Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh Proteaza từ tôm nguyên liệu và ứng dụng trong khử protein trong sản xuất chitin

i

LỜI CẢM ƠN
ðể hoàn thành bài luận văn này, em ñã nhận ñược rất nhiều sự giúp ñỡ, ñộng
viên, khích lệ cuả nhiều tập thể và cá nhân.
ðầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu trường ðại
Học Nha Trang, Ban Chủ Nhiệm khoa Chế Biến và quý thầy cô ñã giảng dạy và
truyền ñạt kiến thức quý báu làm hành trang cho em trong suốt quá trình học tập
ñến khi làm ñề tài tốt nghiệp cũng như khi em ra trường.
Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin gửi tới TS.Nguyễn Minh Trí – người có
những ñịnh hướng ñúng ñắn và tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ, ñộng viên em. ðồng
thời, thầy cũng là người ñóng góp nhiều ý kiến thiết thực, quý báu trong suốt thời
gian em làm ñề tài.
Em cũng xin cảm ơn các thầy cô quản lý phòng thí nghiệm Vi Sinh – Hóa
Sinh – Phân tích kiểm nghiệm ñã giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho em trong
thời gian thực hiện ñề tài.
Xin cảm ơn tất cả những người bạn ñã luôn ở bên cạnh, quan tâm, an ủi,
ñộng viên tôi trong suốt thời gian qua.
Cuối cùng, con xin kính gửi tới bố mẹ của con và gia ñình lòng biết ơn sâu
sắc. Cám ơn mọi người ñã cổ vũ, ñộng viên con trong những năm qua.

Nha Trang, tháng 6 năm 2009
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thu


ii

MỤC LỤC

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3
1.1.1.2. Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới 3
1.1.2. Tổng quan về enzyme Proteaza 4
1.1.2.1. Giới thiệu chung 4
1.1.2.2. Phân loại Proteaza 5
1.1.3. Nguồn thu nhận enzym proteaza 7
1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza từ
vi sinh vật 11
1.1.5. Những nghiên cứu về Proteaza 15
1.1.6. Ứng dụng của enzym Proteaza 21
1.1.7 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình thủy phân protein bằng enzym 23
1.2 TÌM HIỂU VỀ NGUỒN PHẾ LIỆU TÔM 27
1.2.1 Sản lượng phế liệu tôm 27
1.2.2 Thành phần, tính chất phế liệu tôm 28
1.2.3 Biện pháp sử dụng phế liệu tôm 29
1.3 TÌM HIỂU VỀ CHITIN, ỨNG DỤNG CỦA CHITIN 32
1.3.1. Tìm hiểu về chitin 32
PHẦN 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37
2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 37
2.1.1. Môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp Proteaza 37
2.1.2 Nguyên liệu tôm 37
2.1.3 Nguyên liệu casein 37
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. 38
2.2.1 Phương pháp xác ñịnh thành phần hóa học của nguyên liệu 38
2.2.2 Phương pháp phân tích vi sinh vật 38
2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 38
2.3.1 Sơ ñồ nội dung nghiên cứu 38

iii

3.2 Xác ñịnh hoạt ñộ proteaza của chủng vi sinh vật sinh proteaza phân lập
ñược. 47
KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT Ý KIẾN 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55
PHỤ LỤC 57


iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.3: Kết quả hàm lượng ñạm N
NH3
của chủng P
2
trong 3 lần xác ñịnh 48
Bảng 3.4: Kết quả hàm lượng ñạm N
NH3
của chủng P
3
trong 3 lần xác ñịnh 48
Bảng 3.5: Kết quả hàm lượng ñạm N
F
của chủng P
1
qua 3 lần xác ñịnh 48
Bảng 3.6: Kết quả hàm lượng ñạm N
F
của chủng P
2
qua 3 lần xác ñịnh 49

Bảng 3.7: Kết quả hàm lượng ñạm N
F
của chủng P
3
qua 3 lần xác ñịnh 49
Bảng 3.8: Kết quả hàm lượng ñạm N
aa
của chủng P
1
qua 3 lần xác ñịnh 49
Bảng 3.9: Kết quả hàm lượng ñạm N
aa
của chủng P
2
qua 3 lần xác ñịnh 50
Bảng 3.10: Kết quả hàm lượng ñạm N
aa
của chủng P
3
qua 3 lần xác ñịnh 50
Bảng 3.12: So sánh thành phần hóa học ñầu tôm trước và sau khi ép tách 51
Bảng 3.13: Hàm lượng protein tổng số trong nước rửa và còn lại trong vỏ tôm 52
Bảng 3.13: Kết quả phân tích vi sinh. 53


v

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Mô hình enzyme Proteaza thủy phân phân tử Protein 4
Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Proteaza 5

Hình 1.3. Sơ ñồ phân loại proteaza 5
Hình 2.1. Nấm mốc 9
Hình 2.2. Xạ khuẩn 10
Sơ ñồ 1.1: Sơ ñồ quá trình sản xuất Chitin 35
Sơ ñồ 2.1: Nội dung nghiên cứu chính 38
Sơ ñồ 2.2: thí nghiệm phân lập chủng vi sinh vật sinh Proteaza từ tôm 39
Sơ ñồ 2.3: thí nghiệm tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh proteaza từ tôm nguyên
liệu 40
Sơ ñồ 2.4: thí nghiệm ñịnh danh vi sinh vật 41
Sơ ñồ 2.5:thí nghiệm thu nhận dịch nuôi cáy chứa enzym Proteaza 42
Sơ ñồ 2.6: Thí nghiệm ñánh giá khả năng sinh Proteaza từ các chủng vi khuẩn phân
lập ñược 43
Sơ ñồ 2.7:thí nghiệm ứng dụng khả năng khử protein ñầu tôm của dịch nuôi cấy
chứa proteaza 44


vi

TÓM TẮT ðỀ TÀI.

Nghiên cứu thu nhận chế phẩm proteaza có hoạt ñộ cao từ vi sinh vật và ứng
dụng vào lĩnh vực sản xuất thực phẩm nhằm nâng cao năng suất, chất lượng, hiệu
quả ñã và ñang ñược các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm. Trong thời
gian gần ñây, các nhà khoa học Việt Nam thuộc lĩnh vực hóa sinh thực phẩm ñã ñạt
ñược những thành tựu ñáng kể trong nghiên cứu thu nhận các chế phẩm proteaza từ
thực vật, ñộng vật, vi sinh vật vào chế biến thực phẩm: sản xuất bia, nước chấm,
bánh mì, ñồ hộp thịt, cá v.v Tuy nhiên, việc nghiên cứu thu nhận enzym proteaza
từ vi sinh vật và ứng dụng của chúng cần ñược quan tâm hơn. Bởi lẽ ñây là một lĩnh
vực còn mới và có rất nhiều triển vọng ở nước ta. Ứng dụng enzym proteaza vào
công nghệ khử protein trong sản xuất Chitin là một hướng quan trọng ñang ñược

các nhà khoa học Việt Nam quan tâm nghiên cứu.
ðề tài nhằm phân lập chủng vi sinh vật sinh Proteaza từ tôm nguyên liệu và
ứng dụng bổ sung dịch chứa enzym thu nhận ñược từ chủng vi sinh vật phân lập
ñược trong khử protein trong sản xuất Chitin với phương pháp nuôi cấy trên những
môi trường phù hợp và tìm ra chủng vi sinh vật có khả năng sinh Proteaza cao nhất
bằng phương pháp ñánh giá sơ bộ như: xác ñịnh ñường kính vòng ly giải protein
của vi sinh vật và xác ñịnh hàm lượng ñạm acid amin tạo thành.
Kết quả của ñề tài là ñã phân lập, tuyển chọn ñược chủng vi sinh vật
Pseudomonas aeruginosa có khả năng sinh tổng hợp proteaza, có khả năng ñưa vào
sản xuất proteaza ñể khử protein trong sản xuất Chitin.

1

LỜI MỞ ðẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme ñược sản xuất càng nhiều và ñược sử dụng trong hầu hết trong các
lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm lượng
enzyme ñược sản xuất trên thế giới ñạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500
triệu USD, ñược phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [4].
Phần lớn enzyme ñược sản xuất ở quy mô công nghiệp ñều thuộc loại
enzyme ñơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là
enzyme thủy phân ñược sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.
Proteaza là enzyme ñược sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành
sản xuất như: chế biến thực phẩm (ñông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ sung
ñể làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế
biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…
Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp
proteaza ñã cải thiện ñáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm ñược tạo ra nhiều hơn.
Tuy nhiên, việc nghiên cứu thu nhận proteaza từ vi sinh vật và ứng dụng của chúng
cần ñượ quan tâm hơn nữa. Mặt khác, giá thành chế phẩm proteaza còn khá cao, do

ñó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Trong những năm
gần ñây, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của các ngành khoa học kỹ thuật, ngành Thủy
sản ngày càng phát triển không ngừng nhưng ñi cùng với sự phát triển của ngành
vấn ñề phế liệu trong chế biến thủy sản là một ñiểm hạn chế do lượng phế thải ra từ
công nghiệp chế biến thủy sản hàng năm là rất lớn, ñặc biệt là phế liệu tôm. Như
chúng ta ñã biết, phế liệu tôm có thể sử dụng ñể sản xuất Chitin – Chitosan mà
trong quá trình sản xuất Chitin – Chitosan hiện nay còn sử dụng một lượng hóa chất
lớn gây ra tình trạng ô nhiễm môi trường một cách trầm trong. Vì lý do này mà tôi
chọn ñề tài: “ Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh Proteaza từ tôm nguyên
liệu và ứng dụng trong khử protein trong sản xuất Chitin”.

2


Nội dung nghiên cứu của ñề tài gồm có:
− Phân lập chủng vi sinh vật sinh Proteaza từ tôm nguyên liệu.
− Thu nhận dịch chứa enzym Proteaza từ môi trường nuôi cấy.
− Xác ñịnh hoạt ñộ của dịch chứa enzym Proteaza.
− Ứng dụng dịch chứa enzym Proteaza trong khử Protein trong sản xuất
Chitin.
Với sự nỗ lực của bản thân và sự giúp ñỡ của thầy cô, bạn bè và gia ñình ñến
nay tôi ñã hoàn thành ñề tài. Mặc dù ñã có nhiều cố gắng nhưng vì khả năng có hạn
nên không thể tránh ñược những thiếu sót, rất mong ñược sự góp ý, phê bình của
quý thầy cô và các bạn.

3


PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. TÌM HIỂU VỀ ENZYM PROTEAZA
1.1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme
1.1.1.1. Vấn ñề nghiên cứu enzyme ở nước ta
Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống ñều cần phải có vai trò xúc
tác của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme ñã
thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều
nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng
tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có ñộ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu
trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng
dụng enzyme trong thực tế. Nghiên cứu về công nghệ enzyme ñã ñược tiến hành bởi
nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ ñể sản xuất pancreaza, pepsin,
trypsin sử dụng mầm mạ ñể sản xuất amylaza. ðã có những thử nghiệm công
nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng proteaza, bột protein thịt bằng
bromelain từ ñọt dứa, lên men rượu bằng enzyme cố ñịnh trên cột. Cũng ñã có
những nghiên cứu sử dụng peroxydaza, cyt-P

450
trong chế tạo biosensor và thuốc
phát hiện chất ñộc Trong lĩnh vực y dược, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng
của một số enzyme nhằm mục ñích kiến tạo nên một số thuốc dùng ñiều trị một số
bệnh ñặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dưỡng ở trẻ em, ñồng
thời ñã tiến hành sản xuất ñại trà. ðây là một ñóng góp rất thiết thực và kịp thời
trong việc phòng chống suy dinh dưỡng ở nước ta.
1.1.1.2. Công nghệ sản xuất enzyme trên thế giới
Trong những năm gần ñây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp
trên toàn thế giới ñạt khoảng 1 tỷ USD, trong ñó chủ yếu là các enzyme thủy phân
(75%), và Proteaza là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công
nghiệp (60%) [4].

4

1.1.2. Tổng quan về enzyme Proteaza
1.1.2.1. Giới thiệu chung
Nhóm enzyme Proteaza (peptit – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân
liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)
n
trong phân tử protein, polypeptit ñến sản phẩm
cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều proteaza cũng có khả năng thuỷ phân
liên kết este và vận chuyển axit amin.






Hình 1.1. Mô hình enzyme Proteaza thủy phân phân tử Protein.[17]

Proteaza cần thiết cho các sinh vật sống, rất ña dạng về chức năng từ mức ñộ
tế bào, cơ quan ñến cơ thể nên ñược phân bố rất rộng rãi trên nhiều ñối tượng từ vi
sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) ñến thực vật (ñu ñủ, dứa ) và ñộng vật (gan, dạ
dày bê ). So với protease ñộng vật và thực vật, proteaza vi sinh vật có những ñặc
ñiểm khác biệt. Trước hết hệ proteaza vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao
gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên
rất khó tách ra dưới dạng tinh thể ñồng nhất.

5

Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên proteaza vi sinh vật thường
có tính ñặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt ñể và ña dạng.

Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Proteaza.[17]
1.1.2.2. Phân loại Proteaza[2].
Proteaza (peptidaza) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) .











Hình 1.3. Sơ ñồ phân loại proteaza
Peptidaza (Proteaza)
(E.C.3.4)

Exopeptidaza
(E.C. 3.4.11-17)
Endopeptidaza
(E.C. 3.4.21-99)
Aminopeptidaza
Carboxypeptidaza
Serine proteinaza
Cystein proteinaza
Aspartic proteinaza
Metallo proteinaza

6

Proteaza ñược phân chia thành hai loại: endopeptidaza và exopeptidaza.[2]
* Dựa vào vị trí tác ñộng trên mạch polypeptide, exopeptidase ñược phân
chia thành hai loại:
+ Aminopeptidaza: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở ñầu N tự do của
chuỗi polypeptide ñể giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
+ Carboxypeptidaza: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở ñầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào ñộng học của cơ chế xúc tác, endopeptidaza ñược chia thành bốn
nhóm:
+ Serin proteinaza: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt ñộng và có vai trò ñặc biệt quan trọng ñối với hoạt ñộng xúc tác của
enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm
chymotrypsin bao gồm các enzyme ñộng vật như chymotrypsin, trypsin, elastaza.
Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg,
subtilisin BPN. Các serine proteinaza thường hoạt ñộng mạnh ở vùng kiềm tính và
thể hiện tính ñặc hiệu cơ chất tương ñối rộng.

+ Cysteine proteinaza: Các proteinaza chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
ñộng. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin,
một vài protein ñộng vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường
hoạt ñộng ở vùng pH trung tính, có tính ñặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinaza: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các aspartic proteinaza có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt ñộng và
thường hoạt ñộng mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinaza: Metallo proteinase là nhóm proteinaza ñược tìm thấy ở
vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinaza

7

thường hoạt ñộng vùng pH trung tính và hoạt ñộ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
Ngoài ra, proteaza ñược phân loại một cách ñơn giản hơn thành ba nhóm [2]:
- Proteaza acid: pH 2-4
- Proteaza trung tính: pH 7-8
- Proteaza kiềm: pH 9-11
1.1.3. Nguồn thu nhận enzym proteaza.
a. Nguồn ñộng vật:[2]
- Tụy tạng: ñây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều
enzyme nhất.
- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm
Proteaza tên là renin. Enzyme này ñã từ lâu ñược sử dụng phổ biến trong công nghệ
phomat. Renin làm biến ñổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi
trường sữa có ñủ nồng ñộ Ca
2+.
ðây là quá trình ñông tụ sữa rất ñiển hình, ñược
nghiên cứu và ứng dụng ñầy ñủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm

pepsin (trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi ñó dạ dày bê ñã phát
triển ñầy ñủ có khả năng tiết ra pepsin) thì khả năng ñông tụ sữa kém ñi.
Gần ñây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có ñặc tính
renin như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus.
b. Nguồn thực vật:[2]
Có 3 loại proteaza thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu ñược
từ nhựa của lá, thân, quả ñu ñủ (Carica papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa,
vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này ñược sử dụng ñể chống lại hiện tượng
tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng
dụng khác của proteaza thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục
tiêu tiêu hoá. Ficin thu ñược từ nhựa cây cọ (Ficus carica). Enzyme ñược sử dụng
thuỷ phân protein tự nhiên.


8

c. Nguồn vi sinh vật:
Enzyme Proteaza phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm
nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và
một số và một số loại nấm men.[3]
 Vi khuẩn
Lượng proteaza sản xuất từ vi khuẩn ñược ước tính vào khoảng 500 tấn,
chiếm 59% lượng enzyme ñược sử dụng [6].
Proteaza của ñộng vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidaza
hoặc exopeptidaza, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do ñó
protease của vi khuẩn có tính ñặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới
80% các liên kết peptide trong phân tử protein [6].
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh proteaza là
Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi
Clostridium. Trong ñó, B. subtilis có khả năng tổng hợp proteaza mạnh nhất

(Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các proteaza hoạt
ñộng thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các proteaza trung tính của vi khuẩn hoạt ñộng ở khoảng pH hẹp (pH= 5÷8)
và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các proteaza trung tính tạo ra dịch thủy phân
protein thực phẩm ít ñắng hơn so với proteaza ñộng vật và tăng giá trị dinh dưỡng.
Các proteaza trung tính có khả năng ái lực cao ñối với các amino acid ưa béo và
thơm. Chúng ñược sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B.
thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.

Proteaza của Bacillus ưa kiềm có ñiểm ñẳng ñiện bằng 11, khối lượng phân tử
từ 20.000-30.000. Ổn ñịnh trong khoảng pH= 6÷12 và hoạt ñộng trong khoảng pH
rộng từ 7-12 .


9

 Nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn proteaza ñược ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum)… Các loại nấm mốc này có khả năng
tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc ñen tổng hợp chủ
yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng
có khả năng tổng hợp proteaza có khả năng ñông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho
mát.


Hình 2.1. Nấm mốc [18]
 Xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp proteaza, xạ khuẩn ñược nghiên cứu ít hơn vi

khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng ñã tìm ñược một số chủng có khả
năng tổng hợp proteaza cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus

10


Hình 2.2. Xạ khuẩn [18]
Các chế phẩm proteaza từ xạ khuẩn ñược biết nhiều là pronaza (Nhật) ñược
tách chiết từ S. grieus, enzyme này có ñặc tính ñặc hiệu rộng, có khả năng thủy
phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liên Xô (cũ),
người ta cũng tách ñược chế phẩm tương tự từ S. grieus có tên là protelin.
Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết ñược keratinaza thủy phân karetin. Ở
Mỹ, chế phẩm ñược sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ S.
fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do ñó chúng ñược dùng trong công nghiệp
chế biến thịt.
Hầu hết các proteaza phân cắt protein ở các liên kết ñặc hiệu, vì thế có thể sử
dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp ñể tổng hợp các liên kết
peptide ñịnh trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm
carboxyl hoặc nhóm amine ñược lựa chọn ñể bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm,
phản ứng trong hệ hai pha lỏng.
Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất ñể sản xuất
enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và ñời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có
những lợi ích chính như sau:
• Chủ ñộng về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.

11

• Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu hoặc
nhiều lần quanh năm.
• Có thể ñiều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (ñịnh

hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).
• Giá thành tương ñối thấp vì môi trường tương ñối rẻ, ñơn giản, dể tổ chức
sản xuất.
Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh ñộc tố (gây ñộc,
gây bệnh) ñể có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp.
ðể sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh
vật có trong tự nhiên hoặc các giống ñột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất,
chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất ñịnh cần thiết nào ñó.
1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza từ
vi sinh vật.
a. Môi trường nuôi cấy
.Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh
hưởng trực tiếp ñến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành
phần môi trường phải có ñủ các chất ñảm bảo ñược sự sinh trưởng bình thường của
vi sinh vật và tổng hợp enzyme.
ðặc biệt lưu ý là ñể tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện
tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì
chất ñó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả
của chất kìm hãm nhằm bảo ñảm khả năng sinh tổng hợp enzyme ñã cho không bị
cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ
chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn,
Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác.
A . Nguồn cacbon.
Thường là hợp chất hữu cơ trong ñó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào ñặc tính
của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp.

12

Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp

ñối với nấm mốc sinh ra enzyme proteaza có hoạt lực cao. Các nguồn cacbon có tác
dụng ñến sinh tổng hợp proteinase của nấm mốc có thể theo thứ tự:
ðối với Asp. flavus 74: fructoza→ glucoza→ sacaroza→ ramnoza→
manoza→ galactoza→ arabinora→ lactoza.
ðối với Asp. awamori 200: fructoza→ manit→ sacaroza→ arabinoza→
manoza→ galactoza→ lactoza.
ðối với Asp. oryzae 79: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→
arabinoza→ galactoza.
Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme
Proteaza. Ví dụ: Vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp Proteaza ở môi
trường tinh bột >8%.
Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong ñó Micromonospora vulgaris 42, mọc tốt và
sinh tổng hợp proteaza cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng ñộ tinh bột từ 0,25-
1,5% sinh khối cũng tăng ñồng thời với hiệu xuất tổng hợp enzyme.Nếu tăng nồng
ñộ tinh bột hơn nữa sẽ không thu ñược kết quả dương tính. Tỷ số giữa cacbon và
nitơ cần phải là 4: 1. Trên môi trường có maltoza (0,5- 2%) vi sinh vật phát triển
bình thường, nhưng tổng hợp proteaza ngoại bào bị ức chế. Xạ khuẩn không phát
triển ñược ở trên môi trường có các nguồn cacbon duy nhất là sacaroza, lactoza
hoặc arabinoza. Glucoza, manoza, fructoza, xyloza có trong môi trường (0,2- 5%)
làm ức chế sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp enzyme.
Ngoài ra một số loại hydrocacbon cũng có nguồn cacbon có 125 chủng vi
sinh vật. Chẳng hạn chủng Ps. Seruginosa có thể ñồng hoá hydrocacbon và có khả
năng sinh tổng hợp proteaza có hoạt lực cao trên môi trường n- parafin với 12, 14
và 16 nguyên tử cacbon, dầu nặng hoặc propylenglycol. Chúng không chỉ ñồng hoá
ñược cả hydrocacbon béo mà còn ñồng hoá cả hydrocacbon thơm.
B . Nguồn nito.
Nguồn nito sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ.

13

ðối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A.
flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp protease axit cao.
Trên môi trường kzapek NaNO
3
ñược thay bằng cả cazein hoạt lực proteaza của
nấm mốc ñược tăng lên 3,5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucoza và bổ sung
pepton hoạt lực enzyme tăng 6 lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng
hợp enzyme ñược nâng cao khi trong môi trường có ñồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ
và nitơ vô cơ. Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột ñậu tương ñã tách chất béo,
các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme proteaza tăng 22- 74%. Còn trường hợp
dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn ñến ngừng sinh tổng
hợp protease nói chung.
Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong ñó có B. subtilis và B. mesentericus,
các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ ñược dùng phối hợp trong môi trường sẽ tạo ñiều
kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp protease. Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH
4
,
H
2
PO
4
là tốt hơn cả. Những muối khác NH
4
Cl, (NH
4
)
2
SO
4
, NH

4
NO
3
, NaNO
3
,
KNO
3
, Ca(NO
3
)
2
làm giảm hoạt lực proteaza tới 30- 50% , còn amylaza giảm 7- 10
lần. Còn trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực proteaza và amylaza
cũng thấp hơn trong môi trường ñối chứng (NH
4
)
2
HPO
4
và nước chiết ñậu tương.
ðối với xạ khuẩn ưa nhiệt Actynomyces Vulgaris U2 thì pepton là chất cảm
ứng ñể sinh tổng hợp enzyme protease là tốt nhất.
Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh
vật. Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực protease của
chủng ñột biến A. oryzae 251- 90 ñến 6- 9% và nguyên chủng A. oryzae 132- 63 tới
7- 24%. Nhiều axit amin có tác dụng ức chế ñến sinh tổng hợp enzyme, Valin, axit
glutamic, izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzyme ở B. megaterium 60%. Còn ñối
với B. subtilis các axit amin ức chế trong quá trình này là glyxin, metionin, axit
glutamic, alanin, lơxin,…

Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của
chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng ñáng kể sinh tổng hợp
proteinza vi sinh vật.

14

C . Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng
Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt ñộng vi sinh vật.
Ion Mg
2+
có tác dụng sinh tổng hợp và ổn ñịnh các enzyme có hoạt tính ở
nhiệt ñộ cao.
ðộ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy ở môi
trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề sâu
(môi trường dịch thể) , thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực
kỳ quan trọng). ðộ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ
thuộc vào thành phần môi trường bề mặt.
Khi lựa chọn môi trường cần chú ý ñến cả thành phần ñịnh tính và ñịnh
lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất. Muốn vậy
người ta có thể sử dụng một số phương pháp:
Phương pháp tối ưu hóa quy hoạch thực nghiệm toàn phần.
Phương pháp toán học mô hình hóa thực nghiêm.
 Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme.
Có thể chia làm 2 loại: môi trường tổng hợp và môi trường tự nhiên.
 Môi trường tổng hợp: là môi trường bao gồm các chất với liều lượng
xác ñịnh (qua tìm hiểu, nghiên cứu), chẳng hạn nguồn cacbon có thể là tinh bột,
xenluloza, ñường, axit, rượu, nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ. Loại môi trường này
ñược sử dụng cho mục ñích nghiên cứu.
 Môi trường tự nhiên: thường dùng các loại phế liệu, nguyên liệu có
chứa các nguồn cacbon, nitơ, khoáng, các yếu tố sinh tổng hợp trưởng. Mặt khác,

các nguyên liệu này có sẵn, rẻ tiền nên ñược sử dụng rất nhiều trong công nghiệp
sản xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật. Các nguyên liệu ñể chuẩn bị làm môi
trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép hoa quả, rau,
khô dầu, bã rượu, rĩ ñường, sản phẩm phân huỷ nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi lựa
chọn sử dụng môi trường cần chú ý ñến các chất có tác dụng ñiều hoà sinh tổng hợp
enzyme, ñặc biệt các chất cảm ứng.

15

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt ñộ nuôi
cấy thông thường từ 25 - 30
0
C. Trị số pH ban ñầu của môi trường (chủ yếu ở môi
trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào ñó ñến sự tạo thành enzyme, nhưng
khi ñó cũng cần tính ñến khả năng biến ñổi nhanh chóng chỉ số ñó bởi vi sinh vật.
b. Chất cảm ứng
ðặc biệt lưu ý là ñể tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện
tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì
chất ñó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả
của chất kìm hãm nhằm bảo ñảm khả năng sinh tổng hợp enzyme ñã cho không bị
cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ
chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp.
c. ðiều kiện nuôi cấy
ðây cũng là một trong nhữn yếu tố ảnh hưởng lớn ñên sự sinh trưởng của vi
sinh vật. Mỗi loài vi sinh vật thích ứng với một ñiều kiện nuôi cấy nhất ñịnh. Bởi
ñiều kiện nuôi cấy bao gồm: nhiệt ñộ, ñộ ẩm,… chỉ phù hợp với những loài cụ thể.
Nếu ñiều kiện nuôi cấy không phù hợp, trường hợp nuôi cấy không thực hiện
ñược các yêu cầu vô trùng thì vi sinh vật ñược nuôi cấy trong ñiều kiện ñó rất dễ bị
nhiễm khuẩn. Như vậy việc sinh trưởng và sinh tổng hợp của enzym ñều bị ảnh
hưởng.

1.1.5. Những nghiên cứu về Proteaza
Các proteaza ( peptít – hydrolaza ) xúc tác cho quá trình thuỷ phân liên kết
peptít ( -CO – NH -) trong phân tử protein.
Proteaza ñã ñược nghiên cứu từ lâu trên thế giới, trong ñó proteaza của hệ
tiêu hoá ñược nghiên cứu sớm hơn cả. Ngay từ cuối thế kỷ 18 ñầu thế kỷ 19 ñã tách
ñược chế phẩm pepsin từ dịch vị dạ dày, tripsin từ dịch tụy tạng của ñộng vật ăn thịt
[7]
Những dẫn liệu khoa học gần ñây cho biết trong ñộng vật thuỷ sản có ñầy ñủ
các laọi proteaza như pepsin, tripsin, chathepsin, erepsin v.v…chúng có tính ñặc

16

hiệu rộng rãi và ñóng vai trò rất quan trọng trong chể biến và bảo quản các sản
phẩm từ thuý sản, như sản xuất nước mắm, bột cá…[8]
Các proteaza của thực vật ñược phát hiện muộn hơn. Cuối thế kỷ 19, ñầu thế
kỷ 20, các nhà khoa học mới tách ñược papain từ nhựa ñu ñủ (carica papaya),
bromelin trong các phần khác nhau của cây dứa, ureaza từ ñậu tương, v.v…[13]
Proteaza của vi sinh vật mới ñược nghiên cứu nhiều từ năm 1950. Tuy nhiên
số công trình nghiên cứu về proteaza của vi sinh vật tăng lên rất nhiều so với các
công trình nghiên cứu proteaza của ñộng vật và thực vật.[7]
Những kết quả ñạt ñược trong lĩnh vực nghiên cứu poteaza vi sinh vật ñã góp
phần mở rộng quy mô sản xuất các chế phẩm enzym và ứng dụng enzym trong
nhiều lĩnh vực của ñời sống kinh tế – xã hội. Phần lớn proteaza ñược sản xuất nhờ
qúa trình nghiên cưú vi sinh vật ở qui mô công nghiệp.hiện nay hàng năm trên thế
giới sản xuất khoảng 600 tấn proteaza tinh khiết từ vi sinh vật: trong ñó khoảng
500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc.[9]
Nhịp ñộ sản xuất enzym ở qui mô công nghiệp tại các nước phát triển tăng
trung bình hàng năm từ 5% ÷÷ 15%, và doanh thu từ sản xuấ enzym hang năm ở
các nước này khoảng 1,5 tỷ USD.[12]
Những nước có sông nghệ sản xuất và ứng dụng proteaza tiên tiến trên thế

giới hiện nay là: Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan. Trung Quốc, ðan Mạch, ðức,
Ao. Các nước này ñã ñầu tư thích ñáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng
dụng chế phẩm proteaza của vi sinh vật – nguồn nguyên liêu rất dồi dào ñể sản xuất
enzym nói chung và proteaza nói riêng.
Trong thời gian gần ñây, các nhà khoa học trên thế giới ñã ñạt ñược những
thành tựu to lớn trong linh vực nghiên cứu về proteaza của vi sinh vật.
Một nhóm các nhà khoa học của trường ñại học nông nghiệp Tokyo, Nhật
Bản ñã tách ñược enzym X-prolyl ñipeptiyl-aminopeptitdaza từ môi trường nuôi
cấy rắn A.oryzae. enzym này ñược tinh chế bằng phương pháp ñiện di trên gen
polyacrylamit (PAGE – PolyAcrylamide Gel Electrophorasis ) ở pH = 9,4 và ở
ñiểm ñẳng ñiện. Bằng phương pháp lọc gel ñã xác ñinh ñược phân tử lượng của

17

enzym này là 280.000 ñơn vị. Kết quả nghiên cứu cho thấy, enzym này do hai tiểu
phần ñồng nhất hợp thành, ñiểm ñẳng ñiện pH = 4,2 và bị ức chế bởi hợp chất
diisopropylphosphorofluorit.
Một loại proteaza trung tính của A.ozyrae cũng ñã ñược nghiên cứu bởi các
nhà khoa học Nhật Bản, cho thấy ñó là một proteaza – kẽm có 3 liên kết disulfua
nội phân tử. Enzym này gần như không bền sau 10 phút ở nhiệt ñộ 75
0
C, nhưng ñộ
bền nhiệt lai ñựoc phục hồi ở nhiệt ñộ trên 75
0
C cho ñến 100
0
C. Các nghiên cứu
tiếp theo ñã giải thích rằng enzym này có tính thuận nghịch trong khoảng nhiệt ñộ
từ 75
0

C cho ñến 100
0
C. Tính thuận nghịch này do các liên kết disulfua trong phân
tử enzym quyết ñịnh.
Amyloprotooryzin ñược sản xuất từ chủng A.oryzae 387 là một phức hệ các
enzym và có hoạt tính thuỷ phân protein. Amyloprotooryzin làm tăng hàm lượng
của các axít amin lên khoảng 108% ÷ 227% tuỳ thuộc vào cơ chất sử dụng.phức
hợp enzym này dã xác ñịnh gồm: proteaza, -amylaza, exo-ß-glucanaza, và xylaza,
chúng có hoạt tính thuỷ phân protein mạnh nhất ở pH = 4 ÷ 5,5.
ðể làm tăng ñộ bền nhiệt của proteaza kiềm từ A.oryzae, các nhà khoa học
Nhật Bản ñã nghiên cứu ñưa vào cấu trúc enzym này một liên kết disulfua bằng
phương pháp ñột biến gel. Kết quả cho thấy, ñối với enzym ban ñầu có hoạt tính
mạnh nhất ở 51
0
C, khi làm ñột biên gel ở ñoạn Cys-200 thì hoạt tính của enzym này
mạnh nhất ở 56
0
C
Klaus Prommer cho biết các loại proteaza kiềm ñược ứng dụng nhiều trong
sản xuất bột giặt vì có những tính chất sau: Bền vững ở nhiệt ñộ cao; Bễn vững
trong môi trường kiềm (pH = 9 ÷ 11); Và bền vững khi kết hợp với các yếu tố tạo
phức. Tuy nhiên các proteaza kiềm không bền với các chất hoạt ñộng bề mặt. Các
chủng vi sinh vật thường dùng ñể sản xuất proteaza kiềm là vi khuẩn Bacillus như:
B.licheniormic, B.amiloliquefaciens, B.fermus, B.megatetericum, các chủng nấm
mốc A.oryzae, A.niger, A.sojae. Chế phẩm subtilisin BPN và subtilisin NOVO sản
xuất từ vi khuẩn B.amiloliquefaciens có chứa seirin ở trung tâm hoạt ñộng của

18

phân tử và bị ức chế bởi EDTA (Ethyl – Diamin – Tetraaxetic – Axít), nhưng

không bị ức chế bởi DFP ( Diisopropyl – Fluoro – Phosphat).các proteaza trung tính
ñược sản xuất từ các chủng vi sinh vật B.subtilic, B.cereus, B.megaterium,
Pseudomonas aerugenas, các chủng nấm mốc A.oryzae, A.sojae và Pericularia
oryzae. Các proteaza trung tính kém bền hơn, cần Ca
++
ñể ổn ñịnh và cần Zn
++
ñể
hoạt hoá. Mất hoạt tính nhanh khi tăng nhiệt ñộ và do tác ñộng của proteaza kiềm,
vì vậy chúng ñược sử dụng hạn chế, chủ yếu trong công nghiệp thuộc da và sản xuất
bánh mì. Các proteaza axít ñược sản xuất từ các chủng nấm mốc Aspergillus, có pH
tối ưu từ 2 ÷ 3. Hầu hết ñược sử dụng ñể thuỷ phân gluten trong bánh mì và sản
xuất pho-mát.
Trong thời gian gần ñây, người ta ñã nghiên cứu ñược các phương pháp thích
hợp ñể thu nhận ñược chế phẩm proteaza không tan – proteaza ñược cố ñịnh trên
các chất mang như xelluloza, polyacrylamit, agaroza, axít alginic, DAEA-
Xelluloza, DAEA- Sephadex. Nhờ những kết quả này mà có thể tái sử dụng enzym
nhiều lần ñể sản xuất các sản phẩm một cách liên tục và tựu ñộng hoá quá trình sản
xuất sản phẩm, do ñó giảm ñược giá thành sản phẩm.
Ơ nước ta, những nghiên cứu về enzym nói chung và proteaza nói riêng ñã
thu hút ñược sự quan tâm ñông ñảo của các nhà khoa học thuộc lĩnh vực hoá sinh
học và vi sinh vật học. Các nghiên cứu tập trung theo các hướng: tách, tinh chế
enzym từ các cơ quan nội tạng ñộng vật và các mô thực vật, tạo các sản phẩm có ñộ
sạch khác nhau. Nghiên cứu cấu trúc, tính chất của proteaza, sự liên quan giữa cấu
trúc với hoạt tính sinh học của chúng và khả năng ứng dụng proteaza vào các lĩnh
vực khác nhau. Có thể thấy rõ qua một số công trình nghiên cứu ñã ñược công bố.
Phan Thị Chân Trâu, và cộng sự (1987), ñã nghiên cứu thành phần và một số
tính chất của chế phẩm bromelain tách từ chồi ngọn dứa tây. Kết quả nghiên cứu
cho thấy bromelain thuộc nhóm proteaza – xystein, có nghĩa là trung tâm hoạt ñộng
của nó có chứa nhóm thiol (-SH). Các số liệu thí nghiện còn cho thấy hoạt tính thuy

phân của chế phẩm bromelain ñược gia tăng rõ rệt khi có mặt xystein 1.10
-2
M và

19

EDTA 4.10
-3
M, ngược lại các hoá chất chứa kim loại nặng như HgCl
2
lại có tác
dụng ức chế hoạt tính cực ñại trong khoảng nhiệt ñộ từ 50
0
C ÷ 60
0
C, pH thích hợp
của chế phẩm khi sử dụng cơ chất cazein là 8,0 ÷ 8,5, còn ñối với azocazein thì dao
ñộng trong khoảng 6÷9. Như vậy khả năng thuỷ phân protein của chế phẩm này
cũng khác nhau.[11]
Năm 1992, Nguyễn Thị Vĩnh và các cộng sự ñã nghiên cứu một số tính chất
của proteinaza của dịch chiết từ thịt rắn hổ mang ?(Naja – Naja).kết quả cho thấy
proteinaza P-I có pH tối ưu bàng 7,0, bị kìm hãm dưới tác dụng của EDTA nhưng
có thể phục hồi ñến 71% ( So với lúc chưa xử lý EDTA) dươi tác dụng của Zn
++
và
Ca
++
. Ca
++
cũng có khả năng hoạt hoá enzym nhưng ở mức ñọp thấp hơn, như vậy

P-I là protea kim loại. P-II chiếm 70% hoạt ñộ của dịch chiết. P-II ñã ñược tinh sach
qua cột SE – Sephadex G-50, ñạt ñộ dồng nhất khi ñiêm di trên gel polyacrylamit có
hoạt ñộ riêng gấp 135 lần so với dịch chiết. PH tối ưu của P-II vào khoảng 6. Hoạt
ñộ P-II tăng lên dưới tác dụng ñồng thời của xystein và EDTA, mức ñộ hoạt hoá
enzyme lớn hơn khi mỗi thứ tác dụng riêng rẽ. P-II bị kìm hãm dưới dụng của
KCN, H
2
O
2
,Hg, Cd
++
, Zn
++
,Pb
++
, Cu
++
, Ba
++
. Như vậy P-II có nhiều tính chất của
proteinaza- thiol.[10]
Phạm Thị Trân Châu và cộng sự (1993), ñã nghiên cứu tính chất proteaza
của ñầu tôm biển, cho biết ñầu tôm biển có chứa 2 loại proteaza khác nhau, ký hiệu
là P-I và P-II. Khối kượng phân tử của P-II nhỏ hơn P-I. hoạt ñộ proteolitic của dịch
chiết ñầu tôm ñạt cực ñai ở pH =7,5 và ở nhiệt ñộ bằng 65
0
C. ðối với chế phẩm thô
thì pH tối ưu bằng 8,5 và nhiệt ñộ tối ưu là 55
0
C. xystein –iot và các ion hoá tri 2

như: Ba
++
, Cu
++
, Pb
++
, Ca
++
, Fe
++
, Mg
++
, Cd
++
, Zn
++
, Mn
++
,Hg
++
ở nồng ñộ 10
-3
M
làm giảm hoạt ñộ proteolitic của dịch chiết và chế phẩm thô.[13]
Nguồn enzym proteaza của ñông vật thuỷ sản nói chung và của tôm nói riêng
mới ñược nghiên cứu trong khoảng 40 năm trở lại ñây và còn rất ít. Các kết quả
nghiên cứu cho thấy trong thuỷ sản gồm có các proteaza quan trọng như: pepsin,
tripsin, chimotripsin, cathepsin v.v… Các enzym này có tính ñặc hiệu rộng rãi,