Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus Mutans

MỤC LỤC


Trang
MỞ ĐẦU
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4
1.1.
Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan
4
1.1.1.
Bệnh sâu răng
4
1.1.2.
Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam
4
1.1.3.
Cơ chế gây bệnh sâu răng
6
1.1.4.
Mảng bám răng và sự hình thành mảng bám răng
8
1.2.
Vi khuẩn Streptococcus mutans và khả năng gây sâu răng
9
1.2.1.
Một số đặc trưng hình thái và phân loại của Streptococcus mutans
10

1.2.2.
Một số đặc trưng sinh lý sinh hoá của S. mutans
12
1.2.3.
Cơ sở phân tử của đáp ứng stress ở vi khuẩn S. mutans
14
1.2.3.1
Đáp ứng stress axit ở vi khuẩn S. mutans
15
1.2.3.2
Đáp ứng stress oxy hóa ở vi khuẩn S. mutans
19
1.2.4.
Các đặc trưng trong hệ gen của S. mutans đối với việc phân lập và
nhận dạng
20
1.3.
Các biện pháp chống sâu răng
22
1.3.1
Sử dụng chất kháng khuẩn
22
1.3.2.
Sử dụng các chất tổng hợp
25
1.3.3.
Sử dụng các hợp chất tự nhiên
26
1.3.4.
Sử dụng các biện pháp khác

28
1.3.4.1.
Liệu pháp thay thế
28
1.3.4.2.
Vaccine phòng chống sâu răng
28
1.3.5.
Tình trạng nhiễm fluo trên răng
28
1.4.
Các chất thứ cấp từ thực vật
29
1.4.1.
Phân loại, cấu tạo hoá học và tính chất của chất thứ cấp từ thực vật
29


1.4.1.1.
Nhóm các hợp chất terpene
30
1.4.1.2.
Nhóm các hợp chất phenolic
30
1.4.1.3.
Nhóm hợp chất chứa nitơ
33
1.4.2
Hoạt tính sinh học của các hợp chất thứ cấp từ thực vật
34

1.4.2.1.
Tác dụng chống oxy hoá của các hợp chất thứ cấp từ thực vật
34
1.4.2.2.
Tác dụng kháng sinh, kháng khuẩn của các hợp chất thứ cấp từ
thực vật
36
1.4.2.3.
Một số tác dụng khác của các chất thứ cấp từ thực vật
38
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
40
2.1.
Nguyên liệu
40
2.1.1.
Chủng vi sinh vật
40
2.1.2.
Mẫu thực vật
40
2.1.3.
Hoá chất
40
2.1.4.
Thiết bị thí nghiệm
41
2.2.
Phương pháp nghiên cứu
41

2.2.1.
Nuôi cấy vi khuẩn và bảo quản tế bào vi khuẩn
41
2.2.2
Phương pháp nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn gây sâu răng S.
mutans từ các bệnh phẩm mắc bệnh sâu răng
41
2.2.2.1.
Phân lập trên môi trường Mitis salivarius
42
2.2.2.2.
Phân lập trên môi trường TSA pH 5,0
42
2.2.3.
Phương pháp nhận dạng Streptococcus mutans phân lập từ người
Việt Nam
43
2.2.3.1.
Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn
43
2.2.3.2.
Phương pháp nhuộm Gram cải tiến
43
2.2.3.3.
Kiểm tra hoạt tính catalase
43
2.2.3.4.
Kiểm tra các đặc tính hoá sinh (kit Api 20 Strep)
43
2.2.3.5

Phương pháp PCR nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome
16S và kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn giới hạn
44


2.2.3.6.
Phương pháp PCR mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen mã hóa cho
dextranase của Streptococcus mutans
45
2.2.3.7.
Phương pháp đọc trình tự đoạn gen mã hóa ARNr 16S
45
2.2.4.
Phương pháp nuôi cấy biofilm
46
2.2.5.
Phương pháp xác định mức độ sinh axit của vi khuẩn
46
2.2.6.
Phương pháp xác định mức độ gây chết tế bào
46
2.2.7.
Phương pháp xác định khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn
47
2.2.8.
Phương pháp đo mức độ tiêu thụ oxy của tế bào
47
2.2.9.
Xác định hoạt độ một số enzyme quan trọng của S. mutans
47

2.2.9.1.
Chuẩn bị tế bào thấm
48
2.2.9.2.
Phân tích hoạt độ ATPase
48
2.2.9.3.
Phân tích hoạt độ phosphotransferase (PTS)
49
2.2.9.4.
Phân tích hoạt độ NADH oxidase
49
2.2.9.5.
Phân tích hoạt độ lactate dehydrogenase
50
2.2.9.6.
Phân tích hoạt độ pyruvate kinase
50
2.2.10.
Phương pháp nghiên cứu định tính thành phần một số hợp chất
thực vật thứ sinh trong dịch chiết thực vật
51
2.2.11.
Phương pháp phân tách các hợp chất bằng sắc ký
52
2.2.12.
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
53
2.2.13.
Phương pháp xử lý số liệu

53
Ch¬ng 3. KÕt qu¶ nghiªn cøu
54
3.1.
Nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có khả năng kháng khuẩn
sâu răng
54
3.1.1.
Khả năng ức chế sự sinh axit của một số dịch chiết thực vật
54
3.1.2.
Khả năng diệt S. mutans GS-5 bởi dịch chiết một số thực vật
58
3.1.2.1.
Khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 ở pH 4
58
3.1.2.2.
Khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 ở pH 7
59
3.1.3.
Khả năng ức chế sự hình thành bioflim của S. mutans GS-5 bởi các
60


dịch chiết thực vật
3.1.4.
Tác dụng của dịch chiết một số thực vật phối hợp với fluo
62
3.1.5.
Tác dụng của dịch chiết một số thực vật phối hợp với H

2
O
2

64
3.1.6.
Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên một số vi khuẩn
đường miệng
65
3.2.
Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một số chất thứ cấp
có hoạt tính kháng khuẩn sâu răng từ vỏ cây Sao đen
67
3.2.1.
Tìm hiểu nhóm chất thứ cấp có trong vỏ cây Sao đen
67
3.2.2.
Tách chiết tinh sạch một số chất thứ cấp từ vỏ cây Sao đen
68
3.2.3.
Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu răng của hopea phenol và
malibatiol A từ vỏ Sao đen
72
3.2.3.1.
Tác dụng của hopea phenol và malibatiol A lên sự sinh axit của S.
mutans
72
3.2.3.2.
Tác dụng giết tế bào S. mutans GS-5 của hopea phenol và
malibatol A

73
3.2.3.3.
Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ ATPase
74
3.2.3.4.
Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ
phosphotransferase của S. mutans GS-5
74
3.2.3.5.
Tác dụng của hopea phenol, malibatol A lên hoạt độ lactate
dehydrogenase
75
3.2.3.6.
Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ pyruvate
kinase
76
3.2.3.7.
Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ NADH
oxidase
77
3.3.
Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một số chất thứ cấp
có hoạt tính kháng khuẩn sâu răng từ lá cây Sắn thuyền
77
3.3.1.
Tìm hiểu các nhóm chất thứ cấp có trong lá Sắn thuyền
78
3.3.2.
Tách chiết tinh sạch một số chất thứ cấp từ lá cây Sắn thuyền
79

3.3.3.
Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu răng của axit asatic
83
3.3.3.1.
Tác dụng của axit asiatic lên sự sinh axit của S. mutans GS-5
83


3.3.3.2.
Tác dụng của axit asiatic lên sự diệt S. mutans GS-5
83
3.3.3.3.
Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ ATPase của S. mutans GS-5
84
3.3.3.4.
ảnh hưởng của axit asiatic lên hoạt độ phosphotransferase của S.
mutans GS-5
84
3.3.3.5.
Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ lactate dehydrogenase của S.
mutans GS-5
85
3.3.3.6.
Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ pyruvate kinase của S.
mutans GS-5
85
3.3.3.7.
Tác dụng của axit asiatic lên NADH oxidase của S. mutans GS-5
86
3.4.

Phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ người
Việt Nam
87
3.4.1.
Phân lập S. mutans trên môi trường Mitis Salivarius và môi trường
TSA pH 5
87
3.4.2.
Xác định một số đặc điểm hình thái, sinh lý, hoá sinh của tế bào vi
khuẩn phân lập từ người Việt Nam
89
3.4.2.1.
Xác định hình thái tế bào vi khuẩn và kiểm tra hoạt tính catalase
89
3.4.2.2.
Nhận dạng sơ bộ Streptococcus mutans bằng kit API 20 Strep
91
3.4.3.
Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus bằng kỹ thuật đa hình độ dài
các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) và PCR
93
3.4.3.1.
Tách ADN tổng số
93
3.4.3.2.
Nhận dạng vi khuẩn bằng kỹ thuật RFLP đoạn gen mã hoá cho
ARNr 16S
93
3.4.3.3.
Nhận dạng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu của

gen dextranse của Streptococcus mutans
95
3.4.4.
Một số đặc điểm sinh lý của 3 chủng vi khuẩn Streptococcus
mutans H1, H2 và H3
96
3.4.4.1.
Khả năng sinh axit của S. mutans H1, S. mutans H2 và S. mutans
H3
96
3.4.4.2.
Khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn phân lập từ người Việt
Nam
97


3.4.4.3
Giải trình tự gen mã hóa ARNr 16S của S. mutans H2 phân lập từ
người Việt Nam
98
3.4.5.
Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên S.
mutans H2 phân lập từ người Việt Nam
100
3.4.5.1.
Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên khả năng sinh
axit của S. mutans H2
100
3.4.5.2.
Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền với việc diệt các tế

bào S. mutans H2
100
3.4.5.3.
Nghiên cứu tác dụng của axit asiatic, hopea phenol và malibatol A
lên hoạt độ một số enzyme của S. mutans H2
101
THẢO LUẬN
104
KẾT LUẬN
113
ĐỀ NGHỊ
114
TÀI LIỆU THAM KHẢO
116
PHỤ LỤC
137



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT


ADP
ATP
Adenosine diphosphate
Adenosine triphosphate
CTI
DMFT
Chàm tía (Strobilanthes cusia Bremek.)
Chỉ số răng sâu, răng mất hay trám răng do sâu răng (Decayed

Missing Filled Teeth)
HNT
IC
50

Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L.)
Nồng độ ức chế 50% hoạt độ enzyme (Inhibitory concentration)
KNG
Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.)
kDA
Kilo dalton
Kb
Kilo base
LDH
Lactate dehydrogenase
MS
Phổ khối (Mass spectrophotometry)
NAD
+

Nicotinamide adenine dinucleotide
NMR
Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)
NOX
NADH oxidase
NPK
NADH peroxidase
PCR
Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction)
PEP

Phosphoenolpyruvate
PTS
Hệ thống enzyme chuyển phosphate (Phosphotransferase system)
QCT
ROS
Quỷ châm thảo (Bidens pilosa L.)
Dạng oxy hoạt động (Reactive oxygen species)
RFLP
Đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn (Restriction Fragment
Length Polymorphism)
SD
Độ lệch chuẩn (Standard deviation)
SDA
Sài đất (Verbesina calendulaceae L.)
SDE
Sao đen (Hopea odorata Roxb.)
SOD
Superoxide dismutase
STH
Sắn thuyền (Syzygium resinosum Gagnep.)
TSA
Môi trường thạch đậu tương phân giải (Tryptic Soy Agar)
TY
Tryptone cao nấm men (Tryptone yeast extract)


DANH MỤC CÁC BẢNG


Trang

Bảng 1.1.
Các loài thuộc nhóm mutans streptococcus
11
Bảng 3.1.
Danh mục các mẫu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu
54
Bảng 3.2.
Tác dụng của một số dịch chiết thực vật bằng H
2
O và ethanol
lên sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans GS-5
56
Bảng 3.3.
Tác dụng của dịch chiết lên sự hình thành biofilm ở S.
mutans GS-5
61
Bảng 3.4.
Tác dụng của dịch chiết thực vật phối hợp với NaF lên sự
sinh axit của S. mutans GS-5
63
Bảng 3.5.
Tác dụng của dịch chiết các mẫu thực vật phối hợp với H
2
O
2

lên sự sinh axit của S. mutans GS-5
64
Bảng 3.6.
Thành phần một số hợp chất trong vỏ Sao đen chiết bằng các

dung môi
67
Bảng 3.7.
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của
hợp chất SDE1 và SDE 2 tách từ vỏ Sao đen
71
Bảng 3.8.
Thành phần hóa học dịch chiết lá Sắn thuyền trong các dung
môi
78
Bảng 3.9.
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của
hợp chất ST3A từ cây Sắn thuyền
81
Bảng 3.10.
Một số đặc tính sinh lý, hoá sinh của các chủng
Streptococcus phân lập từ bệnh phẩm sâu răng người Việt
Nam
91


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ


Trang
Hình 1.1
Cấu tạo của răng
7
Hình 1.2.
Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan

7
Hình 1.3.
Vi khuẩn Streptococcus mutans
11
Hình 1.4.
Mối quan hệ giữa chất trao đổi bậc nhất và các chất thứ cấp từ
thực vật
32
Hình 3.1.
Tác dụng của ethanol lên sự sinh axit của S. mutans GS-5
55
Hình 3.2.
ảnh hưởng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên sự sinh axit
của S. mutans GS-5
57
Hình 3.3.
Tác dụng không thuận nghịch của dịch chiết Sao đen và Sắn
thuyền lên khả năng sinh axit của S. mutans GS-5
57
Hình 3.4.
ảnh hưởng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên sự tiêu thụ
oxy của S. mutans GS-5
58
Hình 3.5.
Khả năng diệt S. mutans GS-5 từ các dịch chiết thực vật tại pH
4
59
Hình 3.6.
Khả năng diệt S. mutans GS-5 từ các dịch chiết thực vật tại pH
7

60
Hình 3.7.
Khả năng ức chế sự hình thành biofilm của S. mutans GS-5 từ
dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền
61
Hình 3.8.
Tác dụng của các dịch chiết lên sự sinh axit của S. mutans GS-5
trên biofilm
62
Hình 3.9.
Khả năng diệt S. mutans GS-5 của dịch chiết Sao đen và Sắn
thuyền khi phối hợp với NaF tại pH 4
64
Hình 3.10.
Khả năng diệt S. mutans GS-5 của dịch chiết Sao đen và Sắn
thuyền khi phối hợp với H
2
O
2
tại pH 4
65
Hình 3.11.
Tác dụng diệt một số vi khuẩn đường miệng của dịch chiết Sắn
thuyền và Sao đen
66
Hình 3.12.
Các bước tách hopea phenol và malibatol A từ vỏ Sao đen
70
Hình 3.13.
Cấu trúc hoá học của hopea phenol và malibatiol A

71


Hình 3.14.
Một số tương tác H-C chủ yếu của hopea phenol
72
Hình 3.15.
Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên sự sinh axit của
S. mutans GS-5
73
Hình 3.16.
Khả năng diệt S. mutans GS-5 tại pH 4 và pH 7 của hopea
phenol và malibatol A
73
Hình 3.17.
ảnh hưởng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ ATPase
của S. mutans GS-5
74
Hình 3.18.
Ảnh hëng cña opea phenol vµ malibatol A
lªn ho¹t ®é phosphotransferase cña S.
mutans GS-5
75
H×nh
3.19.
¶nh hëng cña hopea phenol vµ malibatol A
lªn ho¹t ®é lactate dehydrogenase cña S.
mutans GS-5
75
Hình 3.20.

ảnh hưởng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ
piruvate kinase của S. mutans GS-5
76
Hình 3.21.
ảnh hưởng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ NADH
oxidase của S. mutans GS-5
77
Hình 3.22.
Các bước tách chiết axit asiatic từ lá Sắn thuyền
80
Hình 3.23.
ảnh sắc ký trên bản mỏng mẫu ST3A tách từ Sắn thuyền
81
Hình 3.24.
Cấu trúc hóa học của ST3A tách chiết từ lá Sắn thuyền
81
Hình 3.25.
Các tương tác H-C chủ yếu của axit asiatic
82
Hình 3.26.
Tác dụng ức chế sự sinh axit của S. mutans GS-5 của axit asiatic
83
Hình 3.27.
Tác dụng diệt S. mutans GS-5 của axit asiatic
84
Hình 3.28.
ảnh hưởng của axit asiatic hoạt độ ATPase của S. mutans GS-5
84
Hình 3.29.
ảnh hưởng axit asiatic lên hoạt độ phosphotransferase của S.

mutans GS-5
85
Hình 3.30.
Ảnh hëng cña asiatic axit lªn ho¹t ®é
lactate dehydrogenase cña S. mutans GS-5
85
H×nh
3.31.
¶nh hëng cña asiatic axit lªn ho¹t ®é
pyruvate kinase cña vi khuÈn S. mutans GS-5
86


Hình 3.32.
ảnh hưởng của axit asiatic lên hoạt độ NADH oxidase của S.
mutans GS-5
86
Hình 3.33.
Hình thái khuẩn lạc một số chủng vi khuẩn phân lập từ người
Việt Nam trên môi trường Mitis- salivarius
88
Hình 3.34.
Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch TSA pH 5,0
89
Hình 3.35.
ảnh chụp hiển vi điện tử của các chủng vi khuẩn chi
Streptococcus
90
Hình 3.36.
Điện di kiểm tra trên gel agarose sản phẩm ADN tổng số của

các chủng vi khuẩn Streptococcus
93
Hình 3.37.
Điện di trên gel agarose các sản phảm nhân bản đoạn gen ARNr
16S của các chủng vi khuẩn Streptococcus
94
Hình 3.38.
Điện di trên gel agarose các sản phẩm PCR của đoạn gen mã
hóa cho ARNr 16S sau khi cắt bằng HpaII
95
Hình 3.39.
Điện di trên gel agarose các sản phẩm PCR của đoạn gen mã
hóa cho ARNr 16S sau khi cắt bằng HaeIII
95
Hình 3.40.
Điện di trên gel agarose sản phẩm nhân bản bằng PCR gen
dextranase của S. mutans
96
Hình 3.41.
Khả năng sinh axit của các chủng S. mutans từ người Việt Nam
97
Hình 3.42.
Khả năng chịu axit của các chủng S. mutans từ người Việt Nam
98
Hình 3.43.
Vị trí phân loại của chủng S. mutans H2
99
Hình 3.44.
ảnh hưởng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên sự sinh axit
của S. mutans H2

100
Hình 3.45.
Tác dụng diệt S. mutans H2 phân lập từ người Việt Nam từ
dịch chiết Sắn thuyền và Sao đen ở pH 4 và pH 7
101
Hình 3.46.
ảnh hưởng của axit asiatic, hopea phenol và malibatol lên hoạt
độ ATPase của S. mutans H2
102
Hình 3.47.
ảnh hưởng của axit asiatic, hopea phenol và malibatol lên hoạt
độ phosphotransferasecủa S. mutans H2
102



1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Sâu răng là một trong số các bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay và
đang có xu hướng ngày một tăng lên ở các nước đang phát triển trong đó có Việt
Nam. Theo số liệu điều tra gần đây của Viện Răng Hàm Mặt Trung Ương, khoảng
90% dân số Việt Nam mắc các bệnh về răng, miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu
răng và viêm quanh răng [38]. Bệnh sâu răng không chỉ gây ảnh hưởng tới tình
trạng sức khoẻ của người bệnh mà còn gây ra nhiều chi phí tốn kém trong chữa trị.
Tổ chức Y tế thế giới coi sâu răng là một trong những bệnh nguy hiểm của loài
người. Nhiều chương trình nghiên cứu cũng như khuyến cáo nhằm mục đích ngăn
ngừa và phòng chống bệnh này đã được WHO thực hiện trong những năm qua. Mặc
dù tỷ lệ sâu răng trong cộng đồng dân cư đã giảm đi đáng kể nhưng vẫn còn ở mức
cao và đòi hỏi phải có những biện pháp dự phòng tốt hơn nữa để đạt mục tiêu mà

Tổ chức Y tế thế giới đưa ra.
Cách tốt nhất để hạn chế bệnh sâu răng là vệ sinh răng miệng thường xuyên
và đúng cách cùng với việc hạn chế sử dụng các thức ăn, đồ uống có nhiều đường.
Tuy vậy, phương pháp vệ sinh răng miệng, thói quen ăn uống không phải lúc nào
cũng thực hiện được, do vậy việc sử dụng các chất có khả năng kháng khuẩn như
fluo, axit yếu, muối kim loại v.v là một biện pháp để phòng chống sâu răng. Trong
số các chất kháng khuẩn được sử dụng fluo là chất có tiềm năng hơn cả. Tuy nhiên,
việc sử dụng fluo lâu dài hay với nồng độ cao có thể làm xuất hiện hiện tượng
nhiễm fluo (fluorosis) làm men răng ố vàng và trở nên sần sùi [68, 89]. Chính vì
những lý do đó mà xu hướng hiện nay là tìm kiếm các hợp chất mới, có thể thay thế
một phần fluo hay kết hợp với fluo nhưng ở nồng độ thấp hơn mà vẫn có hiệu quả
chống sâu răng cao. Hiện nay, việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có tác dụng bảo
vệ răng miệng đang là xu hướng được quan tâm nghiên cứu và có nhiều ứng dụng
trong thực tiễn.
Việt Nam có hệ thực vật nhiệt đới vô cùng phong phú và đa dạng, trong đó
gồm rất nhiều loài chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Từ ngàn xưa, cộng
đồng các dân tộc trên đất nước ta cũng có truyền thống sử dụng cây cỏ để chữa
bệnh, bảo vệ sức khỏe chống lại bệnh tật trong đó có bệnh sâu răng [2, 16, 17]. Tuy


2
nhiên cho đến nay việc tìm kiếm các hợp chất mới cũng chưa mang lại nhiều kết
quả như mong muốn. Hơn nữa, chưa có nhiều nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng
của các hợp chất tự nhiên lên vi khuẩn sâu răng.
Đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi
khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans” của chúng tôi nằm trong xu thế
nghiên cứu chung của thế giới và Việt Nam. Việc tiến hành đề tài này là cần thiết và
có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các bệnh về
răng đặc biệt là bệnh sâu răng.

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là điều tra tác dụng chống sâu răng của dịch
chiết một số loài thực vật ở Việt Nam thông qua việc nghiên cứu ảnh hưởng của
chúng lên các quá trình sinh lý, hoá sinh, một số enzyme và hệ enzyme có liên quan
của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans, từ đó nghiên cứu cách tách chiết,
tinh sạch một vài chất thứ cấp và đi sâu tìm hiểu tác dụng chống sâu răng của
chúng.

3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài
Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans GS-5, một số vi khuẩn
thuộc chi Streptoccocus từ bộ sưu tập giống tại Phòng thí nghiệm của GS. Robert E.
Marquis, Đại học Rochester, Mỹ. Một số chủng vi khuẩn được phân lập từ người
Việt Nam.
Các thực vật được lựa chọn bao gồm: Chàm tía, Hương nhu trắng, Kim ngân,
Quỷ trâm thảo, Sài đất và Sao đen là những loài được dùng trong các bài thuốc dân
gian Việt Nam để chữa bệnh sâu răng và có tính kháng khuẩn, chống viêm.
Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu điều tra ảnh hưởng một số dịch chiết thực vật lên quá trình sinh
axit gây sâu răng Streptococcus mutans và tác dụng giết chết vi khuẩn này
của các dịch chiết.


3
2. Tách chiết, tinh sạch, xác định cấu trúc và nghiên cứu tác dụng của một số
chất thứ cấp từ các loài thực vật được điều tra lên các quá trình sinh lý, hoá
sinh của vi khuẩn S. mutans cũng như một số enzyme và phức hệ enzyme
đích, liên quan đến tính chất gây sâu răng của vi khuẩn này.
3. Phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ bệnh phẩm của
người Việt Nam bị sâu răng và bước đầu nghiên cứu tác dụng của một số

chất thứ cấp thu được lên một số quá trình sinh lý, hoá sinh cũng như một số
enzyme và phức hệ enzyme liên quan của chủng vi khuẩn Streptococcus
mutans phân lập được.

4. Địa điểm thực hiện đề tài
Các nghiên cứu của luận án được thực hiện chủ yếu tại các phòng thí nghiệm
của Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội.
Một số thí nghiệm để tinh sạch và xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất thực
vật thứ cấp được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Viện Hoá học các hợp chất
tự nhiên-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

5. Đóng góp mới của đề tài
1. Đây là công trình nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có tác dụng chống sâu
răng ảnh hưởng đến quá trình sinh lý phát triển của vi khuẩn gây sâu răng
Streptococcus mutans.
2. Đây là công trình nghiên cứu có tính hệ thống về tác dụng của dịch chiết vỏ
cây Sao đen và lá cây Sắn thuyền lên vi khuẩn gây sâu răng S. mutans.
3. Đây là công trình đầu tiên công bố về việc tách chiết, xác định công thức hoá
học và tác dụng chống sâu răng của hợp chất hopea phenol, malibatol A từ
vỏ Sao đen và axit asiatic từ lá Sắn thuyền thông qua việc đánh giá tác dụng
của chúng lên sự sinh axit, khả năng giết vi khuẩn và tác dụng của chúng lên
hoạt độ một số enzyme đích trong việc sinh và chịu axit của vi khuẩn S.
mutans.
4. Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu phân lập và nhận dạng đến loài một số
chủng vi khuẩn S. mutans từ người Việt Nam.


4

6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài

Các kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần cung cấp các dẫn liệu về khả
năng kháng khuẩn sâu răng của một số dịch chiết thực vật, hợp chất tinh sạch từ lá
Sắn thuyền và vỏ Sao đen có ở Việt Nam góp phần ứng dụng hiệu quả hơn trong
việc bảo vệ răng, miệng.
4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. BỆNH SÂU RĂNG VÀ CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN
1.1.1. Bệnh sâu răng
Bệnh sâu răng là bệnh gây ra bởi vi khuẩn trên mảng bám răng, điển hình là
vi khuẩn Streptococcus mutans. Những vi khuẩn trên mảng bám răng sử dụng các
carbohydrate chủ yếu là đường glucose lên men tạo axit lactic. Môi trường axit phá
vỡ sự cân bằng của các vi khuẩn đường miệng, tạo điều kiện thích hợp với vi khuẩn
gây sâu răng. Những vi khuẩn này có khả năng chịu được pH thấp và do đó có thể
duy trì hoạt động trao đổi chất và tiếp tục tạo axit [12, 69, 80]. Khi lượng axit hình
thành đủ lớn sẽ hòa tan các khoáng chất có trong men răng vốn được cấu tạo bởi
hydroxylapatide liên kết với ion canxi tích điện dương và ion phosphate tích điện
âm, dẫn đến làm mòn men răng, tạo thành các hố trên răng và gây ra sâu răng [11,
12, 80].
1.1.2 Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam
Bệnh sâu răng là một trong 3 bệnh được tổ chức Y tế thế giới cảnh cáo về
mức độ nguy hiểm chỉ sau các bệnh tim mạch và ung thư [29]. Trong các thập niên
trước, tỷ lệ số người mắc bệnh sâu răng cao ở cả người lớn và trẻ em. Trung bình
mỗi trẻ em 12 tuổi có từ 8 đến 10 răng sâu hoặc răng đã bị mất do sâu. Chỉ số
DMFT được sử dụng để phản ánh số răng sâu, số răng mất hay trám răng do sâu.
Năm 1997, chỉ số DMFT ở lứa tuổi trung niên (từ 35 đến 44 tuổi) tại các nước công
nghiệp phát triển như Canada, Nhật Bản, Úc và các nước Bắc Âu là 13,9 tương
đương một người có trung bình 13,9 răng bị sâu, trám hay mất, chỉ số này ở Mỹ cao

hơn 9 [29]. Những năm gần đây, tỷ lệ sâu răng đã giảm tuy nhiên còn ở mức cao
một phần do điều kiện sống được cải thiện, hàm lượng đường tăng trong chế độ ăn
và việc sử dụng nhiều loại bánh kẹo và sản phẩm có đường và hiệu quả công tác
tuyên truyền phòng chống bệnh chưa cao [130, 131, 139].
Tại các nước đang phát triển như Thái Lan, Uganda v.v chỉ số DMFT ở lứa
tuổi 12 cuối những năm 1960 chỉ từ 1 đến 3 nhưng đã tăng lên mức từ 3 tới 5 và
5

thậm chí cao hơn vào những năm 1970-1980 [29, 119]. Chỉ số DMFT ở tuổi 12 ở
mức cao trên 4,4 còn gặp ở Ba Lan, Philipin và một vài nước ở Trung Mỹ như
Nicaragoa, Honduras, Guatemala và hầu hết các nước Nam Mỹ như Braxin,
Colombia, Chilê, Bolivia và Paragoay. Bên cạnh đó một số nước Đông Nam Á như
Malaysia và Singapore tình trạng sâu răng đặc biệt ở trẻ em có xu hướng giảm trong
những năm gần đây do đã làm tốt công tác phòng bệnh [130, 131].
Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của Nguyễn Dương Hồng năm 1977 [13]
tại Hà Nội có tới 77% trẻ em 6 tuổi có sâu răng, tỷ lệ này đối với thanh niên là 48%.
Theo Võ Thế Quang và tập thể [30], từ năm 1983 đến 1991 số người mắc bệnh sâu
răng ở các tỉnh phía Nam cao hơn các tỉnh phía Bắc nhưng mức độ gia tăng bệnh ở
các tỉnh phía Bắc lại cao hơn các tỉnh phía Nam. Nhìn chung trong thời gian 1980-
1990 số bệnh nhân bị sâu răng ở Việt Nam có chiều hướng gia tăng. Đến năm 1990,
tỷ lệ sâu răng ở lứa tuổi 12 là 57% với tỷ lệ viêm lợi và viêm quanh răng là 95% và
đối với lứa tuổi từ 35 đến 44 thì tỷ lệ này cao tới 99,26% [30]. Theo kết quả điều tra
của Trần Văn Trường và tập thể [38] về tỷ lệ mắc bệnh sâu răng trong một số tỉnh
thành trong cả nước, hai thành phố lớn là Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh có tỷ
lệ sâu răng trong khoảng từ 36 đến 92% tuỳ theo từng độ tuổi. Theo số liệu điều tra
sức khoẻ răng miệng toàn quốc lần thứ 2 năm 2001 với nhóm tuổi 18 đến 34 chỉ số
DMFT là 3,64 và tăng dần theo độ tuổi từ 34 đến 44 là 5,06 và trên 45 là 8,26. Tỷ lệ
sâu răng vĩnh viễn là 54,89%, 75,2% và 89,7% đối với các độ tuổi dưới 12, từ 18
đến 34 và trên 45 tuổi. Tỷ lệ viêm quanh răng cũng rất cao ở cả trẻ em và người lớn.
Tỷ lệ người Việt Nam có răng khoẻ mạnh chỉ đạt mức dưới 10% [9, 38].

Đáng chú ý trong điều tra gần đây của Trịnh Đình Hải [9] tỷ lệ sâu răng ở
người Việt Nam trưởng thành cao tới 87,5%. Nhìn chung ở tất cả các nhóm tuổi đều
có bệnh nhân sâu răng và chỉ số DMFT gia tăng theo tuổi. Với người 45 tuổi trở lên
có 89,7% người bị sâu răng và trung bình mỗi người có 8,93 răng bị sâu. Trong số
8,93 răng sâu có 6,64 răng bị mất, chiếm tỷ lệ 74,36%. Tỷ lệ này cho thấy việc
chăm sóc điều trị để bảo tồn được răng ở nước ta còn yếu kém. Cũng theo nghiên
cứu của tác giả tỷ lệ sâu răng ở nam và nữ người Việt Nam trưởng thành không
khác nhau, nhưng lại rất khác nhau về tỷ lệ sâu răng giữa hai vùng thành thị và nông
thôn. Người sống ở thành thị có tỷ lệ sâu răng và chỉ số DMFT cao hơn so với
6

người sống ở nông thôn. Trong cả 7 vùng địa lý của Việt Nam, tỷ lệ sâu răng đều ở
mức cao, trong đó 3 vùng địa lý là vùng Duyên hải Nam Trung bộ, vùng Đông Bắc
Nam Bộ và vùng Đồng bằng sông Cửu Long có chỉ số DMFT ở nhóm tuổi trên 45 ở
mức trên 10, tức là mỗi người có trung bình trên 10 răng bị sâu hoặc bị mất do sâu.
Tỷ lệ các răng đã bị mất do không được điều trị bảo tồn gia tăng theo tuổi từ
18,31% ở tuổi 18 lên đến 74,36% ở người từ 45 tuổi trở lên.
Tổ chức Y tế thế giới, Liên đoàn Nha khoa Quốc tế đã quan tâm đến vấn đề
dự phòng sâu răng và tuyên bố ủng hộ nguyên tắc phòng bệnh hơn chữa bệnh và từ
đó liên tục nghiên cứu, tìm kiếm các biện pháp phòng bệnh sâu răng. Tổ chức Y tế
thế giới đưa ra mục tiêu cho toàn cầu, phấn đấu đến năm 2010 chỉ số DMFT dưới
1,0 [158]. Tại Việt Nam với chương trình nha học đường, chúng ta hy vọng mục
tiêu đến năm 2010 đạt được các chỉ tiêu: ở lứa tuổi 5-6 có 50% không bị sâu răng, ở
độ tuổi 18 có 85% người giữ được toàn bộ răng, từ 35-44 tuổi giảm 50% số người
không còn răng và trên 65 tuổi giảm 25% số người không còn răng với số lượng
răng trên 20 chiếc tương đương là 75 và 50% [37, 38].
1.1.3. Cơ chế gây sâu răng
Răng có cấu tạo dọc gồm 3 lớp: men răng, ngà răng và tuỷ răng [12]. Men
răng là lớp ngoài cùng rắn chắc nhất. Men răng bao gồm chủ yếu các tinh thể canxi
phosphate dài và mảnh, xếp sát cạnh nhau theo một trật tự nhất định. Men răng rất

bền vững, không bị vỡ, không bị cọ xát nhưng có thể bị bào mòn do tác động của
axit trong miệng. Ngà răng là lớp bên trong, là phần chính của răng. Tuỷ răng nằm
ở chính giữa của răng, gồm mô liên kết có chứa tận cùng thần kinh và các mao
mạch làm cho răng có cảm giác và để nuôi răng (hình 1.1).


Men răng
Ngà răng
Tuỷ
Lợi

Lợi
7

Hình 1.1. Cấu tạo của răng [12]
Răng bị sâu khi lớp men răng không được bảo vệ tốt và bị axit ăn mòn. Axit
hoà tan các tinh thể hydroxyapatite chứa canxi phosphate trên bề mặt răng, tạo ra
các hố nhỏ trên răng. Các hố này lớn dần, ăn sâu vào các tổ chức bên trong của răng
(ngà răng, tuỷ răng). Vi khuẩn theo các hố sâu xâm nhập vào bên trong, gây viêm
tuỷ răng, tạo ra cảm giác đau đớn cho người bệnh. Vào giai đoạn cuối, các mạch
máu, mô thần kinh bị chết, hình thành áp xe ở chân răng gây viêm, sưng và cuối
cùng phải nhổ răng [12, 39, 80].

Hình 1.2. Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan  Sâu răng
A: theo Keyes [112] ; B: theo White và tập thể [197]
Trước năm 1970, để giải thích căn bệnh sâu răng, người ta chú ý nhiều đến
vai trò của đường và vi khuẩn S. mutans và đưa ra ra sơ đồ của Keyes [112]. Theo
sơ đồ này, việc phòng tránh bệnh sâu răng chỉ tập trung vào việc ăn hạn chế chất
đường, tiến hành vệ sinh kỹ răng miệng (hình 1.2A). Năm 1976, White và tập thể
[197] giải thích cơ chế bệnh học của sâu răng bằng việc thay vòng tròn chất đường
trong sơ đồ của Keyes bằng vòng tròn chất nền, đề cao vai trò bảo vệ của nước bọt
và vai trò của fluo. Trong sơ đồ của White và tập thể (hình 1.2B) cho thấy có nhiều
yếu tố tác động, hạn chế quá trình phân huỷ khoáng, tăng cường quá trình tái
khoáng và có tác dụng bảo vệ răng không bị sâu như nước bọt, các ion F
-
, Ca
2+


v.v


R¨ng
§ - êng
Vi khuÈn
pH, dßng ch¶y n-í c bät
A
B
N- í c bät

Vi khuÈn
§ - êng

R¨ng

8

Năm 1995, Hội Nha khoa Mỹ khẳng định bệnh sâu răng là bệnh nhiễm trùng
do vi khuẩn gây nên và giải thích nguyên nhân sâu răng theo sơ đồ như của Keyes
tuy nhiên có một số thay đổi trong sơ đồ như đường được thay thế bằng môi trường,
vi khuẩn được thay bằng tác nhân gây sâu răng và răng được coi là vật chủ. Trong
đó tác nhân gây sâu răng là các vi khuẩn gây sâu răng S. mutans, Lactobacillus và
Actinomyces; vật chủ là răng gồm men răng, ngà răng và xương răng; môi trường là
các loại thức ăn chứa carbohydrate có khả năng lên men [42].
Bệnh sâu răng chỉ hình thành và phát triển khi ba yếu tố chính gây ra bệnh
sâu răng là vi khuẩn, đường (trong thức ăn) và thời gian đường cùng vi khuẩn tồn
tại trong khoang miệng. Vi khuẩn gây bệnh sâu răng cùng với các vi khuẩn khác
trong khoang miệng tồn tại, bám trên bề mặt răng và sử dụng đường trong thức ăn,
đồ uống để tạo và phát triển các mảng bám răng đồng thời chúng tiêu hoá đường để
tạo axit, ăn mòn dần các chất vô cơ ở men răng và ngà răng, làm thành lỗ sâu [51,
60, 80]. Nói chung vi khuẩn luôn tồn tại trong miệng còn đường thường tồn tại từ
20 phút đến 1 giờ trong miệng sau khi ăn, tuỳ thuộc hình thức chế biến thức ăn. Do
vậy, khoảng 20 phút sau khi ăn, axit được hình thành với lượng đủ lớn và bắt đầu
tấn công ăn mòn men răng.
Bệnh sâu răng chỉ diễn ra khi cả ba yếu tố trên cùng tồn tại. Vì thế cơ sở của
việc phòng chống bệnh sâu răng là ngăn chặn một hoặc cả ba yếu tố xuất hiện cùng
một lúc [80, 141]. Ngoài ra một yếu tố thứ tư không kém phần quan trọng là bản
thân người bệnh. Các yếu tố chủ quan như tuổi tác, hoạt động không bình thường
của tuyến nước bọt, dị tật bẩm sinh của răng có thể khiến cho khả năng mắc bệnh
sâu răng tăng cao và tốc độ bệnh tiến triển nhanh [12, 13, 88].
1.1.4. Mảng bám răng và sự hình thành mảng bám răng
Miệng là môi trường của nhiều loài vi khuẩn. Vi khuẩn đường miệng có mặt
ở mọi nơi trong miệng: răng, lưỡi, niêm mạc miệng, lợi. Những vi khuẩn này có thể

là có hình cầu (cầu khuẩn), hình que (trực khuẩn) hay hình xoắn (xoắn khuẩn).
Trên răng, các vi khuẩn và sản phẩm của chúng cùng với những mảnh vụn
thức ăn tạo thành mảng bám răng. Sự hình thành mảng bám răng gồm 3 giai đoạn
chính: giai đoạn đầu vi khuẩn được vận chuyển đến bề mặt của răng và bám vào
9

răng nhờ lực hút tĩnh điện yếu; giai đoạn tiếp theo là sự hình thành các liên kết
không thuận nghịch được tạo ra nhờ sự tương tác phân tử giữa tế bào vi khuẩn và
các thụ thể trên bề mặt răng và giai đoạn cuối là sự hình thành mảng bám răng làm
tăng quá trình tương tác giữa các tế bào [34, 114, 117, 198].
Mảng bám răng sơ cấp tạo thành từ các vi khuẩn Gram (+) như
Streptococcus mutans và Actinomyces filamentous. Một thời gian ngắn sau khi đánh
răng, lớp màng mỏng (bản chất là màng protein từ nước bọt) tạo thành trên bề mặt
răng. Streptococcus mutans sử dụng các protein vỏ của mình để gắn vào lớp màng
mới hình thành, đây là quá trình gắn không cần sucrose. Sau đó, Streptococcus
mutans sử dụng sucrose để tổng hợp glucan không tan nhờ enzyme glucosyl
transferase để bám dính vào lớp màng mỏng trên răng. Sự sinh trưởng, trao đổi chất
của các vi sinh vật thế hệ đầu tiên làm thay đổi điều kiện môi trường (pH, nguồn
thức ăn v.v ) trên mảng bám răng sơ cấp, tạo điều kiện cho các loài vi sinh vật
khác định cư, phát triển trên mảng bám sơ cấp và hình thành nên mảng bám răng
thứ cấp. Trên mảng bám răng có khoảng 500 loài vi khuẩn khác nhau với trên 300
loài đã được định loại tên chính xác [198].
Các vi khuẩn trên mảng bám răng đều có chung các đặc điểm là có khả năng
sinh axit, chịu axit và sản xuất polysaccharide ngoại bào cũng như nội bào [200].
Các vi khuẩn trên mảng bám răng có khả năng đề kháng với các tác nhân kháng
khuẩn cao hơn so với các vi khuẩn tự do có thể lên tới 1000 lần. Những vi khuẩn
chủ yếu có mặt trong mảng bám răng là lactobacillus và Streptococcus sanguis
chiếm 70% số loài phân lập được [29, 117]. Một số vi khuẩn trên mảng bám răng là
trung tính hay có ích, trong khi số khác là có hại nếu số lượng của chúng không
kiểm soát được như Streptococcus mutans và các loài khác gần gũi có ảnh hưởng

đến bệnh sâu răng. Một số vi khuẩn khác như Porphyromonas gingivalis lại liên
quan đến bệnh nha chu [117, 119].
Mảng bám răng không chỉ gây ra sâu răng mà còn là nguyên nhân gây ra
bệnh nha chu. Trong trường hợp này mảng bám răng được tạo thành dưới lợi do đó
vi khuẩn trên mảng bám răng sẽ tiết các enzyme gây độc, dẫn tới lợi bị chảy máu và
sưng, nếu không được chữa trị có thể phá huỷ các cấu trúc thiết yếu của răng [117].

10

1.2. VI KHUẨN Streptococcus mutans VÀ KHẢ NĂNG GÂY SÂU RĂNG
Những vi khuẩn có khả năng lên men đường thành axit lactic tồn tại trong
khoang miệng được xem là nguyên nhân gây sâu răng. Chúng chủ yếu thuộc 3
nhóm vi sinh vật: Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus sorbrinus,
Streptococcus salivarius, Streptococcus milleri v.v ), Lactobacillus (Lactobacillus
axitophilus, Lactobacillus casei v.v ) và Actinomyces. Trong số những vi khuẩn
này, Streptococcus mutans luôn được phát hiện trong nước bọt, mảng bám răng của
người và có số lượng rất cao ở những vùng răng bị sâu [88, 129, 135, 142]. Trong
nhóm Streptococcus thì Streptococcus mutans cùng với Streptococcus sobrinus là
hai loài vi khuẩn xuất hiện phổ biến ở vùng răng sâu ở người. Một số Streptococcus
khác cũng được phát hiện ở động vật như Streptococcus rattus, Streptococcus
cricetus, Streptococcus macacae, Streptococcus downeii, Streptococcus ferus v.v
Streptococcus mutans được coi là nguyên nhân chủ yếu gây sâu răng do vi
khuẩn này khả năng sinh axit mạnh, chịu axit tốt, có khả năng tạo polysaccharide
ngoại bào cũng như nội bào thành phần chính của mảng bám răng. S. mutans được
phân lập trong nước bọt, mảng bám răng và ở các vị trí sâu răng [69, 88, 129]. Sự
có mặt S. mutans cũng liên quan đến sự tiến triển của bệnh sâu răng, bệnh giảm
hoặc mất hẳn khi không có mặt S. mutans [117]. Mặt khác, sự nhiễm S. mutans ở
động vật thực nghiệm gây ra bệnh sâu răng ở các động vật này [72, 77].
1.2.1. Một số đặc trưng hình thái và vị trí phân loại của Streptococcus mutans
Streptococcus mutans được Charke [60] phát hiện lần đầu tiên vào năm

1924. Theo khoá phân loại của Bergey [99], các loài thuộc chi Streptococcus là
những vi khuẩn Gram (+), sống kị khí và sinh mủ, tế bào hình cầu hoặc hình trứng,
đường kính từ 0,5 đến 2 m (hình 1.3), tồn tại dạng cặp hoặc chuỗi khi sinh trưởng
trên môi trường lỏng. Streptococcus cần môi trường giàu dinh dưỡng để sinh
trưởng.
Các loài thuộc chi Streptococcus đường miệng sử dụng quá trình lên men tạo
ra sản phẩm chủ yếu là axit lactic và giải phóng năng lượng. Streptococcus gồm các
vi khuẩn không có hoạt tính catalase, chúng thường tấn công hồng cầu và làm cho
hồng cầu đổi thành màu lục nhạt. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của các loài vi khuẩn
11

đường miệng trong đó có S. mutans là 37
o
C và sự sinh trưởng bị giới hạn trong
khoảng nhiệt độ từ 25
o
C đến 45
o
C [64, 65]. Streptococcus tạo nên quần thể chính
trong khoang miệng với các loài khác nhau, định cư trong các ổ sinh thái khác nhau.
Do đó việc phân lập, phân loại, nhận biết giữa các nhóm vi khuẩn đường miệng với
các nhóm vi khuẩn khác trong khoang miệng gặp nhiều khó khăn [65, 99].

Hình 1.3. Vi khuẩn Streptococcus mutans [209]
Do sự phá hủy từng phần của các hồng cầu xung quanh khuẩn lạc nên nhóm
vi khuẩn đường miệng còn được gọi là viridans Streptococcus. Tuy nhiên một số
loài được phân loại là viridans Streptococcus lại không được phát hiện ở trong
khoang miệng. Theo sự phân loại hiện nay [65, 100, 101], dựa trên các đặc điểm
hóa học, kiểu di truyền và đặc biệt là kết quả lai ADN-ADN, phân tích trình tự
ARNr 16S các vi khuẩn Streptococcus đường miệng được chia vào các nhóm:

Nhóm anginosus: Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus và
Streptococcus intermedius.
Nhóm mitis: Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Streptococcus
gordonii, Streptococcus sanguis và Streptococcus parasanguis.
Nhóm salivarius: Streptococcus salivvarius và Streptococcus vestibularis.
Nhóm mutans: Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus .
Sự phân biệt các loài nhóm mutans hiện nay còn dựa trên sự khác biệt về các
phản ứng hóa sinh, đặc điểm hóa lý bề mặt và đặc biệt dựa trên việc sử dụng các
phân tích về sự sai khác ở mức độ phân tử với axit nucleic [81, 145, 181] hay với
protein [84]. Mutans Streptococcus có 8 kiểu huyết thanh (Bảng 1.1) [64].
Bảng 1.1. Các loài thuộc nhóm mutans Streptococcus
12

Loài
Kiểu huyết thanh
Vật chủ
Streptococcus mutans
c, e, f
Người
Streptococcus sobrinus
d, g
Người
Streptococcus cricetus
a
Người, động vật
Streptococcus ferus
c
Chuột
Streptococcus ratti (rattus)
b

Người, loài gặm nhấm
Streptococcus macacae
h
Khỉ
Streptococcus downei
h
Khỉ

Thuộc nhóm mutans, loài phổ biến nhất được phân lập từ mảng bám răng của
người là S. mutans (kiểu huyết thanh là c, e và f). Tế bào vi khuẩn S. mutans có
đường kính khoảng 0,5 đến 0,75 m, có dạng cặp, chuỗi ngắn hay trung bình và
không có vỏ bao quanh. Trong điều kiện axit của thức ăn và trên môi trường rắn,
chúng có thể tạo dạng tế bào hình que dài từ 1,5 đến 3 m. Loài phổ biến thứ 2
phân lập được từ những vùng răng sâu ở người thuộc nhóm mutans là
Streptococcus. sobrinus (d, g). Tế bào vi khuẩn Streptococcus sobrinus có đường
kính khoảng 0,5 m tồn tại dưới dạng cặp hoặc chuỗi. Loài vi khuẩn này cũng liên
quan đến bệnh sâu răng ở người nhưng chúng chưa được nghiên cứu kỹ như S.
mutans. Tế bào của Streptococcus rattus, Streptococcus ferus và Streptococcus
cricetus cũng có đường kính khoảng 0,5 m, xuất hiện dạng cặp hay chuỗi [64, 65,
88, 196]. Theo hệ thống phát sinh loài Streptococcus ferus vẫn chưa có vị trí chính
thức, tuy nhiên bằng việc giải trình tự ARNr 16S cũng như các số liệu khác hiện
nay Streptococcus ferus được xếp vào nhóm mutans Streptococci [196].
Mutans streptococci được tìm thấy trong miệng của tất cả các quần thể thu
mẫu, qua đó chỉ ra rằng các loài vi khuẩn này có sự phân bố toàn cầu. Trong mỗi
quần thể thu mẫu, có thể tìm thấy những người mang số lượng rất lớn các loài vi
khuẩn này trong khi một số khác chỉ có số lượng vi khuẩn trung bình và thực tế là
vẫn có những người mang số lượng rất thấp hay không có những loài vi khuẩn này
[129, 135].
13

1.2.2. Một số đặc trưng sinh lý, hoá sinh của Streptococcus mutans
S. mutans có khả năng gây sâu răng là do vi khuẩn này có khả năng sinh axit
mạnh và chịu axit tốt. S. mutans là vi khuẩn Gram (+), có thể sinh trưởng hiếu khí
hay kị khí. S. mutans trong điều kiện kị khí (đáy mảng bám răng) thiếu oxy chúng
lên men kỵ khí, tạo axit lactic gây ăn mòn men răng và gây sâu răng. Các vi khuẩn
thuộc nhóm Streptococcus như S. mutans, S. gordonii và S. salivarius đều lên men
đường để lấy năng lượng cho sinh trưởng và phát triển. S mutans chuyển hoá
sucrose thành glucose và fructose, sau đó lên men fructose. S. mutans, S. gordonii
lên men sử dụng cả sucrose lẫn fructose còn S salivarius có thể lên men glucose,
sucrose nhưng chủ yếu là lactose [88].
Streptococcus mutans có thể sinh axit là do chúng có khả năng sản xuất các
polysaccharide ngoại bào. Các polysaccharide ngoại bào có vai trò hình thành các
lưới màng tạo chỗ bám cho tế bào đồng thời sản sinh ra các sản phẩm lên men có
tính axit cao. Bên cạnh đó S. mutans còn có khả năng sản xuất các polysaccharide
nội bào từ các nguồn đường khác nhau. Hợp chất này được tế bào tiếp tục sử dụng
để sản xuất axit khi không có đường đưa từ ngoài vào. Các vi khuẩn S. mutans tích
luỹ polysaccharide nội bào và góp phần làm phát sinh bệnh sâu răng. Trong số các
dạng huyết thanh khác nhau của vi khuẩn S. mutans dạng d và dạng g sản xuất các
polysaccharide nội bào ít hơn so với dạng c và e [106].
Streptococcus mutans có khả năng bám dính trên bề mặt răng và tổng hợp
polysaccharide ngoại bào là glucan và fructan từ đường sucrose nhờ sự xúc tác của
enzyme glucosyl transferase (EC 2.4.1.5) và fructosyl transferase (EC 2.4.1.10).
Các polysaccharide đặc biệt là glucan là nhân tố quan trọng quyết định hình thành
mảng bám răng và do đó gây ra bệnh sâu răng vì chúng không hoà tan trong nước
và có khả năng kết dính khi tổng hợp với các chất cứng khác trên bền mặt [88]. S.
mutans còn có khả năng polymer hoá glucose hay fructose thành các dextran
(glucan không tan), gắn vi khuẩn vào men răng và tạo thành lớp vỏ. Lớp vỏ này
chứa từ 300 đến 500 lớp tế bào và chính là chất nền của mảng bám răng. Các nhóm
S. mutans khác nhau cũng có khả năng tổng hợp glucan này theo các mức độ khác
nhau. Dạng d của vi khuẩn S. mutans tổng hợp được lượng lớn glucan hơn dạng c

và tỷ lệ giữa glucan không tan và glucan tan cao cũng cao hơn. Glucan được tổng