Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo cây hoa Kiết tường, sử dụng Alginate chiếu xạ

1


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Thầy-Tiến sĩ Lê Quang Luân đã tận
tình dạy dỗ, giúp đỡ và hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Em
xin cảm ơn những kiến thức, những kinh nghiệm cũng như những kĩ năng quí báu
mà thầy đã truyền đạt để em có thể tự tin hơn trên con đường nghiên cứu khoa học.
Em xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại Học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm
Khoa Chế biến và bộ môn Công Nghệ Sinh Học và quý thầy cô đã dạy dỗ và tạo điều
kiện cho chúng em học tập tốt trong suốt bốn năm học qua.
Xin cảm ơn các cô chú, anh chị Phòng Sinh học, Trung tâm Hạt nhân Thành
phố Hồ Chí Minh đã luôn tạo điều kiện và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Cảm ơn những người bạn đả luôn giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn trong
suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Cuối cùng, con xin cảm ơn ba má, cảm ơn gia đình và những người thân yêu
luôn quan tâm, thương yêu và động viên con.








2

MỤC LỤC

Trang
Trang bìa phụ
Lời cảm ơn 1
Mục lục 2
Danh mục viết tắt 6
Danh mục bảng 7
Danh mục biểu đồ 8
Danh mục hình 9
Lời mở đầu 10
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11
1.1. Giới thiệu về cây hoa Kiết Tường 12
1.1.1. Vị trí phân loại và nguồn gốc 12
1.1.1.1. Vị trí phân loại 13
1.1.1.2. Nguồn gốc 13
1.1.2. Những tiềm hiểu về nhân giống Kiết Tường 13
1.1.2.1.Nhân giống bằng hạt 13
1.1.2.2. Phương pháp giâm cành 14
1.1.2.3. Phương pháp nhân giống in vitro 14
1.2. Khái quát về nuôi cấy mô thực vật 16
1.2.1. Lịch sử phát triển và các thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô 16
1.2.2. Các phương pháp nuôi cấy in vitro 17
1.2.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 17
1.2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo 17
1.2.2.3. Nuôi cấy phôi 18
1.2.3. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 19
1.2.3.1. Một số thành phần chính trong môi trường nuôi cấy
mô tế bào thực vật 19
1.2.3.2. Các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào
thực vật 20

3

1.3. Sản xuất hạt nhân tạo 22
1.3.1. Lịch sử phát triển 22
1.3.2. Nghiên cứu vỏ bọc hạt nhân tạo 22
1.3.2.1. Bọc vỏ và làm khô hạt 23
1.3.2.2. Bảo quản và làm nảy mầm hạt nhân tạo 23
1.3.2.3. Hệ thống cấy chuyền hạt nhân tạo 24
1.3.3. Vật liệu tạo hạt nhân tạo 25
1.3.3.1. Giới thiệu chung về Alginat 25
1.3.3.2. Đặc điểm cấu tạo và các tính chất của Alginic 26
1.3.3.3. Cơ sở khoa học tạo vỏ bọc hạt nhân tạo từ Alginat 27
1.4. Công nghệ bức xạ - ứng dụng trong nuôi cấy mô thực vật 30
1.4.1. Công nghệ bức xạ 30
1.4.1.1. Giới thiệu chung 30
1.4.1.2. Các ứng dụng 30
1.4.1.3. Một số ưu điểm của công nghệ bức xạ 31
1.4.2. Ứng dụng công nghệ bức xạ trong nuôi cấy mô thực vật 31
1.4.2.1 Oligosacarit (chất điều hòa sinh trưởng mới) 31
1.4.2.2. Một số loại oligosacarit 33
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 36
2.1. Vật liệu 37
2.1.1. Mẫu thí nghiệm 37
2.1.2. Môi trường nuôi cấy 37
2.1.3. Điều kiện nuôi cấy 37
2.1.3.1. Địa điểm thực hiện đề tài 37
2.1.3.2. Phòng nuôi cấy 37
2.2. Phương pháp thí nghiệm 38
2.2.1. Chế tạo và khảo sát đặc trưng của hạt chế tạo được 38

2.2.1.1. Chế tạo và khảo sát đặc trưng của hạt chế tạo được
từ alginate không chiếu xạ 38

4

2.2.1.2. Chế tạo và khảo sát đặc trưng của hạt chế tạo được từ
alginate không chiếu xạ kết hợp alginate chiếu xạ (300kGy) 39
2.1.1.3. Chế tạo và khảo sát đặc trưng của hạt chế tạo được
từ alginate kết hợp chitosan chiếu xạ (0,1%) 39
2.2.2. Khảo sát quá trình tạo chồi của cây Kiết Tường
làm nguyên liệu để chế tạo hạt nhân tạo 40
2.2.2.1. Khảo sát quá trình tạo chồi từ lá 40
2.2.2.2. Khảo sát quá trình tạo chồi từ chồi 41
2.2.2.3. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh
cây Kiết Tường 41
2.2.3. Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ chồi 42
2.2.3.1. Khảo sát ảnh hưỏng của thời gian đông tụ
hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 42
2.2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl
2

lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 43
2.2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate lên
khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 44
2.2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate 4%
kết hợp alginate chiếu xạ (300kGy) lên khả năng
tạo hạt nhân tạo từ chồi Kiết Tường 44
2.2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat 44
kết hợp chitosan chiếu xạ 0.1% lên khả năng
tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 46

2.2.4. Phương pháp xử lí thống kê số liệu 46
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 47
3.1. Chế tạo và khảo sát đặc trưng của hạt chế tạo được 48
3.1.1. Chế tạo và khảo sát đặc trưng của hạt chế tạo được
từ alginate 48
3.1.2. Chế tạo và khảo sát đặc trưng của hạt chế tạo được từ
alginate kết hợp alginate chiếu xạ 52

5

3.1.3. Chế tạo và khảo sát thời gian đông tụ của hạt chế tạo
được từ alginate kết hợp chitosan chiếu xạ (0,1%) 53
3.2. Khảo sát quá trình tạo chồi của cây Kiết Tường
làm nguyên liệu để chế tạo hạt nhân tạo 54
3.2.1. Khảo sát quá trình tạo chồi từ các chồi mẹ ban đầu 54
3.2.2. Khảo sát quá trình tạo chồi từ lá 56
3.2.3. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh cây Kiết Tường 57
3.3. Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ chồi 59
3.3.1. Khảo sát ảnh hưỏng của thời gian đông tụ hạt nhân tạo
từ chồi cây Kiết Tường 59
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl
2
lên
khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 60
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate lên khả năng
tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 60
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate 4% kết hợp
alginate chiếu xạ (300kGy) lên khả năng tạo hạt nhân
tạo từ chồi cây Kiết Tường 62
3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat 4% kết hợp

chitosan chiếu xạ 0,1% lên khả năng tạo hạt nhân tạo
từ chồi cây Kiết Tường 64
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 66
4.1. Kết luận 67
4.2. Đề nghị 67
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

6

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT



Agl…………………………… Alginate
BA……………………………… 6-Benzylaminopurine
2,4D…………………………… Acid (2,4-dichlorophenoxy) acetic
ĐC……………………………… Đối chứng
ĐHST………………………… Điều hòa sinh trưởng
ĐST…………………………… Đỉnh sinh trưởng
GA
3
…………………………… Giberrlline
IBA Indol Butiric Acid
NAA……………………………. Nathalen Acetic Acid
MS Murashige & Skoog (1962)
SVĐC………………………… So với đối chứng

7

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Khảo sát khả năng tạo cụm chồi từ chồi của cây
Kiết Tường trong môi trường MS có bổ sung BA
kết hợp với NAA 40
Bảng 2.2. Khảo sát khả năng tạo cụm chồi từ lá của
cây Kiết Tường trong môi trường MS có bổ sung BA 41
Bảng 2.3. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh trong
môi trường MS có bổ sung NAA, IBA và GA
3
42
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến quá trình tạo hạt 48
Bảng 3.2. Khảo sát thời gian lưu của hạt algintae 4% trong dung dịch
CaCl
2

50Mm 51
Bảng 3.3. Khảo sát thời gian đông tụ 1/4, 1/2 và toàn bộ bán kính hạt tạo
được từ alginate 4% kết hợp alginate chiếu xạ (300kGy) 51
Bảng 3.4. Khảo sát thời gian đông tụ 1/4, 1/2 và toàn bộ bán kính hạt tạo
được từ alginate 4% kết hợp chitosan chiếu xạ (0,1%) 53
Bảng 3.5. Khảo sát khả năng tạo cụm chồi từ chồi của cây Kiết Tường
trong môi trường MS có bổ sung BA kết hợp với NAA. 55
Bảng 3.6. Khảo sát khả năng tạo cụm chồi từ lá của cây Kiết Tường trong
môi trường MS có bổ sung BA 56
Bảng 3.7. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh trong môi trường MS
có bổ sung NAA, IBA và GA
3
58
Bảng 3.8. Khảo sát thời gian lưu giữ của hạt nhân tạo trong dung dịch CaCl
2
59
Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ CaCl
2
lên khả năng tạo hạt
nhân tạo 60
Bảng 3.10. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate lên khả năng tạo hạt
nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 61
Bảng 3.11. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate chiếu xạ lên khả năng
tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 62
Bảng 3.12. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan chiếu xạ lên khả năng tạo hạt
nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 64



8

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Trang

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ alginate lên khả năng
tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 61
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ alginate chiếu xạ lên khả năng
tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 63
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của chitosan chiếu xạ lên khả năng tạo
hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường 64



9

DANH MỤC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Hoa Kiết Tường 12
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của auxin 21
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của cytokinin 21
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của GA3 22
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Alginic axit 26
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của Alginate Canxi 28
Hình 3.1. Hạt alginate (Alg) ở các nồng độ khác nhau 49
Hình 3.2. Chồi tạo được từ chồi mẹ ban đầu 56
Hình 3.3. Chồi tạo được từ lá 57
Hình 3.4. Cây tái sinh từ môi trường MS bổ sung kết hợp NAA, IBA và GA
3

58
Bảng 3.5. Hạt nhân tạo cây Kiết Tường 59
Hình 3.6. Cây tạo thành từ alginate 3% và algiante 4% 62





10


LỜI MỞ ĐẦU


Hoa Kiết Tường là loài hoa đã được du nhập sang Việt Nam mấy chục năm gần
đây.
Đây là loài hoa đẹp và có giá trị kinh tế cao. Hàng năm công ty Lang Biang đã thu về
hàng tỉ đồng từ việc xuất khẩu loài hoa này. Và ở Việt Nam, hoa Kiết Tường đã dần đi
vào đời sống tinh thần của người Việt Nam, bởi lẽ hoa không chỉ đẹp về hình dáng,
màu sắc mà tên hoa còn mang ý nghĩa của sự an lành và may mắn. Hoa được biết đến
bởi những nhà trồng hoa Đà Lạt vào những năm 90. Đầu tiên hoa được trồng bằng cách
gieo hạt với hạt giống nhập từ nước ngoài và có giá thành rất cao. Hơn nữa, người
trồng hoa rất bị lệ thuộc vào nguồn cung cấp hạt giống.
Hiện nay, loài hoa này đã được nhân giống in vitro thành công, tuy nhiên vẫn chưa
đáp ứng kịp thời nhu cầu của thị trường. Do đó, việc tạo hạt nhân tạo cung cấp số
luợng giống lớn và nhanh là yêu cầu bức thiết đang được đặt ra.
Đề tài này được tiến hành nhằm khảo sát và đánh giá khả năng tạo hạt nhân tạo cây
Kiết tường từ alginate có bổ sung các chất kích thích sinh trưởng.
Tuy nhiên, đề tài vẫn chưa sâu sát hết các vấn đề như chưa khảo sát cụ thể khả năng
sống của cây sau khi chuyển ra thuần hóa ở ngoài vườn ươm, chưa nghiên cứu quá

trình tạo hạt nhân tạo từ phôi soma cây Kiết Tường vì thời gian thực hiện đề tài còn
hạn chế. Chúng tôi hi vọng kết quả của đề tài sẽ góp một phần nhỏ vào công nghệ sản
xuất hạt nhân tạo ở Việt Nam cũng như trên thế giới.



11






Chương 1
TỔNG QUAN












12

1.1. Giới thiệu về cây Kiết Tường

1.1.1. Vị trí phân loại và nguồn gốc [7]

Blue Bell Field

Blue Bell Eustoma grandiflorum
Hình 1.1. Hoa Kiết tường



13


1.1.1.1. Vị trí phân loại
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Lớp phụ: Asteridae
Bộ: Gentianales
Họ: Genianaceae
Giống: Eustoma
Tên khoa học: Eustoma gandiflorum
Tên khác: Lisianthus, Texas bluebell,…
1.1.1.2. Nguồn gốc
Hoa Kiết Tường (Eustoma Grandiflorum) là loài hoa dại Bắc Mỹ thuộc thảo
nguyên Nebraska, Colorado và kéo dài xuống tận Texas. Chúng là loài cây lâu năm có
khả năng chịu rét tương đối trên đồng cỏ và được biết đến với nhiều màu sắc khác
nhau, có loại cánh đơn và cánh đôi. Màu khởi nguyên là màu xanh, dần dần đã có sự
xuất hiện đa dạng về màu sắc như hồng, trắng, trắng pha tím, trắng pha hồng, Đây là
loài hoa khá thanh lịch không chỉ bán như các loại hoa cắt cành mà còn được biết đến
dưới dạng hoa chậu nghệ thuật [14].
1.1.2. Những tìm hiểu về nhân giống cây Kiết Tường

Cây Kiết Tường được sản xuất hàng năm với số lượng hoa ở mỗi cây là 3 hoa trong
lần thu hoạch đầu tiên và duy trì cho đến vụ thứ hai thì xem như không còn giá trị nữa
(Halev và Kofranek, 1984). Tuổi thọ của phát hoa và hoa chậu là hai tuần, đôi khi
nhiều hơn 5 tuần (Rod va Lawson, 1984). Cây Kiết Tường được nhân giống bằng hạt
hay giâm cành [12].
1.1.2.1. Nhân giống bằng hạt
Bằng kỹ thuật nhân giống này, thông thường người ta sẽ có được một số lượng lớn
cây giống nhưng cây sẽ không đồng đều nhau về số lượng hoa, chiều cao cây và thời
gian ra hoa.

14

Hiện nay, Kiết Tường vẫn được nhân giống chủ yếu bằng phương pháp gieo hạt. Tại
Đà Lạt trước đây hoa Kiết Tường được nhân giống bằng hạt giống F1 do công ty giống
Sakata (Nhật Bản), Takii (Nhật Bản) cung cấp nhưng hạt Kiết Tường rất nhỏ (khoảng
1500 hạt/1g hạt), do đó gieo hạt ngoài vườn ươm rất dễ thất thoát, tỉ lệ nảy mầm chỉ
khoảng 50-70% đó là chưa kể đến những bất lợi về biến dị ở những giống lai [7].
1.1.2.2. Phương pháp giâm cành
Lúc này đặc tính di truyền của cây mẹ sẽ được duy trì nhưng thời gian cung cấp cây
con sẽ rất dài và cho số lượng không nhiều.
1.1.2.3. Phương pháp nhân giống in vitro
a. Trong nước
Bắt đầu từ những năm 90, tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt đã có những
nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Kiết Tường được tiến hành như nhân giống bằng kỹ
thuật microcutting, gây tạo cụm chồi, tái sinh cây từ mô lá, thân, nụ hoa và cánh hoa.
Kết quả của những khảo nghiệm này đã và đang được sử dụng để sản xuất giống cây
con thuần dòng phục vụ cho việc trồng hoa thương phẩm [2].
Sự nhân giống vô tính cây hoa Kiết Tường được nghiên cứu và công bố năm 2005
[8], trong đó công trình này đã khảo sát về khả năng tái sinh chồi và rễ trực tiếp từ mô
lá của hoa Kiết Tường nuôi cấy in vitro với kết quả là tần số tái sinh chồi và số chồi

trên mỗi mảnh lá đạt cao nhất trên môi trường MS có bổ sung 2,0mg/l BA. Sự tái sinh
cả chồi và rễ đạt được trên môi trường MS bổ sung 2,5mg/l BA và 0,5mg/l IBA. Trên
môi trường có bổ sung 3,0mg/l BA kết hợp 0,5mg/l IBA, mô lá chỉ phát sinh rễ. Khi
nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật, các
chồi tái sinh từ mảnh lá có sự phân đốt ngắn. Trên môi trường MS có bổ sung 2,0mg/l
BA và 3,0mg/l GA
3
hoặc 2,5mg/l BA, 0,5mg/l IBA và 0,3mg/l GA
3
, chồi tái sinh từ
mảnh lá có sự hình thành thân chính và có đốt thân dài hơn. Sự tái sinh chồi từ lát cắt
ngang lá và các đoạn rễ in vitro đạt 100% trên môi trường MS bổ sung 2,5mg/l BA,
0,5mg/l IBA và 0,3mg/l GA
3
hoặc 2,0mg/l BA và 0,3mg/l GA
3
.



15

b. Ngoài nước
Một số nghiên cứu về phát sinh cơ quan cây hoa Kiết Tường.
Semenuik và cộng sự (1987) là một trong những tác giả đầu tiên nghiên cứu nhân
giống cây hoa Kiết Tường in vitro thông qua nuôi cấy chồi nách, lá và huyền phù tế bào.
Từ đầu thập niên 90, các phương pháp vi nhân giống hoa Kiết Tường đã được phát
triển và cây có thể tái sinh từ thân, lá và đỉnh sinh trưởng [2].
Môi trường LS bổ sung 1mg/l BA cũng được cho là môi trường tối ưu để tái sinh
chồi từ mảnh lá.

Sự nghiên cứu tái sinh chồi từ rễ mà hoàn toàn không cần bổ sung chất điều hòa
sinh trưởng thực vật đã cho thấy sự tái sinh chồi vẫn thực hiện được đối với hệ số là 5
chồi/đoạn rễ [16].
Nghiên cứu về đặc điểm của cây tái sinh từ rễ và lá cũng đã được Furukawa và
cộng sự khảo sát sau đó vào năm 1993 [15].
Những nghiên cứu về tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như
cytokinin, auxin cũng như sự bổ sung than hoạt tính lên các đặc tính giải phẫu và phát
sinh hình thái trong quá trình nuôi cấy đỉnh, chồi cây Kiết Tường đã được Paek và
cộng sự công bố vào năm 2000 [13]. Một số nghiên cứu khác về gieo hạt và sinh lí ra
hoa cây Kiết Tường.
Nếu hạt giống được gieo trồng vào thời điểm thích hợp dưới môi trường mát mẻ, cùng
với sự nảy mầm ở nhiệt độ thấp thì những cây Kiết Tường sẽ phát triển tốt hơn [19].
Ảnh hưởng của quang kỳ và cường độ ánh sáng đến sự ra hoa và phát triển của cây
Kiết Tường đã được nghiên cứu trước đây. Kết quả nghiên cứu cho thấy Kiết Tường là
loại cây cần có độ dài ngày để phát triển, đặc biệt với cường độ chiếu sáng cao sẽ làm
tăng số lượng chồi, tiếp đến là cây sẽ phát triển tốt. Tuy nhiên đối với điều kiện ngày
ngắn thì cây sẽ gia tăng số lượng nhánh, số lượng búp và hoa, đường kính cây cũng to
hơn [18].
Ảnh hưởng của Chitosan trên sự nảy mầm và màu sắc cánh hoa Kiết Tường cũng
đã được khảo sát. Những nghiên cứu cho thấy có sự biến đổi trên các chồi hoa đang
phát triển được xử lí với chitosan. Sau khi được xử lí với fructose và chitosan thì hầu

16

hết các lô thí nghiệm đều cho ra sản phẩm với màu sắc sặc sỡ trên cánh hoa. Chitosan
được xử lí theo những quá trình khác nhau trên nụ hoa bao gồm sự làm giàu chất sắt
trong cánh hoa in vitro. Hệ thống cảm ứng nhân tạo đã được sử dụng để định lượng
tổng cộng thành phần của anthocyanin trong cánh hoa Kiết Tường [3].
Đối với cây Kiết Tường ethylen không phải là chất nhạy cảm trong quá trình nở hoa
nhưng nó có khả năng kéo dài tuổi thọ cho hoa Kiết Tường [18].

Một lượng GA
3
được bổ sung sẽ làm tăng tốc độ phát triển của cây Kiết Tường gieo
hạt và cải thiện những cây có trạng thái ngừng sinh trưởng và phát triển [12].
1.2. Khái quát về nuôi cấy mô thực vật
1.2.1. Lịch sử phát triển và các thành tựu đạt được trong nuôi cấy mô
Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết
tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể phức tạp gồm nhiều đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành. Các
tế bào đã phân hóa đều mang thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên đó là trứng
sau khi thụ tinh và là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng toàn bộ cơ thể.
Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và
Schwann vào thực nghiệm Haberlandt gặp thất bại trong nuôi cấy tế bào đã phân hóa
tách từ một số cây một lá mầm như: Erythronium, Ornithogalum, Tradescantia. Ngày
nay chúng ta biết rất rõ nguyên nhân thất bại của Haberlandt vì các cây một lá mầm là
đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh.
Năm 1922, Kotte học trò của Haberlandt và Robbins người Mỹ đã lập lại thí
nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ của cây Hòa Thảo. Trong
môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh tạo nên
một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại một thời gian
sau đó chậm dần và ngừng lại mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới.
Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự vô số hạn của việc nuôi
cấy tế bào rễ cà chua.
Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn.
Năm 1951, Skoog và Miller phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nhân chồi.

17

Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu bước
phát triển trong kỹ thuật nuôi cấy mô.
Từ năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính cây lan bằng phương

pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Các môi trường cơ bản lần lượt được tìm ra dựa trên các thí nghiệm khi nuôi cấy
từng loại và từng bộ phận. Ngoài ra môi trường nuôi cấy còn thay đổi tùy theo sự phát
triển phân hóa của mô nuôi cấy. Tuy nhiên, môi trường Murashige và Skoog (1962),
Linsmainer và Skoog (1965) và môi trường Gamborg và cộng sự (1968) là môi trường
cơ bản.
Nuôi cấy mô thực vật được đưa vào các chương trình chọn giống, nhân giống hiện
đại. Mặc dù còn nhiều vấn đề cần phải đi sâu nghiên cứu và giải quyết trong những
năm tới [5].
1.2.2. Các phương pháp nuôi cấy in vitro
1.2.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Là phương thức dễ dàng nhất dễ đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực
vật (bao gồm nuôi cấy chồi ngọn và chồi bên).
Mẫu sau khi vô trùng sẽ được nuôi cấy trên môi truờng thích hợp chứa đầy đủ chất
dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích
thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi
cấy nhất định, mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển
vuơn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần
dần thích nghi và phát triển bình thường.
1.2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo
Những mẫu cấy khi được nuôi cấy trên môi trường nhân tạo có bổ sung cả auxin và
cytokinin phát triển thành một khối không có tổ chức được gọi là mô sẹo, mô sẹo hình
thành do sự phản phân hóa của các tế bào đã phân hóa. Trong nuôi cấy, sự phát triển có
thể duy trì vô hạn định nhiều hay ít, mô sẹo được cấy chuyền sang môi trường mới một
cách định kì. Sự bổ sung các chất khác là điều cần thiết như vitamin, nguồn cacbon
được dùng làm chất khoáng dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy [5].

18

Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo mô

sẹo (Pierik, 1987). Trong đa số trường hợp, sự tạo mô sẹo trong tối thường tốt hơn
ngoài sáng, đặc biệt là đối với mẫu cấy từ lá. Hình thái của mô sẹo phụ thuộc rất nhiều
vào chủng loại cũng như nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện
trong môi trường nuôi cấy. Qua một số thí nghiệm, người ta đã ghi nhận được rằng nếu
giữ nguyên nồng độ và loại auxin nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin
trong môi trường nuôi cấy thì hình thái của mô sẹo sẽ thay đổi (Mehra và Jaidka, 1985,
Pal và cộng sự, 1985, Shrikhande và cộng sự, 1993). Sự có mặt của BAP trong môi
trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu và có khả năng sinh
phôi, mô sẹo trên môi trường có kinitin có dạng bở và thường không có khả năng sinh
phôi (Shrikhande và cộng sự, 1993). Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo
dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Ceriani và
cộng sự, 1992).
1.2.2.3. Nuôi cấy phôi
Tế bào có khả năng sinh phôi hay còn gọi là tế bào có khả năng tạo phôi là những tế
bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, vách mỏng, tế bào chất đậm đặc, nhân to, hạch nhân
đậm màu và khá to.
Sự sinh phôi từ tế bào soma là một quá trình, do một hay vài tế bào soma, trong các
điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật),
có thể dấn thân vào một sự phân chia theo một trật tự nhất định để cho mô phôi, theo
kiểu giống như kiểu sinh phôi từ hợp tử.
Tiềm năng sinh phôi của loài thực vật được xác định không chỉ bởi kiểu gen mà còn
ở trạng thái sinh lí của vật liệu nuôi cấy, chính xác hơn là do sự tương tác giữa trạng
thái sinh lí của vật liệu nuôi cấy và thành phần môi trường nuôi cấy. Theo một số tác
giả thì khả năng sinh phôi của tế bào soma tùy thuộc vào hai yếu tố nhất định: nguồn
gốc của vật liệu nuôi cấy và chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng.




19

1.2.3. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.2.3.1. Một số thành phần chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật [5]
a. Khoáng đa lượng
Dung dịch gốc cung cấp được những yếu tố cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển
của thực vật. Nitơ, photpho, kali, magiê, canxi và lưu huỳnh,… thường được xem là
khoáng đa lượng. Những nguyên tố này chiếm tối thiểu 0,1% trọng lượng khô của cây.
b. Khoáng vi lượng
Có nhiều yếu tố được đòi hỏi trong sự tăng trưởng, phát triển của cây và có nhiều
vai trò khác nhau. Khoáng vi lượng thường gặp là mangan, iôt, đồng, kẽm,…
Theo Welander (1997), tế bào thực vật trong quá trình phát sinh hình thái sẽ cần
nhiều khoáng vi lượng hơn. Các nguyên tố vi lượng có thể ảnh hưởng đến sự phân hóa
tế bào khi kết hợp với các chất điều hòa sinh trưởng thực vật.
c. Vitamin
Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là B
1
, PP, B
6
và
myo – inositol. Các vitamin khác cũng được sử dụng trong một số môi trường nuôi
cấy. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến chuyển khác nhau.
d. Axit amin
Axit amin được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng
tế bào. Việc sử dụng amino axit đặc biệt quan trọng trong môi trường nuôi cấy tế bào
và tế bào trần.
e. Cacbon và nguồn năng lượng
Sucrose rẻ, dễ tìm, dễ tiêu hóa và tương đối ổn định, cho nên sucrose thường được
dùng làm nguồn cacbon. Ngoài ra có thể sử dụng các nguồn carbonhydrate khác như:
glucose, maltose, galactose và sorbiton.
f. Than hoạt tính

Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường nuôi cấy sẽ có nhiều lợi ích và có tác
dụng khử độc. Than hoạt tính thường được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy với
nồng độ 1,5-3%.


20

g. Tác nhân keo tụ
Môi trường nuôi cấy in vitro có thể được dùng trong dạng lỏng hoặc đặc, phụ thuộc
vào từng loại nuôi cấy. Một số loài nuôi cấy đòi hỏi tế bào hoặc mô thực vật phát triển
trên bề mặt môi trường, nó phải được làm đông đặc lại. Agar, được sản xuất từ tảo
biển, là một loại chất đông đặc thường xuyên được sử dụng. Tuy nhiên vì nó là sản
phẩm tự nhiên, chất lượng agar có thể khác nhau do người cung cấp.
1.2.3.2. Các chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
a. Auxin
Auxin là một chất có nhân inodole, có công thức nguyên là C
10
H
9
O
2
N, tên của nó là
axit indole  acetic hoặc axit  indolyacetic. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần
dinh dưỡng trong môi trường để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo và huyền phù tế
bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với
cytokinin.
Hàm lượng auxin tự nhiên trong mẫu cấy phụ thuộc trạng thái của cây mẹ như tuổi,
thời gian thu mẫu trong năm (Cassells, 1979). Auxin quang trọng nhất được tìm thấy là
IAA nhưng trong môi trường nuôi cấy thực vật IAA bị giới hạn, IAA dễ thay đổi trong
nhiệt độ nóng và ánh sáng. 2,4 D là phổ biến nhất và ảnh hưởng nhất. Những loại auxin

khác cũng có thể dùng được và một vài loại có thể ảnh hưởng hơn hoặc hiệu quả hơn
2,4 D trong một vài trường hợp.
Nồng độ auxin trong môi trường cao sẽ ngăn cản sự phát sinh hình thái nhưng lại
cảm ứng sự phát sinh phôi soma từ các tế bào có khả năng sinh phôi. Khi nồng độ
cytokinin cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy. Ngược lại khi nồng độ auxin
cao hơn cytokinin hoặc khi xử lí với auxin thì rễ sẽ được hình thành.
Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, auxin chiếm vị trí quan trọng hơn, hai tính chất
của chúng được nghiên cứu thuộc về lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ.



21


NAA IAA IBA
Naphtalenacetic acid 3-Indolacetic acid 3-Indolbutyric acid
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của auxin
b. Cytokin
Cytokinin được xúc tiến trong quá trình phân chia tế bào. Có hai loại cytokinin là
cytokinin tự nhiên và cytokinin tổng hợp.
Cytokinin tự nhiên: 2 loại cytokinin tự nhiên thường được sử dụng trong nuôi cấy mô
là zeatin và 2-iP. Chúng không phổ biến do giá thành cao (zeatin) và không ổn định.
Cytokinin tổng hợp: 3 loại cytokinin tổng hợp thường được sử dụng trong nuôi cấy
mô là kinetin, BAP và TDZ.
Cytokinin có vai trò rất rõ trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ
sự thành lập các chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng với sự tái sinh rễ. Cytokinin
còn định hướng tế bào trong con đường phân hóa.


BAP Kinetin TDZ

6-Benzylaminopurine 6-Furfuryl aminopurine 1-phenyl-3-(1,2,3-
Thiadiazol-5-yl) urea
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của cytokinin
c. Gibberelline
Chất gibberelline đầu tiên được nhận dạng là axit gibberellin hay GA
3
. Gibberelline
gồm hơn 80 hợp chất khác nhau. Gibberelline có vai trò quan trọng trong quá trình cây
phát triển chiều cao ra hoa và kết trái [3].

22


Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của GA
3
1.3. Công nghệ sản xuất hạt nhân tạo [5]
1.3.1. Lịch sử phát triển
Hạt giống nhân tạo là một kỹ thuật sinh học được phát hiện trong những năm gần
đây và rất có ý nghĩa quan trọng trong tương lai (Redenbaugh và cộng sự, 1987). Hạt
giống nhân tạo về cơ bản giống như hạt giống tự nhiên, có cấu tạo là phôi được bao
bọc bởi lớp áo bên ngoài. Hạt giống nhân tạo có khả năng nảy mầm như hạt giống tự
nhiên. Hiện nay người ta vẫn tiếp tục nghiên cứu hạt giống nhân tạo theo hai hướng:
 Nghiên cứu cơ bản.
 Nghiên cứu tạo hạt giống nhân tạo cho mục đích ứng dụng.
1.3.2. Nghiên cứu vỏ bọc hạt nhân tạo
Năm 1979, New đã tạo hạt có chứa phôi theo kiểu nhỏ giọt và hạt có thể tái sinh
cây trong môi trường không có carbonhydrate.
Năm 1981, Kitto và Janick bọc vỏ phôi hay từng cụm tế bào và thấy rằng từ cụm tế
bào cũng có thể tạo hạt nhân tạo.
Năm 1986, Pedenbaugh và cộng sự đã thành công khi dùng giá thể như alginate

canxi làm vỏ bọc phôi để tạo hạt giống nhân tạo. Đến nay, người ta thấy dùng boron
hydrogen làm vỏ bọc phôi thì sẽ có tỉ lệ thành công cao hơn.
Các nghiên cứu cấu tạo vỏ của hạt tự nhiên bằng kỹ thuật huỳnh quang tia X hay
kính hiển vi điện tử quét, cho thấy vỏ có cấu tạo 3 lớp: lớp nhu mô giậu, lớp chịu áp
lực và lớp nhu mô mềm. Ba lớp này được cấu tạo chủ yếu bởi K, Ca, S, P,… Có nhiều
nghiên cứu bổ sung cellulose vào lớp vỏ để tăng cường sự trao đổi khí, cải thiện sự nảy

23

mầm. Hỗn hợp vỏ bao Na-alginate + propanal LF.20 + CaO
2
(5%) cho phép hạt giống
nhân tạo đạt tỉ lệ nảy mầm 70%.
1.3.2.1. Bọc vỏ và làm khô hạt
Mặc dù đã chế tạo được máy bọc vỏ hạt nhưng hiện nay, phổ biến nhất là bao hạt
bằng tay. Sau khi bọc vỏ hạt, người ta tiến hành làm khô hạt để có thể tồn trữ được lâu
hơn. Kitto và Janick đặt hạt cà rốt trên khay có chứa 25% polyethylene để làm mất
nước, và khi làm ướt hạt thì hạt sẽ nảy mầm và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
1.3.2.2. Bảo quản và làm nảy mầm hạt nhân tạo
Cho đến nay, vẫn chưa có một phương pháp hoàn hảo để bảo quản hạt giống.
Thông thường, hạt giống nhân tạo được bảo quản trong điều kiện lạnh, nhưng nếu giữ
trong nhiệt độ dài thì khả năng nảy mầm của hạt sẽ giảm đi một cách đáng kể. Có thể
giải thích do phôi bị ngăn cản sinh trưởng hay không đủ oxi trao đổi. Theo các nhà
khoa học Mỹ cho thấy tồn trữ 6 tháng trong parafin lỏng thì hạt nảy mầm với tỉ lệ cao.
Hạt giống nhân tạo cây cà rốt được làm khô và tồn trữ trong tủ lạnh 4
0
C với độ ẩm
67%. Trong suốt 2 tháng tồn trữ, hạt không nảy mầm. Sau 2 tháng đưa ra điều kiện
bình thường, hạt nảy mầm gần 100%. Trong điều kiện tương tự, nếu hạt được giữ trong
bao plastic alunium (4

0
C, 20 ngày) thì hạt nảy mầm khoảng 96%. Nhưng quá 60 ngày
bảo quản thì hạt không nảy mầm.
Nguyên nhân đưa đến khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo thấp:
Đối với những phôi được nuôi cấy kéo dài trong dung dịch lỏng, tế bào đôi khi mất
khả năng tái sinh hay tế bào phát triển không bình thường. Trong trường hợp như tế
bào sâm thì có đến 80% tế bào không bình thường.
Vật liệu dùng để tạo vỏ bao có thể gây cản trở sự trao đổi khí của phôi. Các nghiên
cứu hiện nay tập trung vào việc cải thiện lớp vỏ bao phỏng theo cấu trúc của vỏ hạt tự
nhiên nhằm tăng cường sự trao đổi khí và tránh hiện tượng thoát dinh dưỡng từ trong
hạt nhân tạo ra ngoài.
Mặc dù có những ứng dụng vào nông nghiệp rất có ý nghĩa. Nhưng cũng có nhiều
vấn đề cần nghiên cứu rất cơ bản:


24

 Phôi có chất lượng cao, bình thường và khả năng tái sinh mạnh.
 Chất liệu bao hạt.
 Tồn trữ và nảy mầm của hạt.
1.3.2.3. Hệ thống cấy chuyền hạt nhân tạo
Cho đến gần đây, khả năng thu nhận ít nhất một cây từ hạt giống nhân tạo được
xem như là thành công lớn. Tuy nhiên vào thập niên 1980, có nhiều nghiên cứu về cải
thiện sức sống của phôi khả năng nảy mầm nhanh và gia tăng tỉ lệ phôi hình thành cây.
Kết quả ghi nhận là cần phải có hệ thống cấy chuyền thích hợp để nhân số lượng lớn
phôi sô ma.
Ngày nay, hầu hết các hệ thống tái sinh phôi đều yêu cầu bước trung gian trước khi
tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chuyển ra ruộng. Thí dụ: Hagdu và Vasil (1981) làm
nảy mầm phôi pennisetum purpureum trong nuôi cấy mô và ngay cả sinh trưởng đạt 1-
5cm. Những cây này được cấy chuyền sang môi trường không có hoocmon để tạo rễ.

Giai đoạn kế là trồng cây cấy mô trên những bầu đất có cơ cấu cơ chất veimiculite, và
thuần hóa cây con trong điều kiện ẩm độ thấp. Sau cùng cây cấy mô được chuyển ra
vườn ươm cho sinh trưởng phát triển trong một nhiệt độ nhất định và trồng trên đồng
ruộng.
Với những loài thực vật, sự hình thành cây từ phôi cần phải mất thời gian dài. Phôi
rau cần tây cần 5 tuần lễ để tạo rễ và lá (Dunstar el al, 1982), sau khi cây phát triển đến
độ thích hợp sẽ được cấy chuyển sang khay nhân giống trong vườn ươm và cuối cùng
được tách cấy từng cây riêng rẽ trong bầu đất.
Spergel-poy và Vardi (1984) phát triển hệ thống nuôi cấy tái sinh Citrus từ giai
đoạn phôi đến khi thành cây hoàn chỉnh qua nhiều lần cấy chuyền từ môi trường đặc-
lỏng. Khi đạt chiều cao thích hợp cây sẽ được cấy vào trong ống nghiệm và đặt trên
một cầu giống để tiếp tục phát triển trước khi cấy ra đất.
Để có thể tạo được một cây hoàn chỉnh trong phòng thí nghiệm và chuyển ra trong
điều kiện vườn ươm và trên đồng ruộng, thì phải trải qua nhiều công đoạn, tốn nhiều
công sức và mất thời gian dài. Vì vậy người ta tìm cách để giảm chi phí và thời gian
bằng cách bọc phôi để có thể gieo trực tiếp trên đất.

25

1.3.3. Vật liệu tạo hạt nhân tạo
1.3.3.1. Giới thiệu chung về Alginat [6]
Trong rong Nâu có chứa một hợp chất quan trọng là Alginic. Alginic là
polysaccharid có tính axit, loại axit này rất khó hòa tan. Từ Alginic sẽ thông qua các
phản ứng với kiềm tạo nên một số hợp chất từ Alginic. Sau khi tạo muối sẽ làm thay
đổi tính tan và có nhiều công dụng hơn.
Alginate Natri là muối của Alginic với Natri, khi cho Alginic tương tác với kiềm
hóa trị I như NaOH, Na
2
CO
3

hoặc Na
2
HPO
4
, Na
2
SO
3
,…
Alginate Canxi là muối của Alginic với Ca
++
khi cho Alginic tương tác với CaCl
2
,
CaCO
3
, Ca(OH)
2
,…
Alginate amonium là muối của Alginic với NH
4
khi cho Alginic tương tác với
NH
4
OH hoặc kiềm amonium khác.
Hợp chất muối Alginate Amonium có nhiều công dụng trong quốc phòng và y tế.
Alginate propylen glycol là dạng ester tạo thành khi hóa hợp Alginic với propylene
glycol có nhiều ứng dụng trong công nghệ chế tạo nước hoa, làm chất giữ mùi cho các
sản phẩm mùi thơm.
Alginic axit được phát hiện đầu tiên bởi Stanford (1881). Năm 1975, Booth đã viết

về lịch sử công nghiệp Alginate dựa theo các kết quả nghiên cứu của Stanford. F. C
Thernley đã tiến hành chiết rút Alginate thô ở Orkey vào năm 1923 và bắt đầu hình
thành công nghệ sản xuất Alginate cho đồ hộp rau quả. Sau đó công ty đã đặt tên là
Kelp Products Corp và đến năm 1929 được tái thành lập có tên là công ty Kelco (Kelco
Company). Tại Anh, Alginate được sản xuất mạnh mẽ và sớm nhất vào những năm
1934-1939. Còn ở Na Uy, Alginate được sản xuất sau chiến tranh thế giới thứ II. Đến
năm 1981 sản xuất Alginate lan sang nhiều nước trên thế giới, đã có 17 nhà máy ở 9
nước khác nhau sản xuất Alginate ( Na Uy, Pháp, Nhật, Mỹ, Canada, Tây Ban Nha,
Chilê, Liên Xô cũ, Ấn Độ). Hai công ty sản xuất Alginate lớn nhất thế giới là Kelco
Company ở Mỹ và công nghiệp sản xuất Alginate ở UK, với sản lượng 70% mức sản
lượng của thế giới. Tiếp theo là đến công ty ProTan A/S của Na Uy, và các công ty của
Nhật, Pháp. Sản xuất Alginate ở Trung Quốc tăng trong những năm gần đây, sản lượng
trung bình đạt 7000-8000 tấn/năm.