắn (khoảng 15 phút).
Trong ngành thực phẩm, việc kiểm tra chất lượng thực phẩm dựa trên các phương
pháp truyền thống thường mất nhiều thời gian từ vài giờ đến vài ngày. Nhưng với kỹ
thuật dùng biosensor đã mang lại cho ngành công nghiệp thực phẩm một thiết bị theo dõi
và đo lường nhanh, độ nhạy cao, sử dụng thuận lợi hơn so với những phương pháp truyền
thống, trong đó biosensor đã được ứng dụng để kiểm soát thành phần các chất dinh
dưỡng, số lượng vi sinh vật, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc kháng sinh, kim loại nặng trong
thực phẩm cũng như kiểm soát một số quá trình lên men.


TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 17
PHẦN 2

ỨNG DỤNG CỦA BIOSENSOR TRONG PHÂN TÍCH
THÀNH PHẦN THỰC PHẨM
Đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để xác định các thành phần hợp chất
trong thực phẩm như phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử, phương pháp so màu, đo chỉ số
khúc xạ, phương pháp sắc ký và phương pháp quang phổ. Mặc dù những phương pháp
này có độ chính xác cao, đáng tin cậy nhưng nó khá phức tạp, tốn thời gian và cần nhiều
bước chuẩn bị, thiết bị đắt tiền và cần kỹ thuật viên có trình độ cao. Do đó, các nhà
nghiên cứu luôn nỗ lực tìm ra những phương pháp phân tích mới. Biosensor chính là một
trong những phương pháp phân tích giải quyết được các nhược điểm của những phương
pháp cũ và đáp ứng được yêu cầu của một phép phân tích nhanh, chính xác.
2.1 Kiểm soát chất lượng rượu vang
Rượu vang là hỗn hợp gồm hàng trăm hợp chất tồn tại đồng thời với nồng độ khác
nhau. Chất chiếm ưu thế hơn là nước, ethanol, glycerol, đường, acid hữu cơ, và những ion
khác. Ngoại trừ ethanol và glycerol; alcohol béo và có vòng, amino acid, và hợp chất
phenolic có nồng độ rất ít [4].
Glucose không chỉ là nguồn carbon cho quá trình lên men của nấm men mà còn là
cơ chất làm hạn chế sự phát triển của nó (do tạo ra áp lực thẩm thấu cao). Ethanol không
chỉ là sản phẩm chính của quá trình lên men ethanol mà còn là yếu tố ảnh hưởng đến sự
phát triển của nấm men. Hàm lượng ethanol sinh ra trong quá trình lên men từ khoảng vài
phần trăm đến 14%. Nếu trên khoảng này, ethanol sẽ ức chế hoạt động của enzyme và quá
trình lên men sẽ ngừng lại. Glycerol là sản phẩm thứ hai của quá trình lên men cồn, tạo ra
độ nhớt và vị ngọt cho rượu vang, ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của sản phẩm. Hàm
lượng glycerol tạo ra suốt quá trình lên men khoảng 1:10 so với alcohol, và nồng độ cuối
cùng trong sản phẩm là từ 1 – 10 g/l [4]. Do đó việc kiểm soát nồng độ các chất này trong
quá trình lên men cũng như trong sản phẩm cuối cùng là điều hết sức cần thiết.
2.1.1 Biosensor xác định hàm lượng glucose
Glucose có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau. Biosensor đo
cường độ dòng điện, biosensor đo điện thế, biosensor đo quang, biosensor đo nhiệt,
biosensor đo áp điện đã được ứng dụng trong xác định glucose.
Enzyme glucose oxidase là enzyme phổ biến nhất dùng làm bioreceptor. Nó xúc

tác phản ứng xảy ra như sau khi có mặt glucose và O
2
:
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 18

Do nồng độ glucose tỷ lệ với lượng O
2
tiêu thụ và lượng H
2
O
2
tạo ra nên có thể sử
dụng điện cực phát hiện O
2
hoặc H
2
O
2
có phủ màng enzyme glucose oxidase để xác định
nồng độ glucose.
2.1.1.1 Biosensor dựa trên phát hiện oxy hay H
2
O
2

Biosensor dựa trên việc phát hiện oxy đơn giản nhất là sử dụng điện cực oxy của
Clark làm điện cực làm việc.

Cấu tạo của điện cực Clark gồm một cathode Pt (nơi oxy bị khử) và một điện cực
so sánh Ag/AgCl. Cả hai điện cực được đặt vào chất điện phân là KCl bão hòa. Hệ thống
điện cực này được ngăn cách với môi trường nghiên cứu bằng một màng thấm khí kỵ
nước (bằng teflon hay polypropylen) chỉ cho oxy thấm qua. [1]

Hình 2. 1: Cấu tạo của điện cực Clark trong biosensor đo cường độ dòng điện; A - ống
bảo vệ; B – đầu để nạp điện thế; C – điện cực Ag/AgCl; D – dung dịch chất điện phân
KCl; E – điện cực Pt; F – màng chỉ cho oxy thấm qua; G – vòng chữ O để cố định màng;
H – màng enzyme
Khi đặt điện thế -0.65V lên điện cực Pt (so với điện cực Ag/AgCl), oxy khuếch tán
qua màng sẽ bị khử tại cathode theo phản ứng:
Ag anode: 4Ag
o
+ 4Cl
-
 4AgCl + 4e
-
Pt cathode: O
2
+ 4H
+
+ 4e
-
 2H
2
O
Khi điện cực oxy được phủ lớp màng enzyme oxidase và nhúng vào dung dịch
mẫu chứa cơ chất, một lượng oxy tiêu thụ cho phản ứng enzyme nên lượng oxy đi đến
Glucose + O
2

+ H
2
O Acid gluconic + H
2
O
2
(1)
GOD
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 19
điện cực bị giảm, cường độ dòng điện cũng giảm. Do đó, có thể nói, cường độ dòng điện
tỷ lệ nghịch với nồng độ cơ chất. Dòng điện được đo sau khi khuếch đại và được chỉ thị
trực tiếp bằng số hoặc biểu diễn dưới dạng nồng độ oxy hay áp suất riêng phần của oxy.
Thông thường, người ta còn sử dụng enzyme catalase đồng cố định với enzyme oxidase
để khôi phục lại một nửa lượng O
2
tiêu thụ. Chú ý: toàn bộ dung dịch tiếp xúc với
biosensor đều phải bão hòa oxy, và trước mỗi lần đo biosensor cũng phải được nhúng
trong dung dịch đệm bão hòa oxy cho đến khi tín hiệu ổn định thì mới đem nhúng sang
dung dịch chứa cơ chất [3].

Hình 2.2: Đường cong biểu diễn sự thay đổi cường độ dòng điện khi biosensor tiếp xúc
với mẫu chứa cơ chất của enzyme
Điện cực này có ưu điểm là không bị các thành phần khác trong dung dịch gây
nhiễu (do có màng bán thấm ngăn không cho các chất đến điện cực trừ O
2
) nhưng cũng có
nhược điểm là tín hiệu điện phụ thuộc vào nồng độ oxy trong dung dịch (do phải đảm bảo

dung dịch phân tích phải được bão hòa oxy trước) nên làm giảm tính chính xác và khả
năng tái sử dụng của phép đo, hơn nữa tín hiệu nền cao làm giới hạn phát hiện cao. Để
khắc phục nhược điểm đó, điện cực phát hiện H
2
O
2
được thay thế cho điện cực oxy [3].
Khi đặt điện thế là +0,65V lên điện cực Pt (so với điện cực Ag/AgCl). Pt sẽ đóng
vai trò là anode và tại anod xảy ra phản ứng sau:
H
2
O
2
 O
2
+ 2H
+
+ 2e
Dòng điện sinh ra tỷ lệ với lượng H
2
O
2
bị oxy hóa ở điện cực. Phương pháp này
phát hiện trực tiếp H
2
O
2
còn được gọi là “thế hệ thứ nhất” của biosensor.
Ưu điểm của điện cực này là nhỏ gọn, khoảng tuyến tính rộng [3].
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh

SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 20
2.1.1.2 Một số loại biosensor đo cường độ dòng điện khác
Ở “thế hệ thứ nhất” của biosensor, O
2
và H
2
O
2
là chất trao đổi điện tử với điện cực,
nhưng như thế sẽ phải đặt một điện thế khá lớn lên điện cực, điều này sẽ gây lệch kết quả,
nguyên nhân là do có một số hợp chất khác cũng bị oxy hóa ở điện cực cùng với H
2
O
2
.
Do đó, “thế hệ thứ hai” của biosensor là sử dụng mediator (chất vận chuyển điện tử trung
gian nhân tạo) làm chất trao đổi điện tử với điện cực, như thế sẽ giảm được điện thế đặt
vào điện cực (chỉ còn khoảng 0,19 V so với điện cực chuẩn) [1]. Mediator sử dụng nhiều
nhất là ferrocene. Phản ứng của nó như sau:

Hình 2. 3: Cơ chế vận chuyển điện tử nhờ mediator
FAD (flavin adenine dinucletide) là cofactor của enzyme glucoxidase, nó lấy điện
tử từ cơ chất và trở thành dạng khử FADH
2
, khi có ferrocene, FADH
2
bị oxy hóa trở lại
thành FAD. Trong quá trình ferrocene chuyển thành ferrocinium ion, điện tử được truyền

cho điện cực, làm sinh ra dòng điện.
Nhược điểm của mediator này là dạng ferrocinium ion rất dễ bị phân tán trong môi
trường mẫu do đó, để hạn chế điều này, người ta thường gắn mediator vào polymer dẫn
điện (ví dụ như polypyrrole) hay polymer không dẫn điện (ví dụ poly vinyl imidazole) –
thường được tạo ra từ các monomer tương ứng trên điện cực bằng phương pháp điện hóa.
Khi đó, tốc độ vận chuyển điện tử và độ bền của biosensor tăng, tránh thát thoát mediator
[26].
Ngoài việc sử dụng ferrocene làm mediator, người ta còn sử dụng kết hợp cặp
enzyme oxidase – peroxidase để phát hiện H
2
O
2
do peroxidase có khả năng trao đổi
electron trực tiếp với điện cực và có tính đặc hiệu cao đối với H
2
O
2
. Peroxidase sử dụng
nhiều nhất là horseradish peroxidase (HRP) do peroxidase này có khả năng vận chuyển
electron nhanh hơn các loại khác [26].
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 21


Hình 2. 4: Cơ chế vận chuyển electron khi sử dụng cặp enzyme oxidase – HRP
2.1.1.3 Screen-print biosensor để xác định hàm lượng glucose
Tuy đã sử dụng thêm enzyme HPR để cải thiện tốc độ vận chuyển điện tử nhưng
tốc độ này vẫn còn khá chậm, do đó, ta lại có thể sử dụng thêm mediator để tăng tốc độ

vận chuyển electron và giảm điện thế đặt vào. Đó là trường hợp của ví dụ này [8].
Screen-print là một kỹ thuật để chế tạo transducer điện hóa của biosensor.
Transducer được chế tạo bằng phương pháp screen-print được gọi tắt là screen-print
transducer. Cấu tạo của nó gồm “đường dẫn” Ag, điện cực carbon làm việc, điện cực
carbon đếm, và điện cực Ag/AgCl so sánh. Những điện cực này được in trên lớp màng
polymer (tùy theo từng trường hợp mà lớp màng này có thể khác nhau, trong trường hợp
chế tạo biosensor đo nồng độ glucose, người ta dùng màng polyethylen telephtarate) bằng
phương pháp screen-print. Một lớp màng cách điện sẽ được in trực tiếp lên điện cực trừ
những vùng xảy ra phản ứng enzyme. [7]

Hình 2. 5: Điện cực screen-print điển hình (kích thước của nó có thể thay đổi tùy từng
trường hợp chế tạo)
Biosensor sử dụng screen-print transducer được gọi là screen-print biosensor. Để
xác định nồng độ glucose trong sản xuất rượu vang, người ta sử dụng screen-print
e
Điện
cực
phân
cực
Cơ chất
S
ản phẩm

FAD
FADH
Oxidase

H
2
O

2

O
2

H
2
O
Fe
4+

Fe
3
+


Pero
xidas
e

TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 22
biosensor khi đồng cố định hai enzyme horseradish peroxidase (HRP) và glucose oxidase
(GOD) lên bề mặt điện cực carbon (điện cực làm việc) bằng cách tạo liên kết ngang với
glutaraldehyde (GA). Biosensor này rất tiện lợi, có thể chế tạo nhỏ gọn để cầm tay, chi
phí thấp, có thể chỉ dùng 1 lần, nhưng cũng đảm bảo được độ nhạy và chính xác của phép
đo.
Trước khi phân tích, dung dịch mẫu được hòa trộn với mediator (khoảng 0.1

mmol/dm
3
). Điện thế đặt vào điện cực làm việc là – 0,16V (so với điện cực Ag/AgCl).
Phản ứng xảy ra ở điện cực khi nhúng biosensor vào dung dịch mẫu được thể hiện trên
hình 2.6. Quá trình vận chuyển electron đến điện cực xảy ra do sự chuyển đổi giữa các
dạng oxy hóa và khử của các cặp chất và cuối cùng là cặp oxy hóa khử của mediator sẽ
đóng vai trò trao đổi electron trực tiếp với điện cực, làm sinh ra cường độ dòng điện tỷ lệ
với lượng glucose tham gia phản ứng. Bằng cách đo cường độ dòng điện và từ đường
chuẩn, ta có thể suy ra được nồng độ gluose trong mẫu.

Hình 2. 6: Cơ chế phản ứng xảy ra ở điện cực (ox: dạng oxy hóa, red: dạng khử)
Với biosensor như thế, ta có thể xác định được hàm lượng glucose trong nước nho,
hoặc rượu vang với khoảng tuyến tính 4,9 – 49,0 µmol/dm
3
.
2.1.1.4 Biosensor quang
Ngoài ra, người ta còn có thể sử dụng biosensor đo quang sử dụng phẩm lam Phổ
(Prussian blue – PB) [6].
Prussian blue là muối feri-ferocyanua của kali, natri hoặc amoni, có màu lam đậm.
Nó là chất xúc tác điện cho quá trình oxy hóa – khử của H
2
O
2
. Dạng khử của Prussian
blue (còn gọi là Prussian white – PW) có tác dụng xúc tác quá trình khử O
2
, và dạng oxy
hóa của nó lại có tác dụng xúc tác quá trình oxy hóa hydrogen peroxide [5].
Khi PB thay đổi dạng oxy hóa, nó sẽ thay đổi màu sắc. Bằng cách đo độ hấp thu
của lớp màng PB, ta có thể suy ra được nồng độ chất cần phân tích.

TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 23
Cấu tạo biosensor gồm có màng mỏng polyester, màng này có một mặt được bảo
vệ bằng đệm silicone và một mặt phủ bằng màng PB, cuối cùng màng enzyme glucose
oxidase phủ trên màng PB.
Trước khi tiến hành phân tích, màng PB sẽ bị khử thành dạng PW không màu bằng
cách cho vitamin C vào. Màng PW trong suốt không màu sẽ bị khử lại thành PB khi có
H
2
O
2
sinh ra trong phản ứng enzyme (phương trình (1)). Máy quang phổ sẽ đo độ hấp thu
của PB ở bước sóng 720 nm.



Hình 2. 7: Cơ chế hoạt động của biosensor đo quang xác định hàm lượng glucose
Biosensor có thể được lắp vào hệ thống FIA: tiêm mẫu (0,25 ml) vào dòng chất
mang chứa 0,01 M ascorbic acid với tốc độ dòng 2,25 ml/min. Nó khá đặc hiệu với
glucose, các chất khác như sulfate, phosphate, carbonate, actate, citrate đều không gây
ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
pH và tác nhân tái sinh (vitamin C) là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến việc
phân tích của biosensor. pH của dòng chất mang giảm thì độ nhạy tăng, do trong môi
trường acid H
2
O
2
là chất oxi hóa mạnh, vitamin C là chất khử yếu. Nhưng nếu pH quá

thấp thì sẽ làm biến tính enzyme, độ nhạy cũng giảm. Nếu pH > 8 sẽ có hiện tượng
enzyme bị phân hủy và làm trôi màng PB. Để tránh ức chế enzyme và làm hỏng màng
PN, ta nên dùng dung dịch đệm potassium actate pH 5,0. Ngoài ra trong dung dịch đệm
có chứa ion Kali nên sẽ giảm được thời gian “tái sinh” màng do cation kim loại có tác
dụng khử PB thành PW. Khi tăng hàm lượng vitamin C trong dòng chất mang sẽ làm
giảm độ nhạy của phép đo.
Thông số kỹ thuật của biosensor: biosensor trong hệ thống FIA có khoảng tuyến
tính là 0,1 – 1 mM, phân tích được 15 mẫu/h.
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 24
Bảng 2. 1: Kết quả phân tích nồng độ glucose (mM) trong một số loại nước uống bằng
biosensor và phương pháp quang phổ
Mẫu Biosensor Phương pháp quang phổ
Nước ép nho
95,1 1,3 93,7  3,7
Nước ép táo
135,0  1,3 134,1  5,6
Rượu vang đỏ
45,1 1,2 43,2  3,6
Rượu vang trắng
46,7  1,0 43,7  3,9
Coca - cola
76,7 0,3 77,3  3,2
Red Bull
216,4  2.4 216,6  8,7

2.1.2 Biosensor xác định ethanol
Nhiều loại biosensor đã được dùng để xác định hàm lượng ethanol trong mẫu, phổ

biến nhất là biosensor đo cường độ dòng điện hay biosensor đo điện thế với bioreceptor là
enzyme hay vi sinh vật.
Hai loại enzyme được sử dụng rộng rãi làm bioreceptor trong xác định ethanol là
alcohol oxidase (AOD) và alcohol dehydrogenase (ADH). [3]
Alcohol oxidase (AOD) có cofactor tự nhiên flavine adenine dinucleotide (FAD).
Nó thủy phân các alcohol phân tử thấp thành aldehyde với O
2
làm chất nhận điện tử. Do
bản chất oxi hóa mạnh của oxi mà quá trình oxi hóa alcohol bằng AOD là không thuận
nghịch. Phương trình phản ứng:

Cũng như trong trường hợp xác định glucose, hàm lượng ethanol trong mẫu tỷ lệ
với hàm lượng H
2
O
2
sinh ra và hàm lượng O
2
tiêu thụ. Do đó, ta có thể sử dụng điện cực
pH
2
O
2
và pO
2
gắn với màng enzyme AOD để xác định nồng độ ethanol trong mẫu.
Alcohol dehydrogenase (ADH) ổn định và đặc hiệu hơn so với AOD, nhưng nó lại
cần coenzyme là nicotinamide adenine dinucleotide (NAD
+
), dạng khử của nó (NADH)

RCH
2
OH + O
2
RCHO + H
2
O
2

AOD
TQTL ứng dụng biosensor trong KSCL thực phẩm GVHD: Vũ Thị Kim Hạnh


SVTH: Huỳnh Thuận Nữ 25
không bị oxy hóa bởi oxy, do đó, nó phải cần một số loại mediator để oxy hóa NADH
như flavine mononucleotide (FMN). Phản ứng xảy ra ở điện cực như sau:
CH
3
CH
2
OH + NAD
+
 CH3CHO + NADH + H
+

NADH + FMN + H
+
 NAD+ + FMNH
2

FMNH
2
 FMN + 2H
+
+ 2e
Điện cực sẽ nhận 2e này và sinh ra dòng điện trong mạch, dựa vào cường độ dòng
điện sinh ra, ta biết được nồng độ ethanol tương ứng. Mặc dù loại biosensor alcohol
dehydrogenase có thể loại trừ ảnh hưởng của oxy nhưng nó lại khá tốn kém và phức tạp
hơn biosensor alcohol oxidase do nó cần thêm co-enzyme tan là NAD
+
.
Các ví dụ điển hình để xác định hàm lượng ethanol được giới thiệu sau đây.
2.1.2.1 SIREbiosensor để xác định nồng độ ethanol trong rượu vang
Phương pháp này khác với phương pháp thông thường (phuơng pháp enzyme cố
định trên điện cực) là bioreceptor là enzyme tan, nó được bơm liên tục qua đầu điện cực
[9].
SIRE Biosensor P100 có 1 buồng phản ứng (buồng phản ứng) đặt trước transducer
đo cường độ dòng điện. Dung dịch đệm được bơm liên tục qua buồng. Buồng phản ứng
đặt ở đầu điện cực và bao bọc bởi màng bán thấm dùng để giữ bioreceptor bên trong
buồng phản ứng. Điện cực được nhúng vào dung dịch mẫu và phân tử mẫu sẽ khuếch tán
qua màng, vào trong buồng phản ứng. Bioreceptor được bơm cùng với dung dịch đệm,
giữ trong buồng phản ứng trong khoảng thời gian định trước, đo và sau đó được thải ra.
Nghĩa là bioreceptor chỉ được sử dụng 1 lần. Phản ứng xảy ra giữa bioreceptor và chất
phân tích bên trong buồng phản ứng sẽ tạo thành sản phẩm. Sản phẩm này sẽ bị oxi hóa
bởi điện cực, nơi có đặt hiệu điện thế. Đầu tiên, tín hiệu được đo sau thời gian phản ứng
định trước với sự có mặt của bioreceptor. Tín hiệu thứ hai sẽ được đo mà không có
enzyme, và đó là tín hiệu nền. Sự khác nhau giữa 2 loại tín hiệu này sẽ cho ta biết nồng độ
chất phân tích.
SIRE biosensor có thể đo được nhiều chất khác nhau như glucose, L- lactate,
sucrose, ethanol, methanol, hydrogen peroxide (H

2
O
2
), phenylalanine, galactose và
oxalate; thường ứng dụng trong dược, lên men, và công nghiệp thực phẩm. Trong những
trường hợp đó, những oxidase tương ứng kết hợp với catalase được dùng làm bioreceptor
trong SIRE biosensor P100 với quá trình oxy hóa hydrogen peroxide ở 650mV. Trong bài
này, alcohol dehydrogenase (ADH) từ Sacchromyces cerevisae được dùng làm
bioreceptor với sự có mặt của NAD
+
.