NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN SINH PROTEASE KIỀM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH




Nguyễn Thị Trần Thụy


NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI
KHUẨN BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT
VƯỜN SINH PROTEASE KIỀM


Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số : 60 42 40


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
PGS.TS. LƯƠNG ĐỨC PHẨM





Thành phố Hồ Chí Minh - 2009

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành bởi sự nỗ lực của bản thân, sự giúp đỡ tận tình của
các thầy cô giáo, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp và những người thân trong gia đình.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

PGS.TS. Lương Đức Phẩm, người đã tận
tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn thành luận văn. Cô
Trần Thanh Thủy đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá
trình thực hiện.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban lãnh đạo, cùng các thầy cô giáo Khoa Sinh,
trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức và thực hiện thành công
khóa đào tạo thạc sĩ chuyê
n ngành Vi Sinh Vật (2006 – 2009) , tạo cơ hội học tập nâng
cao trình độ về lĩnh vực mà tôi tâm huyết.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường trung học phổ thông Ngô
Quyền, phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã
giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Xin gửi lời cảm ơn Phòng khoa học công nghệ - sau đại học, trường Đại học sư
phạm th
ành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn được hoàn thành
đúng tiến độ.

MỞ ĐẦU
Ngày nay với các hiểu biết của mình về vi sinh vật con người đã sử dụng chúng
vào trong các lĩnh vực sản xuất khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học...
để phục vụ cho đời sống của con người. Ta biết rằng trong quá trình sống của thế
giới sinh vật luôn xảy ra các phản ứng hóa sinh để chuyển hóa vật chất. Các phản
ứng này luôn gắn chặt với sự có mặt của enzim với hiệu suất xúc t
ác cực kì lớn so
với các chất vô cơ và hữu cơ khác và có tính đặc hiệu cao. Do đó các chế phẩm
enzim thường được sử dụng rộng rãi trong y học, trong công nghiệp, sản xuất thực
phẩm và trong chăn nuôi... Trong đó protease là nhóm enzim được sử dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp. Người ta có thể thu enzim protease từ nhiều
nguồn khác nhau như từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Song trong cơ thể động
vật và thực vật quá trình tổng hợp e
nzim thường gắn liền với yêu cầu sống của cơ
thể vì vậy muốn thu được enzim cần phải phá bỏ các tổ chức đó. Nguyên liệu động
vật để sản xuất enzim thường phải tươi lấy ngay sao khi động vật vừa bị giết chết
và bảo quản ở -20
0
C, thời gian thu hoạch dài làm cho việc sử dụng động vật và
thực vật để sản xuất enzim là không kinh tế và không thể đáp ứng được nhu cầu
ngày càng cao về enzim. Trong khi đó các vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn có chứa
rất nhiều loại enzim có hoạt tính cao. Chúng lại có khã năng chuyển hóa các chất

và sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại thường rẻ tiền, người
ta có thể dể dàng điều khiển sự tổng hợp enzim từ các ng
uồn nguyên liệu khác
nhau. Trong các nguồn protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng nhất là việc thu
protease từ vi khuẩn Bacillus vì thường có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn
hẳn. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu,
phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzim protease từ đất vườn”.
Với các nội dung sau:
 Phân lập và tuyển c
họn các chủng Bacillus từ đất vườn.


 Nghiên cứu hình thái tế bào và khuẩn lạc, một số đặc tính sinh học cơ bản.
 Nghiên cứu nuôi cấy trên môi trường tiêu chuẩn và môi trường thay thế để
thu được sinh khối lớn và hoạt tính enzim protease cao.
 Nghiên cứu phương pháp tách chiết và thu nhận chế phẩm protease có hoạt
lực cao.
 Ý nghĩa của đề tài
 Ý nghĩa khoa học
Góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái của tế bào và khuẩn lạc
của một số vi khuẩn t
huộc nhóm Bacillus, các điều kiện, các yếu tố môi
trường và ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến việc thu sinh khối và thu
enzym protease của vi khuẩn.
 Ý nghĩa thực tiễn
Dựa trên những gì thu được trong quá trình nghiên cứu góp phần giúp
xác định được một số môi trường dinh dưỡng phù hợp có thể ứng dụng vào
qui mô sản xuất lớn hơn để thu sinh khối hoặc thu chế phẩm en
zym
protease có hoạt tính cao.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn Bacillus
1.1.1. Đặc điểm chung
Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí do chúng
có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí tùy tiện. Phần lớn các chủng thuộc
các loài của giống này đều có khả năng sinh ra nhiều - amylase và protease kiềm,
có một số chủng sinh ra xenlulase, giống này không sinh ra lipase.
 Bacillus là vi khuẩn Gram dương
 Hình dạng: hình que có kích thước khác nhau (0,5-2,5)x(1,2-10)m.
 Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động.
 Dinh dưỡng
: Là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lượng nhờ
oxi hóa các hợp chất hữu cơ
 Chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện.
 Bacillus có khả năng sinh bào tử. Thông thường bào tử được tạo ra khi tế
bào đã trãi qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh
dưỡng. Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một bào tử. Khi bào tử trưởng thành
tế bào dinh dưỡng tự phâ
n giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ.
Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì
chúng có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm. Bào tử của vi

khuẩn không phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là một hình thức
thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những điều kiện sống bất lợi.
 Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH
= 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10
như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus
acidocaldrius.[7]
 Về nhiệt độ có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (45
0
C – 75
0
C), hay ưa lạnh (5
0
C
– 25
0
C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 34
0
C – 37
0
C.


Hầu hết Bacillus không gây độc cho người và động vật. Một số loại gây độc
cho côn trùng . Chùng có khả năng sinh enzim ngoại bào do đó được ứng dụng
nhiều trong công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp....
Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:
1.1.1.1. Bacillus subtilis [4], [14], [17], [18]
Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Rober Knoch tên là
Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872
Bacillus subtilis phân bố nhiều trong đất đặc biệt là cỏ khô nên còn được

gọi là trực khuẩn cỏ khô.
Hình dạng: có dạng hì
nh que, ngắn và nhỏ, kích thước 0,6 x (3-5) m.
Bacillus subtilis là vi khuẩn gram dương, đôi khi các tế bào nối lại với nhau tạo
thành chuổi dài, ngắn khác nhau hoặc các tế bào đứng riêng rẽ.
Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám trắng, hoặc tạo ra lớp màng
mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi lõm nhiều hay ít, bám
chặt vào môi trường thạch.
Bacillus subtilis có lớp màng nhày (giáp mạc), được cấu tạo chủ yếu từ
polypeptit chủ yếu là axit polyglutamic. Việc hình t
hành màng nhày giúp vi
khuẩn có khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt nhờ màng nhày có khả năng
dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi khô hạn. Màng nhày
có thể quan sát được khi nhuộm tiêu bản: qua kính hiển vi ta có thể nhìn thấy
màng nhày của vi khuẩn Bacillus subtilis là không màu, trong suốt, tế bào của vi
khuẩn bắt màu đỏ trên nền tiêu bản xa
nh hoặc đen.
Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của Bacillus subtilis là 36
0
C –
50
0
C, tối đa khoảng 60
0
C, là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng
chịu được nhiệt khá cao.
Bào tử có hình bầu dục, kích thước 0,6m – 0,9m. Phân bố không theo
nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát

tán rộng rãi, được tạo ra vào cuối thời kì sinh sản của vi khuẩn. Do mỗi tế bào
chỉ tạo ra một bào tử nên đây không phải là một hình thức sinh sản mà chỉ là
một hình thức thích nghi giúp vi khuẩn vượt qua các điều kiện sống bất lợi. Bào
tử có thể sống từ vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy
trì sức sống trong 200-300 năm của bào tử Bacillus subtilis [6]. Khi gặp điều
kiện thuận lợi những bào tử nà
y sẽ phục hồi và tiếp tục chu kì sống của mình.
Các vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phân hủy pectin và
polysaccarit ở mô thực vật và góp phần tạo ra các nốt trên củ khoai tây bi u.
Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung
thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp
phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh
trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều kiện tối ưu. C
húng là nguyên nhân gây
hỏng bánh mì và nhiều thực phẩm khác [16].
Bacillus subtilis sinh ra rất nhiều loại enzim, đặc biệt là  amylase và
protease kiềm có giá trị cao, ngoài ra Bacillus subtilis có khả năng sinh ra
riboflavin ( tiền vitamin B
2
)[3]. Vì vậy chúng được ứng dụng nhiều trong công
nghiệp cũng như một số ngành khác.
1.1.1.2. Bacillus megaterium
Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn”. Tế bào của nó khá lớn, gấp 2 lần
tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2-1,5)m có thể đến 2m, dài từ
3m -12m, ở các giống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn đôi khi hình thoi
với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ,
glyc
ogen) [4].
Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7 – 1)m, bào tử
lớn nhất có đường kính từ 1,2 – 1,5 m. Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều

ngang hoặc xiên của tế bào.[4]


Khuẩn lạc tròn đều, không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn
sóng, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu
trắng sữa hay đục.
Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kì
một yếu tố sinh trưởng nào.
Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzim tương tự như Bacillus
subtilis nên cũng được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp.
1.1.1.3. Bacillus mensentericus
Bacillus mensentericus rất giống Bacillus subtilis. Thường có trong đất,
hạt m
ì và ngũ cốc và đặc biệt là trên khoai tây và cỏ khô.
Hình dạng tế bào hình que mảnh, dài ngắn khác nhau (3-10)x(0,5-
0,6)m. Đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuổi dài.
Khuẩn lạc ăn sâu và bám chặt vào môi trường thạch, nhăn nhúm, khô
không mọc lan ra môi trường thường có màu màu xám nhạt hoặc trắng hơi vàng
kem, vàng nâu, hồng hoặc đen.[4]
Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus
mensentericus là 36 - 45
0
C tối đa là 50 – 55
0
C, ở pH từ 4,5 – 5 thì nó ngừng
phát triển.
Bào tử của Bacillus mensentericus thường có hình bầu dục và dài
khoảng 0,5 – 0,9 m, nắm ở vị trí bất kì trong tế bào, tế bào thường không phình
to khi mang bào tử.
Bacillus mensentericus có hoạt tính enzim amylase và protease cao hơn

hẳn Bacillus subtilis nhưng lên men đường lại kém hơn. Hai loại trực khuẩn này
rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm và làm hư hỏng thực phẩm, nhất là
các thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm g
iàu đường, đây cũng là loại được
ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuất enzim protease và amylase... Ngoài ra


nó còn sinh ra một hợp chất có hoạt tính kháng một số vi khuẩn( như Vibrio)
gọi là Bacterioxin.
1.1.1.4. Bacillus cereus
Tế bào của Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 -5)m, có khi
dày hơn, chúng thường đứng riêng rẽ hay xếp thành chuổi. Bào tử có hình bầu
dục kích thước 0,9 x ( 1,2 – 1,5 )m nắm lệch tâm, tế bào chất của nó có chứa
các hạt và không bào.[4]
Khuẩn lạc của Bacillus cereus là khuẩn lạc phẳng, khá khuyếch tán, hơi
lõm, trắng đục, mép lồi lõm [4].
Bào tử của nó phát tán khắp nơi, t
rong đất, không khí... Thường sinh sôi
và nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh ra độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Nó
còn được áp dụng để sản xuất thuốc kháng sinh. [16]
1.1.1.5. Bacillus pumilus
Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường Baccillus pumilus có mặt
trong đất nhiều hơn Bacillus subtilis.[7]
Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó
gần giống với tế bào của Bacillus subtilis.[7]
1.1.
1.6. Bacillus polymyxa
Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1 ) x (2 -7)m, đứng
riêng rẽ hay xếp thành đôi hoặc chuổi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ
phồng lên hình quả chanh. [4]

Khuẩn lạc của Bacillus polymyxa không màu, phẳng hoặc lồi, trơn,
nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy.[18]
Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chúng
phát tán rộng, kích thước dài khoảng ( 1,7 – 2,6) m, nằm giữa tế bào.
Loại vi khuẩn nà
y làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng còn
có khả năng cố định đạm.


Chúng thường sinh trưởng và phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì
vậy, người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những
môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để
sản xuất thuốc kháng sinh polimixin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và
có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược.
1.1.1.7. Bacillus brevis
Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm.
Bacillus brevis là trực k
huẩn kích thước ( 0,7 -1) x (3 -5 )m. Chúng
thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ (0,8 – 1)m, nằm cuối tế
bào làm cho đầu tế bào hơi bị phồng to lên.[4]
Khuẩn lạc thường màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp
lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc.
Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu hỗn hợp axit amin cho
sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitam
in.
1.1.1.8. Bacillus simplex
Tế bào của Bacillus simplex thường nhỏ bé , có kích thước ( 2-5)x
0,6m, thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi.
Khuẩn lạc giống khuẩn lạc của Bacillus cereus, phẳng khá khuyếch tán,
với bề mặt hơi xù xì. hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc biệt khuẩn lạc của

Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi
trường.[4]
Bào tử có hình bầu dục, có kích thước từ 0,6 – 0,
9 m, nằm lệch tâm.
1.1.1.9. Bacillus linchenniformis
Bào tử của chúng chủ yếu phát tán trong đất. Chúng sinh trưởng và phát
triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra Bacitracin,
một loại kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến


trong công nghiệp dược và sản xuất kháng sinh dùng trong chăn nuôi làm chất
kích thích sinh trưởng.
1.1.2. Một số nghiên cứu và ứng dụng của giống Bacillus ở VN và trên thế giới
Hiện nay chủng Bacillus đang được ứng dụng vào rất nhiều các lĩnh vực sản
xuất khác nhau để phục vụ cho đời sống của con người như :
1.1.2.1. Sinh tổng hợp enzim
Ở Việt Nam công nghệ enzym gần như chưa phát triển nhiều. Tuy đã có
rất nhiều cá
c nghiên cứu đề cập đến việc sản xuất các enzym của động vật, thực
vật và vi sinh vật nhưng hầu như chưa có enzym nào được sản xuất với qui mô
công nghiệp. Việt Nam vẫn hoàn toàn lệ thuộc vào nguồn enzym của nước
ngoài.[9]
Hiện nay chủng Bacillus đang được ứng dụng để sản xuất một số enzym
sau:
Tên Enzym
Mã số
EC
Nguồn
Nội bào(I) /
Ngoại bà

o (E)
Sản
lượng
Ngành ứng
dụng
-Amylase
3.2.1.1
Bacillus
E +++ Starch
-Amylase
3.2.1.2
Bacillus
E + Starch
Glucose isomerase
h
5.3.1.5
Bacillus
I ++ Fructose syrup
Penicillin amidase 3.5.1.11
Bacillus
I - Pharmaceutical
Protease
i
3.4.21.14
Bacillus
E +++ Detergent

(Nguồn
Các enzym này có vai trò trong nhiều ngành sản xuất khác nhau.
1.1.2.2. Công nghệ thực phẩm [16]

Việc ứng dụng vi sinh vật vào việc chế biến thực phẩm là những công
trình đầu tiên của con người trong lĩnh vực này. Ngày nay người ta ứng dụng vi
khuẩn Bacillus để sản xuất ra các enzym có vai trò quan trọng trong công nghệ
thực phẩm như amylase dùng để đường hóa tinh bột v.v...
1.1.2.3. Dược phẩm và y tế [16]


Trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe con người và vật nuôi, công nghệ vi
sinh vật cũng tạo ra được nhiều loại thuốc trị bệnh hữu hiệu, nhất là những bệnh
nhiểm khuẩn như : kháng sinh...như penixilinase sản xuất từ Bacillus subtilis.
1.1.2.4. Nông nghiệp và đời sống [35]
Trong trồng trọt các chất hoạt động do vi sinh vật sinh ra có thể dùng
làm thuốc trừ sâu và bảo vệ thực vật như Bacillus thuringiensis gâ
y bệnh cho
côn trùng và các chất trao đổi có tính độc của nó được dùng như những chất diệt
côn trùng đặc hiệu.
1.1.2.5. Bảo vệ môi trường [23]
Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường vì
chúng tham gia vào quá trình phân hủy các chất trong vòng tuần hoàn vật chất.
Nhờ có các loại vi sinh vật trong đó có vi khuần Bacillus mà các rác thải được
thải ra do hoạt động sống của con người sẽ được phân hủy.
1.1.
3. Hệ enzim của vi khuẩn Bacillus
Bacillus có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzim có hoạt tính cao như
protease, amylase, xenlulase.
1.1.3.1. Protease
Protease là enzim xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid[-CO-NH-]
giữa các loại axit amin trong phân tử protein (hay các nhóm polypeptid) thành
axit amin.
Protease là một nhóm enzim phân giải protein (gồm proteinaza,

peptidaza, desaminaza....) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt động ở
bên ngoài tế bào.
Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong
việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống.




1.1.3.2. Amylase
Amylase là các enzim xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột và các
polyoza tương tự như dextrin, glucogen. Có hai loại amylase là: -amylase, -
amylase và glucoamylase tuy nhiên các chủng Bacillus thường chỉ có khả năng
tổng hợp -amylase còn không tổng hợp được - amylase và glucoamylase [9]
-amylase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết -1,4 glucozit nội
mạch ở bất kì vị trí nào trong phân tử tinh bột với cơ chất là amyloza. -
amylase cho sản phẩm thủy phân chủ yếu là maltoza (khoảng 87%) và một ít
glucose (13%) với cơ chất là amylopectin, -amy
lase chỉ thủy phân liên kết 1,4
không thủy phân liên kết 1,6. Trong họ Bacillus thường gặp rất nhiều chủng
phát triển ở nhiệt độ không cao nhưng lại sinh ra -amylase chịu nhiệt cao.
1.1.3.3. Xenlulase
Xenlulase là một phức hệ enzim phức tạp xúc tác cho sự thủy phân
xenlulose thành xenlobiose và cuối cùng thành glucose.
Một phức hệ enzim xenlulase gồm 3 enzim chủ yếu đó là:
 Endogluconaza hay CMC-ase: là enzim tấn công chuổi xenlulose
một cách tùy tiện và phân hủy liên kết -1,4 glucozit.
 Enxogl
uconase hay xenlobiohydrolase: giải phòng xenlobiose hoặc
glucose từ đầu không khử của xenlulose, tác dụng yếu lên CMC, nhưng
tác dụng mạnh lên xenlulose vô định hình hoặc xenlulose đã được phân

hủy một phần.
 - glucozidase hay xenlobiose : thủy phân xenlobiose và các
xenlodextrin khác hòa tan trong nước.





1.2. Enzim protease
1.2.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu enzim [9], [34], [35]
Từ trước thế kỉ 17 con người đã biết sử dụng rộng rãi các qui trình enzim
trong hoạt động thực tế như làm bánh mì, bia, rượu...tuy nhiên, việc ứng dụng
enzim trong giai đoạn này hoàn toàn có tính chất kinh nghiệm thuần túy.
Từ thế kỉ 17 đến thế kỉ 19, người ta đã đề ra được khái niệm lên men.
Vanhelmont, người Hà Lan, lần đầu tiên đã quan sát được sự tạo thành các chất kh
í
khác với không khí trong quá trình lên men.
Năm 1659, Silvius lần đầu tiên đã chỉ ra rằng tất cả các quá trình sống đều là
những quá trình hóa học.
Năm 1787, Pabroni cho rằng bản chất quá trình lên men và sự phân giải một
chất này bởi một chất khác là “ferment”.
Năm 1876, Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là
enzim.
Trong số tất cả các enzim của hệ tiêu hóa thì protease là enzim được nghiên
cứu sớm hơn tất cả. Các protease ở động vật đư
ợc nghiên cứu sớm nhất.
 Từ thế kỉ 18, nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã
phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt.
 Năm 1836, Schwann đã quan sát được hoạt động phân giải protein của
dịch vị. Tuy nhiên, 30 năm sau mới tách được enzim này.

 Năm 1857, Corvisar đã tách được tripsin từ dịch tụy, đây là protease đầu
tiên nhận được dưới dạng c
hế phẩm, những chế phẩm này vẫn còn lẩn nhiều
enzim và protein khác.
 Năm 1861, Brucke đã tách được pepsin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương
đối tinh khiết.
 Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colodion đã tách
được tripsin với amylase tụy tạng.


 Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin (renin).
Ngoài ra cũng có một số nghiên cứu về protease trong máu. Schmidt (1869-
1872) đã nêu giả thuyết rằng trong máu có enzim fibrin tham gia vào quá trình làm
đông máu. Tác giả cũng đã tách enzim này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm thu được
có tác dụng làm fibrinogen đông lại nhanh chóng.
Các protease ở thực vật được phát hiện muộn hơn
 Năm 1874, Group Besanez công bố đã thu nhận được protease từ hạt của
một số loại hạt đậu đều có hoạt tính phân giải protein.
 Năm
1879, Wurtz được xem là người đầu tiên tách được protease ở thực
vật. Ông thấy rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có protease, khi dùng
cồn kết tủa sẽ nhận được chế phẩm không tinh khiết (100g/cây) gọi là papain.
 Đến nữa đầu thế kỉ 20, người ta mới phát hiện thêm các peptid hydrolase
khác như:
 Bromelin protease có trong các phần khác nhau của cây dứa
(Willstatter, Grassmanm, Ambros 1926).
 Fixin protease có trong các cây thuộc giống Ficus (Walti, 1938)
Trong khi đó các pr
otease của vi sinh vật chỉ được chú ý nghiên cứu từ năm
1950, mặc dù từ năm 1918-1919, Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải

protein của xạ khuẩn. Trong vài chục năm sau đó, số công trình nghiên cứu
protease của vi sinh vật đã phát triển nhanh chóng. Một số công trình thu protease
từ vi sinh vật như:
Enzim
, nguồn nguyên liệu Tác giả Năm
Subtilizin A (Bacillus subtilis)
Peptidase A (Streptococus)
Protease kiềm (Aspergillus oryzae)
Aspergilopeptidase A ( Aspergillus satoi)
Guntelberg và Ottensen
Elliot
Crewther và Lennox
Yoshida
1950
1950
1950
1956


Protease kiềm (Pseudomonas aeruginosa)
Subtilopeptidase C (
Bacillus amyloliquefaciens
)
Keratinase (Streptomyces fradiae)
Elastase (Pseudomonas aeruginosa)
Protease (Arthrobacter)
Protease trung tính II
(Bacillus amylosacchariticus)
Protease kiềm ( Apergillus sydowi)
Morihara

Hagihara và cộng sự
Nickerson, Durand
Morihara Tsuzuki
Hofsten và cộng sự
Tsuru và cộng sự
Danno, Yoshimura
1957
1958
1963
1965
1965
1966
1967

Nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease với số lượng lớn. Các
enzim này có thể ở trong tế bào (nội bào) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy
(ngoại bào).
Vi sinh vật là nguồn sản xuất protease tương đối l y tưởng vì nó có khá nhiều
ưu điểm so với các nguồn khác như động vật và thực vật.
1.2.2. Phân loại và các đặc điểm của protease [9], [12], [17]
Protease là enzim thuộc nhóm hydrolase, thủy phân liên kết peptid CO-NH
của phân tử protein và pepti
d thành các axitamin tự do và một ít peptid khối lượng
phân tử nhỏ.
Theo kết quả nghiên cứu trên các protease từ 1950 đến nay cho thấy các
protease của mỗi loài sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Hiện nay có
nhiều cách gọi tên và phân loại nhóm của protease, và được thay đổi qua nhiều thời
kì.
1.2.2.1. Theo phân loại quốc tế các enzim thuộc nhóm này được chia thành
4 phân nhóm phụ

 Aminopeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptid ở đầu
Nitơ của mạch polypeptid.
 Cacboxypeptidase: xúc tác cho sự thủy phâ
n liên kết peptid ở đầu
cacbon của mạch polypeptid.


 Dipeptihydrolase: xúc tác cho việc thuỷ phân các liên kết dipeptid.
 Proteinase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.
1.2.2.2. Phân loại theo trung tâm hoạt động của enzim (Barrett-1984)
Theo Barrett, protease được chia thành 4 nhóm nhỏ, tên của các nhóm
này gồm tên của các axit amin quan trọng nhấtcó vai trò xúc tác trong trung tâm
hoạt động của enzim.
 Protease serine (EC 3.4.21.): là những protease có nhóm (-OH) của
serine trong trung tâm hoạt động. Các protein serine này thường hoạt
động ở vùng pH kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng.
 Protease cystein ( EC 3.4.22.): là các protein có nhóm thiol (-SH)
của axit amin cystein ở trung tâm hoạt động. Nhóm (-SH) này có vị
trí đặc biệt trong trung tâm hoạt động của enzim
, vì nó có khả năng
tham gia phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hoá học
 Protease aspartic (EC 3.4.23.) : là những protease chứa nhóm (-
COOH) trong trung tâm hoạt động. Nhóm này thường hoạt động
mạnh ở vùng pH là axit, bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl
ester (DNME) và có tính đặc hiệu đối với các axit amin có vòng
thơm hoặc axit amin kị nước ở cả hai phía của liên kết peptit bị thủy
phân.
 Protease kim loại (EC 3.4.24.): Là những protease mà trong trung
tâm hoạt động của chúng có những i
on kim loại. Nhóm này thường

hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính.
1.2.2.3. Phân loại theo pH tác dụng tối ưu của protease
Dựa vào pH hoạt động của các protease người ta chia nó ra thành 3 loại:
 Protease acid: hoạt động trong khoảng 3-3,8.
 Protease base: hoạt động trong khoảng 8,5-8,9.
 Protease trung tính.


Tuy nhiên, tác động tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của
cơ chất vì cùng một loại protease của một chủng vi khuẩn, khi thủy phân casein,
hemiglobin, gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau.
1.2.3. Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vi sinh vật [1], [9], [14], [15]
Khác với protease của thực vật và động vật, protease của vi sinh vật là những
enzim ngoại bào. Hệ protease của vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm
nhiều enzim rất giống nhau về hì
nh dạng cấu trúc và khối lượng phân tử nên rất khó
tách ra dười dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzim khác
nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy
phân triệt để và đa dạng. Protease do vi khuẩn tổng hợp có khả năng chịu được
nhiệt độ cao hơn các nguồn khác.
Protease là loại enzim đư
ợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: công
nghiệp thực phẩm, y học, nông nghiệp v.v...Ở nước ta các nghiên cứu về protease
được bắt đầu từ những năm 60.
1.2.3.1. Trong công nghiệp thực phẩm
Protease của vi khuẩn được sử dụng trong quá trình chế biến cá. Ở mang
cá, đặc biệt là ở ruột cá nguồn vi sinh vật rất phong phú. Khi làm nước mắm,
muối cá, sản xuất bột cá ...protease có trong ruột cá thủy phân một p
hần protein
của cá...Trong một số trường hợp khi thêm protease sẽ làm tăng hương vị của sản

phẩm.
Ngoài ra protease còn được sử dụng để làm mểm thịt và tăng hương vị
thịt sau khi chế biến. Nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến sẽ
làm tăng hương vị thịt.
Việc thủy phâ
n protein bằng protease không phá hủy các vitamin có
trong nguyên liệu, không làm sẩm màu dịch thủy phân và không tạo thành các
sản phẩm phụ khác.


Người ta cũng sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ
các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da...và để sản xuất thức ăn kiêng.
Một số protease có khả năng làm đông sữa trong sản xuất phomat.
Protease làm phomat chóng chín, nâng cao chất lượng và có thể tạo ra nhiều loại
phomat khác nhau. Protease của vi khuẩn có thể thay thế một phần renin. Vì thế,
ta có thể giảm giá thành trong sản xuất phomat. Protease này có thể thu từ
Bacillus mesentericus.
Dùng prote
ase của vi khuẩn để thu casein kỹ thuật dùng trong các ngành
khác nhau như: vecni, chất màu, hương liệu... Nó cũng được sử dụng trong sản
xuất chao và các dịch thủy phân.
1.2.3.2. Trong công nghiệp nước giải khát
Protease được sử dụng để làm trong bia và nước quả. Được sử dụng
trong quá trình sản xuất rượu giúp phân giải các protein có tác dụng kìm hãm
amylase do đó làm tăng quá trình đường hóa tinh bột.
1.2.3.3. Trong công nghiệp thuộc da
Protease còn được sử dụng để làm mềm d
a, tăng cường khả naăng tách
lông ra khỏi da mà không là ảnh hưởng đến chất lượng da, vì vậy, da thu được sẽ
mềm và sạch lông hơn.

1.2.3.4. Trong mỹ phẩm
Protease được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng
tắm, kem bôi mặt...Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da
mịn. các loại xà phòng có chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn
protein như: vết m
áu..khá tốt.
1.2.3.5. Trong nông nghiệp
Protease được sử dụng để xử l ý các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho
vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hệ số sử dụng thức ăn, có thể


tiến hành bằng cách thêm trực tiếp protease vào thức ăn trước khi dùng hoặc
dùng protease để xử l ý sơ bộ thức ăn.
1.2.3.6. Trong nghiên cứu khoa học
Được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc protei
n
1.2.
3.7. Trong công nghiệp dược phẩm và y học
Sản xuất các chất hoạt hóa và kiềm hãm protease để điều trị các bệnh đặc
trưng. Protease được sử dụng để tăng khả năng tiêu hóa protein ở những người bị
tiêu hóa kém
do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường do thiếu enzim.
Protease còn được sử dụng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể để chữa
bệnh nghẽn tỉnh mạch. Protease được sử dụng để làm tiêu mủ ở các vết thương,
các ổ viêm, làm thông đường hô hấp...
1.2.3.8. Trong xử lý rác
Hiện nay đất nước đang ngày càng phát triển, dân số tăng nhanh, khối
lượng chất thải đặc biệt là rác hữu cơ trong công nghiệp, nông nghiệp và sinh
hoạt tăng rất nhanh. Theo tính toán của c
ông ty công trình đô thị I, mổi ngày

người Hà Nội thải ra khoảng 1500m
3
rác. Mỗi năm, một người dân ở thành phố
Hồ Chí Minh trung bình thải ra 160 kg rác. Như vậy, khối lượng rác mà thành
phố thãi ra mỗi năm là 360000 tấn.
Phần lớn rác được đưa đến các bãi rác để đem chôn, đem đốt hoặc đổ vào
các dòng nước đây là nguồn gốc lây lan của các ở bệnh tật, phát sinh ra các độc
chất gây ô nhiểm không khí ảnh hưởng đến con người, vật dụng gia súc và hoa
màu. Trong rác vi khuẩn thương hàn có thể tồn tại 115 ngày, vi khuẩn phó
thương hàn tồn tại 136 ngày, vi khuẩn kiết lỵ 40 ngày, trứng giun đũa 300 ngày.

Rác không được dọn kịp thời sẽ gây tắc nghẽn cống rãnh hoặc án ngữ đường
phố, tạo môi trường tốt cho ruồi muổi và các loài trung gian truyền bệnh khác
phát triển.


Hiện nay, người ta xử lý rác bằng cách đốt ở các nhà máy thu hơi nhiệt
cho nhà mát phát điện hoặc nhà mày hơi công nghiệp. Khi đốt như thế các chất
thải là các chất tổng hợp, cao su sẽ gây ra nhiều khì độc như SO
2
, SO
3
, P
2
O
5
,
NO, NO
2
, CO... gây hại cho sức khỏe.

Nhờ tiến bộ của công nghệ sinh học, người ta đã đề ra con đường xử lý
rác bằng c
on đường sinh học. Tức là phân hủy rác hữu cơ dưới tác dụng của vi
sinh vật. Nguồn vi sinh vật có hoạt tính protease hiện hữu khá phong phú trong
tự nhiên.. Người ta có thể sử dụng các vi sinh vật này để phân hủy các nguồn
protein động vật và thực vật có trong rác hữu cơ. Để giải quyết vấn đề bảo vệ
môi trường sống, đồng thời tận dụng phế liệu sản xuất ra những vật liệu qua
n
trọng cho các ngành. Một trong những biện pháp tốt nhất là tái xuất phế thải làm
phân bón hữu cơ, giá thể trồng nấm, nuôi giun... Trong rác có chứa một số chất
hữu cơ, cũng như các yếu tố dinh dưỡng dùng để bổ sung độ phì nhiêu cho đất và
làm tăng thu hoạch cây trồng. trung bình trong 10 tấn rác có 900-1900kg chất
hữu cơ theo hướng nà
y rác có thể ủ thành đống, tại đây sẽ xảy ra các quá trình
phân giải các chất hữu cơ của vi sinh vật. Nhiệt độ của các đống ủ khoảng 50
0
C.
Muốn cho quá trình ủ rác diễn ra nhanh hơn người ta cho thêm vào đó các loại vi
khuẩn như Streptomyces, Azotobacter, một số nấm mốc như Rhizobium.
Ở nước ta hiện nay đã có những nhà máy ủ phân rác để bổ sung chất hữu
cơ cho nông nghiệp như nhà máy DANO (hóc môn) công suất 5 tấn/ ngày. Tại
đây ủ phân rác dựa trên các tác động phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật. Các
điều kiện bên ngoài có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi sinh vật trong quá
trình ủ rác. Do đó phải tạo điều kiện cần t
hiết nhằm thúc đẩy mạnh hoặc khống
chế hoạt động của vi sinh vật làm cho rác hoại kĩ hơn, đỡ mất chất dinh dưỡng.
1.2.3.9. Trong kỹ nghệ phim ảnh
Protease từ vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu cảm quan
khác nhau như phim điện ảnh, phim rơnghe
n, phim chụp. Nó sẽ phân giải và hòa

tan lớp nhủ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử
dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quí.
1.3. Thu nhận enzim từ vi sinh vật
1.3.1. Ưu điểm của việc sản xuất enzim từ vi sinh vật [9], [16]
Việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzim có những ưu điểm sau:
 Có thể chủ động quá trình sản xuất enzim từ vi sinh vật vì quá trình sinh
trưởng, phát triển và tổng hợp enz
im của vi sinh vật hoàn toàn không phụ
thuộc vào điều kiện bên ngoài.
 Chu kì sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật ngắn do đó việc sản xuất
enzim từ vi sinh vật trong thời gian ngắn từ 36 – 60 giờ.
 Có thể dễ dàng định hướng việc tổng hợp enzim từ vi sinh vật theo hướng
sản xuất chọn lọc enzim với số lượng lớn.
 Giá thành của enzim sản xuất từ vi sinh vật thấp. M
ôi trường nuôi cấy vi
sinh vật thường đơn giản và rẻ tiền.
 Các enzim thu được từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao.
 Vi sinh vật có thể cùng lúc sinh tổng hợp nhiều loại enzim khác nhau
1.3.2. Lý thuyết về sinh tổng hợp enzim cảm ứng
Hiện nay người ta có thể điều khiển được tốc độ sinh tổng hợp enzim trong
khi sản xuất. Các enzim tham gia thủy phân đư
ợc vi sinh vật tổng hợp là những
enzim cảm ứng. Hiện tượng cảm ứng trong tổng hợp enzim được Monod-Jacob tìm
ra vào năm 1961, cơ chế điều khiển này thể hiện rất rõ ở vi sinh vật. Tác động của
các yếu tố bên ngoài lên tế bào vi sinh vật thường là tác động trực tiếp, tế bào vi sinh
vật phản ứng lại các tác động này thường cũng rất nhanh. Chính vì thế ta có thể sử
dụng các yếu tố mô
i trường như nhiệt độ, độ pH và đặc biệt là cơ chất để điều khiển

quá trình sinh tổng hợp enzim của vi sinh vật.
Các enzim thủy phân một chất nào đó và khi có mặt chất đó trong môi trường
nuôi cấy thì lượng enzim này được tổng hợp ra gấp nhiều lần so với bình thường khi


không có cơ chất, được gọi là enzim cảm ứng. Các chất được đưa vào môi trường
nuôi cấy để kích thích tổng hợp ra enzim cảm ứng được gọi là cơ chất cảm ứng. Cơ
chất cảm ứng thường được coi là yếu tố quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh
tổng hợp enzim.
Khi ta cho cơ chất với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzim cảm
ứng của vi sinh vật cũng sẽ tăng dần. N
hưng nếu ta vẫn cứ tiếp tực tăng nồng độ cơ
chất lên đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chựng lại hoặc giảm do hiện tượng
tăng áp suất thẩm thấu bởi cơ chất gây nên.
Như vậy, để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzim bằng cơ chất cảm ứng
cần chú ý:
 Có gen tương ứng trong nhiểm sắc thể của tế bào.
 Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng các phần tử en
zim đó
 Năng lượng cần thiết dùng cho tổng hợp enzim.
 Muốn thu nhận enzim cảm ứng nào thì phài cho cơ chất cảm ứng của enzim
đó vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
 Tác động cảm ứng chỉ đạt hiệu quả cao ở một liều lượng nhất định. Nếu vượt
quá liều lượng nà
y sẽ làm cho quá trình tổng hợp enzim giảm. Do đó, không
phải cho càng nhiều cơ chất thỉ khả năng sinh tổng hợp enzim sẽ càng cao.
Bình thường khi không có cơ chất cảm ứng, chất kìm hãm có trong tế bào sẽ
tương tác với gen điều khiển làm cho quá trình tổng hợp enzim bị ức chế. Khi ta cho
cơ chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy, cơ chất sẽ tương tác với chất kìm
hãm và

các gen tương ứng. Enzim được tổng hợp sẽ phân hủy cơ chất . Khi đó chất kìm hãm
sẽ không bi phong tỏa nên tương tác với gen điều khiển ức chế quá trình tổng hợp.
Như vậy, muốn enzim được tổng hợp ta phải luôn cho cơ chất cảm ứng vào môi
trường. Trong công nghiệp sản xuất enzim cần phải lựa chọn những cơ chất cảm ứng
thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong mội trường để có hiệu quả sinh

tổng hợp cao nhất.


1.3.3. Chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh enzim cao
Không phải tất cả các loại vi sinh vật đều có khả năng sinh enzim như nhau và
ngay cả những chủng của cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợp
enzim. Vì vậy người ta cần phải lựa chọn trong số rất nhiều loại vi sinh vật để có
được những chủng có hoạt lực cao trong việc tạo ra các enzim thuần khiết. Trong số
đó Bacillus subtilis đã trở thành nguồn c
hủ yếu trong việc sản xuất ra nhiều loại
enzim khác nhau được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực kĩ thuật.
Ngoài ra để nâng cao hoạt tính của enzim người ta còn tiến hành các biện pháp
gây đột biến để tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền
của vi sinh vật tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzim cao hơn hẳn
chủng ban đầu
1.3.4. Ảnh hưởng của yếu tố môi trường lên khả năng sinh enz
im
Quá trình tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố
khác nhau. Để thu nhận được với hiệu suất cao nhất khi phân giải protein bởi sinh
khối của vi sinh vật, ta cần tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy. Muốn vậy ta phải
nghiên cứu kĩ các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải protein của vi sinh vật.
1.3.
4.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật, khả năng sinh tổng

hợp enzim của vi sinh vật, tính chất của enzim được tổng hợp. Tùy từng loài vi
sinh vật nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Các loại mốc phát triển thích hợp ở
22
0
C – 32
0
C còn các loại vi khuẩn phát triển thích hợp ở 35
0
C – 55
0
C. Nói
chung, đa số vi sinh vật tổng hợp protease không bền nhiệt và bị kìm hãm nhanh
chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp.
1.3.4.2. Độ pH
Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng
đến quá trình tổng hợp enzim ở vi sinh vật và hầu như không thay đổi trong quá
trình phát triển của vi sinh vật. Đối với nấm mốc pH
op
từ 6-6,5 và đối với vi


khuẩn pH
op
trung tính từ 6,6-7,4. Khi dùng phương pháp bề sâu, pH môi trường
có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai trò quyết định đối với sự phát triển và sự
tích lũy protease của môi trường của vi sinh vật. Điều này thể hiện khá rõ ở các
loài thuộc giống Bacillus, pH môi trường thường có thể thay đổi sau khi khử
trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật, pH ban đầu thích hợp cho sự
phát triển của vi sinh vật là đối với nấm mốc pH từ 3,
8-5,6, đối với vi khuẩn là

6,2-7,4. Trong quá trình nuôi cấy tùy theo thành phần môi trường và các sản
phẩm trong quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật, pH của môi trường sẽ chuyển
dần về phía axit hoặc kiềm. Đối với các loài thuộc giống Bacillus, pH thường
chuyển về phía kiềm. Nhiều khi có thể căn cứ vào pH của môi trường sau khi
nuôi cấy để dự đoán lượng protease được tích lũy trong môi trường. Theo tác giả
Lê Ngọc Tú- La văn Trứ pH môi trường ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa các protease
đư
ợc tổng hợp. Do đó, nếu giữ cho pH luôn có giá trị xác định trong suốt quá
trình nuôi cấy, vi sinh vật sẽ tạo thành mạnh mẽ một dạng protease xác định,
chiếm ưu thế trong môi trường.
1.3.4.3. Ảnh hưởng của độ thông khí
Độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng hợp
protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo từng loài vi sinh vật.
Trong một số trường hợp t
hiếu oxi tuy kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật
nhưng lại tăng quá trình tổng hợp protease.Sự thiếu khí mạnh sẽ kìm hãm sự
tổng hợp protease. Lượng oxi thích hợp cho quá trình tổng hợp protease ở vi sinh
vật có khác nhau. Ngay cả đối với một vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng
ảnh hưởng khác nhau đến quá trình tổng hợp các protease khác nhau.
1.3.4.4. Độ ẩm
Độ ẩm của môi trường lên men cũng là một yếu tố cần thiết cho sự sinh
trưởng của
vi khuẩn khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt. Thông thường thì