Nghiên cứu chế tạo bộ kit RT-PCR để chuẩn đoán virus lở mồm long móng (LMLM) đại diện đang lưu hành ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ





KIỀU MẠNH HÙNG




NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KIT RT-PCR ĐỂ
CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG
(LMLM) ĐẠI DIỆN ĐANG LƯU HÀNH Ở VIỆT NAM






LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ
NANO SINH HỌC

HÀ NỘI - 2012
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ





KIỀU MẠNH HÙNG




NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ KIT
RT-PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM
LONG MÓNG (LMLM) ĐẠI DIỆN ĐANG LƯU HÀNH
Ở VIỆT NAM


Chuyên ngành: Công nghệ Nano sinh học
Chuyên ngành đào tạo thí điểm



LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ
NANO SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. ĐỒNG VĂN QUYỀN




HÀ NỘI - 2012
MC LC
LI CAM AN
LI CM N
DANH MC VIT TT
M U 1
U 2
1.1 nh l m gii Vit Nam 2
1.1.1  gii 2
1.1.2 n bnh LMLM  Vit Nam 3
1.1.2.1 Lch s bnh 3
1.1.2.2 ch bnh trong nh 4
1.2 Bnh L m 6
1.2.1 c v bnh L m 6
1.2.2 c ca virus LMLM 7
1.2.2.1 u to 7
1.2.2.2 i 8
1.2.3 Kh n ti ca mm bu kin t  9
1.2.4 nh 9
1.2.5  9
1.2.5.1  9
1.2.5.2 Ngun bnh 10
1.2.6 nh 10
1.2.6.1 Ch 10
1.2.6.2 Chm 10

1.2.6.3 c 11
1.2.6.4 t thanh hc 11
1.2.6.5 Phn ng kt hp b th 11
1.2.6.6 Phn ng trun 11
1.2.6.7 Phn ng ELISA 12
1.2.6.8 -PCR 12
1.2.6.9 i dng loi
(phylogentic trees) 13
1.3 C gen ca virus LMLM 13
1.3.1  c gen ca virus LMLM 13
1.3.2  15
NG, VT LI
NU 16
2.1 u 16
2.2 Vt liu 16
2.2.1 Sinh Phm 16
2.2.2 t 16
2.3 u 17
2.3.1 t RNA tng s 17
2.3.2 t k mc hiu gen VP1 ca virus LMLM 17
2.3.3 hui gen VP1 bng RT-PCR 18
2.3.4  18
2.3.4.1 n sn phm RT- g 18
2.3.4.2 n np 19
2.3.4.3 t DNA plasmid t vi khun E. coli 20
2.3.4.4 Kim tra DNA plasmid bng enzym gii hn 21
2.3.5 Tng h 21
2.3.6 ng lom di truyn 22
3. 










 23
3.1 c RNA tng s ca virus LMLM t mu bnh phm 23
3.2 







-



 24
3.2.1 












(universal) 

P1 24
3.2.2 






















-PCR 25
3.2.3  26
3.3  gen VP1 26
3.3.1 T hp mang gen VP1 26
3.3.2 Gi  28
3.4 

  29




 31




31
U THAM KHO 32
PH LC 38

DANH MC VIT TT

Amp Ampicilin
Bp (bp) Base pair
Cre cis  acting replication element
DNA Acide Deoxyribonucleic
E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylen Dimine Tetra acetic Acid
ER Endoplasmic Reticulum

EtBr Ethidium Bromide
IRES Internal Ribosome Entry Site
IPTG Isopropyl   D  Thiogalactopyranoside
LB ng Lauria Betani
LMLM L m
OIE Ofice International Epidemiology
ORF Open Reading Frame
PCR Polymezase Chain Reaction
RGD Arginyl  Glycyl  Aspatic Acid
RNA Acide Ribonucleic
RT-PCR Reverse trancriptase  PCR
Sol I, II, III Solution I, II, III
TAE Tris  Acetae  EDTA
v/p 
WHO Who Health Orgnizations

1


Bnh l m t loi bnh truyn nhim cc k
nguy hing v
guc cht nhanh qua nhing
c tip ging vt v
 ch gii (OIE) xp bnh
truyn nhim nguy hinh truyn nhim  ng vt.







 


 


 

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




Hin nay vic ch nh phm thu ph
b kit mua ct hn ch trong vic ch 
ng bnh dt t 
a ch Nghiên cứu chế tạo bộ kit RT-PCR để chẩn đoán
virus lở mồm long móng (LMLM) đại hiện đang lưu hành ở Việt Nam
 c thc hin t m Vi sinh vt hc p, Vi
ngh sinh hc, Vin Khoa hc v Vit Nam.




2


1.1 nh l m gii Vit Nam

1.1.1  gii
Bt hin  nhic thuM La tinh
h-1985, dch xut hin  
n tht ln cho nn kinh t ca nh[8,9,10,58,63].  dch
xy ra  l t hi nng n v kinh t  li
hu qu xn trong nhic Nht B
Quc t t hin
b [17]. T     y ra     
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xy ra  Italia 1993[20]; Hy Lp 1994-1996;  
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3
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Myanmar, Philippines, Malaysia u nhng thit hi rt ln do dch
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1.1.2 n bnh LMLM  Vit Nam
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4
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9n tn ti mt s  d nh min
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nh LMLM ch xy ra  16 t vc bnh.
nh LMLM xy ra  26 ti c bnh.
nh LMLM xy ra  38 tch
ch  lnh dch xy ra  c n), vi
tng s n mc b c
bnh nhing Trc L.
/2004) dch xy ra  ng, 169 huyn, th ca
45 t trc thu,
22 tdch  ln, 16 tnh dch xy ra  c n), vi tng s 
c bu so v  v
din dch xy ra  n,  ng
m,      t kh       a ca
nhiu t    y ra d       d   a
 ho chng m ng,
u qu ch dch mt ch.
ch LMLM xy ra  ng ca 160 qun, huyn thuc 37

5
t gng, Ninh Thu
n Tre, TP.H  
     u Giang, Tin Giang, B    ng
Nam, Quc L
Qung Nam, Ngh An, Qu         
QuCai, H
c bnh.
  ch LMLM xy ra  nhi    c, hu h  nh
[24].
u dch t hc kt hp vi ch
 Vit Nam g
t dch trong nh
ph bin nht [22,35,60].        a t dch 2007
[24,38].
y ra tng ca 43 huyn, qun ca
14 tn mc bnh. Tng s 
n. 
Chnh: hu h dng
O12/2008 virus cht hin ti Ngh An.
y ra  ng thuc 87 huyn, qun ca 27 tnh,
 vi tng s c bnh 432 con phn
dch x ra  ng thuc 23 huyn, qun ca 16 t 
ln mc bnh LMLM, 429 con phy.
ch xt hi
d  dch gim dn. V chnh hu h dch LMLM
xng O; chng A xut hin  
La, B
y ra  c 103 huyn ca 28 t 
Bc Ninng, Bc C ng

              
Quc L
Rn Giang, S i tng
s c b
ph n b mc bnh LMLM, vi tng s 1.675 con ln mc bnh 848 con phi
y.
Dch x 2010 v d
 dch xut hich xi
nhiu 
T  -2011, b   y ra ti 2.873 (26% trong tng s
ng s ch thuc 463 (66,7% trong tng s 694)

6
huyn th ca tt c 63 t. Tng s n
b b [64].

1.2 Bnh L m
1.2.1 c v bnh L m
Bnh L mvit tbnh truyn nhim nguy him
c ng v c chn       [7,17]. S nguy
him ca b t nhanh, rt mnh. S  do tip
ng vt khe vng vt mc bu con ng k c
y bi dt hi v 
n kinh t i nhic thuc nhi gii. Do bnh
ng dch bn
c s ng c ca cng.
Bt hi l
s  t, l ng n   c b ng gi  ng, gim sn
ng sng vy c 
trin rt hit loi bnh nh l t vong thp

ngoi tr nhng con vt non, t 2-i v-50%  
n con.  n, by thai khong
ng va, sng sa ging sc
phi tri qua nhi c tp mi s dc. y s
thit hi v kinh t do bt trm trng [32]. Khi dch bnh xy
u qu ng cho nn kinh t v 
ng  khu vch  bt  v  2 bng A trong
danh mnh truyn nhim  
Bc xnh bt buc pht
 gic hoc xut khng
vt, sn phng vn ch xut khi quc gia
 giu phng bnh LMLM. Bnh
ng hu qu ng v t kinh to v
c x  nh truyn nhim nguy him c ng thi
c ghi trong hin chuyng vn phng vt
gi c.







7
1.2.2 c ca virus LMLM
1.2.2.1 u to
i virus nh nht thuc h Picornavirideae 
Aphthovirus,c 20-n 30 mu, ht virus cha
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8

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 nh [57], y phnh chng virus

9
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1.2.4 nh
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chung, chut Hamster d cm nhia chut lang r

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1.2.5 ng th
1.2.5.1 
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10
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1.2.5.2 Ngun bnh
Ngun bnh t  n chuy
ng vt n phng vm bnh.
Do s ting c
 t  i
Do vic vn chuyng vn phng vt t 
Do mm bnh LMLM tn ti    d
ng vm bnh truy
1.2.6 nh
1.2.6.1 Ch
Vic chnh s thc hing
hp bnh xy ra ti khu vc xch su chng

a b xut hic trong khoang mii, li), quanh
 i va, ln
u chn ng con vt b m
i gp nhing ln mc bnh d b t
n tring vu kin cho s
bi nhim th  c ch ng rt d b nhm
ln v ng mc, bnh mc  ln, bnh
ngoi bang, bnh t nh nhii tt
c s c bu hiu cht. Do
vy, cn kt hp v liu dch t   ch
1.2.6.2 Chm
T xy ra du ch 
ng nhnh trong vic ch,  t thit phi
 khng
nh bnh. Nh  i vi b   t phc tp v chng loi ca
      ng triu ch     ng li
o min dt
  
hng dch bu qu.
Loi tr 3 chng SAT1, SAT2, SAT3 ch  c
 gi n nay cn
ph

11
Trong thi k  bnh, phi ly mc hu ca bnh vt. Khi
 mch trong m nhng con v
lc huy n ng huyt thanh hnh hi
.
1.2.6.3 c
nh phm trong phm vi 

d mc bnh bao gi-
48 gi. Nu mu bnh phm mang virus LMLM s xut hin mc  ch 
   nh bh
nh ph-24 gi  i mn nh,
i nhit.
1.2.6.4 t thanh hc
n ng huyt thanh h ch nh
 ng virus mi vi
nhau hoc gi t
gia chnc tin ng
c ng nh loi. n ng 
 c t v tha  dch. Kt
qu cn ng huyt thanh hng r
 s tim ngun
gc ca  d nh
u ca mu dch t hc hii. Mt s
c s dng gm :
1.2.6.5 Phn ng kt hp b th
Phn ng kt hp b th c thc hin nh hai h thng: h thng dung khun
 thng dung huyt vi s tham gia ca b th.
Huyt thanh min dch ca tt lang: b
i min dch
t lang (mi type mt chut ) hai ln, mi l
lt huy.
c bnh LMLM honh phm cy
ng t  chc ly t tuyc ca ln, t 
hoc cu non ho  nh t
hii t y dn ng kt hp b th.
Phn ng kt hp b th n rt k  d
thc s n hu hi ch t gi


1.2.6.6 Phn 
   c hiu, s kt hp
gia virus v  c na.

12
Phn  ng hp bnh din ra  th nh
u kin ly mu bnh phci l .
Phn c thc hing t  chc nhn
thn ln hoc thn cu, hoc t u cm BHK-a
l nhh t thanh cc x  nhi 56
0
C
t
  a, c t
     m.  100TCID
50
(50% Tissue Culture Infectiou
Dose) ca virus trong th ng huyt thanh nghi  37
0
C trong
20-t. n hp dch c nhy t 
 a huyt thanh. c type virus
nh, tip tn   nh
hi  
Phn ng
 .
1.2.6.7 Phn ng ELISA
 hot ga 96 l  
vnh phm bi nghi (t con vt nghi b

bnh LMLM)
Phn ng ELISA trc ti 
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 nhy ln ch  ng
cho tt c i mu bnh phm [7,25,51]. -PCR hioc

13
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ca virus dn ng RT-PCR s dp mc hiu.
1.2.6.9    i d     ng loi
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VP1[42,57], nh c quan h di truyn
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t dch LMLM  t dy
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lo ngi v i du [55,57].
1.3 C gen ca virus LMLM
1.3.1  c gen ca virus LMLM
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h gen RNA s tt vng nh
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(nucleotide), m  100 nt-
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ng h gen mu qu [6].

14

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ng nht ca b t bi 3B, 3B mt
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15
1.3.2 
H gen cng 8.2kb bao g
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trong vic virus LMLM t nh vt ch
thng min dch s bo v. S 
gi  l  
       

[34,37,44].
M v s bii  m gen ca
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ng s  c Vit Nam
 ra r Vi
mt s bii v  
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c ng s c
p  Vi
u thuc chi Mya-98. 
nh thu ng rt cao vi chi dch
LMLM  Trung Qu 












16
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
2.1 u
Mu bnh phm nhinh l m(Bng 2.1) do Trung

p.
Bng 2.1. u bnh phm virus LMLM s dng
u

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1
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
2
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

3

SimaCai




4
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ng Phn
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
5
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
n
ng Chanh

6


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ng Chanh

7
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
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8
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

9
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Khe Gy

10



ng Tanh

u RNA cn, g
1 do Vim dc cung cc s d
chu c 
2.2 Vt liu
2.2.1 Sinh Phm
- S dng b sinh phm Super Script
TM
OneStep RT- thc
hin phn ng RT-PCR.
- B sinh phm TA cloning Kit c 
- B sinh ph       tinh sch DNA
plasmid.
- B sinh phn BigDye
R
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
 gi gen.
2.2.2 t
u : IPTG, ethanol 100%, Acetat natri,

phenol, chloroform, isopropanol, SDS, MgCl
2
, EDTA, X-gal, Trypton, cao nm men,
Agarose, NaCl, Agar,t tinh khic s du v sinh
hc cung cp b

17
2.2.3 Trang thit b 
c lc n nhit 37
0
y t (Rotoab, OSI); T l-
20
0
C  -80
0
C (Sanyo, Nht Bn)  y tr     
(Speed Vac Se 110A- (Hewlett Parkrd, Mp
         n di DNA (Advance
Tech, Nht Bn); T cng ( Sanyo); Ni kh t B
l
i.
2.3 u
2.3.1 t RNA tng s
 sau:
- B sung l dung dn dc bt hot
ngay sau thi thu mu) trong 400 
-   nhi 
-  4
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C.

- Chuyt ng Eppendorf mi (vng khong 400l).
- B sung 0,5 ml Isopropanol.
-   nhi 
-  4
0
 thu ta RNA.
- Ra ta li bng 1 ml Ethanol 70%.
-  4
0
C.
-  .
- i cn RNA trong 20 i RNase.
2.3.2 thit k mc hiu gen VP1 ca virus LMLM
     u g          
LMLM ch yu  Vit Nam trong nh
  t c
s thit k p mc hi ch virus LMLM. Cp mc hiu cho
 Vic thit k b
gen VP1 ca 40 chng virus   (Ph lc 2), s dng
phn mm ClustalX. Cp mi chung (universal primers) VN-VP1F/VN-c
thit k do th  
VP1F: 5` - GYGCYGGYAARGAGTTTGA - 3`
VP1R: 5` - CATGTCYTCYTGCATCTGGT - 3`
 c s dng  A/G).


18
2.3.3 i gen VP1 bng RT-PCR
Phn ng RT-PCR bao gn:
n 1: To cDNA t  


 t. cDNA c tng
hp t c ch chit nh enzyme phin m c (reverse transcriptase).
 to cDNA chng t  b kit SuperScript
TM
(Invitrogen) s dng mi Oligo
dT v   5-CTGTGAATGCTGCGACTACGATTTTTTTTTTTTTTTTTTT-
3. n phn u kin tng hp cDNA  tinh sch,
    i RNase    mi loi   mi oligo dT
  
TM
II RNase H-   
  ca 5x first strand buffer. Phn ng tng hp cDNA
c thc hin  trong 60   5 .


 1 

 cDNA. 
1 




VP1

1R. 




():
Bng 2.2. n phn ng PCR khui gen VP1
n
N
Th l)
c kh 

16
Dung dm cho Taq
10X
2,5
dNTP
2,5 mM
2,5
VP1F
10 pmol/l
1,0
VP1R
10 pmol/l
1,0
Taq DNA polymerase
5U/l
1,0
cDNA 
100 ng
1,0
Tng th 

25
y PCR: -  ( 

  )  1 



  n phm






 2.1 (Invitrogen)   b
 DNA t ng (model 3730; Applied Biosystems) s dng kit BigDye
terminator cycle sequencing (Applied Biosystems).
2.3.4 
2.3.4.1 n sn phm RT- 
 to n gen VP1 cn trc tip sn
phm RT-pCR2.1 (invitrogen). n phn ng  (Bng 2.3)



19
Bng 2.3. n phn ng ni sn phm RT-
n
Th 
H
2
0
4l
Dung dm cho T4-ligase

1 l
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