Nghiên cứu tạo ra một chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGSTS Quyền Đình Thi, Phó Viện
trưởng, Trưởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm,
sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hóa chất cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi
hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Hạnh đã trực tiếp hướng dẫn khoa học, ThS
Lê Thị Thùy Dương, ThS Nguyễn Hữu Quân cùng tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh
học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm
khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học
Mở Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.
Cuối cùng, tôi chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ động viên tôi trong suốt
quá trình học tập.
Hà nội, tháng 5 năm 2011
Sinh viên
Nguyễn Đức Thuận
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức Thuận
Danh mục chữ viết tắt
Chữ viết tắt Tên đầy đủ
PDA Potato dextrose agar
PDB Potato dextrose broth
LB Luria-Bertani
EDTA Etylene diamine tetra acetic acid
PCR Polymerase chain reaction
TBE Tris base Boric acid EDTA
TE Tris EDTA
OD Optical density
w/v Weight/volume
M Marker
Kb Kilo base

Bp Base pair
DNA Deoxyribonucleic acid
v/v Volume/volume
LT
50
Thời gian gây chết một nửa số rệp thí nghiệm
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
MỤC LỤC
MỤC LỤC 1
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1.Giới thiệu chung về rệp 2
1.2. Tình hình rệp hại và sử dụng nấm diệt côn trùng trên thế giới 4
1.2.1. Tình hình rệp hại trên thế giới 4
1.2.2. Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng trên thế giới 4
1.3. Tình hình rệp hại và sử dụng nấm diệt côn trùng tại Việt Nam 6
1.3.1. Tình hình rệp hại tại Việt Nam 6
1.3.2. Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng tại Việt Nam 7
1.4. Công nghệ lên men lỏng và lên men xốp 9
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12
2.1. Vật liệu 12
2.1.1. Chủng nấm 12
2.1.2. Hóa chất 12
2.1.3. Dung dịch và đệm 13
2.1.4. Môi trường 13
2.1.5. Thiết bị thí nghiệm 13
2.2. Phương pháp 14
2.2.1. Sàng lọc chủng nấm có khả năng diệt rệp đào 14
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử 14

2.2.3. Khảo sát một số yếu tố lên sản xuất bào tử trong lên men xốp 18
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19
3.1. Sàng lọc chủng nấm Lecanicillium spp. diệt rệp đào 19
Hình 3.2. Rệp khi phun đối chứng 0,05% Tween 80 (A), rệp chết bởi nấm trên lá
rau cải (B), rệp chết bởi nấm, chụp với kính hiển vi 10X (C) 23
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
3.2. Phân loại chủng nấm 8514 dựa vào trình tự đoạn gene 28S rRNA 23
3.3. Ảnh hưởng một số yếu tố lên men xốp lên số lượng bào tử chủng 8514 24
3.3.1. Tối ưu nguồn cơ chất 24
3.3.2 Nguồn nitrogen 25
3.3.3 pH môi trường 27
3.3.4 Độ thoáng khí 28
3.3.5 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt 29
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến khả năng tách bào tử và sự
nảy mầm bào tử của chủng nấm 8514 29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
PHỤ LỤC 37
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
MỞ ĐẦU
Rệp là loài côn trùng gây hại rất lớn đối với cây trồng. Trong đó, rệp đào Myzus
persicae, rệp hại bông Aphis gossypii, rệp hại ngô Maydis aphid là một trong những loài
gây hại phổ biến trên nhiều cây trồng. Hàng năm, trên thế giới sản lượng nông nghiệp bị
tổn thất do nạn rệp gây ra lên tới hàng tỷ đô la. Trong vòng 4 năm trở lại đây, tốc độ tăng
trưởng của rệp rất nhanh, kéo theo vùng gây hại của chúng ngày càng mở rộng.
Ở Việt Nam, cây trồng bị rệp tàn phá diễn ra với mức độ cao. Rệp gây hại trên nhiều
loại cây trồng như ngô, cà phê, sầu riêng, cây bông, làm ảnh hưởng đến năng suất cây
trồng và chất lượng nông sản, gây thiệt hại lớn về kinh tế đối với người sản xuất. Rệp

đang là mối đe dọa nguy hiểm đối với các loại rau, lương thực. Ở nước ta, cây rau cải
xanh và cây bí được trồng rất phổ biến ở nhiều vùng, là loại rau lương thực được sử dụng
thường xuyên trong bữa ăn hàng ngày của người dân. Do được trồng nhiều và thường
được trồng thành những khu vực tập trung chuyên canh, nên khả năng bị rệp gây hại cục
bộ là rất lớn, gây thiệt hại cho nhà sản xuất.
Trên thế giới, có nhiều chế phẩm diệt rệp có nguồn gốc hóa học. Một trong những tồn
tại lớn của sản xuất nông nghiệp hiện nay là việc sử dụng quá nhiều thuốc bảo vệ thực
vật có nguồn gốc hóa học. Tình trạng này nếu cứ tiếp diễn sẽ đi ngược lại mục tiêu xây
dựng một nền nông nghiệp bền vững và an toàn mà chúng ta đang nỗ lực tiến tới. Theo
đó, các nhà khoa học đang rất quan tâm nghiên cứu để tìm ra thuốc bảo vệ thực vật có
nguồn gốc vi sinh vật. Các chế phẩm được sản xuất từ nấm kí sinh côn trùng, trong đó có
chế phẩm diệt rệp, châu chấu có nguồn gốc từ bào tử của chủng Lecanicillium spp. trên
thị trường đã có sản phẩm thương mại như Vertalec và Mycotal diệt côn trùng. Tuy
nhiên, giá thành của các sản phẩm này còn cao đối với nhà nông. Vì vậy, việc nghiên cứu
tạo ra một chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật có giá thành thấp, đồng thời
cho hiệu quả diệt rệp cao, là rất cần thiết và cấp bách ở nước ta.
Xuất phát từ những nhu cầu thực tế, chúng tôi đã thực hiện các nội dung nghiên cứu
sau: i) tuyển chọn chủng nấm có khả năng diệt rệp đào mạnh; ii) tối ưu các điều kiện lên
men xốp để sản xuất cao sản bào tử bởi chủng nấm diệt rệp mạnh trên môi trường lên
men xốp.
1
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về rệp
Rệp là loài côn trùng thân mềm, có kích thước thay đổi từ 1-10 mm, cơ thể màu xanh
lá cây, đen, nâu, hồng hoặc không màu. Rệp có một lớp biểu bì mềm, có cánh (dạng
màng) hoặc không cánh. Rệp sinh sản bằng hai hình thức: đơn tính và hữu tính (là sự kết
hợp giữa các cá thể khác nhau tạo ra trứng để tồn tại qua mùa đông). Một con rệp cái
trong mùa xuân có thể đẻ tới hàng nghìn con cháu. Ví dụ, loài rệp vừng bắp cải

(Brevicoryne brassicae) có thể tạo ra tới 41 thế hệ con cháu. Trong môi trường ấm áp,
như ở vùng nhiệt đới hoặc trong nhà kính, rệp có thể sinh sản vô tính tron nhiều năm.
Một số loài sinh ra con cái có cánh trong mùa hè nhằm đáp ứng lượng thức ăn khan hiếm.
Ví dụ, rệp táo (Aphis pami) sau khi sinh ra nhiều con cái không cánh sẽ tồn tại trên cây
chủ, chúng sẽ gia tăng lượng có cánh và bay đến cây cỏ hoặc cây ngô để kí sinh
( />Rệp trên thế giới rất đa dạng về loài. Ước tính trên thế giới có khoảng 4000 loài rệp
đã được miêu tả. Trong số này, có khoảng 250 loài gây hại cho cây trồng (Blackman,
Eastop, 2000). Các loài thuộc họ rệp muội gây hại mạnh trong nông nghiệp, như rệp đào
(Myzus persicae) gây hại trên cải, rệp bông (Aphis gossypi) gây hại trên cây bông, rệp
muội (Phenacoccus solenopsis), rệp muội hại ngô (Aphis maydis)…
Chế độ ăn của các loài rệp là khác nhau, có loài đơn thực (chỉ ăn được một loài thực
vật), có loài đa thực (sử dụng nhiều loài thực vật). Rệp đào (Myzus persicae) có một phổ
vật chủ rộng hơn, bao gồm hơn 100 họ thực vật, có thể gây ra thiệt hại lớn đến mùa màng
(Blackman, Eastop, 1984).
Trong số các loài rệp gây hại, những loài thuộc họ rệp muội gây ảnh hưởng lớn,
thường xuyên đến cây trồng nói chung và cây lương thực nói riêng. Chúng đã gây thiệt
hại hàng tỷ đô la Mỹ mỗi năm do cây cho năng suất kém hoặc mất mùa. Mặt khác, thế
giới mỗi năm cũng phải chi nhiều tỷ đô la Mỹ để khống chế rệp muội phá hại cây trồng.
Rệp muội gây hại bốn mùa, đặc biệt từ mùa xuân đến mùa thu, nhất là vào thởi điểm thời
tiết râm mát, độ ẩm trong không khí cao.
Rệp đào thuộc họ rệp muội, chúng là rệp hại đáng kể nhất của cây họ đào và một số
cây lương thực khác như cải, hồ tiêu, ớt, chúng hút nhựa cây từ lá cây, chồi non làm giảm
2
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
sinh trưởng của cây, làm xoăn lá và gây chết mô tế bào. Rệp đào được tìm thấy trên toàn
thế giới, mặc dù nó ít chịu được khí hậu lạnh và trải qua mùa đông thông qua giai đoạn
trứng của nó.
Rệp đào tồn tại dưới 2 hình thức: loại hình không cánh có cơ thể dạng hình trứng,
màu xanh hoặc đỏ hoặc vàng nhạt, dài từ 1,3-1,9 mm, vòi chích hút màu đen, kéo dài tới

đốt chậu chân sau, râu đầu 6 đốt, màu đen, ống bụng màu đen, trên lưng, khoảng giữa 2
ống bụng có một mảnh màu đen hơi nổi to; loại hình có cánh có chiều dài thân từ 1,6-2
mm, đầu và ngực màu nâu đen, bụng màu vàng hoặc xanh, đôi khi đỏ, giữa mặt lưng của
bụng có một đốm to màu nâu đen, râu đầu 6 đốt màu đen, vòi chích hút kéo dài đến đốt
chậu chân giữa, ống bụng màu đen.
( />%20persicae%20%286%29.jpg).
Hình 1.1: Rệp đào Myzus persicae
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới, rệp đào có vòng đời thay đổi
đáng kể, phụ thuộc vào thời tiết. Chúng phát triển nhanh chóng, thường là 10-12 ngày
cho một thế hệ hoàn chỉnh, và có thể có khoảng 20 thế hệ trong năm nếu thời tiết thuận
lợi. Rệp cái sinh thế hệ mới sau từ 6 đến 17 ngày, với tuổi sinh sản trung bình là 10,8
ngày. Trung bình rệp sinh 1,6 ấu trùng trong mỗi ngày. Rệp đào có cánh dường như
muốn xâm chiếm hết bề mặt cây. Chúng thường để lại một số ấu trùng nhỏ trên cây và
bay đến chỗ khác. Khả năng phát tán cao này của rệp giúp nó trở thành một trung gian
truyền virus vào thực vật ( />cycle.html).
3
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
1.2. Tình hình rệp hại và sử dụng nấm diệt côn trùng trên thế giới
1.2.1. Tình hình rệp hại trên thế giới
Trên thế giới, rệp đang được coi là kẻ thù nguy hiểm đối với cây trồng. Rệp gây hại
tại nhiều quốc gia và không cố định trong một vùng nhất định. Những thiệt hại do rệp gây
ra đang ngày càng nghiêm trọng và diễn ra trên diện rộng.
Tại Châu Á, rệp gây thiệt hại nghiêm trọng một số loại cây trồng, đặc biệt là dưa
chuột, hạt tiêu, và cà chua. Các rệp đào Myzus persicae thường phát triển nhanh chóng
trong mùa vụ và phát triển nhanh chóng đến tuổi trưởng thành và tăng nhanh về số lượng.
Ước tính thiệt hại hàng tỷ đô la Mỹ mỗi năm do nạn rệp hoành hành. Tại ba tỉnh phía
Nam Thái Lan, nạn rầy nâu hại lúa, rệp hại cây trồng đã bùng phát mạnh và gây thiệt hại
khoảng 7,5 ngàn ha mỗi vụ.
Theo nghiên cứu của các nhà côn trùng học Úc, ngành du lịch nước này đã thiệt hại

75 triệu USD/năm do nạn rệp hoành hành. Tình trạng nạn rệp lan tràn ở xứ sở này chỉ là
một phần của đại dịch toàn cầu với số lượng rệp trên thế giới đã tăng lên gấp đôi mỗi
năm. Các nhà côn trùng học cho biết, nguyên nhân là việc thay đổi biện pháp diệt côn
trùng (không dùng thuốc xịt mà dùng mồi) và do sự gia tăng đáng kể lượng du khách đến
từ các nước đang phát triển, nơi rệp vẫn còn đang hoành hành.
1.2.2. Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng trên thế giới
Trong thời đại ngày nay, với việc thuốc hóa học đang gây ảnh hưởng xấu đến sức
khỏe con người và môi trường sống, cùng với sự tiến bộ của khoa học việc tìm ra một
chế phẩm có tác dụng kiểm soát côn trùng cao, không gây hại tới sức khỏe con người là
cần thiết. Rệp muội (trong đó có rệp đào) và bọ cánh trắng là những côn trùng gây hại
cây trồng rất nghiệm trọng trong nhà kính trên toàn thế giới. Chúng gây thiệt hại nặng nề
trên nhiều loại cây trồng, đặc biệt trên các cây như dưa chuột, hồ tiêu, ớt, rau cải và cà
chua. Chúng tăng số lượng rất nhanh và truyền virus từ cây bệnh sang cây khỏe mạnh.
Để kiểm soát chúng, nông dân đã áp dụng liều cao của thuốc trừ sâu. Các thuốc trừ
sâu hóa học sử dụng quá mức đã dẫn đến hậu quả là côn trùng kháng thuốc, và để kiểm
soát nông dân phải sử dụng liều cao hơn so với ban đầu. Dư lượng thuốc trừ sâu hóa học
trong môi trường và sản phẩm nông nghiệp cũng đang được người tiêu dùng rất quan tâm
4
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
chú ý, vì họ muốn dùng những sản phẩm nông nghiệp, sạch, an toàn, và không còn dư
lượng thuốc trừ sâu.
Mặt khác, do phải sử dụng liều lượng cao hơn nên lượng hóa chất còn dư trên mặt đất
và ngấm xuống mạch nước ngầm là rất lớn. Thuốc hóa học làm nhiễm bẩn nghiêm trọng
tới môi trường sống, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của người, gia súc và các loại sinh vật
khác, đặc biệt là các loại động vật sống trong nước như cá, tôm, cua, và các loài thủy sinh
khác. Do đó, rất nhiều nước đang cố gắng làm giảm bớt việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa
học trong nông nghiệp. Hơn nữa, kiểm soát sinh học đang là một phương pháp thay thế
hiệu quả, bao gồm việc dùng nấm ký sinh côn trùng (tức là sử dụng tác nhân gây bệnh là
nấm để tiêu diệt các loài côn trùng) (Bartlett, Jaronski, 1988; Hajek, St Leger, 1994).

Một số chủng nấm diệt côn trùng mạnh như Beauveria sp., Metarhizium sp.,
Paecilomyces sp., Nomuraea sp., Verticillium sp., đã được sử dụng làm chất trừ sâu sinh
học ở một số nước trên thế giới. Ở các nước như Liên Xô cũ, Mỹ, Anh chi nấm
Beauveria dùng để sản xuất chế phẩm có tên Beauverin, ở Việt Nam có tên thương mại là
Beauverit từ chủng Beauveria spp Bào tử của nấm M. anisopliae đã được phối chế tạo
sản phẩm có tên gọi thương mại là “BioBlast” được sử dụng để kiểm soát mối, mọt, côn
trùng gây hại (Rath, 1995). Cho đến nay, kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng một số chủng
nấm thuộc hai loài nấm Beauveria sp. và Metarhizium sp. có tiềm năng rất mạnh để gây
bệnh, diệt côn trùng, bướm gây hại ở cây trồng trên đồng ruộng. Tuy nhiên, các nghiên
cứu ứng dụng chế phẩm nấm này dùng để diệt côn trùng trên đồng ruộng thì rất ít. Việc
sử dụng bào tử nấm ký sinh côn trùng để xử lý đất trồng cây, để kiểm soát côn trùng có
cánh gây hại đã được đề cập (Dimbi et al. , 2003; Vu et al. , 2006).
Hiện nay, các nghiên cứu về các chủng nấm Lecanicillium spp. được sử dụng để kiểm
soát côn trùng gây hại cây trồng cũng đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới
nghiên cứu bởi khả năng diệt côn trùng của chúng rất cao.
Vi nấm Lecanicillium spp. ký sinh trên nhiều loại côn trùng bao gồm bộ cánh đều, bộ
cánh cứng, cánh thẳng và bướm (Hall, Burges, 1979; Hall, 1981a, b; Jackson et al. ,
1985; Milner, Lutton, 1986; Johnson et al. , 1988; Gopalakrishnan, 1989;
Khachatourians, 1992). Việc sử dụng bào tử nấm Lecanicillium spp. đã rất được quan
tâm để kiểm soát côn trùng và sâu bệnh hại cây trồng. Bên cạnh đó, giun tròn nang gây
5
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
hại đậu tương, nấm mốc gây hại dưa chuột và các loại nấm gỉ gây hại cây hoa cúc cũng
có thể được kiểm soát bởi loại nấm này (Whipps, 1993; Verhaar et al. , 1996; Meyer et
al. , 1997). Ngoài ra, nấm Lecanicillium spp. có thể được sử dụng với hỗn hợp của một số
thuốc trừ sâu hay thuốc diệt nấm trong các chương trình điều khiển dịch hại cây trồng
tích hợp để có được một hiệu ứng hiệp đồng (Hall, 1981a; Hall R. A., 1981; Hall, 1983).
Hơn nữa, Lecanicillium spp. đã được chứng minh có độc tính rất mạnh đối với một số
loài rệp muội như rệp đào (Myzus persicae) , rệp bông (Aphis gossypii) và Macrosiphum

euphorbiae (Askary et al. , 1998; Alavo et al. , 2001; Kim et al. , 2001), do đó tại Anh,
Mỹ và một số nước khác đã nghiên cứu và có chế phẩm thương mại như Vertalec® từ
bào tử nấm L. longisporum diệt các loài rệp muội, rệp chích hút nhựa cây. Ngoài ra,
Lecanicillium spp. cũng đã được chứng minh rằng, nó có các hoạt động chống nấm mốc
gây bệnh phấn trắng trên nhiều loại cây trồng (Askary et al. , 1998; Dik et al. , 1998;
Verhaar et al. , 1998; Millner et al. , 2004), diệt các ký sinh trùng khác hại cây trồng như
sâu, bọ (Kim et al. , 2005; Lee et al. , 2006; Goettel et al. , 2008).
1.3. Tình hình rệp hại và sử dụng nấm diệt côn trùng tại Việt Nam
1.3.1. Tình hình rệp hại tại Việt Nam
Theo số liệu thống kê ở Việt Nam nếu mỗi năm công tác phòng trừ dịch hại không tốt
thì bị hao hụt từ 3-10 % sản lượng nông sản dự trữ.
Theo nghiên cứu và điều tra của các nhà khoa học, nước ta chịu sự tấn công của hơn
250 loài rệp khác nhau. Các loài gây hại thường gặp: rệp đào, rệp bông, rệp cờ ngô, rệp
thuốc lá, rệp cam, rệp đậu, rệp cải. Tại Đồng bằng sông Cửu long cây sầu riêng bị sự tấn
công từ rệp sáp, một số cây trồng ăn quả tại Tp. Hồ Chí Minh và vùng phụ cận bị ảnh
hưởng từ những loài rệp muội làm mất năng suất và thiệt hại về kinh tế. Cây cà phê tại
một số vùng tại Tây Nguyên cũng đang gặp phải vấn nạn rệp sáp và rệp bông (huyện Đác
Mil hơn 350 ha, huyện Đác Song hơn 150 ha). Ở 3 huyện Trà Ôn, Tam Bình và Vũng
Liêm (Vĩnh Phúc), diện tích ngô bị nhiễm rệp muội từ 2-7%, như vậy nếu tính trên cả
nước thì thiệt hại gây bởi rệp muội là rất lớn.
Trong những năm gần đây, thống kê các loài gây hại cho cây trồng tại nước ta, rệp
đào đang là mối đe dọa cho ngành nông nghiệp với sự ra tăng nhanh chóng về diện tích
6
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
và số lượng cây trồng bị hại. Chúng có thể gây hại trên 300 loài cây trồng khác nhau,
trong đó thường thấy trên các cây như: các loại rau họ thập tự (cải trắng, cải củ, cải xanh,
cải bắp), một số cây ăn quả như đào, hồng, lê, mận. Trong điều kiện nước ta, rệp đào có
thể xuất hiện và gây hại quanh năm, trong đó tập trung nhiều khi thời tiết dịu mát, độ ẩm
cao. Trong một năm rệp đào có thể có tới 15-17 vòng đời, phát sinh và gây hại nặng với

mật độ cao vào tháng 4-5 (vụ đông xuân) và tháng 9-10 (vụ thu đông).
1.3.2. Tình hình sử dụng nấm diệt côn trùng tại Việt Nam
Tại Việt Nam, trong những năm gần đây, việc sử dụng biện pháp sinh học phòng
chống sâu hại cây trồng như sử dụng kí sinh, thiên địch, mới được đi sâu nghiên cứu, tuy
nhiên việc sử dụng biện pháp vi nấm kí sinh đối với rệp muội là một vấn đề đang còn
mới mẻ trong nông nghiệp. Sử dụng nấm kí sinh côn trùng gây hại không ảnh hưởng đến
nguồn nước, môi trường sống, con người và vật nuôi. Việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh
học có những đặc tính nổi bật sau:
Ưu điểm
- Không tạo nên tính kháng thuốc của sâu hại cây trồng, nếu dùng liều cao.
- Không độc hại cho người và gia súc, không gây ô nhiễm môi trường, không
ảnh hưởng đến chất lượng nông sản, không tác dụng tiêu cực đến đất trồng.
- Hiệu quả thuốc vi sinh thường kéo dài vì chúng không chỉ tiêu diệt trực tiếp
lứa sâu đang phá hoại mà chúng còn có thể lan truyền cho thế hệ tiếp theo, nên
rất tiết kiệm chi phí.
- Không ảnh hưởng tiêu cực đến tài nguyên vi sinh vật đất, các loài thiên địch
hữu ích.
Nếu sử dụng hợp lý, đúng kỹ thuật sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao.
Nhược điểm
- Tác động của thuốc trừ sâu vi sinh chậm nên hiệu quả chậm bởi vì thuốc trừ sâu vi
sinh thường có quá trình gây bệnh và nhiễm bệnh khi vào cơ thể sâu thì thời gian ủ
bệnh phải mất 1-3 ngày.
- Hiệu quả của thuốc ban đầu không cao, phổ tác dụng của thuốc còn hẹp.
7
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
- Một vài loại thuốc trừ sâu vi sinh bị ảnh hưởng bởi điều kiện thời tiết như độ ẩm
không khí, gió, ánh nắng mặt trời. Nếu như phun trừ sâu sinh học không đúng kỹ
thuật, phun trong điều kiện không thích hợp sẽ khó đạt hiệu quả cao.
- Khả năng bảo quản các thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học không cao nên dẫn tới

khó khăn trong việc bảo quản, lưu thông, phân phối và sử dụng. Giá thuốc còn cao.
Tại Việt Nam, quy trình sử dụng vi nấm M. anisopliae và B. bassiana đã được nghiên
cứu khá thành công và được sản xuất thành một số chế phẩm. Theo Nguyễn Thị Lộc
(Viện lúa ĐBSCL) cho biết việc triển khai sản xuất bào tử nấm đến hộ nông dân và sử
dụng nấm để kiểm soát rầy nâu đã góp phần làm giảm chi phí và tăng thu nhập cho người
trồng lúa. Chế phẩm từ 2 loại nấm này giúp bảo vệ môi trường và tạo thêm một số mô
hình kinh tế mới như trồng lúa kết hợp nuôi tôm. Sử dụng biện pháp sinh học này giúp
việc kiểm soát rầy nâu giảm bớt chi phí so với dùng thuốc trừ sâu hóa học
( />Vi nấm M. anisopliae cũng có hiệu lực cao đối với rệp sáp giả Dysmicoccus sp. hại
na. Phun nấm với nồng độ 9x10
8
bào tử/ ml đã kiểm soát được 82% rệp sáp giả sau 5
ngày xử lý. Tuy nhiên, hiệu quả trừ rệp sáp giả của nấm M. anisopliae trên cây na ở điều
kiện đồng ruộng ở ngoại ô Tp. Hồ Chí Minh thấp hơn so với ở phòng thí nghiệm, nhưng
cũng đạt 56-78% (Võ Thị Thu Oanh, 2008). Chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học 2B có
nguồn gốc từ nấm B. bassiana đã được thử nghiệm kiểm soát rầy nâu hại lúa (Phạm Văn
Mạch, 1998). Các chủng B. thuringiensis được chọn lọc từ tự nhiên ở Việt Nam và nước
ngoài cũng đã được nghiên cứu tạo chế phẩm, chế phẩm Bt do Viện Công nghệ sau thu
hoạch sản xuất có hoạt tính diệt sâu cao đối với côn trùng bộ cánh vảy hại rau quả, nông
sản bảo quản (Nguyễn Thuỳ Châu et al. , 2000).
M. anisopliae Ma5 đã được phối trộn với chất phụ gia sinh học tạo thành chế phẩm
thuốc trừ sâu sinh học có tên Vimetazimm 95DP, sản phẩm của công ty Trường An.
Thuốc trừ sâu vi sinh BT do Viện Công nghiệp Thực phẩm Hà Nội sản xuất, có hiệu
quả giết sâu róm thông (D. punclatus). Thuốc không độc đối với người và gia súc và
không gây ô nhiễm môi trường, rẻ hơn các loại thuốc diệt sâu róm thông khác (Đào Xuân
Trường, 1992). Một chế phẩm khác từ Metarhizium diệt trừ được các loại sâu xanh,
bướm trắng, sâu khoang ăn lá, bọ hung đen ăn mía, mối đất ăn thông trắng, một số loại
8
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận

côn trùng hại bồ đề, cây điều, cây ăn quả; sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắp cải, sâu
khoang hại cà chua cho kết quả diệt trừ sâu bệnh hơn 70%
Thuốc trừ sâu vi sinh MVP 10FS, Delfin WG 32BIU, Aztron, Tập Kỳ 1,8EC
(Abamectin từ Streptomyces avermitilis) có hiệu lực diệt sâu tơ Plutella xylostella và sâu
khoang Spodoptera litura khá cao, hiệu lực dài. Đặc biệt thuốc Tập kỳ 1,8EC có hiệu lực
rất cao đối với sâu tơ và sâu xanh bướm trắng, thuốc có mùi dễ chịu và dùng với lượng
rất nhỏ trên một ha, cần đưa vào chương trình quản lý dịch hại tổng hợp IPM. Bốn loại
thuốc trừ sâu vi sinh này được xếp loại ưu tiên lựa chọn để phòng trừ sâu tơ và sâu
khoang hại rau họ thập tự bắp cải, súp lơ, su hào và các loại rau cải. Bên cạnh đó Thuốc
VBt và Bacterin BT cũng có hiệu lực diệt sâu tơ cao (Nguyễn Văn Sơn et al. , 2001)
Có thể thấy, xu hướng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc là sinh học trên
thế giới và Việt Nam ngày càng nhiều và càng được quan tâm, trong đó có xu hướng sử
dụng nấm kí sinh. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có chưa có nghiên cứu nào về khả năng
diệt côn trùng của chủng nấm Lecanicillium spp.
Trái lại, trên thế giới, chủng nấm này có độc lực cao đối với rệp đào đã được khẳng
định. Chẳng hạn, vi nấm Lecanicillium spp. được phân lập từ rệp đào có khả năng diệt
100% rệp Aphis gossypii, hại dưa cà, bông sau 3 đến 5 ngày trong điều kiện phòng thí
nghiệm và trên 78% trong điều kiện nhà kính sau 14 ngày. Bào tử của vi nấm
Lecanicillium spp. cũng có khả năng diệt 100% rệp đào hại rau cải, rau diếp, ớt sau 4-5
ngày phun trong điều kiện phòng thí nghiệm, ngoài ra bào tử của nấm này có khả năng
diệt được một số côn trùng và rệp cây khác (Vu et al. , 2007).
1.4. Công nghệ lên men lỏng và lên men xốp
Đối với việc kiểm soát sinh học bằng thuốc diệt côn trùng sinh học cần một lượng lớn
bào tử. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm kí sinh diệt
côn trùng đã chứng minh rằng số lượng và chất lượng của bào tử phụ thuộc vào nhiều
yếu tố, chẳng hạn như phân lập, chất dinh dưỡng, mật độ và điều kiện môi trường. Sự
thành công của kiểm soát rệp bằng biện pháp sinh học không chỉ phụ thuộc vào đặc điểm,
cách ly và gây bệnh mà còn phụ thuộc vào nồng độ bào tử của chủng nấm. Việc nâng cao
lượng bào tử nấm kí sinh diệt côn trùng với mong muốn giảm lượng nấm trong sử dụng
để kiểm soát rệp. Phát triển và tối ưu điều kiện lên men để sản xuất bào tử cho số lượng

9
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
lớn trong thời gian ngắn bằng lên men lỏng hoặc lên men rắn (Roussos et al. , 1993). Cả
hai hệ thống lên men xốp và lên men lỏng đã được sử dụng để sản xuất hàng loạt các chất
bảo vệ cây trồng có nguồn gốc từ vi sinh vật. Tuy nhiên, lên men trạng thái xốp cho phép
sản xuất bào tử cứng và khỏe mạnh hơn (Bartlett, Jaronski, 1988). Cách khả thi nhất là
nuôi nấm trong môi trường lỏng sau đó hút dịch có bào tử sang nuôi cấy trong môi
trường rắn (Burges và Hussey, 1981).
Một trong những quan tâm quan trọng nhất trong việc thiết kế một quy trình sản xuất
hàng loạt bào tử là khả năng tương thích của sản phẩm với chất phụ gia sinh học trong
quá trình phối chế trước khi phun và quy trình phun sản phẩm trên đồng ruộng. Ví dụ,
việc sử dụng các công thức dầu cho việc phối chế tạo chế phẩm siêu nhũ để phun ngoài
đồng ruộng, thì bào tử được sản xuất từ lên men xốp là thích hợp, vì bào từ được tạo ra là
dạng kị nước nên dễ tạo độ đồng nhất trong dầu hơn là bào tử tạo ra từ lên men lỏng
(Bartlett, Jaronski, 1988; Jenkins, Thomas, 1996). Tuy nhiên lên men lỏng có thể áp dụng
cho việc phối chế sau này không dùng dầu. Bào tử trần được sản xuất trong quá trình lên
men lỏng, ưa nước và hoạt tính của bào tử mất khá nhanh, khả năng sống sót giảm tương
đối nhanh trong thời gian bảo quản (Kleespies, Zimmermann, 1992).
Gần đây, nhu cầu hệ thống lên xốp tăng, đã mở ra cơ hội cho ngành công nghiệp
trong việc nghiên cứu, thiết kế, sản xuất thiết bị đặc biệt này, hệ thống lên men xốp hiếu
khí được gắn với các thiết bị điều khiển tự động cơ bản giống với lên men lỏng. Điều này
làm giảm chi phí lao động và cho phép kiểm soát chặt chẽ và tiêu chuẩn hoá của quá trình
sản xuất. Tuy nhiên, ở các nước nghèo, hoặc đang phát triển, nơi lao động tương đối rẻ,
kinh tế còn nhiều khó khăn, do đó nó có thể làm cản trở sự phát triển hệ thống lên men
xốp tự động này (Roussos et al. , 1993). Vì vậy, việc sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ
tiền trong lên men xốp sẽ giúp các nước này giảm thiểu chi phí. Trên thế giới, có rất
nhiều nhà sản xuất bào tử nấm diệt côn trùng gây hại, đặc biệt là ở châu Mỹ La tinh
(Alves, Pereira, 1989) và Trung Quốc (Feng et al. , 1994), họ có thể cung cấp đủ số
lượng sản phẩm cho thị trường trong nước ngay lập tức. Hệ thống sản xuất bào tử bằng

lên xốp ở đây khá đơn giản như dùng khay, bình nhựa, túi và thường cần nhiều lao động
phổ thông, vì ở các quốc gia này chi phí lao động khá thấp và thị trường của sản phẩm
tương đối nhỏ nên qui mô sản xuất bằng cách này có thể đáp ứng nhu cầu và giải quyết
việc làm cho người lao động.
10
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
Lên men xốp được coi là hệ thống thích hợp cho sản xuất hàng loạt bào tử nấm để sử
dụng trong việc tạo chế phẩm siêu nhũ khi phun trên đồng ruộng. Lên men xốp cũng có
lợi thế bổ sung khi so sánh với quá trình lên men lỏng như: thao tác đơn giản, đòi hỏi vốn
đầu tư thấp, có năng suất cao, tiết kiệm năng lượng, các thông số quá trình lên men không
bị yêu cầu quá nghiêm ngặt, sử dụng ít nước và nước thải thải ra môi trường rất ít, dễ
dàng kiểm soát nhiễm khuẩn, máy móc vật tư có giá thành rẻ hơn, chi phí thấp cho quá
trình thu hồi sản phẩm (Pandey A., 1994; Feng KC, Liu BL and Tzeng YM., 2000; Vu,
Kim, 2008).
Việc sản xuất bào tử trần chủng Lecanicillium spp., một loại nấm độc lực cao, bằng
lên men xốp đã được sử dụng như một chất kiểm soát sinh học. Trong số nhiều môi
trường xốp từ sản phẩm công nông nghiệp thì gạo hấp tạo ra lượng bào tử cao nhất. Các
điều kiện tối ưu cho sản xuất bào tử nấm trần được xác định là : 28,5% độ ẩm trong gạo,
nhiệt độ nuôi cấy là 25°C, pH gạo bằng 6, độ ẩm xung quanh là 75%, nấm nuôi cấy trên
môi trường lỏng 4 ngày, 0,6% KNO
3
, thời gian ủ là 12 ngày. Bào tử nấm tăng từ
5,7x10
9
/g gạo lên 18,2x10
9
bào tử / gam gạo sau khi các điều kiện đã tối ưu(Vu et al. ,
2008).
11

Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng nấm
Các chủng nấm Le85, 8514, L43, 85K, 1014 và 1305 thuộc bộ chủng của Phòng Công
nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam. Các chủng này được phân lập từ các mẫu đất, lá cây, côn trùng chết từ các vùng địa
lí khác nhau. Chủng VTCC (1037, 1039) được cung cấp bởi Bảo tàng chủng vi sinh vật
gốc, Viện vi sinh và Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nội.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết (Bảng 2.2).
Bảng 2.2. Hóa chất chính dùng trong thí nghiệm
Tên hóa chất
Hãng sản xuất
Agar
Việt Nam
Agarose
Bio Basic Inc (Mỹ)
Boric acid Bio Basic Inc (Mỹ)
Peptone Bio Basic Inc (Mỹ)
Tween 20 BioBasic Inc (Mỹ)
Tween 80 BioBasic Inc (Mỹ)
Yeast extract (cao nấm men) Bio Basic Inc (Mỹ)
Calciumchloride Dihydrate Merck (Đức)
Natrium dihydrogenphosphate dihydrate Merck (Đức)
Natriumacetate-trihydrate Merck (Đức)
Ammonium chloride China
Ammonium nitrate China
Kali chloride China

Maganesium sulfate heptahydrate China
Triton X-100 Sigma (Mỹ)
12
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
2.1.3. Dung dịch và đệm
Các dung dịch hóa chất và đệm sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng 2.3.
Thành phần hóa chất, nồng độ, cách pha được thực hiện theo hướng dẫn của các bài báo
đã được công bố.
Bảng 2.3. Các dung dịch và đệm được sử dụng trong thí nghiệm
Dung dịch Nồng độ, chất hóa học
Sol I 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 8
Sol II 0,2 N NaOH; 1% SDS
Sol III 60% potassium acetate; 11,5% (v/v) acid glacial acetic
protease K 20 μg/ml protease K
RNase 10 μg/ml Rnase
Amp gốc 100 mg/ml ampicillin
Dung dịch nhuộm gel 0,1 μg/ml ethidium bromide
Đệm TE 100 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA; pH 8
Đệm tra mẫu DNA 6x 0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) Xylene
xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol
Đệm TBE 10x 108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
Dung dịch isopropanol 99%
Chloroform:isoamylalcohol 24:1
2.1.4. Môi trường
Potatoes dextrose (PD) lỏng: 20% dịch chiết khoai tây, 2% glucose (w/v), 0,6%
KNO3 (w/v). PD rắn, môi truờng PD lỏng được bổ sung 2% agar (w/v).
Luria-Bertani (LB) lỏng : 1% (w/v) peptone, 0,5% (w/v) cao nấm men, 1% (w/v)
NaCl, pH 7,5. LB rắn, môi trường LB lỏng được bổ sung 2% agar (w/v). Đối với việc
chọn chủng mang plasmid, môi trường được bổ sung 100 µg ampicillin/ml.

Tất cả các môi trường lỏng, đặc dùng cho nuôi cấy vi sinh đều được khử trùng ở khử
trùng 121
o
C trong 15 phút.
2.1.5. Thiết bị thí nghiệm
Các thiết bị chính sử dụng trong thí nghiệm được liệt kê ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các thiết bị dùng trong thí nghiệm
13
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
Tên thiết bị Hãng sản xuất
Bể ổn nhiệt Trung Quốc
Box cấy LB-1234 Việt Nam
Cân phân tích BL 150S Sartorius (Thụy Sĩ)
Hệ thống chụp ảnh gel Wealtec (Mỹ)
Hệ thống điện di ngang
Mupid α (Nhật Bản)
Lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc)
Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức)
Máy PCR Eppendorf (Đức)
Máy chuẩn pH 827 pH Lab Metrohm (Thụy Sĩ)
Máy lắc nuôi cấy Certomat HK (Đức)
Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật Bản)
Tủ lạnh 4°C, -20°C, -84°C
Toshiba, Sanyo (Nhật Bản)
Kính hiển vi Trung quốc
Máy li tâm lớn Hitachi
2.2. Phương pháp
2.2.1. Sàng lọc chủng nấm có khả năng diệt rệp đào
Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA, sau 7 ngày tiến hành thu bào tử bằng

dung dịch 0,05% Tween 80 để tách bào tử ra khỏi sợi nấm. Rệp đào ở giai đoạn 2-3 ngày
tuổi được nuôi trên lá cải thảo đặt vào trong hộp kích thước 30x20x20 cm
3
duy trì ở 23-
27
o
C và độ ẩm 80-85%. 15 ml dung dịch bào tử nấm (3x10
8
/ml) pha trong 0,05% Tween
80, được phun dạng sương lên lá cải đã có 25 con rệp, với khoảng cách từ rệp đến miệng
vùi phun khoảng 25 đến 30 cm. Lô đối chứng chỉ phun 15 ml dung dịch 0,05% Tween
80. Lá cải có rệp sau khi được phun đặt vào trong hộp. Hàng ngày theo dõi số lượng rệp
chết bởi nấm (quan sát trong 7 ngày), làm cơ sở đánh giá khả năng diệt rệp của nấm.
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử
Tách chiết DNA tổng số
Chủng nấm 8514 được nuôi cấy trong môi trường PDB ở 25°C, lắc 200 vòng/phút
trong 5 ngày. Dịch nuôi được li tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút, ở 4°C. Bỏ dịch, thu
thể sợi rồi nghiền nhanh trong nitơ lỏng, bổ sung 600 µl đệm phá tế bào, lắc nhẹ và thêm
14
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
65 µl dung dịch lysozyme, ủ ở 37°C trong 30 phút. Sau đó hỗn hợp được bổ sung 5 µl
protease K ủ 2 giờ ở 56°C. Bổ sung chloroform : isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 và
ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. 500 µl dịch nổi phía trên được thu sang ống
eppendorf mới và bổ sung isopropanol tỷ lệ 1:1 để ở -20°C trong 2 giờ. Tủa thu được sau
khi ly tâm 12000 vòng/phút, ở 4°C trong 15 phút được làm khô dưới ánh sáng đèn và bổ
sung 500 µl ethanol 70% để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm ở 12000
vòng/phút trong 10 phút, tủa được làm khô và hòa trong 40 µl đệm TE và bảo quản ở
-20°C (Sandgren et al. , 2003).
Khuếch đại PCR

Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào, nhà hóa sinh người Mỹ Karry
Mullis đã phát minh ra kĩ thuật tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR) vào năm 1985.
PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2
mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA
polymerase.
Để khuếch đại đoạn gene 28S rRNA từ chủng nấm 8514 cặp mồi NL1 (5'-GCA TAT
CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3') và NL4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-
3') được sử dụng.
Nhiệt độ gắn mồi của cặp NL1 và NL4 là 50°C. Hỗn hợp phản ứng PCR gồm: 1 µl
mồi mỗi loại; 2 µl dNTP; 2,5 µl 25 mM MgCl
2
; 2,5 µl đệm10x PCR; 0,35 µl Taq; 1 µl
khuôn DNA và bổ sung H
2
O cất tiêm đến tổng thể tích 25 µl.
Phản ứng được thực hiện ở điều kiện: 95°C/5’, 35x (95°C/1’; 52°C/1’; 72°C/1’);
72°C/10’.
15
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
Gắn dính sản phẩm PCR vào pJET1.2

Hình 1.2. Vector nhân dòng pJET1/blunt.
Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET1.2 được thực hiện theo
chỉ dẫn của Fermentas. Hỗn hợp gồm 5 µl đệm 2x; 1,5 µl sản phẩm PCR; 0,5 µl enzyme
blunting; 2,5 µl H
2
O và hỗn hợp được ủ ở 70°C trong 15 phút. Bổ sung 0,5 µl pJET1.2 và
0,5 µl T
4

DNA ligase rồi ủ qua đêm ở 22°C tạo plasmid tái tổ hợp.
Biến nạp plasmid vào tế bào khả biến
Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α theo phương pháp sốc nhiệt.
Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E. coli được cấy chuyển vào 3 ml môi trường
LB, lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm. 100 ml môi trường LB được tiếp giống với 1 ml
dịch tế bào qua đêm, nuôi lắc ở 37°C với 200 vòng/phút. Khi OD
600nm
đạt 0,4-0,6 (khoảng
2-3 giờ nuôi cấy), dịch nuôi cấy được đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 10 phút ở 4°C với
6000 vòng/phút. Tủa tế bào được hòa đều trong 100 ml dung dịch 100 mM CaCl
2
lạnh và
vô trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm như trên. Tủa tế bào lại được hòa đều trong 40 ml 100
mM CaCl
2
lạnh vô trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 10 phút với 4000 vòng/phút. Tủa tế
bào lại được hòa vào 4-5 ml 100 mM CaCl
2
lạnh, vô trùng chứa 15% glycerol. Dịch hỗn
hợp tế bào và glycerol được chia nhỏ vào các ống eppendorf, dùng để biến nạp ngay hoặc
bảo quản ở -84°C.
Lấy tế bào khả biến E. coli DH5α từ tủ -80°C, đặt trong khay đá lạnh khoảng 10 phút.
5 μl plasmid mang gene ngoại lai được trộn với 40 μl dịch tế bào khả biến trong ống
16
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
eppendorf, ủ 30 phút trên khay đá lạnh. Hỗn hợp được sốc nhiệt 45 giây ở 42°C. Sau đó
đặt ngay vào khay đá lạnh 5 phút rồi bổ sung 250 μl môi trường LB đã khử trùng. Sau khi
nuôi lắc hỗn hợp khoảng 45 phút ở 37°C với 200 vòng/phút, 50-200 μl dịch tế bào đã
biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc chứa 100 μg/ml ampicillin ủ qua đêm ở

37°C.
Tách chiết DNA plasmid
Một khuẩn lạc đã được biến nạp trên đĩa thạch LB/amp được cấy vào 3 ml môi trường
LB chứa ampicillin, nuôi lắc qua đêm ở 37°C, 200 vòng/phút. Dịch tủa tế bào thu được
sau khi ly tâm 5 phút với 6000 vòng/phút được lắc rung 30 giây trong 150 µl Sol I thành
dịch đồng nhất, ủ 15-20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó 150 µl Sol II được bổ sung vào
hỗn hợp và đảo nhẹ, tiếp tục bổ sung 150 µl Sol III vào hỗn hợp đảo nhẹ. Hỗn hợp được
bổ sung 450 µl chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc nhẹ và ly tâm 10 phút với 12500
vòng/phút trong. 450 µl pha trên được hút sang ống mới, bổ sung 320 µl isopropanol, lắc
nhẹ và ủ 5 phút ở -80°C để tủa DNA plasmid. Tủa DNA plasmid sau khi ly tâm 12500
vòng/phút trong 5 phút được rửa với 500 µl 70% ethanol ở 4°C để loại muối và
isopropanol, làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Tủa plasmid được hòa trong đệm
TE pH 8 hoặc nước khử ion vô trùng và điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid rồi bảo
quản ở -20°C.
Cắt DNA tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn
DNA plasmid tái tổ hợp được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn XhoI và XbaI qua
đêm ở 37°C để kiểm tra phân đoạn chèn. Hỗn hợp phản ứng gồm 3,5 µl DNA plasmid tái
tổ hợp; 0,25 µl enzyme giới hạn mỗi loại; 2 µl đệm Tango Y
+
và bổ sung H
2
O cất tiêm
đến 10 µl. Sau phản ứng, sản phẩm cắt được điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra.
Giải trình tự nucleotide
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, đoạn gene DNA chèn vào plasmid được giải
trình tự.
Kết quả đọc trình tự được phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình
tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại.
17
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức

Thuận
2.2.3. Khảo sát một số yếu tố lên sản xuất bào tử trong lên men xốp
Sau khi sàng lọc, chủng có khả năng diệt rệp đào với hiệu quả cao nhất trong bộ
chủng Lecanicillium spp. ở phần trên được chọn và nghiên cứu một số yếu tố lên khả
năng sản xuất bào tử trong lên men xốp.
Tối ưu cơ chất
Nấm được nuôi trên các nguồn cơ chất như ngô xay, bã mía, cám, mùn cưa, gạo tấm
nhỏ, gạo tấm to, gạo nứt trong cùng nồng độ. Ở 25°C, sau 12 ngày lên men, bào tử được
thu và xác định số lượng bào tử được sản xuất trên 1 g cơ chất.
Nguồn nitrogen
Chọn cơ chất có khả năng sinh bào tử cao từ thí nghiệm trên để sử dụng tối ưu nguồn
nitrogen. Các nguồn nitrogen như peptone, bột đậu tương, NH
4
Cl, NH
4
NO
3
, KNO
3
, cao
nấm men được bổ sung vào gạo đã ngâm trương (đã dáo nước) với tỷ lệ 1% (nguồn
nitrogen/ gạo, w/w) trước khi khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Đối chứng cơ chất không
bổ sung nguồn nitrogen. Bào tử chủng nấm được cấy vào cơ chất, lên men ở 25
o
C, sau 12
ngày tiến hành thu bào tử và xác định số lượng bào tử trên 1 g cơ chất.
pH môi trường
Cơ chất được xử lí với các dung dịch đệm có pH từ 4 đến 10. Sau đó gạo được để dáo
nước rồi cho vào bình lên men, khử trùng ở 121
o

C trong 20 phút. Bào tử chủng nấm được
cấy vào cơ chất, lên men ở 25°C. Sau 12 ngày tiến hành thu bào tử và xác định số lượng
bào tử trên 1 g cơ chất.
Độ thoáng khí
Cơ chất đã được ngâm, để dáo nước. Cân cơ chất với lượng 5; 10; 15; 20; 25; 30 và
40 g đưa vào bình tam giác dung tích 250 ml, khử trùng như trên. Bào tử chủng nấm
được cấy vào cơ chất, lên men ở 25°C. Sau 12 ngày tiến hành thu bào tử và xác định số
lượng bào tử trên 1 g cơ chất.
Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến khả năng tách bào tử từ cơ chất và khả
năng nảy mầm của bào tử nấm
Các dung dịch Tween 20, Tween 80, Triton X-100 với nồng độ khác nhau 0,02; 0,05;
0,1% được sử dụng để nghiên cứu. Cân 1 gam cơ chất đã lên men 12 ngày đưa vào ống
18
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
falcon dung tích 50 ml, thêm tiếp 24 ml dung dịch hoạt động bề mặt, lắc 200 vòng/ phút
trong 30 phút. Số lượng bào tử trên gam cơ chất được tách bởi dung dịch hoạt động bề
mặt được xác định.
Đánh giá ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt đến khả năng nẩy mầm của bào tử:
Bào tử thu được từ các dung dịch hoạt động bề mặt khác nhau được pha loãng đến
nồng độ 10
7
bào tử/ ml. Hút 30 μl dung dịch bào tử trải đều lên lam kính đã phủ một lớp
mỏng 1% agar (w/v). Ủ ở 25
o
C, sau 12 giờ và 24 giờ quan sát tỷ lệ nảy mầm của bào tử.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sàng lọc chủng nấm Lecanicillium spp. diệt rệp đào
Tám chủng nấm Le85, 8514, L43, 1039, 85K, 1037, 1014 và 1305 được khảo sát khả
năng diệt rệp. Ở 20~22

o
Cvà độ ẩm 80~85%, sau 5 ngày phun bào tử, hai chủng Le85,
8514 diệt rệp tương ứng là 89% và 90%, trong khi đó rệp bị diệt bởi chủng L43 và 85K
tương ứng là 87% và 88%. Các chủng nấm khác diệt được 28 đến 60%. Bên cạnh đó, ở
23~24
o
C và độ ẩm 80~85%, sau 5 ngày phun bào tử, ba chủng Le85, 8514, L43 diệt đựợc
19
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận
92 đến 96% rệp. Ở 25~27
o
C và độ ẩm 80 ~85%, bốn chủng Le85, 8514, L43 và 85K diệt
đựợc 100% rệp. Các chủng còn lại ở cùng điều kiện diệt được 28 đến 60%. Như vậy, khả
năng diệt rệp đào của các chủng nấm trên có sự khác biệt rõ rệt. Đặc biệt 3 chủng Le85,
8514 và L43 có khả năng diệt rệp hiệu quả 96 đến 100% ở khoảng nhiệt độ rộng
20~27
o
C, với cùng điều kiện độ ẩm. Khả năng diệt rệp đào, rệp bông ở phổ nhiệt độ rộng
và độ ẩm thay đổi cũng đã được nghiên cứu trước đây bởi Vu VH và cộng sự. Ở nhiệt độ
25°C, độ ẩm 75-85% chủng Lecanicillium spp. thể hiện độc lực cao đối với rệp cả rệp
đào M. persicae và rệp bông A. gossypii, diệt rệp 100% sau 5 và 2 ngày phun (Vu et al. ,
2007)
Ở 25-27
o
C và độ ẩm 80-85% (A)
20
A
Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Đức
Thuận

Ở 20-22
o
C và độ ẩm 80-85% (B)
Ở 23-24
o
C và độ ẩm 80-85% (C)
Hình 3.1. Khả năng diệt rệp đào của các chủng nấm Lecanicillium spp. ở 25-27
o
C và độ
ẩm 80-85% (A), 20-22
o
C và độ ẩm 80-85% (B), 23-24
o
C và độ ẩm 80 -85% (C)
21
B
C