Nghiên cứu sử dụng các chỉ thị hóa sinh để đánh giá mức độ ô nhiễm Asen trong nước khoan và mối tương quan với thâm nhiễm Asen trên người

4

MỤC LỤC



Trang
Mở đầu
1
Chƣơng 1. Tổng quan
1.1. Vấn đề ô nhiễm asen trong nước ngầm và nhu cầu phát triển công
cụ phân tích nhanh
4
1.1.1. Nguyên tố asen trong tự nhiên và đời sống
4
1.1.2. Vấn đề ô nhiễm asen trong nước giếng khoan trên thế giới và
ở Việt Nam
6
1.1.3. Nhu cầu phát triển công cụ phân tích nhanh, phục vụ cho
nhiệm vụ đánh giá hiện trạng ô nhiễm asen trong nước giếng
khoan
10
1.2. Biosensor sử dụng vi khuẩn chuyển gen để phân tích asen trong
nước
14
1.2.1. Biosensor sử dụng các tế bào vi khuẩn
14
1.2.2. Biosensor vi khuẩn đáp ứng đặc hiệu với asen và có gắn các
gen chỉ thị khác nhau

16
1.2.2.1. Gen kháng asen ở vi khuẩn E. coli (arsenic resistance
gene)
16
1.2.2.2. Các gen chỉ thị thường được sử dụng trong biosensor vi
khuẩn
17
1.2.2.3. Ứng dụng thực tiễn của các biosensor sử dụng vi khuẩn
biến đổi gen có đáp ứng với asen
20
1.3. Sử dụng các biomarker trong nghiên cứu thâm nhiễm asen trên
người
23
1.3.1. Tác hại tới sức khoẻ gây ra bởi nhiễm độc asen
23
1.3.2. Sử dụng các biomarker trong nghiên cứu thâm nhiễm asen
trên người
24
1.3.2.1. Vai trò của các biomarker trong đánh giá nguy cơ
24


5

nhiễm độc
1.3.2.2. Sử dụng chỉ số hàm lượng asen trong tóc để đánh giá
mức độ thâm nhiễm lâu dài asen từ nước giếng khoan
27
1.3.2.3. Sử dụng chỉ số các thành phần asen methyl hoá trong
nước tiểu để đánh giá mức độ thâm nhiễm asen hiện tại

và cung cấp số liệu minh hoạ cơ chế nhiễm độc asen ở
người
28
Chƣơng 2. Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
34
2.1. Nguyên liệu
34
2.1.1. Mẫu nước giếng khoan, mẫu tóc và mẫu nước tiểu
34
2.1.2. Mẫu biosensor sử dụng các chủng vi khuẩn chỉ thị
36
2.1.3. Thiết bị, hoá chất và chất chuẩn
37
2.2. Phương pháp
38
2.2.1. Nuôi, cấy chuyển và giữ giống vi khuẩn chỉ thị asen
38
2.2.2. Phân tích hàm lượng asen hoà tan trong dung dich trung tính
bằng vi khuẩn chỉ thị
38
2.2.3. Thí nghiệm chọn thời gian vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB tiếp
xúc với asen và tối ưu hoá lượng cơ chất n-decanal.
40
2.2.4. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng sắt trong nước
tới khả năng sử dụng sinh học asen đối với vi khuẩn chỉ thị
40
2.2.5. Phương pháp phân tích asen trong dung dịch bằng quang phổ
hấp thụ nguyên tử nối ghép thiết bị sinh khí hydrua asin
(AsH
3

)
41
2.2.6. Phương pháp xử lý mẫu tóc
41
2.2.7. Phân tích các dạng asen hữu cơ trong nước tiểu bằng kỹ thuật
nối ghép sắc ký trao đổi ion với phổ khối cảm ứng plasma (IC-
ICPMS)
42




6

Chƣơng 3. Kết quả và bàn luận

3.1. Chọn lựa và tối ưu phương pháp phân tích hàm lượng asen trong
nước giếng khoan bằng biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị
43
3.1.1. So sánh khả năng phân tích asen bằng ba chủng vi khuẩn E.
coli có các gen chỉ thị khác nhau là lacZ, gfp và luxAB
43
3.1.2. Tối ưu hoá và xây dựng qui trình phân tích asen trong nước
giếng khoan bằng chủng vi khuẩn E. coli luxAB
50
3.1.3. Ứng dụng biosensor vi khuẩn để đánh giá ô nhiễm asen trong
nước giếng khoan tại Việt Nam
59
3.2. Mối tương quan giữa ô nhiễm asen trong nước giếng khoan với mức
độ thâm nhiễm asen trên người

65
3.2.1. Mức độ tích luỹ asen trong các mẫu tóc
65
3.2.2. Mối tương quan giữa ô nhiễm asen trong nước giếng khoan,
nước đã lọc với hàm lượng asen trong tóc
73
3.2.3 Mối tương quan giữa ô nhiễm asen trong nước giếng khoan,
nước đã lọc với hàm lượng các dạng asen methyl hoá trong
nước tiểu
76
Kết luận
84
Kiến nghị về các nghiên cứu tiếp theo
85
Tài liệu tham khảo
86
Danh mục các công trình khoa học của tác giả liên quan tới luận án
97











7

Danh mục các bảng


Bảng 1.1 Ví dụ hiện trạng ô nhiễm asen trong nước ngầm tại một số quốc gia
trên thế giới
Bảng 2.1 Địa điểm và số lượng mẫu thu thập cho nghiên cứu ứng dụng
biomarker
Bảng 3.1. So sánh kết quả phân tích asen trong 410 mẫu nước giếng khoan
Bảng 3.2 Số liệu thực địa trong nghiên cứu về mức độ thâm nhiễm asen trong
tóc
Bảng 3.3 Hàm lượng asen trung bình trong tóc, nước giếng và nước sinh hoạt
(đã lọc hoặc dùng trực tiếp)
Bảng 3.4 So sánh mức độ ô nhiễm asen tại nghiên cứu này với một số địa điểm
trên thế giới
Bảng 3.5 Hàm lượng asen trong nước tiểu, nước giếng và nước sinh hoạt (đã
lọc hoặc dùng trực tiếp)

8

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa biomarker và bioindicator
Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hoá các chất độc trong cơ thể
Hình 1.3 Sơ đồ giả thuyết về chuyển hoá của asen trong cơ thể người
Hình 2.1 Bản đồ các vị trí lấy mẫu sinh học
Hình 3.1 Kết quả thí nghiệm đánh giá hàm lượng asen trong nước bằng vi
khuẩn chỉ thị E. coli lacZ
Hình 3.2 Ảnh chụp trên kính hiển vi huỳnh quang kết quả thí nghiệm đánh giá
hàm lượng asen trong nước bằng vi khuẩn chỉ thị E. coli gfp
Hình 3.3 Tương quan giữa cường độ ánh sáng phát ra và nồng độ asen trong
dung dịch khi thử nghiệm với vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB
Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với asen lên cường độ ánh sáng phát
ra ở phản ứng xúc tác bởi luciferase của vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB
Hình 3.5 Ảnh hưởng của lượng cơ chất n-decanal lên cường độ ánh sáng phát
ra
Hình 3.6 Ảnh hưởng của lượng sắt trong dung dịch lên khả năng sử dụng sinh
học asen đối với vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB
Hình 3.7 So sánh tác dụng của các hoá chất tới khả năng sử dụng sinh học asen
đối với vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB
Hình 3.8 Ảnh hưởng của lượng EDTA lên cường độ ánh sáng phát ra ở phản
ứng xúc tác bởi luciferase của vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB.
Hình 3.9 Cường độ ánh sáng phát ra ở phản ứng xúc tác bởi enzym luciferase
của vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB khi dùng dung dịch NaOH và
Natri Pyrophotphat 200mM

Hình 3.10 Quy trình phân tích hàm lượng asen trong nước giếng khoan bằng vi
khuẩn chỉ thị E. coli luxAB.
Hình 3.11 Khoảng đáp ứng động học của vi khuẩn chỉ thị E. coli luxAB đối với
asen


9

Hình 3.12 Đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa đáp ứng của vi khuẩn chỉ thị
với nồng độ asen pha trong nước giếng khoan
Hình 3.13 Tương quan giữa số liệu về nồng độ asen trong nước giếng khoan thu
được từ vi khuẩn chỉ thị và quang phổ hấp thụ nguyên tử
Hình 3.14 Bản đồ ô nhiễm asen tại một số khu vực thuộc đồng bằng sông Hồng
Hình 3.15 Hàm lượng As trong các mẫu tóc thu tại đồng bằng sông Hồng
Hình 3.16 Hàm lượng As trong các mẫu tóc thu tại đồng bằng sông Mê Kông
Hình 3.17 Phân bố hàm lượng asen theo nhóm tuổi
Hình 3.18 Phân bố phần trăm số mẫu tóc với hàm lượng asen trung bình ở nam,
nữ và trẻ em.
Hình 3.19 Tương quan giữa hàm lượng asen trung bình trong tóc và trong nước
Hình 3.20 Sắc ký đồ thu được khi phân tích các dạng asen trong nước tiểu.
Hình 3.21 Tương quan giữa hàm lượng asen methyl hoá trong nước tiểu và hàm
lượng asen trong nước
Hình 3.22 Tương quan giữa hàm lượng asen methyl hoá với asen tổng số trong
nước tiểu của các thể không phơi nhiễm asen
Hình 3.23 Tương quan giữa hàm lượng asen methyl hoá với asen tổng số trong
nước tiểu của các thể phơi nhiễm với asen ở mức độ khác nhau.
Hình 3.24 Tương quan giữa mức độ ô nhiễm asen trong nước sinh hoạt, asen
trong tóc và asen methyl hoá trong nước tiểu

10


MỞ ĐẦU

Đảm bảo chất lượng nước ăn và nước sinh hoạt cho cộng đồng dân cư
tại khu vực nông thôn là một trong những vấn đề trọng tâm của chương trình
chăm sóc sức khoẻ ban đầu hiện nay tại Việt Nam. Đồng bằng sông Hồng và
đồng bằng sông Mê kông là hai khu vực tập trung đông dân nhất nước ta với
dân số tương ứng 17,7 triệu và 16,9 triệu, chiếm gần 42,7% trong tổng số
khoảng 80,9 triệu dân của cả nước (theo số liệu điều tra dân số năm 2003 của
Tổng cục Thống kê). Ngoại trừ tại các thành phố, thị trấn có hệ thống cấp
nước sạch tập trung từ các nhà máy nước, còn lại hầu hết dân cư sống xa đô
thị đều phải tự khai thác và sử dụng các nguồn nước khác như nước mặt
(nước sông, hồ), nước ngầm (nước giếng khơi, giếng khoan), nước mưa. Để
tránh một số bệnh như tiêu chảy, đau mắt, giun sán, v.v…do sử dụng nước
sông, nước hồ gây ra, ngày nay hầu hết các hộ dân tại hai khu vực trên đã tự
khoan giếng để lấy nước ngầm sử dụng cho các sinh hoạt hàng ngày như ăn
uống, tắm giặt [5]. Nhưng người dân lại có nguy cơ đối mặt với một ô nhiễm
mang tính tự nhiên, đó là sự có mặt của nguyên tố asen (thạch tín) trong nước

ngầm [78].
Asen khi thâm nhập hàng ngày vào cơ thể kể cả ở hàm lượng thấp cũng
gây ra những tác hại cho sức khoẻ như: gây hoại tử các vết loét ở tay, chân,
làm rối loạn sắc tố da, sừng hoá gan bàn tay, gan bàn chân, thậm chí liên
quan tới bệnh tiểu đường, tim mạch, ung thư bàng quang, ung thư gan,
v.v…[97]. Do những tác hại lâu dài của asen lên sức khoẻ con người, ngày
nay Tổ chức Y tế thế giới đã đề nghị mức giới hạn asen trong nước uống là
10g/l, Bộ Y tế Việt Nam cũng đã ban hành tiêu chuẩn về asen trong nước
uống là 10g/l thay cho tiêu chuẩn Việt Nam năm 1995 là 50g/l [1, 2].


11

Từ những năm cuối của thế kỷ 20, thảm hoạ nhiễm độc asen do dùng
nước giếng khoan đã được phát hiện tại các nước nam Á như Ấn Độ (vùng
Tây Bengan), Bănglađet và Trung Quốc (vùng cao nguyên Nội Mông) [22,
78, 98]. Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về tình trạng ô nhiễm asen
trong nước ngầm, nước cấp tại khu vực Hà Nội và một số tỉnh lân cận [6, 13].
Mức độ ô nhiễm asen tại một số tỉnh như Hà Nam, Hà Tây, phía nam Hà Nội
được coi là nghiêm trọng ngang với các quốc gia bị ô nhiễm nặng nhất. Đó là
các kết quả ban đầu dựa trên việc phân tích hàm lượng asen của khoảng 14
nghìn trên tổng số 620 nghìn giếng, chiếm tỷ lệ 2,2%. Như vậy, số giếng đã
được điều tra vẫn rất ít so với số giếng còn lại cần được biết có ô nhiễm asen
hay không. Đây là bài toán cần giải quyết sớm không những chỉ ở Việt Nam
mà còn ở cả các nước khác đang chịu ô nhiễm asen [22]. Các thiết bị có khả
năng phân tích chính xác hàm lượng asen lại tập trung hầu hết ở các phòng
thí nghiệm hiện đại, các viện nghiên cứu, các trường đại học. Các phương
pháp phân tích asen hiện trường theo nguyên tắc hoá học hiện đang được sử
dụng khá phổ biến nhưng độ tin cậy lại chưa cao. Chính vì vậy, việc nghiên
cứu, chế tạo các công cụ phân tích asen nhanh, hiệu quả, chính xác theo

nguyên tắc sinh học là hướng đi mới của các nhà khoa học trên thế giới.
Để phát triển phép đo asen nhanh, một số biosensor dựa trên vi khuẩn
chỉ thị asen đã được thiết kế trong phòng thí nghiệm nhờ việc lắp ghép gen
cảm ứng đặc hiệu asen với gen chỉ thị tạo ra tín hiệu đo được [15, 74, 82, 85].
Tuy nhiên độ tin cậy, khả năng ứng dụng thực tiễn để phân tích asen trong
nước giếng khoan vẫn chưa được thử nghiệm, nhất là khi khả năng sử dụng
sinh học asen (bioavailability) đối với vi khuẩn chỉ thị bị giảm đi bởi các
thành phần hoá học khác trong nước.
Để đánh giá mức độ thâm nhiễm asen ở người, các biomarker như hàm
lượng asen trong tóc, hàm lượng các dạng asen hữu cơ bài tiết trong nước
tiểu được sử dụng khá phổ biến. Vấn đề ô nhiễm asen trong nước ngầm đã


12

được phát hiện tại Việt Nam nhưng số lượng công trình công bố về sự thâm
nhiễm asen trong quần thể có phơi nhiễm asen do dùng nước giếng khoan
vẫn còn rất hạn chế.
Để góp phần vào việc triển khai ứng dụng công cụ phân tích asen bằng
biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị asen biến đổi gen, đánh giá mức độ thâm
nhiễm asen ở người và đề xuất giải pháp giảm thiểu nhiễm độc asen, luận án
đã được thực hiện với chủ đề: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CÁC CHỈ THỊ HÓA
SINH ĐỂ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ Ô NHIỄM ASEN TRONG NƢỚC GIẾNG
KHOAN VÀ MỐI TƢƠNG QUAN VỚI THÂM NHIỄM ASEN TRÊN NGƢỜI”,
gồm hai mục tiêu sau:

1. Chọn lựa và tối ƣu phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng asen trong
nƣớc giếng khoan bằng biosensor sử dụng vi khuẩn chỉ thị
2. Đánh giá mối tƣơng quan giữa ô nhiễm asen trong nƣớc giếng
khoan với mức độ thâm nhiễm asen trên ngƣời

Kết quả thu được của luận án góp phần vào việc ứng dụng thành quả của
công nghệ sinh học vào nhiệm vụ bảo vệ môi trường thông qua việc nghiên
cứu xây dựng quy trình phân tích asen trong nước bằng vi khuẩn chỉ thị biến
đổi gen. Luận án cũng đưa ra các bằng chứng về ô nhiễm asen trong nước
sinh hoạt lấy từ giếng khoan, mức độ thâm nhiễm asen trên người do sử dụng
các nguồn nước này. Với các kết quả đó, bản luận án đóng góp một phần nhỏ
bé vào việc thực hiện các nhiệm vụ của chương trình Quốc gia về Asen trong
nước ngầm.







13


Chƣơng 1. TỔNG QUAN

1.1. Vấn đề ô nhiễm asen trong nƣớc ngầm và nhu cầu phát triển công cụ phân
tích nhanh
1.1.1. Nguyên tố asen trong tự nhiên và đời sống
Asen là nguyên tố hoá học thuộc nhóm V của bảng tuần hoàn Mendeleep,
cùng nhóm với các nguyên tố N, P, Sb và Bi. Asen có thể tồn tại trong các hợp chất
vô cơ và hữu cơ với bốn mức hoá trị là -3, 0, +3 và +5. Nguyên tố asen không tan
trong nước, các muối của asen có độ tan khác nhau phụ thuộc vào pH, lực ion và thế
ôxy hoá khử của môi trường. Ví dụ trong môi trường trường mang tính khử và pH
thấp As(III) sẽ chiếm ưu thế, ngược lại trong môi trường mang tính ôxy hoá và pH

cao As(V) sẽ là dạng bền hơn [78, 97].
Asen có mặt trong hơn 200 loại khoáng khác nhau với nồng độ trung bình
khoảng 2mg/kg. Phổ biến nhất là các asenopyrit như orpiment As
2
S
3
, realgar AsS,
mispikel FeAsS, loellingite FeAs
2
, nicolite NiAs, cobalite CoAsS, tennantite
Cu
12
As
4
S
13
, v.v… Từ các quặng này, quá trình phun trào núi lửa đã chuyển asen từ
đất vào không khí. Việc khai thác mỏ cũng rửa trôi các muối asen trong quặng và
gây ô nhiễm asen trong nước mặt tại các khu vực xung quanh mỏ. Trong tầng nước
ngầm, quá trình hoà tan asen xảy ra theo cơ chế khử, tạm thời được giải thích như
sau: các phản ứng sinh học, hoá học diễn ra trong lòng đất đã tiêu hao ôxy và tạo
nên môi trường mang tính khử. Sắt (III) - dạng kết tủa trong quặng sẽ chuyển thành
sắt (II) - dạng dễ tan trong nước. Quá trình này đồng thời làm cho asen rời khỏi
quặng sắt và tan trong nước ngầm. Một số khu vực đồng bằng thấp trũng, thường
xảy ra lụt lội là nơi nước ngầm thiếu ôxy và có thế khử thấp (Eh < 100mV), ví dụ
như Bănglađet, đồng bằng sông Gange, Ấn Độ, đồng bằng sông Hồng, Việt Nam.
Và cũng chính tại đây, ô nhiễm asen trong nước ngầm đã được phát hiện trong thập
kỷ vừa qua [13, 60, 78].
Trong công nghiệp, asen được tạo ra nhờ quá trình khử ôxyt asen (As
2

O
3
)

với
than, ôxyt asen là sản phẩm phụ của quá trình luyện kim và thường có trong bụi


14

khói của quá trình nung quặng, nhất là luyện đồng. Khoảng 70% sản lượng asen tạo
ra trên thế giới được dùng trong ngành xử lý gỗ, đó là các hợp chất asenat crom
đồng (CCA), 22% dùng trong nông nghiệp, còn lại trong công nghiệp thuỷ tinh và
dược phẩm. Từ vài trăm năm trước đây asen đã được dùng phổ biến trong ngành
thuộc da, là thành phần quan trọng của nhiều chất tạo màu, thuốc trừ côn trùng như
các muối asenate của chì, natri, canxi, kẽm. Thuốc trừ cỏ cho công nghiệp trồng
bông là mononatri methylasonate, axit dimethylasinic. Trong dược phẩm, dung dịch
1% kaliasenate (thuốc Fowler) đã được dùng để chữa bệnh bạch cầu, bệnh vảy nến,
thấp khớp, hen, giang mai, v.v…. Tuy nhiên các sản phẩm trên đã bị hạn chế sử
dụng từ những năm 1974 trên toàn thế giới, khi các hoá chất nông nghiệp chứa clo
ra đời và trong y học người ta đã thay thế bằng nhiều thuốc kháng sinh mới. Với
độc tính rất cao nên asen đã được dùng khá phổ biến làm thuốc độc giết người từ
thời Trung cổ cho tới giữa thế kỷ 19 mới bị hạn chế do con người lúc đó đã có cách
để phát hiện asen. Hiện nay, các hợp chất asen vẫn được dùng trong các ngành công
nghiệp gỗ (chất bảo quản gỗ), công nghiệp thuỷ tinh (tạo độ trong suốt của thuỷ
tinh), chế tạo vật liệu bán dẫn (galiasenit), nông nghiệp (chất làm rụng lá) [41, 97].
Do sự tồn tại vốn có trong môi trường tự nhiên nên asen có mặt ở tất cả các
bộ phận của sinh quyển, tuy nhiên với các dạng hoá học và nồng độ khác nhau.
Trong mẫu nước, mẫu đất asen thường ở trạng thái vô cơ, ví dụ các muối asenite,
asenate. Ngược lại trong mẫu thực vật, động vật thì asen ở trạng thái hữu cơ, ví dụ

asenocholine, asenobetain.
Nồng độ asen trung bình trong không khí tại các vùng nông thôn, xa khu
công nghiệp nằm trong khoảng 0,02- 4 ng/m
3
, tại đô thị khoảng 3-200 ng/m
3
, còn ở
các khu công nghiệp và vùng lân cận có thể lên tới 1000 ng/m
3
, đặc biệt ở các khu
công nghiệp luyện kim màu [97].
Trong phần trên của nước biển, asen có mặt với nồng độ khoảng 1-2 µg/l.
Hàm lượng asen cũng thấp khoảng 10 µg/l ở vùng nước bề mặt như sông, hồ. Tuy
nhiên, khi ở gần nguồn phát thải ô nhiễm như các vùng mỏ, nhà máy luyện kim thì
lượng asen trong nước bề mặt có thể cao tới 5 mg/l. Thông thường, asen có mặt
trong nước ngầm với nồng độ khoảng 1-2 µg/l, trừ các khu vực có núi lửa, có quặng


15

sulfit thì có thể lên tới 3 mg/l. Nước ngầm tại các vùng đồng bằng trầm tích trẻ có
thể chứa asen tới vài trăm µg/l.
Trong đất, asen thường có mặt với hàm lượng khoảng 1 - 40 mg/kg, trong
bùn lắng khoảng 5 - 3000 mg/kg, các mẫu bùn đất càng ở gần vùng ô nhiễm thì hàm
lượng asen càng cao [78].
Các sinh vật biển thường chứa asen trong khoảng 1-100 mg/kg và chủ yếu là
asen hữu cơ như asenobetain, asenosugar, trimethylasin, v.v Lượng asen trong cá
nước ngọt thường nhỏ hơn cá biển và ở khoảng 1 mg/kg. Các động vật giáp xác như
tôm, cua, sò cũng chứa asen hữu cơ [97].
Trong cuộc sống, con người tiếp xúc với asen qua không khí, nước uống và

thức ăn. Lượng asen đi vào cơ thể hàng ngày cỡ 20-300 µg với khoảng 25% là asen
vô cơ, phần còn lại là asen hữu cơ. Các dạng asen hữu cơ trong thức ăn như
asenobetain, asenocholin tương đối không độc, ngược lại các dạng asen vô cơ lại rất
độc, với liều gây chết ở người là 100 – 200 mg ôxyt asen [41, 97].

1.1.2. Vấn đề ô nhiễm asen trong nƣớc giếng khoan trên thế giới và ở Việt Nam

Ô nhiễm asen trong nước giếng khoan trên thế giới
Asen vốn là thành phần tự nhiên của lớp trầm tích vỏ trái đất nên nó thường
có mặt trong các tầng nước ngầm và nước mặt tuy chỉ ở hàm lượng thấp khoảng vài
µg/l. Tuy nhiên, ở một số khu vực trên thế giới, nước ngầm có hàm lượng asen rất
cao do lớp trầm tích có cấu trúc, thành phần hoá học thuận lợi cho việc hoà tan asen
từ đất. Hiện tượng này được phát hiện tại các khu vực đồng bằng châu thổ thấp
trũng, xảy ra lụt lội hàng năm, dòng chảy thuỷ văn chậm. Các lớp bồi tích trẻ thiếu
ôxy (mang tính khử) rất thuận lợi cho việc giải phóng asen từ đất ra nước [7, 13, 60,
78].
Sự có mặt của asen trong nước được coi là ô nhiễm khi nó vượt quá giới hạn
an toàn cho sức khoẻ của con người. Dựa trên những số liệu về nguy cơ ảnh hưởng
tới sức khoẻ của asen, năm 1993 Tổ chức Y tế Thế giới đã đề nghị hạ mức tiêu
chuẩn của asen trong nước uống là 10 µg/l thay cho tiêu chuẩn trước đó là 50 µg/l


16

[43]. Tuy nhiên tuỳ theo điều kiện cụ thể về cơ sở hạ tầng và năng lực cải tạo công
nghệ xử lý nước, các quốc gia đã áp dụng tiêu chuẩn này một cách khác nhau. Ví dụ
Bănglađet, Trung Quốc, Ấn Độ, Mỹ hiện đang áp dụng tiêu chuẩn 50 µg/l, Nhật
Bản, Liên minh châu Âu, Việt Nam áp dụng tiêu chuẩn 10 µg/l [6].
Nguồn nước ngầm có chứa asen trên 50 µg/l được phát hiện ở nhiều nơi trên
thế giới như Achentina, Mêhicô, Chilê, Hunggary, Rumani, Mỹ, Đài Loan, Trung

Quốc, Ấn Độ, Bănglađet, Nêpan, Myanma, Việt Nam, v.vv… Số lượng các địa
điểm được coi là có nguồn nước ngầm ô mhiễm asen hiện vẫn gia tăng, nhất là khi
chỉ số asen trong nước ngầm trở thành tiêu chuẩn xét nghiệm của các cơ sở cung
cấp nước sạch. Bảng 1.1 trình bày số liệu về tình hình ô nhiễm asen tại các nước
Đông Á, một trong những khu vực đông dân và kém phát triển nhất thế giới [59,
77].

Bảng 1.1 Ví dụ hiện trạng ô nhiễm asen trong nước ngầm tại một số quốc gia
trên thế giới [59, 77]

Tên nƣớc
Số dân chịu ảnh
hƣởng (triệu)
Khoảng nồng độ asen
trong nƣớc ngầm (µg/l)
Năm phát
hiện
Achentina
2
100 - 1000
1981
Bănglađet
50
<1 – 4700
1980
Ấn Độ
1
<1 – 3900
1980
Trung Quốc

0,6
1 - 2400
1990
Đài Loan
0,2
10 - 1820
1950
Việt Nam
Hàng triệu
1 - 3050
2001

Trong số các quốc gia có báo cáo ô nhiễm asen ở nước ngầm thì Bănglađet
và Ấn Độ là nghiêm trọng hơn cả. Theo kết quả nghiên cứu của Chowdhury và
cộng sự năm 2000, 9 tỉnh thuộc vùng Tây Bengan, Ấn Độ và 42 tỉnh của Bănglađet
có nước ngầm chứa asen trên 50 µg/l, cụ thể 59% trong số gần 11 nghìn giếng kiểm
tra tại Bănglađet, 34% trong số 58 nghìn giếng tại Ấn Độ chứa asen trên 50 µg/l.


17

Kết quả điều tra cho thấy 24,47% trong số 11 nghìn người tại Bănglađet và 15%
trong số 29 nghìn người tại Ấn Độ được khám bệnh đã có các biểu hiện tổn thương
da. Đó là kết quả sau 10 năm tiến hành điều tra tại Ấn Độ và 5 năm tại Bănglađet
với rất nhiều nỗ lực của quốc gia kết hợp sự hỗ trợ quốc tế, tuy vậy các tác giả vẫn
coi đó mới chỉ là một viên đá trong khối băng chìm [22]. Diện tích bị ô nhiễm asen
với những hậu quả nặng nề cho sức khoẻ cộng đồng vẫn cứ ngày một rộng hơn như
trong cảnh báo của tác giả Chakraborti khi các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu
sang các khu vực khác thuộc Ấn Độ [18].
Báo cáo tổng kết tình hình bệnh tật do nhiễm độc asen tại Trung Quốc năm

2004 cho thấy, tám tỉnh thuộc Trung Quốc lục địa với hơn 2 triệu người đã thâm
nhiễm asen từ nước giếng khoan, hàm lượng asen nằm trong khoảng 50 – 2000 µg/l.
Trong số đó 10 nghìn người được chẩn đoán là mắc các bệnh liên quan tới asen
[98].
Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy vấn đề ô nhiễm asen trong nước
giếng khoan và nguy cơ tác hại tới sức khoẻ người dân là rất lớn kể cả diện tích và
số người chịu ảnh hưởng. Hơn thế nữa, đối tượng dùng nước giếng khoan thường là
nông dân ở vùng nông thôn , cơ sở hạ tầng kém phát triển, nhận thức về an toàn vệ
sinh nước ăn uống chưa cao. Chính vì vậy, nhiệm vụ đánh giá hiện trạng ô nhiễm và
đề xuất các giải pháp giảm thiểu asen là những vấn đề cần được giải quyết triệt để
càng sớm càng tốt [6].

Ô nhiễm asen trong nước giếng khoan tại Việt Nam
Trong những thập kỷ cuối của thế kỷ 20, UNICEF đã hỗ trợ chính phủ các
nước nghèo giúp người dân tiếp cận với các nguồn nước sạch hơn để giảm tỉ lệ ốm
đau do sử dụng nguồn nước kém vệ sinh. Một trong những nguồn nước được coi là
sạch hơn này là giếng khoan bơm tay. Cũng nhờ vào các hoạt động nhân đạo này,
vào những năm 1990 người dân nông thôn Việt Nam tại một số vùng đã được lắp
đặt các giếng khoan để lấy nước sạch dùng cho sinh hoạt hàng ngày. Tổng số giếng
do UNICEF hỗ trợ tại Việt Nam là khoảng 150.000 chiếc, tuy nhiên số lượng giếng
khoan bơm tay và bơm điện hiện có đã lớn hơn rất nhiều. Con số tạm ước tính có


18

khoảng 20,48% dân số Việt Nam (16,5 triệu người) đang dùng nước giếng khoan
[6].
Theo quy định của Nhà nước Việt Nam ban hành năm 1995 về môi trường,
giới hạn cho phép của asen trong nước ngầm và nước mặt dùng cho mục đích sinh
hoạt là 0,05 mg/l (50µg/l). Năm 2002, Bộ Y tế Việt Nam đã ban hành tiêu chuẩn vệ

sinh nước ăn uống, trong đó giới hạn tối đa cho hàm lượng asen là 0,01 mg/l (10
µg/l). Tiêu chuẩn này áp dụng cho nước dùng để ăn uống, nước dùng cho các cơ sở
sản xuất, chế biến thực phẩm, nước cấp theo hệ thống đường ống từ các nhà máy
nước ở khu vực đô thị, nước cấp theo hệ thống đường ống từ các trạm cấp nước tập
trung cho 500 người trở lên. Bộ Y tế khuyến khích các trạm cấp nước tập trung quy
mô cho dưới 500 người và các nguồn cấp nước sinh hoạt đơn lẻ áp dụng tiêu chuẩn
này [1, 2].
Nghiên cứu về ô nhiễm asen trong nước tại Việt Nam đã được một số nhà
khoa học tiến hành từ những năm 90 trước khi thảm hoạ asen được phát hiện tại
Bănglađet. Tuy nhiên các nghiên cứu này tập trung điều tra ở các vùng núi có hoạt
động địa nhiệt, nguồn nước mặt với phạm vi nghiên cứu nhỏ, chưa hệ thống [4]. Chỉ
từ những năm 1999 trở lại đây các nhà khoa học Việt Nam và thế giới mới tiến hành
những khảo sát ô nhiễm asen quy mô rộng hơn, mang tính hệ thống hơn [6, 13]. Sự
hỗ trợ kỹ thuật của các tổ chức quốc tế đã đóng góp đáng kể cho các hoạt động khoa
học này. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Berg và cộng sự, khi điều tra tại Hà
Nội và các khu vực lân cận với diện tích 700 km
2
, mật độ lấy mẫu 1/10 km
2
cho
thấy, hàm lượng asen trung bình từ 68 giếng khoan là 159 µg/l, trong đó 48% có
nồng độ asen cao hơn 50 µg/l, 20% cao hơn 150 µg/l. Khu vực có biểu hiện ô
nhiễm asen cao hơn cả là phía nam Hà Nội. Mức độ ô nhiễm này cũng báo hiệu cho
một qui mô ô nhiễm gần như ở Bănglađet và Ấn Độ [13, 18, 22].
Theo bản tổng hợp kết quả điều tra ô nhiễm asen trên toàn lãnh thổ Việt Nam
vào tháng 10 năm 2004 của UNICEF, đồng bằng Bắc bộ và một số khu vực thuộc
đồng bằng Nam bộ là những khu vực có ô nhiễm asen rõ rệt. Bản báo cáo này cũng
cho thấy các tỉnh có mức độ ô nhiễm cao hơn như Hà Nam, Hà Tây, phía Nam Hà
Nội, Đồng Tháp và An Giang. Đặc biệt tại Hà Nam mức độ ô nhiễm đạt giá trị

19

ngang như Bănglađet với 62,1% số mẫu vượt 50 µg/l, tại Hà Tây 24,7 % số mẫu có
hàm lượng asen cao hơn 50 µg/l. Cũng theo tổng kết của tổ chức này, cho đến nay ở
Việt Nam chưa có những ca bị nhiễm asen được báo cáo chính thức. Tuy nhiên đã
có 8 người được đưa vào danh sách những bệnh nhân bị nghi mắc bệnh nhiễm asen
[6]. Như vậy vấn đề ô nhiễm asen trong nước giếng khoan dùng cho sinh hoạt tại
nông thôn Việt Nam là một thực trạng đáng lo ngại. Tuy nhiên quy mô, mức độ ô
nhiễm trên toàn quốc vẫn chưa được điều tra đầy đủ.

1.1.3. Nhu cầu phát triển công cụ phân tích nhanh, phục vụ cho nhiệm vụ đánh
giá hiện trạng ô nhiễm asen trong nƣớc giếng khoan

Như đã trình bày ở phần trên, ô nhiễm asen trong nước giếng khoan là thực
trạng đáng lo ngại ở cả Việt Nam và các nước khác trong khu vực Đông Nam Á với
quy mô tác hại rất lớn kể cả diện tích và số người chịu ảnh hưởng. Sau khi thảm hoạ
môi trường do asen gây ra tại Bănglađet và Ấn Độ được phát hiện, các tổ chức
chính phủ, phi chính phủ đã bắt tay vào cuộc nhằm tích cực giảm thiểu ảnh hưởng
của sự cố này. Một trong những mục tiêu của chính sách giảm thiểu nhiễm độc asen
là phải xác định hàm lượng asen tại tất cả các nguồn nước ngầm dùng cho sinh hoạt
càng sớm càng tốt, để có biện pháp xử lý kịp thời. Tại Việt Nam, Tiểu ban chỉ đạo
quốc gia về giảm thiểu asen đã được thành lập tháng 10 năm 2002 trực thuộc Bộ
Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tiểu ban này đã đề xuất kế hoạch hành động
gồm 5 mục tiêu trong đó có mục tiêu xây dựng hệ thống cơ sở dữ liệu và lập bản đồ
những khu vực bị ô nhiễm asen vượt trên tiêu chuẩn quốc gia. Các nhiệm vụ khảo
sát ngẫu nhiên, khảo sát đại trà, khảo sát thường xuyên có nhiệm vụ cung cấp dữ
liệu cho mục tiêu nói trên. Tuy các chương trình quốc gia về asen đã bắt đầu hoạt
động, nhưng hiện nay cơ sở dữ liệu mang tính đại diện, hệ thống về ô nhiễm asen
vẫn chưa có. Các kết quả điều tra mới chỉ tập trung vào một số xã, huyện cụ thể, nơi

được coi là có ô nhiễm cao [6]. Tuy vậy một bài toán thực tiễn đặt ra là làm thế nào
để hoàn thành nhiệm vụ khảo sát số lượng giếng quá nhiều và hầu hết nằm xa thành
phố. Ví dụ tại Bănglađet, trong chiến dịch khảo sát trọng điểm 5 năm tính đến năm


20

2002 mới chỉ phân tích được khoảng 10% trong tổng số 11 triệu giếng khoan [27,
53]. Ở Việt Nam theo số liệu chưa đầy đủ của UNICEF, tổng số giếng khoan của 7
tỉnh thuộc khu vực đồng bằng Bắc bộ là khoảng 620 nghìn (Hà Nam, Hà Tây, Hải
Dương, Hưng Yên, Nam Định, Quảng Ninh, Thái Bình). Với sự hỗ trợ của
UNICEF, trong số này khoảng 13 nghìn giếng (2,1%) đã được phân tích asen bằng
dụng cụ phân tích ngoài hiện trường kiểu hoá học. Các tổ chức khác cũng đã phân
tích được khoảng 0,1%. Như vậy số giếng còn lại cần phân tích asen là rất lớn [6].
Ngoài ra, sự phân bố của hàm lượng asen trong nước giếng khoan tại một số khu
vực lại không đồng đều với nguyên nhân chưa được tìm hiểu kỹ. Ví dụ, hai giếng
cách xa nhau khoảng 100 m có thể có hàm lượng asen khác nhau từ vài chục đến
vài trăm µg/l [13, 94]. Như vậy, cần phải phân tích mẫu nước của từng giếng với
công cụ có độ chính xác cao, khả năng phân tích nhanh và chi phí thấp.
Về mặt nguyên tắc, trong phòng thí nghiệm người ta có thể dùng một trong
các công cụ sau để phân tích asen tổng số hoặc các dạng hợp chất của asen
 Quang phổ hấp thụ nguyên tử (Atomic Absorption Spectrometry - AAS),
 Quang phổ huỳnh quang nguyên tử (Atomic Fluorescent Spectrometry -
AFS),
 Khối phổ cảm ứng liên kết plasma (Induced Couple Plasma – Mass
Spectrometry ICP-MS)
 Điện hoá (Voltametry)
 Quang phổ Tử ngoại-Khả kiến (UV-Vis)
 Sắc ký trao đổi ion ghép nối với khối phổ cảm ứng liên kết plasma (Ion
Chromatography - Induced Couple Plasma – Mass Spectrometry, IC-ICP-

MS)
Trong điều kiện phòng thí nghiệm chuẩn, các phương pháp trên đều đạt được
giới hạn phát hiện asen nhỏ hơn 10 µg/l [8] và đáp ứng nhiệm vụ phân tích asen
trong nước. Tuy nhiên các thiết bị này thường chỉ có ở những phòng thí nghiệm
hiện đại, các trung tâm nghiên cứu lớn. Để đáp ứng nhiệm vụ phân tích, công sức và
chi phí cho việc vận chuyển mẫu từ các tỉnh xa về thành phố là khá lớn.


21

Chính vì vậy, khi phân tích nhiều mẫu tại địa phương với các cán bộ ít kinh
nghiệm thì giải pháp sử dụng công cụ đo hiện trường đơn giản là hợp lý hơn. Hiện
nay các bộ dụng cụ xác định asen hiện trường kiểu hoá học được sử dụng rộng rãi
tại các quốc gia có ô nhiễm asen nặng như Bănglađet, Ấn Độ, Việt Nam, v.v…
Nguyên tắc hoạt động của chúng dựa trên phản ứng giữa khí asin (AsH
3
) và bromit
thuỷ ngân, tạo ra màu vàng. Độ đậm nhạt của màu sắc tỉ lệ với nồng độ asen trong
mẫu, người phân tích so sánh màu tạo ra với bảng màu đối chứng cho sẵn mà kết
luận hàm lượng asen nằm trong khoảng nào. Tuy giới hạn phát hiện được ghi là
khoảng 10 - 50 µg/l nhưng độ tin cậy của phương pháp này vẫn là câu hỏi đáng
quan tâm [48, 65]. Theo báo cáo của Rahman và các cộng sự vào năm 2002, khoảng
1,3 triệu giếng tại Bănglađet đã được kiểm tra với chi phí khoảng 2 đôla cho một
phép phân tích kể cả xử lý số liệu (so với giá 9 đôla cho một phép phân tích bằng
thiết bị hiện đại). Khi so sánh kết quả phân tích chéo 290 mẫu bằng phương pháp
phân tích hiện trường và trong phòng thí nghiệm cho thấy, với vùng nồng độ từ 10 –
100 µg/l, tỷ lệ sai lệch âm là 68%, sai lệch dương là 35%. Kết quả phân tích lại
2966 giếng bằng quang phổ hấp thụ nguyên tử cũng cho thấy trong số 1920 giếng
đã đánh dấu là an toàn (< 50 µg/l asen) thì có tới 862 giếng là không an toàn (> 50
µg/l asen), chiếm 44,9% [65]. Tại Việt Nam, theo báo cáo của Viện Công nghệ Môi

trường, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam thì trong số 511 mẫu được đối
chiếu kết quả thu được bằng phân tích nhanh ngoài hiện trường và bằng quang phổ
hấp thụ nguyên tử cho thấy 333 mẫu có kết quả là chấp nhận được (sai số < 50%),
như vậy còn lại 178 mẫu là chưa chấp nhận được (sai số > 50%) chiếm tỉ lệ 34,8%.
Ngoài ra độ chính xác của số liệu thu được từ các mẫu có nồng độ nằm trong
khoảng 11 – 200 µg/l chỉ đạt 65 –70% [19].
Nhược điểm chủ yếu của các bộ phân tích asen hiện trường đang được lưu
hành nằm ở chính phần đánh giá độ đậm nhạt của màu sắc dung dịch phản ứng. Khi
nồng độ asen rất thấp (nhỏ hơn giới hạn phát hiện 10 µg/l) hoặc rất cao (>200 µg/l)
thì sự tương phản của màu sắc dễ nhận diện, nó là không có màu hoặc màu rất đậm.
Còn ở vùng nồng độ thấp (10 –100 µg/l) thì khó khăn hơn. Khả năng và kinh


22

nghiệm so sánh độ đậm nhạt màu sắc của người quan sát ảnh hưởng tới độ chính
xác của phép phân tích [19, 48, 65].
Với nhu cầu và thực trạng về công cụ phân tích asen nhanh tại các vùng xa
thành phố, các nhà khoa học trên thế giới đã phát triển, hoàn thiện thêm các phương
pháp phân tích asen hiệu quả và ít chi phí trong đó có biosensor sử dụng vi khuẩn
chỉ thị [15, 30, 74, 82, 85].

23

1.2. Biosensor sử dụng vi khuẩn chuyển gen để phân tích asen trong nƣớc
1.2.1. Biosensor sử dụng các tế bào vi khuẩn
Để đánh giá mức độ ô nhiễm môi trường của một hoá chất độc hại nào đó
người ta có thể sử dụng hoặc các công cụ hoá học hoặc các công cụ cảm biến sinh
học (biosensor). Một biosensor thường bao gồm phần tạo tín hiệu mang bản chất
hoá sinh và phần chuyển đổi tín hiệu đó sang dạng đo lường được. Phần tạo tín hiệu
dựa trên đáp ứng của bộ phận cảm ứng như enzym, kháng thể, chất nhận quang tử,
axit nucleic hoặc các tế bào vi khuẩn với chất cần nghiên cứu. Biosensor đầu tiên
được nghiên cứu bởi Clark năm 1962, chứa glucoseoxidase xúc tác cho quá trình
ôxy hoá glucose thành gluconolacton và hydroperoxyt. Hydroperoxyt chuyển hoá
thành ôxy phân tử và nước, lượng ôxy tạo thành được phát hiện nhờ điện cực platin.

Như vậy lượng glucose sẽ được xác định dựa trên lượng ôxy tạo thành [56]. Các
biosensor có thể được dùng để quan trắc một loại hoặc một nhóm chất nào đó đã
được định danh trước. Biosensor có thể xác định sự thay đổi nồng độ của một chất
hiện có hoặc của một sản phẩm mới sinh ra trong môi trường. Trong khi các
phương pháp phân tích hoá học thường chỉ cho biết hàm lượng của chất ô nhiễm
trong mẫu, phương pháp biosensor còn có thể cung cấp thêm những thông tin về
mức độ sử dụng sinh học và tác hại của chất ô nhiễm đối với đối tượng đáp ứng [11,
32].
Biosensor có thể là một hệ thống tế bào nguyên vẹn (whole cell biosensor),
một dịch chiết chứa enzym hoặc kháng thể của tế bào. Biosensor chứa enzym hoặc
kháng thể đã tinh chế thường có tính chọn lọc cao và khả năng phát hiện tốt. Nhưng
nó cũng có những nhược điểm là quá trình tinh sạch khá tốn kém, enzym tách ra
thường kém bền, cần bảo quản nghiêm ngặt. Chính vì vậy để phục vụ phân tích
ngoài hiện trường người ta thường dùng các tế bào nguyên vẹn thay cho enzym đã
tinh sạch. Các biosensor sử dụng tế bào vi khuẩn có một số ưu điểm sau: vi khuẩn
có mặt phổ biến trên trái đất, phổ trao đổi chất rộng, phát triển nhanh, dễ bảo quản,
chịu được nhiều điều kiện sống bất lợi, vi khuẩn là các đối tượng có thể được biến
đổi gen nhờ kỹ thuật di truyền tạo nên các cấu trúc có đáp ứng đặc hiệu với đối
tượng cần phân tích. Tuy nhiên chúng cũng có những nhược điểm cố hữu, ví dụ sự


24

vận chuyển các chất phân tích qua màng tế bào đến thụ cảm bên trong tế bào
thường chậm, tính đặc hiệu có thể thấp hơn so với biosensor sử dụng enzym do các
phản ứng phụ xảy ra bởi các enzym khác có mặt trong tế bào, tính ổn định và độ lặp
lại có thể chịu tác động của điều kiện bên ngoài [11, 28, 30].
Trong thực tế đã có khá nhiều nghiên cứu nhằm chọn lọc và ứng dụng các
biosensor vi khuẩn để đánh giá sự ô nhiễm môi trường, ví dụ chủng vi khuẩn
Pseudomonas fluorescence NCIMB 11764 với tính năng phân giải đặc hiệu hợp

chất cyanit, chủng Moraxella sp. có khả năng phân giải chọn lọc hợp chất p-
nitrophenol đã được dùng làm biosensor để phân tích các hợp chất cyanit và p-
nitrophenol. Các loại biosensor này có cấu trúc gồm các tế bào vi khuẩn định vị trên
màng của điện cực ôxy, sự có mặt của các chất nói trên sẽ được ghi nhận lại nhờ
lượng ôxy tiêu hao cho quá trình phân giải chúng [50, 57]. Để đánh giá mức ô
nhiễm một số kim loại nặng trong đất, nước như asen, đồng, chì, cadmi, người ta có
thể sử dụng chủng vi khuẩn biển có khả năng phát quang sinh học là Vibrio fischeri
(MicroTox®). Độ phát quang của vi khuẩn sẽ giảm tỉ lệ với hàm lượng các kim loại
độc hại. Tuy nhiên dạng biosensor này thường kém ổn định và không có khả năng
nhận dạng đặc hiệu chất gây độc [30].
Sự phát triển của các kỹ thuật chuyển gen đã cho phép tạo ra các chủng vi
khuẩn có khả năng phát hiện chất ô nhiễm môi trường một cách chọn lọc nhờ gắn
kết các gen đáp ứng đặc hiệu với chất ô nhiễm và gen chỉ thị có độ nhạy cao. Ví dụ
tác giả Ikeno và cộng sự đã đưa plasmit pTS301-GFP chứa các gen liên quan tới sự
phân giải benzen và gen chỉ thị gfp vào vi khuẩn E. coli để tạo ra biosensor có đáp
ứng đặc hiệu với các hợp chất nhóm benzen, vi khuẩn chỉ thị biến đổi gen này có
thể phát hiện dẫn xuất xylen ở nồng độ 0,1 mM [45]. Để phát hiện và định lượng
chất kháng sinh tetracycline, các nhà khoa học Đan Mạch đã gắn gen khởi động
cảm ứng tetracycline P
tet
với các gen chỉ chị lacZYA, luxCDABE hoặc gfp và đưa
vào vi khuẩn E. coli. Chủng vi khuẩn biến đổi gen này đã được ứng dụng để xác
định dư lượng tetracycline trong sữa [38]. Xu hướng tạo ra các chủng vi khuẩn biến
đổi gen đã và đang được phát triển nhằm tạo ra các biosensor phát hiện kim loại
nặng nói chung [30, 85] và asen nói riêng [15, 82].


25

1.2.2. Biosensor vi khuẩn đáp ứng đặc hiệu với asen và có gắn các gen chỉ thị

khác nhau
1.2.2.1. Gen kháng asen ở vi khuẩn E. coli (arsenic resistance gene)
Asen là một nguyên tố hoá học có mặt phổ biến trong tự nhiên cũng như
trong các hoạt động của con người. Trong nước, asen tồn tại chủ yếu ở cả dạng
asenat AsO
4
3-
(hoá trị V) và asenit AsO
2
-
(hoá trị III). Do cấu trúc hoá học của hợp
chất asenat tương tự như photphat nên nó có thể cạnh tranh vai trò của photphat và
làm rối loạn quá trình trao đổi chất. Sự nhiễm độc asen ở vi khuẩn có thể coi tương
tự như thiếu hụt photphat cho hoạt động sống. Asenit có độc tính cao hơn asenat,
trong tế bào asenit có khả năng gắn kết mạnh với các nhóm sulfhydril của protein và
làm bất hoạt enzym. Trải qua quá trình tiến hoá, sinh vật trên trái đất đã tích luỹ khả
năng chống lại tính độc của các hợp chất chứa asen. Khả năng loại bỏ các dạng asen
độc hại ra khỏi cơ thể còn được gọi là tính kháng asen. Tính kháng asen ở vi sinh
vật nhân sơ, nhân chuẩn tương đối giống nhau và gồm các giai đoạn sau [46, 68, 69,
76]:
(i) Asenat(V) thâm nhập vào tế bào nhờ các tác nhân vốn làm nhiệm vụ vận
chuyển photphat. Asenit(III) thâm nhập vào tế bào nhờ các tác nhân thuộc
nhóm aquaglyceroporin vận chuyển.
(ii) Trong tế bào, asenat(V) được khử về asenit(III) nhờ các reductase. Đã
xác định được tác nhân khử là glutaredoxin ở E. coli và thioredoxin ở
Staphylococcus aureus.
(iii) Asenit (III) được đưa ra khỏi tế bào nhờ các protein vận chuyển màng
theo nguyên tắc thẩm thấu hoặc tiêu hao năng lượng ATP.
Các gen mã cho tính trạng kháng asen được tìm thấy ở cả plasmit và nhiễm
sắc thể của tế bào vi khuẩn, tuy nhiên cấu trúc của các gen nằm trên plasmit được

nghiên cứu kỹ hơn cả. Ví dụ plasmit R773 ở E. coli [46], plasmit pI258 ở
Staphylococcus aureus [25], plasmit AIU 301 ở Acidiphilium multivorum [83].
Ở E. coli, operon ars mã cho các tính trạng khử asenat và vận chuyển asenit
nằm ở đoạn plasmit R773 có kích thước 91kb. Operon này hoạt động khi cảm ứng


26

với các nguyên tố hoá học như asen, bitmut, antimony và không làm ảnh hưởng tới
sự thu nhận photphat. Operon ars chứa 5 gen là arsR, arsA, arsB, arsC và arsD.
Gen arsR mã cho protein ArsR điều khiển hoạt động của cả operon ars theo cơ chế
ức chế. Khi không có asen, ArsR liên kết với vùng điều khiển của operon ars và
kìm hãm hoạt động của operon này. Các kim loại như asen, antimony khi thâm nhập
tế bào sẽ gắn với protein ArsR và tách chúng khỏi mối liên kết với vùng điều khiển,
operon ars thoát khỏi trạng thái bị kìm hãm và chuyển sang trạng thái hoạt động để
chống lại sự có mặt của các kim loại độc kể trên. Gen arsA mã cho ATPase, nó có
nhiệm vụ điều khiển bơm protein thông qua sự thuỷ phân ATP và cung cấp năng
lượng. Gen arsB mã cho protein vận chuyển màng ArsB, tạo nên các kênh vận
chuyển As và Sb ra khỏi tế bào. Hai gen này làm thành phức hệ vận chuyển asen
theo kiểu tiêu hao năng lượng hoặc thẩm thấu hoá học. Gen arsC mã cho asenat
reductase, xúc tác quá trình khử asenat thành asenit. Gen arsD mã cho protein điều
khiển sự hoạt động quá mức của cả operon ars. Với chủng vi khuẩn Staphylococcus
aureus, trên plasmit pI258 cũng tồn tại các gen arsR, arsB và arsC có cấu trúc và
chức năng tương tự như các gen cùng tên ở E. coli. [46, 76]. Theo nghiên cứu của
tác giả Carlin, trên nhiễm sắc thể của E. coli cũng có operon ars nhưng khả năng
kháng asen của các gen này yếu hơn so với các gen ars nằm trên plasmit [16].

1.2.2.2. Các gen chỉ thị thƣờng đƣợc sử dụng trong biosensor vi khuẩn
Gen chỉ thị là gen mã cho các protein chỉ thị. Tự thân các protein này, hoặc
khi đóng vai trò là enzym xúc tác, tạo ra những sản phẩm có thể nhận dạng dễ dàng,

đo lường được. Các gen chỉ thị được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu biểu hiện
gen và chuyển gen, cơ chế gây tín hiệu ngoại bào, ví dụ trong phát triển dược phẩm
mới, chế tạo các loại biosensor phát hiện chất ô nhiễm môi trường. Các gen chỉ thị
và gen cấu trúc thường được điều khiển bởi cùng gen khởi động. Khi cảm ứng với
tác nhân cần phân tích gen khởi động sẽ kích hoạt, điều khiển gen cấu trúc và gen
chỉ thị để tạo ra protein chỉ thị. Một trong những tính chất quan trọng của gen chỉ thị
là phải tạo ra các sản phẩm khác biệt rõ ràng với tín hiệu nền. Sự biểu hiện của gen
chỉ thị cần phải thực hiện bằng các thí nghiệm đơn giản, mang tính định lượng. Có


27

thể kể tên một số các protein chỉ thị được ứng dụng nhiều là cloramphenicol
acetyltransferase, -galactosidase, luciferase của vi khuẩn, luciferase của đom đóm,
aequorin, protein huỳnh quang xanh lá cây, uroporphyrinogen III methyltransferase.
Mỗi loại protein chỉ thị nói trên đều có những ưu và nhược điểm khác nhau tuỳ theo
điều kiện thí nghiệm và phương pháp phát hiện. Việc lựa chọn gen chỉ thị phụ thuộc
vào hoạt tính nền của tế bào, biểu hiện của gen và hiệu quả của việc chuyển gen,
khả năng ứng dụng của phương pháp phân tích, v.v… [30, 81].
Để chế tạo các biosensor ứng dụng trong phân tích môi trường thì các tính
năng như độ nhạy, khoảng đáp ứng tuyến tính, khả năng ứng dụng rộng rãi với
nhiều loại mẫu là những tiêu chuẩn quan trọng khi chọn lựa gen chỉ thị [56]. Thực
tiễn cho thấy -galactosidase, luciferase vi khuẩn, và protein huỳnh quang xanh lá
cây là những protein chỉ thị đã được ứng dụng nhiều hơn cả. Tuy nhiên tuỳ thuộc
vào yêu cầu phân tích định tính hay định lượng mà mức độ áp dụng của các gen chỉ
thị này cũng khác nhau [68, 82].
Gen lacZ ở vi khuẩn E. coli mã cho protein -galactosidase, enzym này xúc
tác cho quá trình thuỷ phân các dạng đường -galactosides tạo ra các sản phẩm có
thể đo lường được. Trong thực tiễn người ta có thể sử dụng nhiều loại cơ chất và kỹ
thuật phân tích khác nhau để đánh giá hoạt tính của -galactosidase [30, 58], ví dụ

 Cơ chất o-nitrophenyl -galactopyranoside (ONPG) dùng với máy so
màu, cách này khá đơn giản, nhanh chóng nhưng độ nhạy kém và
khoảng động học hẹp
 Cơ chất 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -galactoside (X-gal) dùng với
kỹ thuật hoá màu, có thể nhận dạng bằng mắt thường. Cách này về
nguyên tắc cũng giống như cách so màu nhưng thời gian thí nghiệm
dài hơn.
 Cơ chất 4-methylumbellieryl--galactopyranoside (MUG) dùng với
máy đo huỳnh quang, cách này có ưu điểm là độ nhạy rất tốt nhưng
cần dùng máy quang phổ huỳnh quang.


28

 Cơ chất p-aminophenyl--galactopyranoside (PAPG) dùng với máy
đo điện hoá, cách này cũng có khả năng đo nhanh, nhưng lại cần cho
thêm cơ chất khác phục vụ cho việc đo điện hoá.
Các gen luxAB, luxFF mã cho các luciferase, đó là tên gọi chung cho các
loại enzym xúc tác cho phản ứng phát quang. Quá trình phát ra ánh sáng bởi các cơ
thể sinh vật chứa luciferase được gọi là sự phát quang sinh học. Luciferase có mặt
khá phổ biến trong tự nhiên, có thể tìm thấy ở vi khuẩn, trùng roi, nấm, sứa, côn
trùng, cá, tôm, mực, v.v… trong đó ở vi khuẩn đã tìm thấy nhiều loài chứa
luciferase, ví dụ Vibrio, Photobacterium, Xenorhabdus. Một trong những ứng dụng
sớm nhất của luciferase vi khuẩn là thí nghiệm Microtox. Người ta đưa vi khuẩn
phát sáng tự nhiên vào môi trường có chứa chất độc nào đó. Dựa vào sự suy giảm
của độ phát sáng ở vi khuẩn khi tiếp xúc với chất độc so với đối chứng để suy đoán
mức độc hại của môi trường.
Gen luxAB ở vi khuẩn mã cho luciferase xúc tác cho quá trình ôxy hoá một
flavin khử (FMNH
2

) và một aldehit béo thành FMN và axit béo. Phản ứng này phát
ra ánh sáng màu xanh ve có cường độ cực đại ở bước sóng 490 nm. Trong cơ thể vi
khuẩn, aldehit tetradecanal (C
13
H
25
CHO) được tổng hợp tự nhiên bởi gen luxCDE
và là cơ chất của luciferase, tuy nhiên cũng có thể dùng một số aldehit mạch thẳng
khác để thay thế như decanal (C
9
H
19
CHO). Ưu điểm nổi bật của protein chỉ thị này
là tạo ra tín hiệu có độ nhạy tốt, mang tính định lượng, chính xác, thí nghiệm nhanh,
khá đơn giản. Tuy nhiên, nhược điểm cần lưu ý là độ bền nhiệt kém khi tồn tại ở
nhiệt độ trên 30
o
C, khoảng tuyến tính hẹp < 10
3
[36].
Gen gfp mã cho quá trình tạo ra các protein phát huỳnh quang xanh lá cây
(Green Fluorescent protein - GFP). Ví dụ, aequorin tạo ra ở loài sứa Aequorea
Victoria, green fluorescent protein ở cây hoa păngxê biển Renilla reniformis. Phổ
kích thích của GFP có cực đại ở bước sóng tử ngoại khoảng 395nm và phổ phát xạ
có cực đại ở bước sóng 509 nm. Như vậy các tế bào có chứa GFP sẽ phát ánh sáng
huỳnh quang khi được kích thích bởi tia tử ngoại. Sự phát sáng huỳnh quang có thể
quan sát bằng mắt, nhìn dưới kính hiển vi huỳnh quang hoặc đo bằng máy quang
phổ huỳnh quang. GFP được ứng dụng rộng rãi làm protein chỉ thị trong nghiên cứu
sự biểu hiện gen, xác định các tế bào đã chuyển gen. Ưu điểm cơ bản của GFP là
khả năng tự phát quang, nên khi sử dụng nó không cần thêm cơ chất, có độ bền sinh

học cao, thí nghiệm đơn giản. Nhược điểm của GFP là có thể bị nhiễu bởi các phân
tử phát huỳnh quang khác vốn có trong tế bào. GFP có độc tính đối với một số dòng