Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid từ đồ uống boza’’

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Acid gamma polyglutamic (γ-PGA) là một polyme tự nhiên có các tính
chất sinh hóa học quan trọng như có khả năng hòa tan trong nước, phân hủy
sinh học, không độc và ăn được. γ-PGA được ứng dụng rộng rãi trong ngành
công nghệ thực phẩm, dược phẩm sinh học, y tế, mỹ phẩm, xử lý môi trường
và các lĩnh vực khác (Shih et al. 2001).
γ-PGA được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn (tất cả vi khuẩn gram
dương), trong đó chủ yếu là chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ sản
phẩm lên men truyền thống như: vi khuẩn Bacillus subtilis (Bacillus subtilis
Natto) được phân lập từ natto ở Nhật Bản (Shih et al. 2001), Thua-nao từ Thái
Lan, chungkookjang từ Hàn Quốc.
Bên cạnh các sản phẩm lên men kể trên, một loại sản phẩm lên men
truyền thống đang được quan tâm tới khả năng có thể phân lập được các
chủng Bacillus có hoạt lực sinh γ-PGA cao đó là Boza.
Boza được biết đến là một loại đồ uống lên men truyền thống được làm
từ lúa mì hoặc kê, có độ nhớt và nồng độ cồn thấp, thường là từ 0,5% – 1 %,
có vị ngọt và chua, đây là một sản phẩm lành tính và giàu dinh dưỡng. Trong
boza có chứa hỗn hợp vi khuẩn lactic và nấm men có lợi cho sức khỏe như:
Lactobacillus brevis subsp. lactis, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis,
Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Enterococcus
faecium, Lactobacillus graminis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus
pentosaceus, Lactobacillus rhamnosus, Pediococcus sp. và Lactobacillus
paracasei, Bacillus subtilis (Kivanc et al. 2011). Hệ vi sinh vật trong Boza lên
men tạo các sản phẩm giàu dinh dưỡng, trong đó chủng vi khuẩn Bacillus có
khả năng tổng hợp γ-PGA.
Với nhu cầu ngày càng cao về γ-PGA, các nhà nghiên cứu không
ngừng tìm kiếm và chọn lọc ra các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
γ-PGA với hiệu suất cao từ tự nhiên. Xuất phát từ vấn đề trên, để phân lập và
đánh giá khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn Bacillus trong đồ uống

Boza, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp gamma-polyglutamic acid từ đồ uống Boza’’.
1.2. Mục đích nghiên cứu
- Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA từ Boza.
- Nghiên cứu điều kiện: pH, thời gian, môi trường nuôi cấy thích hợp
để vi khuẩn tổng hợp γ-PGA cao nhất.
1.3. Yêu cầu
- Phân lập được các chủng vi khuẩn Bacillus từ Boza
- Đánh giá được ảnh hưởng của pH, môi trường và thời gian nuôi cấy
tới khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh γ-PGA từ Boza, đánh
giá được các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Giúp sinh viên rèn luyện thành thạo các kỹ thuật vi sinh như: phân
lập, nghiên cứu hình thái và động thái sinh tổng hợp γ-PGA của vi sinh vật.
- Kết quả phân lập và nghiên cứu điều kiện lên men có thể ứng dụng
trong sản xuất γ-PGA sử dụng trong thực tế.
PHẦN 2
TỔNG QUAN
2.1. Gamma-Polyglutamic acid
2.1.1. Công thức phân tử
Acid gamma-polyglutamic (γ-PGA) còn được gọi là gamma
polyglutamate. γ-PGA được tạo thành bởi đồng phân D-glutamic, L-
glutamic hoặc cả hai đồng phân nối với nhau bởi liên kết amin giữa nhóm α-
amino và γ-carboxyl tạo thành liên kết γ-peptide (Ho et al. 2006).
Hình 2.1: Công thức cấu tạo của gamma-polyglutamic acid
Tỷ lệ L-D-glutamate phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài, điều kiện nuôi
cấy. γ-PGA của chủng Bacillus subtilis (Natto) có tỷ lệ 50-80% là dạng D-

glutamate và 20-50% là L-glutamate (Kubota et al. 1993). Nhiều yếu tố cũng
ảnh hưởng đến mức độ trùng hợp của phân tử γ-PGA. Nồng độ của Mn
2+
có
thể ảnh hưởng đến cấu hình của axit glutamic trong γ-PGA được tổng hợp bởi
Bacillus subtilis. Khi môi trường có nồng độ Mn
2+
cao thì trong γ-PGA có
đồng phân dạng D-glutamate >80%, môi trường có nồng độ Mn
2+
thấp thì γ-
PGA có đồng phân dạng D-glutamate 40% (Thorne et al. 1958).
2.1.2. Tính chất vật lý
Bảng 2.1. Tính chất vật lý, hóa học của gamma-polyglutamic acid
Công thức phân tử (C
5
H
7
NO
3
) n
Công thức cấu tạo
Trọng lượng phân tử
50 kDa - 2000 kDa tùy mức độ trùng hợp
khác nhau
Tên gọi khác nhau
- Gamma-polyglutamic acid (γ-PGA)
- Axit gamma polyglutamic
- Gamma polyglutamate
- Poly [imino [1-carboxy-4-oxo-1, 4-butanediyl]]

Tính chất vật lí
- Là một polymer tự nhiên
- Tinh thể màu trắng, không màu, không mùi,
không vị
- có khả năng phân hủy sinh học
- Hòa tan trong nước
- Không độc và có thể ăn được
- Có khả năng dẫn diện
Tính chất hóa học
- không phản ứng với Coomassie blue
- Nhận biết γ-PGA bằng xanh methylene
- không bị enzyme protease phân hủy
- Có phản ứng được với kim loại để tạo muối
2.1.3. Ứng dụng của gamma-polyglutamic acid
Ngày nay con người có nhu cầu hướng tới sử dụng các hợp chất có
nguồn gốc từ tự nhiên do nó có ưu điểm là an toàn với sức khỏe và thân thiện
với môi trường và γ-PGA là một trong số đó. γ-PGA đã được nghiên cứu
nhắm tối ưu hóa các phương pháp sản xuất với quy trình ít tốn kém, nâng cao
năng suất, hạ giá thành sản phẩm và sử dụng nguồn cơ chất đơn giản, dễ kiếm
để có thể sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm,
y học, xử lý nước thải, sản phẩm vệ sinh, nông nghiệp, chăn nuôi và các lĩnh
vực khác.
2.1.3.1. Ứng dụng trong y học
γ-PGA được sử dụng trong liệu pháp gen, thuốc điều trị ung thư và các
sản phẩm da nhân tạo để chữa bỏng, γ-PGA còn được dùng tạo ra các màng
tổng hợp để chống lại sự bám hút chặt giữa tế bào bình thường với lớp mô bị
tổn thương do tai nạn hay quá trình phẫu thuật ( Furuta et al. 2000).
a) Chất vận chuyển thuốc
γ-PGA được quan tâm về khả năng vận chuyển thuốc do có tính tương
thích sinh học và phân hủy sinh học. Trong chuỗi peptide của γ-PGA có nhóm

carboxyl tạo điểm gắn cho hóa trị liệu, do đó khiến thuốc hòa tan nhiều hơn
và dễ dàng kiểm soát hơn. Liên kết γ-PGA và thuốc có thể xâm nhập vào vị
trí khối u và giải phóng thuốc, sau đó γ-PGA bị phân hủy thành acid glutamic
có thể thâm nhập vào quá trình trao đổi chất của tế bào và được bài tiết qua
thận (Li et al, 1998).
Enzym là chất xúc tác sinh học thường dễ bị ảnh hưởng bởi các tác
nhân môi trường trong đó có các tia phóng xạ (Dengyi et al.,1993; Saha et
al.,1995). Để giảm thiểu các tác nhân và nâng cao hiệu quả sử dụng enzym.
Enzym thường được kết hợp với các chất gắn, hay các hợp chất bảo vệ khác
nhau để tránh khỏi các tác nhân gây ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme. Mỗi loại
hợp chất dùng để gắn enzym đều có những ưu và nhược điểm riêng (Dengyi
et al.,1993; Saha et al.,1995). Hiện nay γ-PGA đang được nghiên cứu để gắn
vào enzym do chúng có ưu điểm là có thể phân hủy sinh học, không ảnh
hưởng tới môi trường)(Miyachi et al.,1996; Sakamoto et al.,1997). Ở Việt
Nam chưa có nhiều các nghiên cứu về ảnh hưởng của các tia bức xạ đến
enzym, cũng như vai trò của γ-PGA trong việc bảo vệ hoạt tính enzym chống
lại các tác nhân do các tia bức xạ gây nên.
b) Chất kết dính sinh học
Chất kết dính sinh học được sử dụng trong việc cầm máu, gắn kết các
vết rò rỉ khí ở phổi, chống lại sự bám dính giữa tế bào bình thường với lớp mô
bị tổn thương do tai nạn hay quá trình phẫu thuật. Các chất kết dính phẫu
thuật hiện tại đang được sử dụng như fibrin nhưng có độ bám dính mô kém.
Otani và cộng sự 1999 đã cho rằng liên kết giữa gelatin và γ-PGA có thể thay
thế cho các chất kết dính có nguồn gốc fibrin và có hiệu quả hơn trong việc gắn kết
vết rò rỉ trên phổi so với chất kết dính có nguồn ngốc từ fibrin (Otani et al. 1999).
c) Chất mang gen chuyển
Dekie và cộng sự năm 2000 đã chỉ ra rằng liên kết giữa DNA và γ-PGA
tương đối ổn định đối với albumin huyết thanh. γ-PGA dễ dàng tạo ra các liên
kết với DNA, kết quả là điện tích bề mặt và kích thước của DNA giảm như
vậy có thể bảo vệ DNA không bị phân hủy bởi enzyme Dnase. γ-PGA mang

gen chuyển giúp cho DNA không bị phân hủy và tăng hiệu quả chuyển gene
(Dekie et al. 2000).
d) Chất phụ tá vaccine
Năm 2006, Sung và cộng sự đã đánh giá rằng γ-PGA như một chất phụ
tá cho vaccine, người ta đã phát hiện ra tổ hợp các thành phần gây miễn dịch
chứa γ-PGA cho 1 đáp ứng miễn dịch chống lại S. epiderrnidis,
staphylococcus và các loài liên quan. γ-PGA được chỉ ra có khả năng kích
thích cơ thể sinh kháng thể cao thậm trí khi được sử dụng với một kháng
nguyên có tính gây miễn dịch yếu. Các phân tử γ-PGA có khả năng phân hủy
sinh học là các thể mang vận chuyển rất tốt vaccine tới các khối u, chúng có
thể phát tán các protein kháng nguyên tới các tế bào trình diện kháng nguyên
(APCs) và đưa ra các đáp ứng miễn dịch hiệu lực dựa trên các kháng nguyên
đặc hiệu của tế bào lympho T. Kháng nguyên được chấp nhận bởi các tế bào
trình diện kháng nguyên còn được tăng cường bằng sự liên kết với các phân
tử polyme (Sung et al. 2006). Vaccine này có ưu điểm là khi tiêm dưới da
không tạo vết sưng tại vị trí tiêm như các vaccine thông thường khác (Uto et
al. 2009).
2.1.3.2. Ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm
Các nhà nghiên cứu đã chứng minh được γ-PGA có thể ứng dụng làm
chất bảo quản đông lạnh mà không gây ảnh hưởng tới sức khỏe do đặc tính
của γ-PGA là một polyme sinh học không gây độc cho người, γ- PGA còn sử
dụng làm chất ổn định mà không làm ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm
cũng như tới sức khỏe con người. Năm 2000, Sakai và cộng sự cho rằng việc
bổ sung PGA vào đồ uống để làm giảm vị đắng của một số đồ uống (chứa
acid amin, peptide, quinine, cafeine…),và làm tăng vị ngon của đồ uống
(Sakai et al.2000).
Ngoài ra, khi bổ sung γ-PGA còn có khả năng liên kết với một số ion
hóa trị 2 như Mn
2+
( ổn định thần kinh), Cu

2+
(thúc đẩy sự hấp thu và sử dụng
sắt để tạo thành hemoglobin và hồng cầu), Mg
2+
(tác dụng ức chế các phản
ứng thần kinh và cơ)…tạo muối tan giúp cơ thể tăng tốc độ hấp thụ các chất và
khoáng chất trong ruột non giúp cho cơ thể hấp thụ tối các chất dinh dưỡng cung
cấp khoáng chất cho cơ thể (Tanimoto et al., 1995 ).
Tanimoto và cộng sự năm 2007 đã chứng minh ngay cả phụ nữ sau
mãn kinh khi dùng γ-PGA còn giúp cho cơ thể hấp thụ canxi tốt qua ruột non
giúp ngăn cản quá trình hình thành calcium phosphate không tan, tình trạng
thiếu canxi trong máu hỗ trợ chứng mất chất khoáng ở trong xương, loãng
xương, còi xương và thiếu Ca tăng trưởng. (Tanimoto et al, 2007.)
2.1.3.3.Ứng dụng trong công nghệ mỹ phẩm
γ-PGA có thể được sử dụng như một thành phần nâng cao tính chất
của các sản phẩm chăm sóc da hoặc như một loại kem dưỡng ẩm, tẩy tế bào
chết và loại bỏ nếp nhăn. Tính chất của γ-PGA tương đối đồng nhất, ổn định
về mặt hóa học nên thường được sử dụng là thành phần trong các loại kem
dưỡng da (Ben-Zur and Goldman, 2007). γ-PGA bổ sung vào sản phẩm có tác
dụng làm mịn da, đàn hồi, tự giữ ẩm và tạo độ mềm mại cho da. γ-PGA liên
kết với chất Aloe veraor chiết xuất từ cây lô hội đã được nghiên cứu làm tăng
lượng acid pyrolidonecarboxylic (là thành phần thiết yếu cho da) trên lớp biểu
bì dưới da mà không làm ảnh hưởng đến sự cân bằng của da. γ-PGA còn giúp
phục hồi tóc sau quá trình tẩy màu tóc và nhuộm tóc bằng cách tăng khả năng
giữ ẩm và hình thành một hàng rào bảo vệ giúp tóc giữ được màu (Ben-Zur
and Goldman, 2007).
γ-PGA còn làm ức chế enzyme hyaluronidase giúp acid hyaluronic
không bị phân hủy, cùng với collagen là những thành phần thiết yếu của da. γ-
PGA có khả năng hấp thụ nước nên nó có tác dụng làm ẩm da, sáng da, làm
đầy nếp nhăn và chống lão hóa, tăng độ đàn hồi da cao hơn collagen. γ-PGA

giúp tăng liên kết với vitamin C và vitamin E có trong thành phần của mỹ
phẩm do γ-PGA dễ dàng hòa tan trong nước và được ion hóa. Dung dịch ion
hóa γ-PGA được đưa vào sâu dưới da bằng công nghệ điện chuyển ion (Shih
et al. 2001).
2.1.3.4. Ứng dụng trong xử lí môi trường
Trong quá trình xử lí nước, các phương pháp loại bỏ và tách tạp chất
như kết tủa, tuyển nổi và lọc đều là quá trình tách chất rắn ra khỏi chất lỏng.
Trong phương pháp tách các kết tủa ra khỏi chất lỏng, thì các chất kết tủa
đóng vai trò quan trọng trong quá trình loại bỏ các tạp chất làm giảm thời gian
xử lí. Tuy nhiên các chất kết tủa thu được sau quá trình xử lí môi trường hiện
nay có chứa các thành phần độc hại gây ảnh hưởng tới sức khỏe như nhôm
sunfat là nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer, polyalumin clorua (PAC) và
một số polyme tổng hợp như polyacrylamid thì monome của nó có độc tố
mạnh gây ảnh hưởng tới sức khỏe và môi trường (Nguyễn Hương. 2005).
Vượt trội hơn những chất kết tủa thông thường trên, γ-PGA được coi là
một chất kết tủa sinh học vì nó có thể kết tủa thành từng mảng gồm các hợp
chất hữu cơ và vô cơ. γ-PGA có khả năng liên kết với kim loại (kim loại nặng,
chất phóng xạ) để tạo kết tủa điều đó thuận lợi cho việc cô lập các kim loại
không cho phát tán rộng ra môi trường hơn nữa γ-PGA còn có tính chất phân
hủy sinh học nên rất thân thiện với môi trường (Sung et al. 2005).
Do đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu γ-PGA như một chất kết tủa có
bản chất sinh học có thể thay thế những chất kết tủa thông thường. γ-PGA có
khả năng kết tuả cao tùy vào trọng lượng phân tử của nó, hơn nữa γ-PGA
hoàn toàn không độc nên rất phù hợp cho quá trình xử lý. Hiện nay các nhà
khoa học đang tiếp tục nghiên cứu khả năng ứng dụng và phát triển của nó đối
với các lĩnh vực xử lý nước, kể cả tinh chế nước và xử lý nước thải (Nguyễn
Hương. 2005).
2.1.3.5. Ứng dụng trong ngành chăn nuôi
γ-PGA được sử dụng nhiều trong ngành sản xuất thức ăn gia súc bởi có
những tính năng như tăng cường khả năng thấp thụ canxi, photpho của gia súc,

gia cầm, giúp tăng chất lượng và trọng lượng cho thịt, xương, tăng sản lượng
trứng, làm giảm lượng chất béo không cần thiết của vật nuôi giúp cho ngành
chăn nuôi đạt hiệu quả cao nhất (Shih et al., 2001; Tanimoto et al., 2007).
2.1.3.6. Trong lĩnh vực nông nghiệp
Năm 2007, King và cộng sự đã nghiên cứu một loại phân bón chứa γ-
PGA giúp cho cây trồng phát triển bộ rễ, nâng cao khả năng hấp thụ dinh
dưỡng, giúp cây tăng trưởng nhanh, tán lá phát triển mạnh, quả lớn, tăng sản
lượng và chất lượng. γ-PGA được sử dụng làm phân bón và cải tạo đất, bảo
quản hạt giống, kiểm soát độ ẩm làm tăng chất lượng và sản lượng cho nông
sản (King et al. 2007).
Kết quả rõ rệt khi sử dụng phân bón chứa γ-PGA và không sử dụng phân
bón chứa γ-PGA của 2 giống sắn
Bảng 2.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phân bón chứa γ-PGA tới
2 giống sắn KM140 và KM 94
Giống
Số cây khảo sát
Trọng lượng trung bình
của củ
Tỉ lệ % trọng
lượng của củ
trên cây bón
PGAvà không
bón PGA
Bón PGA
Không bón
PGA
Bón PGA
Không bón
PGA
KM140 8 cây 8 cây 362,5 g 185,6 g 195 %

KM 94 10 cây 10 cây 261,5 109,0 239 %
B
A
Hình 2.2: Kết quả sử dụng phân bón γ-PGA và không sử
dụng phân bón γ-PGA
( Hình A: -PGA không sử dụng phân bón chứa γ-PGA, +PGA sử dụng phân bón
chứa γ-PGA; hình B: bên trái sử dụng phân bón chứa γ-PGA, bên phải không
sử dụng phân bón chứa γ-PGA)
2.1.4. Phương pháp kết tủa và tinh sạch acid gamma-polyglutamic
Năm 2010, Bhavik Manocha và Argyrios Margaritis, đưa ra phương
pháp để kết tủa, tinh sạch và xác định γ-PGA theo hai con đường khác nhau là
phương pháp kết tủa γ-PGA bằng dung dịch ethanol (sơ đồ B) và bằng dung
dịch CuSO
4
(sơ đồ A)
Hình 2.3: Sơ đồ phục hồi và tinh sạch poly γ-glutamic acid
(Manocha et al. 2010)
(Phương pháp kết tủa γ-PGA bằng dung dịch đồng sunfat (A), Phương pháp
kết tủa γ-PGA bằng dung dịch ethanol (B))
Loại bỏ tạp
chất,protein,các
dinh dưỡng
Dung dịch
0,5M EDTA
Dịch nổi
dd CuSO
4
A
Sinh khối
B

Kết tủa Cu
2+
γ – PGA
Lên men hang loạt
Ly Tâm
(7800xg,15phút ,15
o
C)
Tế bào-dịch
Trộn (RT:15phút)
Ethanol: 4
o
C
Ly tâm
Hòa tan kết tủa
Bổ sung dung dịch đệm
Ly tâm
Phân tách
Lọc
Kết tủa γ –PGA
Kết tủa PGA
Sấy khô
γ – PGA tinh khiết
Theo phương pháp của Bhavik Manocha và Argyrios Margaritis (2010)
cho thấy hiệu quả của phương pháp kết tủa bằng đồng sunfat (85%) hơn hẳn
phương pháp kết tủa bằng ethanol (82%). Vì phương pháp etthanol kết tủa
lượng protein là 48%, trong khi ở đồng sulfate chỉ có 3% protein điều đó chứng
tỏ rằng phương pháp kết tủa bằng đồng sulfate tinh sạch tốt hơn, không bị lẫn
tạp so với phương pháp kết tủa ethanol (Manocha and Margaritis 2010).
2.2. Vi khuẩn tổng hợp gamma-polyglutamic acid

2.2.1. Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Bacillus
Các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng tổng hợp γ-PGA là trực khuẩn
gram dương thuộc chủng Bacillus. Bacillus là những vi khuẩn gram dương.
Thuộc chi Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở
một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác
bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị
kí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động
bằng tiên mao. Chính nhờ khả năng sinh bào tử mà vi khuẩn Bacillus có khả
chống chịu được những điều kiện bất lợi như môi trường có nhiệt độ cao ở
suối nước nóng, nhiệt độ thấp ở bắc cực, những nơi có nồng độ muối cao như
ở mỏ muối hay ở nơi có nồng độ kháng sinh cao… (Tô Minh Châu, 2001).
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại
sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid
hữu cơ…Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và
butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ
để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là
loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30-45
o
C, nhưng cũng có nhiều
loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65
o
C (Rosovitz et al. 1998).
Đa số vi khuẩn Bacillus sinh trưởng ở pH7, một số phù hợp với pH= 9-
10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH=2–6 như Bacillus
acidocaldrius.
Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,
cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, bảo vệ
môi trường. Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose,
saccharose, xylose. Bacillus là vi khuẩn gam dương, dương tính với thử
nghiệm catalase, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí

trong quá trình trao đổi chất, nitrate (-), di động (+), hiếu khí (+) và âm tính
với thử nghiệm sinh indol.
Hình 2.4: Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus
2.2.2. Tổ chức di truyền của vi khuẩn Bacillus tổng hợp gamma-polyglutamic
acid
Một số nhà khoa học đã chứng minh chỉ có một vài vi khuẩn, chủ yếu
là chủng vi khuẩn Bacillus như B. subtilis 168, B. subtilis natto, B.
licheniformis, B. anthracis và S. epidermidis là có gen để tổng hợp nên γ-
PGA, trong đó có 2 loài B. anthracis và B. subtilis có gen đặc trưng mã hóa
để tổng hợp lên polyglutamate.
Vi khuẩn B. anthracis, có 4 gen capB, capC, CapA và CapE , mã hóa
cho 1 chuỗi peptide gồm 47 amino acid để tổng hợp polyglutamate
(Candela et al , 2005a.).
Vi khuẩn B. subtilis có 3 gen liên quan tới sự tổng hợp polyglutamate
đó là pgsB, pgsC và pgsAA (Ashiuchi et al.,1999).
Hình 2.5: Tổng hợp γ-PGA dưới sự tham gia của các gen
tương ứng ở mỗi chủng Bacillus
γ-PGA được tổng hợp dưới dạng tự do hay dưới dạng liên kết tùy thuộc
vào gen tổng hợp (Candela et al ., 2005a)
- Nếu PGA được sinh ra và kết hợp với bề mặt vi khuẩn và tạo thành
một lớp vỏ bao quanh vi khuẩn (gồm γ-PGA và liên kết hóa trị liên kết với
peptidoglycan) thì gen tổng hợp PGA là gen cap
- Nếu PGA được sinh dưới dạng tự do thì gen tổng hợp γ-PGA là gen pgs.
2.2.3. Quá trình tổng hợp γ-PGA trong vi khuẩn
Năm 2007 Shi và cộng sự nghiên cứu và xác định các enzyme tham gia vào
con đường tổng hợp sinh hóa làm tăng hàm lượng γ-PGA (Shi et al. 2007).
Con đường để tổng hợp γ-PGA là từ L-glutamic acid, acid citric và
ammonium sulfate trong B.subtilis IFO 3335 (Kunioka et al., 1997), vì lượng
L-glutamic acid rất ít nên nó có thể được coi như là L-glutamic acid được
tổng hợp từ acid citric thông qua acid isocitric và acid 2-oxoglutaric trong chu

trình TCA. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng bước quan trọng trong quá tình là
tổng hợp 2-oxogluturate (α-ketoglutarate), tiền thân của acid L-glutamic
được tổng hợp qua đường phân và chu trình TCA (Shi et al., 2007).
Quá trình chuyển hóa từ acid 2-oxoglutaric đến L-axit glutamic được
tiến hành 2 cách:
- Khi không có L-glutamine hoặc có 1 lượng rất ít thì axit L- glutamic
được tổng hợp từ acid 2-oxoglutaric và ammonium sulfate xúc tác bởi
dehydrogena glutamate GD (Stadtman, 1966).
2-Oxoglutaric acid + NH3 + NAD(P)H + H
+
L-glutamic acid +
NAD(P)
- Khi có sự tham gia của L-glutamine, axit L- glutamic được tổng hợp
từ acid 2-oxoglutaric và L-glutamine dưới sự xúc tác bởi các enzyme
glutamine synthetase (GS) và Glutamate 2-oxoglutarate aminotransferase
(GOGAT) (Holzer, 1969).
2-Oxoglutaric acid + L-glutamine + (2 H) 2L-glutamic acid
L-Glutamic acid + NH3 + ATP L-glutamine + ADP + Pi
Vi khuẩn B. anthracis và B. subtilis có khả năng chuyển hóa trực tiếp hay
gián tiếp L-glutamic acid thành D-glutamic acid. Acid 2-Oxoglutaric và L-
Alanine được tổng hợp từ axit L-glutamic và acid pyruvic. D-Alanine được hình
thành bởi sự raxemic hóa từ L-Alanine. Axit D-glutamic và acid pyruvic được
tổng hợp từ D-alanine và axit 2-oxoglutaric.
GD
GOGAT
GS
Hình 2.6: Con đường tổng hợp γ-PGA trong
Bacillus subtilis IFO 3335
(1 glutamine: 2-oxoglutarate aminotransferase; 2 glutamine synthetase; 3 L-
glutamic acid: pyruvic aicd axit aminotransferase; 4 alanine racemase; 5 D-

glutamic aid: pyruvic acid aminotransferase; 6 PGA polymerase.TCA axit
tricarboxylic)( Kunioka et al. 1997)
2.3. Boza- nguồn phân lập vi khuẩn Bacillus
Hình 2.7: Sản phẩm Boza
Boza là một đồ uống có nguồn gốc cổ xưa ở vùng Lưỡng Hà từ 8000-
9000 năm trước. Bắt đầu từ thế kỷ 13, với cuộc xâm lược đế quốc Ottoman
của Anatolia, Thổ Nhĩ Kỳ đã biết tới Boza như một thức uống quen thuộc
được lên men từ lúa mì hoặc kê, có độ nhớt và nồng độ cồn thấp dưới 1% có
vị ngọt và chua. Boza giành được sự công nhận ở nhiều quốc gia là đồ uống
không cồn và được sử dụng nhiều so với tất cả các loại đồ uống không chứa
cồn khác (Kivanc et al. 2011). Boza không chỉ được tìm thấy ở Thổ Nhĩ Kỳ
mà còn được tìm thấy ở nhiều nước khác nhau như là Albania, Bosnia và
Herzegovina, Bulgaria…Boza ở mỗi vùng miền lại mang những hương vị
khác nhau đặc trưng cho vùng sản xuất.
Ở Albania, Boza có truyền thống được sản xuất ở Kukes phía đông bắc
của đất nước này. Nó bao gồm bốn thành phần: ngô, bột mì, đường và
nước. Boza Albania khác Boza sản xuất tại các khu vực khác, là thành phần
chính của nó là ngô và có vị chua, trong khi ở các nước khác như ở Thổ Nhĩ
Kỳ, Bulgaria, và Macedonia, thành phần chính thường là kê, lúa mạch hoặc
đậu xanh. Boza Albania có màu vàng kem nhẹ, có vị ngọt chua mang đặc
trưng của vùng, Bulgaria có vị nhạt, loãng và có chất lượng thấp vì vậy Boza
ở Bulgaria người ta tăng độ ngọt bằng cách bổ sung thêm chất ngọt nhân tạo
khác. Cộng hòa Macedonia, Boza loãng và thiếu vị ngọt của đường, còn ở
Romania thì Boza ngọt hơn ở Thổ Nhĩ Kỳ và Bulgaria, nhưng đặc hơn và sẫm
màu hơn so với Cộng hòa Macedonia. Ở Serbia, Boza nó thường được làm bằng
nước, bột mì, bột ngô, men và đường. Boza được bảo quản trong những điều
kiện, ở nhiệt độ từ 2 – 3
o
C, đồ uống có thể được bảo quản lên đến một tháng.
Năm 2011, Merith Kivanc và cộng sự đã chứng minh là có khoảng 45

chủng vi khuẩn axit lactic được phân lập từ 10 mẫu khác nhau của Boza được
sản xuất ở Thổ Nhĩ Kỳ. Các chủng đã được thử nghiệm là có hoạt động ức chế
chống lại vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm. Vi khuẩn lactic phân lập có hoạt
tính kháng khuẩn được xác định là Lactobacillus brevis subsp. lactis,
Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum,
Lactobacillus paraplantarum, Enterococcus faecium, Lactobacillus graminis,
Pediococcus sp. và Lactobacillus paracasei subsp.paracasei; Bacillus subtilis;
Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus
rhamnosus.
Boza là một sản phẩm lên men nhiều dinh dưỡng và có nhiều tác dụng
đối với sực khỏe con người: như là giúp cân bằng huyết áp, tăng sản lượng
sữa cho phụ nữ mang thai và cho con bú tránh tình trạng trẻ sinh ra thiếu sữa
mẹ, có lợi cho tiêu hóa. Boza là có thành phần của nhiều chất chất dinh dưỡng
có giá trị cho những người hoạt động thể chất, vì nó có chứa vitamin A, C, E,
B, sắt và khoáng chất. Boza đặc biệt thích hợp cho người ăn kiêng vì nguyên
liệu của nó hoàn toàn từ tự nhiên và cung cấp vitamin cần thiết cho cơ thể.
2.4. Tình hình nghiên cứu gamma-polyglutamic acid trong nước và
ngoài nước
2.4.1. Tình hình nghiên cứu gamma-polyglutamic acid trong nước
Năm 2004, Nguyễn Quang Huy bước đầu nghiên cứu về γ-PGA trong
việc bảo vệ hoạt tính của enzym papain, một enzym tách chiết từ thực vật và
thường được sử dụng trong in vitro. Một số hợp chất được thử nghiệm và cho
kết quả dương tính về khả năng bảo vệ hoạt tính papain chống lại tác dụng
của các tia bức xạ như tia gamma, tia X và bức xạ điện tử. Trong các hợp chất
thử nghiệm có γ-PGA bảo vệ hoạt tính của enzym papain cao nhất, γ-PGA có
hoạt tính bảo vệ cao nhất ở nồng độ γ-PGA là 1,25%, γ-PGA bảo vệ tới gần
60% hoạt tính ban đầu trong khi mẫu đối chứng hoạt tính giảm tới 90% sau
khi chiếu xạ với cường độ 15kGy (Nguyễn Quang Huy, 2004).
Năm 2013, Lê Phước Cường và cộng sự đã nghiên cứu thành công hệ
thống tuyển nổi để tách chì trong nước bằng cách sử dụng γ-PGA. Khi thêm γ-

PGA vào trong nước như là tác nhân tuyển nổi (vừa là chất đông đặc vừa là
chất tạo bọt) với điều kiện tối ưu, với khối lượng các thành phần trong nước là
khối lượng 0,5 % γ-PGA, 0,1% than hoạt tính, tốc độ sục khí 4L min
-1
,trong
thời gian 30 phút, pH ban đầu là 7. Không khí được sục vào nước sẽ tạo ra bọt
khí, PGA mang các hạt than hoạt tính lên trên bề mặt. Ngoài ra hàm lượng chì
(Pb) trong nước có thể giảm xuống do sự hấp phụ của chúng vào than hoạt tính
vì vậy có thể loại bỏ cả chì và than hoạt tính ra khỏi dung dịch. Sự kết hợp của
than hoạt tính và γ-PGA trong quá trình tuyển nổi là một phương pháp mới có
thể loại bỏ chì trong nước với hiệu quả là 90% lượng Pb trong nước.(Lê Phước
Cường và cộng sự, 2013).
2.4.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Năm 2003, ngành công nghệ sinh học Nhật Bản đã đạt được giải vàng
về nghiên cứu ứng dụng của γ-PGA trong ngành công nghệ mỹ phẩm, là sản
phẩm sinh học tổng hợp tự nhiên và chiết xuất từ một loại thực phẩm truyền
thống của Nhật có tên gọi là Natto, ra đời trên 800 năm. Natto được sản xuất
từ đậu nành lên men bằng trực khuẩn Bacillus subtilis Natto. Natto chứa các
vitamin B2, B6, B12, E, K2. γ-PGA được chiết xuất từ phần chất keo nhớt
chứa trong Natto.
Bác sĩ David Harrison - Trường Đại học North Durham nước Anh,
chuyên gia nghiên cứu về tác dụng của oxy đối với da xác định “Chính không
khí và môi trường chung quanh đã cung cấp oxy vào da đến một độ sâu đáng
kể”. Điều này mở ra triển vọng ứng dụng γ-PGA hiệu quả trong việc trị khô
da. Công nghệ điện chuyển ion γ-PGA của Nhật phối hợp với công nghệ điện
chuyển ion vitamin C + E, các công nghệ Laser, công nghệ Oxyjet, công nghệ
sóng RF, công nghệ Botox, Restylane… sẽ giúp làn da khỏe mạnh và luôn giữ
được vẻ mịn màng tươi sáng, săn chắc, trẻ trung
Năm 2007, Tanimoto đã nghiên cứu γ-PGA làm tăng lượng canxi (Ca)
hòa tan cơ thể, và các nghiên cứu có liên quan tới tình trạng thiếu caxi trong

máu, mất chất khoáng ở trong xương, loãng xương, còi xương ở phụ nữ sau
mãn kinh của Nhật Bản. Đây là nghiên cứu đầu tiên về tác động của γ-PGA ở
một nhóm người lấy ngẫu nhiên để thực hiện và xác định ảnh hưởng của γ-
PGA (với 80,6% axit glutamic) tới sự hấp thu Ca, Ca được tính toán từ tỷ lệ
đồng vị Ca đo bằng ion hóa tứ cực nhiệt khối phổ (TIQMS). Kết quả là ở
người khi sử dụng γ-PGA thì có khăng năng hấp thụ Ca (39,1%) cao hơn so
với người không sử dụng PGA khả năng hấp thụ Ca là 34,6% (Tanimoto et
al., 2007).
Năm 2008, Yang và cộng sự đã nghiên cứu những ảnh hưởng của γ-
PGA đối với hoạt tính sinh học của canxi, hàm lượng canxi trong xương và
được kiểm tra trên đối tượng chuột cái. Số lượng γ-PGA tăng khi khả năng
hòa tan canxi trong ống nghiệm tăng. Các nghiên cứu chỉ ra rằng γ-PGA làm
tăng số lượng canxi hòa tan trong ruột non. Trong một thí nghiệm động học
về canxi trong huyết tương, γ-PGA kích thích cơ thể hấp thụ canxi sau 20
phút và thời gian hấp thụ khoảng 2h. Thí nghiệm cân bằng canxi trong thời
gian dài có kết quả chỉ ra rằng γ-PGA làm tăng sự hấp thụ canxi, tăng hàm
lượng canxi trong xương chuột (Yang et al., 2008).
Năm 2002, Ornek và cộng sự chứng minh nhôm 2024 giảm sự ăn mòn
do vi khuẩn Bacillus có khả năng tổng hợp γ-PGA hình thành màng sinh học.
Màng sinh học hình thành do vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus
subtillis làm giảm tốc độ ăn mòn của nhôm 2024 tới 90%. Khả năng chống ăn
mòn của nhôm 2024 tăng từ 0,15-0,44V do sự hình thành màng sinh học bởi vi
khuẩn B. subtilis và B. licheniformis. γ-PGA tổng hợp bởi vi khuẩn cũng có
tác dụng làm giảm tỷ lệ ăn mòn của nhôm (Ornek et al., 2002).
Năm 2006, Mark và cộng sự nghiên cứu về γ-PGA là một chất hấp thụ
tiềm năng trong việc loại bỏ và thu hồi kim loại nặng (Ni
2+
, Cu
2+
, Mn

2+
và
Al
3+
) từ nước thải công nghiệp. Nghiên cứu phát triển màng vi lọc với γ-PGA
liên kết hóa trị, γ-PGA được tổng hợp từ B. licheniformis ATCC 9945 có khả
năng hấp phụ đồng rất tốt là 77,9 mg/g ở nồng độ 32 mg /l ở pH 4.0 và 25
o
C
(Mark et al., 2006). Năm 2009, Inbaraj và cộng sự đã chứng minh γ-PGA
cũng liên kết rất chặt chẽ với ion hóa trị hai như thủy ngân (Hg
2+
), ion chì
(Pb
2+
), chính nhờ khả năng tạo kết phức với các ion hóa trị hai này mà γ-PGA
được coi như một chất hấp thụ đầy hứa hẹn để loại bỏ các kim loại nặng trong
quá ô ngiễm nguồn nước. γ-PGA còn là một vật liệu hấp phụ thích hợp cho
việc loại bỏ các BB9 thuốc nhuộm cơ bản và BG4 từ dung dịch nước. Quá
trình hấp thụ xảy ra đã nhanh chóng đạt hiệu quả cao, an toàn và không gây
độc hại. Khoảng 98% số thuốc nhuộm hấp phụ trên γ-PGA có thể được phục
hồi và có khả năng tái sử dụng (Inbaraj et al., 2009).
Một số nhà nghiên cứu chỉ ra rằng γ-PGA có thể hấp thụ Hg (II), Cr
(III), Ni (II) và thuốc nhuộm cơ bản. Crom tồn tại trong nguồn nước ở cả hai
dạng hóa trị sáu và hóa trị ba, trong nước uống Cr (III) hiếm khi gặp mà chủ
yếu là Cr (VI). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh Cr (VI) là gây ung thư nếu
hít phải hay tiếp xúc vì vậy PGA được nghiên cứu như một chất hấp phụ để
loại bỏ Cr (VI), Cr (VI) được hấp thụ mạnh ở pH thấp, với nồng độ PGA cao
thì hiệu quả loại bỏ Cr (VI) được nâng cao. Trong nghiên cứu này số lượng
hấp thụ Cr (VI) cao nhất với khối lượng γ-PGA là 21,4 mg /g, kết quả này tuy

thấp nhưng nó cho thấy rằng γ-PGA đóng một vai trò quan trọng trong hấp
thụ Cr (VI) (Yao et al., 2007).
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi khuẩn trong sản phẩm đồ uống lên men truyền thống
Boza của Bulgaria.
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
Sản phẩm đồ uống lên men truyền thống Boza của công ty Harmonica,
Bulgaria.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh - Khoa CNSH-CNTP
– Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian tiến hành: Từ tháng 12 năm 2013 đến tháng 6 năm 2014.
3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng
3.3.1. Hóa chất
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hóa chất Xuất xứ Tên hóa chất Xuất xứ
Peptone Trung Quốc Xanh metylen Trung Quốc
Cao thịt Trung Quốc Lugol Trung Quốc
Cao nấm men Trung Quốc Safranin Trung Quốc
Glucose Việt nam K
2
HPO
4
Trung Quốc
Agar Việt Nam HCl Trung Quốc
KH
2

PO
4
Mỹ Dầu soi Trung Quốc
CH
3
COONa Trung Quốc NaCl Trung Quốc
MgSO
4.
7H
2
O Trung Quốc NaOH Trung Quốc
Tryptone Trung Quốc CaCO
3
Việt Nam
Ethanol 96% Việt Nam
3.3.2. Thiết bị sử dụng
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Xuất xứ Tên thiết bị Xuất xứ
Nồi hấp
thanh trùng
Trung Quốc Cân phân tích Anh
Tủ sấy Đức Máy khuấy từ Đức
Tủ ấm Trung Quốc Máy đo pH Nhật
Box cấy vi khuẩn Mỹ Kính hiển vi Đức
Máy ly tâm lạnh Đức Máy UV-VIS Hàn quốc
Máy lắc Hàn quốc Tủ lạnh Nhật
Máy Voxted Đức Lò vi sóng Mỹ
Các dụng cụ khác được sử dụng trong thí nghiêm bao gồm:
micropipette 10-100μl, 100-1000 μl ( Đức ), đầu côn, bình tam giác, que cấy,
que trang, đĩa petri, ống nghiệm, ống phancol, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm,….

3.3.3. Các môi trường sử dụng
- Môi trường PGM (nghiên cứu khảo sát khả năng sinh tổng hợp γ-PGA
của vi khuẩn) (Ishwar B. et al., 2009): glucose 2,5%; NH4Cl 0,6%; Citric
acid 1,2%; L-glutamic acid 2%; NaCl 2,5%; KCl 0,07%; K2HPO4 0,1%;
MgSO4.7H2O 0,68%; CaCl2.2H2O 0,02%; NaHCO3 0,018%;
MgCl2.6H2O 0,47% và MnSO4.7H2O 0,005%; pH 6,5.
- Môi trường LBA dùng để phân lập và giữ giống vi khuẩn: Cao nấm
men 0,5%; Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; Agar 2%; pH 7,2 - 7,4.
- Môi trường LB dùng để nhân giống vi khuẩn: Cao nấm men 0,5%;
Peptone 1,0%; NaCl 0,5%; pH 7,2 - 7,4.
3.4. Nội dung nghiên cứu
- Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp γ-PGA từ Boza.
- Nội dung 2: Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn
đã phân lập.