Nghiên cứu bảo quản thanh long bằng chế phẩm sinh học nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


CHU THỊ THỦY


NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN THANH LONG BẰNG CHẾ PHẨM SINH
HỌC NANO CHITOSAN KẾT HỢP VỚI TINH DẦU NGHỆ




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC





Hà Nội – Năm 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


CHU THỊ THỦY

NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN THANH LONG BẰNG CHẾ PHẨM SINH
HỌC NANO CHITOSAN KẾT HỢP VỚI TINH DẦU NGHỆ

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. PHẠM VIỆT CƢỜNG



Hà Nội – Năm 2013
1

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT. 3
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ 4
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 5
MỞ ĐẦU 6
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN 8
1.1. Nano chitosan 8
1.1.1. Chitosan 8
1.1.2. Phương pháp điều chế nano chitosan từ chitosan. 9
1.1.3. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật của chitosan 12
1.1.4. Ứng dụng nano chitosan 13
1.2. Tinh dầu nghệ 15
1.2.1. Giới thiệu chung về nghệ 15
1.2.2. Thành phần hóa học 15
1.2.3. Hoạt tính sinh học của tinh dầu nghệ 18
1.3. Thanh Long 23
1.3.1. Thanh long và giá trị kinh tế 23
1.3.2. Vi sinh vật gây hỏng quả 26

1.3.3. Biện pháp bảo quản rau hoa quả tươi sau thu hoạch 28
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32
2.1. Nguyên vật liệu 32
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32
2 1.2. Hóa chất sử dụng 32
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 33
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 34
2

2.2.1. Phương pháp đo độ đục định lượng tế bào nấm men 34
2.2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc nấm men 35
2.2.3. Phương pháp tìm nồng độ diệt tối thiểu (MBC) của hỗn hợp nano chitosan
và tinh dầu nghệ cho nấm men 36
2.2.4. Phương pháp kiểm tra khả năng đối kháng nấm mốc của chế phẩm tinh dầu
nghệ và nano chitosan 37
2.2.5. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính đối kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ
và nano chitosan trên quả thanh long 38
2.2.6 Bảo quản thanh long trong điều kiện phòng thí nghiệm bằng NCS-TDN. 38
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40
3.1. Đánh giá khả năng đối kháng nấm men của chế phẩm nano chitosan và tinh dầu
nghệ in vitro 40
3.2. Đánh giá khả năng đối kháng nấm mốc của chế phẩm nano chitosan và tinh dầu
nghệ in vitro 43
3.3 Đánh giá khả năng đối kháng nấm của nano chitosan-tinh dầu nghệ in vivo trên
thanh long 46
3.4. Đánh giá khả năng bảo quản thanh long bằng chế phẩm nano chitosan và tinh
dầu nghệ 48
3.4.1. Bảo quản thanh long ở nhiệt độ phòng 48
3.4.2. Bảo quản thanh long ở nhiệt độ lạnh (10

± 2
o
C) 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 56






3

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT.
ĐC: Đối chứng.
Đ-d: đƣờng kính kháng khuẩn.
LDL: Low – density Lipoprotein.
MBC: Minimum bactericidal concentration.
MTL2: Cladosporium clasdosporioides de Vries.
MTL4: Cladosporium tenuisimum Cooke.
NCS – TDN: Nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ.
OD: Optical Density.
TL1: Rhodoturola sp.

4

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 1.1: Giá trị dinh dƣỡng trong 100g quả thanh long.
Bảng 2.1: Độ chuẩn Mc Farland ở bƣớc sóng 550nm.
Bảng 2.2: Sơ đồ thí nghiệm xác định tính đối kháng nấm men của NCS-TDN.
Bảng 3.1: Kết quả đo OD ở bƣớc sóng 550nm của mẫu TL1.
Bảng 3.2: Khả năng ức chế sinh trƣởng nấm men của NCS-TDN.
Bảng 3.3: Hoạt tính đối kháng nấm mốc của NCS-TDN.
Bảng 3.4: Khả năng ức chế nấm của NCS-TDN trên thanh long.
Bảng 3.5: Kết quả thanh long đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Bảng 3.6: Kết quả thanh long bảo quản lạnh 10±2
0
C.
Bảng 3.7: Kết quả phân tích hàm lƣợng dinh dƣỡng của thanh long sau khi bảo quản
lạnh 30 ngày.
Sơ đồ 2.1: Nghiên cứu khả năng bảo quản thanh long sau thu hoạch của chế phẩm
NCS-TDN.


5

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của chitosan đƣợc điều chế từ chitin.
Hình 1.2: Hình thái cây nghệ
Hình 1.3: Cấu trúc của các hợp chất curcumin trong tinh dầu nghệ.
Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất trong tinh dầu nghệ.
Hình 1.5: Vị trí và các cơ chế trong tế bào vi khuẩn đƣợc cho là điểm hoạt tính của tinh

dầu.
Hình 1.6: Các giống quả thanh long.
Hình 1.7: Cladosporium cladospotioides.
Hình 1.8: Cladosporium tenuisimum cooke.
Hình 1.9: Rhodoturola sp.
Hình 2.1: Pha loãng mẫu theo dãy thập phân.
Hình 2.2: Cấy trải mẫu vào môi trƣờng Hansen cứng trên đĩa peptri.
Hình 3.1: Đánh giá hoạt tính đối kháng nấm men TL1 của NCS-TDN.
Hình 3.2: Hoạt tính đối kháng của NCS-TDN đối với MTL2.
Hình 3.3: Thử hoạt tính kháng của NCS-TDN với MTL4.
Hình 3.4: Thanh long bị hỏng do nhiễm nấm.
Hình 3.5: Thanh long đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Hình 3.6: Thanh long bảo quản sau 7 ngày ở nhiệt độ phòng.
Hình 3.7: Thanh long đƣợc bảo quản sau 15 ngày ở nhiệt độ phòng.
Hình 3.8: Thanh long đƣợc bảo quản lạnh 10±2
o
C.
Hình 3.9: Thanh long đƣợc bảo lạnh sau 15 ngày.
Hình 3.10: Thanh long đƣợc bảo lạnh sau 30 ngày.
6

MỞ ĐẦU
Tinh dầu nghệ đƣợc biết đến nhƣ là một chất có khả năng chống oxy hóa và có
tính đối kháng vi sinh vật tốt, nhất là ức chế các vi sinh vật có khả năng gây hỏng quả.
Trong khi chitosan là một loại polymer carbohydrate tự nhiên đƣợc tạo ra bằng cách
deacetyl hóa chitin, có thể tìm thấy trong nhiều loài động vật giáp xác, côn trùng và
một vài loại nấm. Với nhiều tính năng nhƣ tính tƣơng thích sinh học, phân hủy sinh
học, bám dính màng và không độc hại nên hiện nay nó trở thành nguyên liệu cho nhiều
ứng dụng trong dƣợc sinh học và thực phẩm chức năng. Vì những tính chất ƣu việt của
nó mà trong những năm gần đây, chitosan đã đƣợc nghiên cứu sử dụng để tạo ra các

hạt nano chitosan. Cùng với tinh dầu nghệ, nano chitosan là chất có khả năng kháng
nấm và vi khuẩn mạnh.
Quả tƣơi và rau rất dễ bị hỏng và mẫn cảm đối với các bệnh sau thu hoạch, hạn
chế thời gian bảo quản và đƣa chúng ra thị trƣờng. Ngoài ra, hƣ hỏng sau thu hoạch
gây thất thu kinh tế đáng kể trên toàn thế giới. Nhƣ đã biết, các loại thuốc diệt nấm
tổng hợp đƣợc sử dụng từ lâu nhƣ phƣơng thức chính để kiểm soát các bệnh sau thu
hoạch. Nhƣng hiện ngƣời ta lo ngại về ảnh hƣởng của các chất này đến sức khỏe ngƣời
tiêu dùng cũng nhƣ sự xuất hiện của các nguồn bệnh kháng thuốc. Vì vậy cần có các
biện pháp thay thế để kiểm soát nguồn bệnh sau thu hoạch có hiệu quả, dƣ lƣợng thấp,
ít độc hoặc không độc đối với cơ thể không đích.
Trong sản phẩm rau hoa quả của Việt Nam, quả Thanh Long đang chiếm vị trí
quan trọng trong xuất khẩu, mang lại hiệu quả kinh tế cao. Vì vậy việc sử dụng các
chất hoạt tính sinh học tự nhiên để bảo quản quả Thanh Long không những có ý nghĩa
kinh tế, mà còn mở ra phƣơng pháp mới trong ngành bảo quản sau thu hoạch ở nƣớc ta.
7

Với đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu bảo quản Thanh long bằng chế phẩm sinh
học nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ ” sẽ đóng góp thêm một phƣơng pháp bảo
quản rau hoa quả an toàn và hiệu quả.
Mục tiêu của đề tài:
 Thử nghiệm in vitro chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ với vi sinh vật
gây hỏng quả Thanh Long để tìm nồng độ ức chế vi sinh vật tối thiểu MBC.
 Thử nghiệm chế phẩm nano chitosan và tinh dầu nghệ trên quả để kéo dài thời
gian bảo quản thanh long, đảm bảo thanh long còn tƣơi, không bị vi sinh vật làm
hỏng quả.
Nội dung nghiên cứu:
 Xác định hoạt tính đối kháng nấm của chế phẩm nano chitosan kết hợp với tinh
dầu nghệ.
 Nghiên cứu thăm dò ứng dụng nano chitosan kết hợp với tinh dầu nghệ trong
bảo quản quả thanh long.

8

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN
1.1. Nano chitosan
1.1.1. Chitosan
Chitosan, đƣợc phát hiện bởi Rouget năm 1859 [55], là một loại polymer
polysaccharide sinh học quan trọng. Về mặt hóa học, đó là một phân tử có trọng lƣợng
phân tử cao, polycationic gồm hai monosaccharide, N-acetyl-D-glucosamine và D-
glucosamine, liên kết với nhau bởi cầu nối β-(1 → 4) glycosidic (Hình 1.1). Hàm lƣợng
tƣơng đối của hai monosaccharide trong chitosan có thể khác nhau, mỗi mẫu ở các mức
độ khác nhau phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa (75-95%), khối lƣợng phân tử (50-
2.000 kDa), độ nhớt, giá trị pKa, v.v [27]. Do đó, chitosan không thể đƣợc định
nghĩa là một hợp chất duy nhất, nó chỉ đơn thuần là họ của các copolymer với các phân
số khác nhau của các đơn vị acetyl.

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của chitosan đƣợc điều chế từ chitin. Chitosan
liên kết (1→4) 2- amino-2-deoxy-β-D-glucan, đƣợc điều chế từ chitin qua quá trình
thủy phân bằng kiềm nhóm N-acetyl.
9

Chitosan chủ yếu đƣợc sản xuất từ quá trình deacetyl hóa chitin xảy ra ở môi
trƣờng kiềm: chitin sôi trong kiềm nồng độ cao vài giờ (40-45% natri hydroxit, 120°C,
1-3 h). Trong điều kiện đó N-deacetyl hóa xảy ra không hoàn toàn, chitosan đƣợc xem
nhƣ là một dẫn xuất một phần N-deacetyl hóa của chitin.

Chitosan cũng đƣợc tìm thấy trong tự nhiên, chẳng hạn nhƣ trong thành tế bào
của nấm thuộc lớp Zygomycetes [43], tảo xanh Chlorella sp., nấm men và động vật
nguyên sinh cũng nhƣ lớp biểu bì trong côn trùng [ 47]. Gần đây trong công nghệ lên
men cho thấy nấm (Aspergillus niger) có thể cung cấp một nguồn thay thế chitosan.
1.1.2. Phương pháp điê
̀
u chê
́
nano chitosan từ chitosan.
Công nghệ nano là một công nghệ rất quan trọng trong khoa học, chủ yếu là do
ứng dụng rộng rãi của nó trong một phạm vi rộng lớn bao gồm các ngành kỹ thuật, y
học, hóa học và sinh học. Việc sử dụng các biopolymer nhƣ polysaccharide trong công
nghệ nano ngày càng đƣợc quan tâm, là trọng tâm các nghiên cứu của các nhà khoa
học trên toàn thế giới.
Trong 30 năm qua, kỹ thuật điều chế nano chitosan đã đƣợc phát triển dựa trên
công nghệ chitosan vi hạt. Nano chitosan có thể đƣợc chế tạo bằng một vài phƣơng
pháp khác nhau. Trƣớc kia, ngƣời ta dùng sodium sulphate nhƣ chất để tủa. Năm 1994,
một số tác giả đã sử dụng glutaraldehyde nhƣ chất liên kết để liên kết chéo các nhóm
amino tự do của chitosan, sau đó nhũ tƣơng hóa (emulsifier), tạo hạt 5-fluorouracil (5-
FU) chitosan với kích thƣớc trung bình 0,8 ± 0,1µm [42]. Phƣơng pháp này hiện vẫn
đƣợc dùng. Nhìn chung, kỹ thuật chế tạo hạt nano chitosan đã đƣợc phát triển dựa trên
kỹ thuật vi hạt chitosan. Có ít nhất 4 phƣơng pháp: sự đông đặc ion hóa (ionotropic
gelation); vi nhũ tƣơng (microemulsion), khuếch tán dung môi nhũ tƣơng
(emulsification solvent diffusion) và tổ hợp đa điện phân (polyelectrolyte complex).
10

Hai phƣơng pháp thƣờng sử dụng là ionotropic gelation và tự lắp ráp polyelectrolyte
[50].
Phương pháp Ionotropic gelation
Nano chitosan chuẩn bị bằng kỹ thuật gel ionotropic lần đầu tiên đƣợc Calvo và

cộng sự báo cáo. Cơ chế tạo nanochitosan dựa trên tƣơng tác tĩnh điện giữa nhóm
amine của chitosan và nhóm tích điện âm của polyanion nhƣ tripolyphosphate. Phƣơng
pháp này đơn giản, nhẹ nhàng. Trƣớc tiên, chitosan có thể hòa tan trong axit axetic, có
hoặc không có chất ổn định, sau đó bổ sung anionic polyme. Khuấy ở nhiệt độ phòng
và các hạt nano đƣợc tạo thành một cách tự phát. Có thể thay đổi kích thƣớc và điện
tích bề mặt của hạt bằng cách thay đổi tỉ lệ chitosan và chất ổn định [7].
Phương pháp Microemulsion
Nano chitosan đƣợc điều chế bằng kỹ thuật microemulsion lần đầu tiên đƣợc
phát triển bởi Maitra và cộng sự [7]. Kỹ thuật này dựa trên sự hình thành của nano
chitosan bên trong giọt micellar đảo ngƣợc và sau đó liên kết ngang qua
glutaraldehyde. Trong phƣơng pháp này, một chất hoạt động bề mặt đƣợc hòa tan trong
N-hexane, sau đó, chitosan trong dung dịch axetic và glutaraldehyde đƣợc thêm vào
chất có hoạt tính bề mặt / hỗn hợp hexane, khuấy liên tục ở nhiệt độ phòng. Hạt nano
đƣợc hình thành trong sự hiện diện của chất hoạt động bề mặt. Hệ thống này đƣợc
khuấy qua đêm để hoàn thành liên kết ngang, và nhóm amin của chitosan kết hợp với
glutaraldehyde. Các dung môi hữu cơ đƣợc lấy ra bằng cách bay hơi dƣới áp suất thấp.
Sản lƣợng thu đƣợc là nano chitosan liên kết ngang và chất hoạt động bề mặt dƣ thừa.
Chất hoạt động bề mặt dƣ thừa đƣợc lấy ra bằng cách kết tủa với CaCl
2
và sau đó đƣợc
loại bỏ bằng ly tâm. Cuối cùng các hạt nano đƣợc thẩm tách và lyophilyzation. Kỹ
thuật này cung cấp hạt kích thƣớc nhỏ hơn 100 nm và kích thƣớc các hạt có thể đƣợc
11

kiểm soát bằng cách thay đổi lƣợng glutaraldehyde từ đó làm thay đổi mức độ liên kết
ngang. Tuy nhiên, phƣơng pháp có một số nhƣợc điểm nhƣ việc sử dụng các dung môi
hữu cơ, quá trình chuẩn bị tốn thời gian, và sự phức tạp trong bƣớc rửa.
Phương pháp khuếch tán dung môi nhũ tương hóa
El-Shabouri báo cáo nano chitosan đƣợc điều chế bằng phƣơng pháp khuếch
tán dung môi nhũ tƣơng, (Ban đầu đƣợc phát triển bởi Niwa và cộng sự sử dụng

PLGA) [7]. Phƣơng pháp này đƣợc dựa trên một phần sự trộn lẫn của dung môi hữu cơ
bằng nƣớc. Nhũ tƣơng thu đƣợc sau khi trộn chất hữu cơ vào dung dịch chitosan có
chứa một chất ổn định (poloxamer) khuấy cơ, tiếp theo là đồng nhất áp suất cao. Nhũ
tƣơng này sau đó đƣợc pha loãng với một số lƣợng lớn nƣớc để khắc phục sự trộn lẫn
dung môi hữu cơ trong nƣớc. Sự kết tủa polymer xuất hiện nhƣ là kết quả của sự
khuếch tán dung môi hữu cơ vào trong nƣớc, dẫn đến hình thành của các hạt nano.
Phƣơng pháp này phù hợp cho các loại thuốc kỵ nƣớc và cho thấy tỷ lệ ngậm thuốc
cao. Những nhƣợc điểm chính của phƣơng pháp này bao gồm điều kiện xử lý khắc
nghiệt (ví dụ, việc sử dụng các dung môi hữu cơ) và lực cắt cao đƣợc sử dụng khi điều
chế các hạt nano.
Phương pháp polyelectrolyte complex (PEC)
Màng polyelectrolyte hoặc tập hợp nhóm polyelectrolyte là một thuật ngữ để mô
tả màng đƣợc hình thành bằng cách tự lắp ráp của polyme mang cation và DNA
plasmid. Cơ chế của PEC hình thành liên quan đến việc trung hòa điện tích giữa cation
polymer và DNA dẫn phá vỡ phân tử ƣa nƣớc. Một số polyme cation (tức là gelatin,
polyethylenimine) cũng có tính chất này. Nói chung, kỹ thuật này cung cấp phƣơng
pháp chuẩn bị đơn giản. Các hạt nano đƣợc hình thành một cách tự nhiên sau khi bổ
12

sung các DNA vào chitosan hòa tan trong dung dịch axit axetic, theo khuấy cơ học ở
nhiệt độ phòng. Kích thƣớc phức hợp có thể đƣợc thay đổi từ 50 nm đến 700 nm. [7]
1.1.3. Hoạt tính đối kháng vi sinh vật của chitosan
Khả năng đối kháng vi sinh vật của chitosan đƣợc sử dụng rộng rãi, tuy nhiên,
cơ chế đối kháng vi sinh vật chính xác của nó cho đến nay vẫn chƣa đƣợc xác định rõ
ràng.
Một vài cơ chế tác động kháng khuẩn của chitosan đã đƣợc đƣa ra: (i) tạo phức
với các nguyên tố vết hoặc các chất dinh dƣỡng thiết yếu, nhƣ vậy ức chế sinh trƣởng
của vi khuẩn; (ii) có thể tƣơng tác với các nhóm anion trên bề mặt tế bào và tạo ra các
phức hợp điện phân với các hợp chất trên bề mặt vi khuẩn, tạo ra một lớp không thấm
quanh tế bào, ngăn cản sự vận chuyển của các chất hòa tan cần thiết vào trong tế bào.

Kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử của chế phẩm chitosan ức chế vi sinh vật cho
thấy, vị trí hoạt động của nó là ở trên bề mặt tế bào vi sinh vật. Các chủng Candida
albicans tiếp xúc với chitosan hoặc các dẫn xuất của chitosan dƣới kính hiển vi điện tử
thấy tổn thƣơng tế bào mức độ khác nhau [37].
Cơ chế đối kháng vi sinh vật của chitosan đƣợc cho là do cation của chitosan tƣơng tác
và làm gián đoạn màng tế bào. Có giả định cho rằng bản chất polycationic của
chitosan, tích điện dƣơng do mang nhóm – của glucosamine, có thể là một yếu tố
cơ bản góp phần tƣơng tác với các thành phần tích điện âm trên màng của nhiều loại
nấm và vi khuẩn, gây ra thay đổi bề mặt tế bào, rò rỉ các chất trong tế bào, cuối cùng
dẫn đến suy giảm các hoạt động quan trọng của vi sinh vật [19].
Chitosan đƣợc chứng minh có hoạt tính đối kháng nấm nhƣ Aspergillus niger,
Alternaria alternata, Rhizopus oryzae, Phomopsis asparagi, và Rhizopus stolonifer. Có
13

3 cơ chế đƣợc đƣa ra cho các cách ức chế của chitosan. (i) màng plasma của nấm là
đích chính của chitosan. Điện tích dƣơng của chitosan tƣơng tác với các thành phần
phospholipid tích điện âm của màng nấm, điều này làm tăng tính thấm của màng làm
cho các thành phần trong tế bào bị thoát ra, dẫn đến tế bào bị chết; (ii) chitosan hoạt
động nhƣ một chất kẹp (chelating) bằng cách gắn với các nguyên tố vết, làm cho nấm
không thể sử dụng các chất dinh dƣỡng thiết yếu để sinh trƣởng bình thƣờng; và (iii)
chitosan có thể thâm nhập vào màng tế bào và gắn với DNA, điều này sẽ ức chế tổng
hợp mRNA và nhƣ vậy ảnh hƣởng đến việc tạo ra các protein và enzyme cần thiết. Mặt
khác, một số báo cáo cho rằng còn các cơ chế hoạt động khác, nhƣ liên kết với nƣớc,
làm bất hoạt enzyme, chọn lọc chelation vi lƣợng khoáng cần thiết cho các enzyme của
vi khuẩn, có thể sáng tỏ cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan [33].
Young và cộng sự [45] cho rằng chitosan làm cho ion Ca
2+
đƣợc giải phóng từ
phức tạo ổn định màng tế bào của Glycine max, kết quả làm mất ổn định của màng và
gây rò rỉ các thành phần tế bào. Tokura và cộng sự [52], đã quan sát thấy chitosan

(MW = 9300) xếp chồng lên nhau trên thành tế bào và ức chế sự tăng trƣởng của vi
khuẩn E. coli. Họ cho rằng hoạt tính kháng khuẩn có liên quan đến việc kìm hãm các
hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn bằng cách ngăn chặn cung cấp chất dinh dƣỡng
qua màng tế bào [52].
Rõ ràng, các cơ chế hoạt động không loại trừ lẫn nhau, kể từ lúc chitosan ức chế
hoạt động của vi sinh vật, và cuối cùng có thể dẫn đến một quá trình giết hại.
1.1.4. Ứng dụng nano chitosan
Các hạt nano chitosan chủ yếu đƣợc ứng dụng trong y học nhƣ chất mang và
phân phối thuốc. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu tạo hạt nano trên cơ sở
polysacarit, đặc biệt là chitosan. Nói chung, những hạt nano này mới chỉ đƣợc khảo sát
về tính chất hóa lý và khả năng mang thuốc, đƣợc ứng dụng trong sinh y, cụ thể là ứng
14

dụng dẫn thuốc còn hầu nhƣ chƣa đƣợc nghiên cứu cho những ứng dụng khác (ngoại
trừ nghiên cứu về axit glutamic ứng dụng cho mục đích làm chất mang thuốc paclitaxel
củaViện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) [3].
Trên thế giới đã có nhiều công bố ứng dụng hạt nano trong y học. Hạt có kích cỡ
nano có thể đƣợc tiêm tĩnh mạch vì đƣờng kính của mao mạch máu là khoảng 4 nm.
Các hạt có đƣờng kính lớn hơn 100 nm nhanh chóng đƣợc hấp thụ bởi hệ thống lƣới
nội mô (RES) trong gan, lá lách, phổi và xƣơng tủy, trong khi các hạt có kích cỡ nhỏ
hơn có xu hƣớng lƣu thông kéo dài một thời gian. Tạo ra hạt nano với điện tích bề mặt
ƣa nƣớc nhƣng trung lập là một phƣơng pháp khả thi để giảm đại thực bào và do đó
nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc. Thuốc hứa hẹn nhất đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi
là những chất chống ung thƣ. Sau khi tiêm tĩnh mạch, nhiều hạt nano chitosan tích tụ
trong một số khối u. Nano chitosan kìm hãm sự phát triển của khối u và nâng cao tỷ lệ
sống của chuột có khối u sau khi đƣợc điều trị [6]. Ngoài ra, hạt nano chitosan có kích
thƣớc nhỏ hơn 100 nm đƣợc dùng nhƣ thuốc kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm và
thuốc chống ký sinh trùng [6].
Có giả thuyết cho rằng các hạt nano có thể bảo vệ thuốc không bị phân giải bởi
enzyme trong đƣờng tiêu hóa. Pan và cộng sự báo cáo rằng tác dụng hạ đƣờng huyết

đã đƣợc quan sát ở các con chuột mắc bệnh tiểu đƣờng sau khi uống các hạt nano
chitosan [7].
Chitosan là vector chuyển gen hứa hẹn lần đầu tiên đƣợc đề xuất bởi Mumper
[17]. Chitosan đƣợc chứng minh có hiệu quả trong chuyển gen in vitro. Hạt nano
thƣờng thể hiện tác dụng bổ trợ đáng kể cho vắc-xin. Kích thƣớc siêu nhỏ của hạt nano
cho phép chúng đƣợc hấp thụ bởi các tế bào M, trong mô bạch huyết niêm mạc , kích
hoạt các vị trí của phản ứng miễn dịch mạnh mẽ [35].
15

1.2. Tinh dầu nghệ
1.2.1. Giới thiệu chung về nghệ
Cây nghệ thuộc họ Zingiberaceae, chi Curcuma, loài Longa. Tên khoa học của
cây nghệ là: Curcuma longa Linaeus (C. longa L.).

Hình 1.2: Hình thái cây nghệ
Nghê
̣
đƣợc trồng ở khu vực ấm áp và có mƣa nhiều trên thế giới nhƣ Trung
Quốc, Ấn Độ, In-đô-nê-xi-a. Tại Ấn Độ, nó đƣợc phổ biến và đƣợc gọi là Haldi (Tiếng
Hin-ddi). Tại Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a và Ấn Độ, nghệ đã đƣợc nghiên cứu do tầm
quan trọng về kinh tế của nó. Thân rễ của nó là thuôn dài, hình trứng và thƣờng phân
nhánh ngắn [20].
1.2.2. Thành phần hóa học
Thành phần trong nghệ gồm: protein (6,3%), chất béo (5,1%), khoáng chất
(3,5%), carbohydrates (69,4%) và độ ẩm (13,1%). Phenolic diketone, curcumin
(diferuloylmethane) (3 - 4%) quy định màu vàng của nghệ, và bao gồm curcumin I
(94%), chất curcumin II (6%) và chất curcumin III (0,3%) (Hình 1.3). Phenolic
16

diketones demethoxycurcumin và bis-demethoxycurcumin cũng đã đƣợc phân lập từ

thân rễ Curcuma longa. Sự có mặt của tumerone (a, b), curdione, curzerenone, mono-
và di-demethoxycurcumin đã đƣợc tìm thấy trong thân rễ. Tinh dầu (5,8%) thu đƣợc
bằng cách chƣng cất hơi nƣớc phần thân rễ có chứa thành phần phellandrene(1%),
sabinene (0,6%), cineol (1%), borneol (0,5%), zingiberene (25%) và sesquiterpines
(53% ) [10].

Hình 1.3: Cấu trúc của các hợp chất curcumin trong tinh dầu nghệ
Kelkar và Sanjeev Rao [32] báo cáo rằng tinh dầu nghệ đƣợc điều chế bằng
phƣơng pháp chƣng cất hơi nƣớc dễ bay hơi chủ yếu là một hỗn hợp của sesquiterpene
xeton và rƣợu. Malingre [38] báo cáo thành phần chiết của C.longa gồm p-cymene, b-
sesquiphellandrene, turmerone, ar-turmerone và rƣợu sesquiterpene (Hình 1.4).
17


Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất trong tinh dầu nghệ
Chen và cộng sự [11] so sánh thành phần của các loại dầu dễ bay hơi của thân rễ
và củ nghệ nguồn gốc Trung Quốc C. Longa gồm: Turmerone (24%), ar-turmerone
(8,4%) và curdione (11,58%) (Hình 1.4) là các hợp chất quan trọng trong cả hai loại
dầu. Tuy nhiên, ar-curcumene đã đƣợc tìm thấy trong dầu thân rễ là 12,2%, nhƣng nó
đã không đƣợc báo cáo trong dầu củ. Gopalan và Ratnambal [21] so sánh các thành
18

phần chính của dầu nghệ sản xuất từ giống cây trồng khác nhau. Có sự thay đổi đáng
kể trong các thành phần chính phụ thuộc vào giống và nguồn gốc sản xuất. Dầu lá nghệ
Việt Nam chứa chủ yếu là α-phellandrene (24,5%), 1,8-cineole (15,9%), p-cymene
(13,2%) và β-pinene (8,9%). Cooray và cộng sự [13] cho biết các thành phần chính của
dầu thân rễ đƣợc sản xuất từ một giống nghệ duy nhất đƣợc trồng ở Sri Lanka, và nó đã
đƣợc báo cáo rằng ar-turmerone (24,7-48,9%) và turmerone (20-39%) là những hợp
chất chính. McCarron và cộng sự [36] đã sử dụng phƣơng pháp phân tích GC-MS để so
sánh hợp chất monoterpene hydrocarbon của các loại dầu sản xuất từ lá và rễ của C.

longa tƣơi, phát hiện ra rằng hydrocarbon monoterpene của lá và các loại dầu thân rễ
tƣơi tƣơng ứng là 92,9 và 16,3%. Dầu thân rễ của C. longa nguồn gốc Trung Quốc
đƣợc phân tích bằng GC-MS [54]. Dầu này đƣợc cho là chứa 17 thành phần hóa học,
trong đó turmerone (24%), ar-turmerone (18%) và germacrone (11%) là các hợp chất
chính.
1.2.3. Hoạt tính sinh học của tinh dầu nghệ
Hoạt tính chống viêm: Tinh dầu của Curcuma longa có hiệu quả chống viêm và
anti-hyaluronidase [40]. Các tác giả cho rằng hiệu quả chống oxy hóa của dầu đƣợc
chứng minh bằng sự ức chế khả năng khuếch tán của hyaluronidase enzyme. Dầu từ lá
Curcuma longa cũng cho thấy hoạt tính chống viêm ở chuột bạch thực nghiệm. Dịch
chiết thân rễ làm giảm sự phát triển của u hạt và không độc đối với động vật.
Hoạt tính chống oxy hóa: Scatezzini và cộng sự (2000) đã nghiên cứu hoạt tính
chống oxy hóa của một số thực vật sử dụng trong y học cổ truyền của Ấn Độ. Nghiên
cứu này chỉ ra rằng cây nghệ đƣợc sử dụng nhiều trong quá trình chuẩn bị liệu pháp
Ayurvedic cách đây hàng ngàn năm [49]. Lee (2006) phát hiện ra thành phần hủy tiểu
cầu ar-turmerone có nguồn gốc từ thân rễ của cây nghệ Curcuma longa L., ở nồng độ
ức chế 50% (IC
50
) ar-turmerone ức chế sự tạo khối của tiểu huyết cầu do collagen cảm
19

ứng (IC
50
, 14,4 μM) và axit arachidonic (IC
50
43,6 μM) [34]. Xác định đƣợc hoạt tính
chống oxy hóa của dịch chiết methanol của thân rễ tƣơi và khô từ 4 dòng nghệ
(Curcuma longa L.) nuôi cấy in vitro [14]. Đã xác định hoạt tính chống oxy hóa của
dịch chiết dầu nghệ đen trồng ở Việt Nam [5].
Tác dụng giảm mỡ: khi sử dụng 1mg dịch chiết nghệ trong 15 ngày, lƣợng lipid

giảm rõ rệt: lƣợng cholesterol tổng, triglyceride và LDL giảm từ 55-40% ở động vật thí
nghiệm. Ngoài ra, dịch chiết này còn làm giảm nguy cơ xơ cứng động mạch. Các tác
giả cho rằng uống dịch chiết nghệ ức chế oxy hóa LDL và có hiệu quả giảm cholesterol
ở thỏ thí nghiệm [29].
Chống dị ứng và làm lành vết thương: dịch chiết thô của thân rễ nghệ có hoạt
tính ức chế cycloxygenase (COX) tốt trong thử nghiệm sinh học in vitro.
Antivenom activity: Phân đoạn có chứa ar-turmerone chiết từ C. longa trung hòa
hiệu quả gây chết và hoạt tính xuất huyết của nọc rắn ở chuột. Trong nghiên cứu này,
ar-turmerone có khả năng thủ tiêu hoạt tính xuất huyết của nọc độc Bothrops và
khoảng 70% hiệu quả gây chết của nọc độc Crotalus. Những nghiên cứu miễn dịch học
chứng minh rằng ar-turmerone ức chế sự tăng sinh và hoạt tính giết tự nhiên của
lyphocytes ngƣời [18;29]
Hoạt tính kháng khuẩn: Tinh dầu nghệ đƣợc thử với các chủng Staphylococcus
albus, Staphylococcus aureus và Bacillus typhosus, kết quả cho thấy sinh trƣởng của
Staphylococcus albus, Staphylococcus aureus bị ức chế ở các nồng độ khác nhau. Đối
với vi khuẩn đƣờng ruột, sinh trƣởng của lactobacili bị ức chế bởi tinh dầu nghệ ở nồng
độ 4,5-90μl/100 ml, Dịch chiết alcohol cũng có hiệu quả ức chế (10–200 mg/ml) nhƣng
không bằng tinh dầu. Một số tác giả đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của dầu
nghệ. Jayaprakasha và cs. (2002) báo cáo hoạt tính kháng khuẩn của dầu nghệ đƣợc
20

tách từ dịch mẹ sau khi đã tách lấy curcumin [30]. Dầu nghệ đƣợc phân đoạn bằng
chƣng cất chân không thu đƣợc 2 phân đoạn, Các phân đoạn này đƣợc thử với một số
chủng nấm nhƣ Aspergillus flavus, A. parasiticus, Fusarium moniliforme và
Penicillium digitatum bằng phƣơng pháp nảy mầm bào tử. Phân đoạn nhận đƣợc dƣới
chân không ở 110-120
0
C có hiệu quả hơn. Kết quả phân tích GC/MS cho thấy trong
phân đoạn này chủ yếu là turmerone thơm, turmerone và curlone cùng với các hợp chất
oxy hóa khác [8;51]. Theo Dhingra và cs. (2007), tinh dầu nghệ (Curcuma longa L, )

độc đối với 7 loại nấm hại nông sản trong kho. Phụ thuộc vào loại nấm, sự ức chế phát
triển của chúng dao động từ 36%-77%, Aspergillus flavus, Fusarium semitectum,
Colletotrichum gloeosporioides và C. musae là những loại mẫn cảm nhất, bị ức chế sự
phát triển trên 70%, ar-turmerone chiếm 87% của hợp chất dầu kháng nấm và ar-
turmerone tinh sạch có hoạt tính kháng nấm tƣơng tự nhƣ dầu thô [16]. Behura và cs.
thấy trong 5 nguồn bệnh nấm lúa đƣợc xử lý với tinh dầu nghệ, Rhizotonia solani mẫn
cảm nhất và F. moniliforme kháng mạnh nhất với sự phát triển bị giảm tƣơng ứng 81%
và 2,5%, [9]. Tƣơng tự, Saju và cs. báo cáo ở nồng độ 1%-5% tinh dầu nghệ, sự phát
triển của C. gloeosporioides, Sphaceloma caradmomi và Pestdlotiopsis palmarum hoàn
toàn bị ức chế, trong khi đó F.solani chỉ bị ức chế 79% [46]. Phan Minh Giang, Phan
Tống Sơn (2000) [44] đã tách sesquiterpenoids trong dung môi n-hexan của củ nghệ
Curcuma cochinchinensis gagnep đƣợc 4 phân đoạn curdione (1), curcumol (2),
isocurcumenol (3) và curcumenol (4). Các tác giả đã nghiên cứu hoạt tính kháng vi
sinh vật của các sesquiterpenoid này. Các hợp chất 1, 2 và 3 trộn với nhau theo tỉ lệ
2:1: 4 có khả năng ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus niger,
Fusarium oxysporum khác nhau. Nồng độ ức chế tối thiểu của hợp chất 1 lớn hơn 300
μg/ml đối với Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicans, Aspergillus
niger, Candida albicans mẫn cảm với hợp chất 2+3 và 4 với nồng độ ức chế tối thiểu
là 50 μg/ml [44].
21

Các tác dụng khác: chống ung thƣ, kháng virus, chống nhiễm trùng, chữa lành
vết thƣơng và loại độc của ar-turmerone tách chiết từ Curcuma longa đƣợc chứng minh
[18]. Ngoài ra nó còn có tác dụng chống nôn, thuốc đánh rắm và chống co thắt và làm
giảm táo bón.
Phương thức kháng khuẩn của tinh dầu
Mặc dù có rất nhiều nghiên cứu về thành phần và hoạt tính kháng khuẩn của
tinh dầu thực vật, nhƣng cơ chế hoạt tính của chúng chƣa đƣợc nghiên cứu tỉ mỉ. Do
tinh dầu có rất nhiều nhóm các hợp chất hóa học khác nhau, nên có lẽ hoạt tính kháng

khuẩn của chúng không do một cơ chế đặc biệt nào mà có một vài đích trong tế bào
(hình 1.5).







Hình 1.5: Vị trí và các cơ chế trong tế bào vi khuẩn đƣợc cho là điểm hoạt
tính của tinh dầu: phân hủy thành tế bào; làm hƣ hại màng tế bào; làm hỏng protein
màng; các thành phần tế bào bị rò rỉ; tủa tế bào chất; và lực đẩy proton bị suy yếu [48].
22

Một đặc điểm quan trọng của tinh dầu là tính kỵ nƣớc, cho phép chúng phân cắt
lipid của màng tế bào vi khuẩn và mitochondria, làm xáo trộn cấu trúc và làm chúng dễ
bị thẩm thấu hơn. Mặc dù một số lƣợng chất nhất định nào đó bị mất đi nhƣng tế bào
vẫn không bị chết, nhƣng khi mất nhiều hoặc các phân tử quan trọng và ion bị mất đi tế
bào sẽ bị chết.
Nhìn chung, tinh dầu chứa các hợp chất phenol cao nhƣ carvacrol, eugenol và
thymol, có hoạt tính kháng nguồn bệnh thực phẩm cao. Rất có lý cho rằng cơ chế hoạt
tính của chúng tƣơng tự nhƣ các phenolics khác đó là làm xáo trộn màng tế bào chất,
gián đoạn lực đẩy proton, dòng electron, vận chuyển chủ động và làm tủa các chất
trong tế bào.
Cấu trúc hóa học của các thành phần trong từng loại tinh dầu tác động đến cơ
chế hoạt động và hoạt tính của chúng. Tầm quan trọng của sự có mặt của các nhóm
hydroxyl trong các hợp chất phenolic đã đƣợc chứng minh. Các thành phần của tinh
dầu cũng tác động lên protein gắn trong màng tế bào chất. Các enzyme nhƣ ATPases
đƣợc biết nằm trong màng tế bào chất và đƣợc bao quanh bởi các phân tử lipid. Các
phân tử lipophilic hydrocacbon có thể tích tụ trong lớp lipid kép và làm hỏng tƣơng tác

lipid-protein; ngoài ra có thể có sự tƣơng tác trực tiếp của các hợp chất lipophilic với
phần kỵ nƣớc của protein. Một vài tinh dầu kích thích sinh trƣởng của pseudomycelia
(một loạt tế bào gắn với nhau do sự phân tách không hoàn thiện của các tế bào mới tạo
thành) của một số nấm men. Điều đó có thể biểu thị tác động của tinh dầu lên enzyme
tham gia vào quá trình điều hòa năng lƣợng hoặc tổng hợp các thành phần cấu trúc
quan trọng. Tinh dầu dã hƣơng và các thành phần của nó đƣợc chứng minh ức chế axit
amino decarboxylases trong Enterobacter aerogenes. Cơ chế này đƣợc cho là do gắn
với protein.
23

Gần đây các nghiên cứu cho thấy điểm hoạt tính của các hydrocacbon vòng,
gồm cả terpene hydrocacbon là màng tế bào. β-pinene làm rò rỉ K
+
, H
+
và ảnh hƣởng
đến hô hấp của nấm men. Tƣơng tự, cyclohexane, limonene và β-pinene cũng ức chế
hô hấp và các quá trình phụ thuộc năng lƣợng khác liên quan đến màng tế bào
S.cerevisiae. Các hydrocacbon terpenes nhƣ α-pinene, β -pinene, γ-terpinene và
limonene đƣợc tìm thấy ảnh hƣởng tới các đặc điểm cấu trúc và chức năng của màng
nhân tạo, chúng làm cho màng thấm tốt hơn và phồng lên. Điều này ức chế các enzyme
hô hấp, dẫn đến pH gradient và điện thế bị trục trặc, mà đây là những yếu tố then chốt
cho hệ năng lƣợng trong tế bào. Phần lớn các terpenoid ức chế quá trình hấp thu oxy và
phosphoryl hóa của vi sinh vật [48;23].
1.3. Thanh Long
1.3.1. Thanh long và giá trị kinh tế
Thanh long một loài cây đƣợc trồng chủ yếu để lấy quả và cũng là tên của một
vài chi của họ xƣơng rồng. Thanh Long là loài thực vật bản địa tại Mexico, các
nƣớc Trung Mỹ và Nam Mỹ. Hiện nay, loài cây này cũng đƣợc trồng ở các nƣớc trong
khu vực Đông Nam Á nhƣ Việt Nam, Malaysia, Thái Lan, Philippines, Indonesia (đặc

biệt là ở miền tây đảo Java); miền nam Trung Quốc, Đài Loan và một số khu vực khác.
Quả của thanh long có ba loại, tất cả đều có vỏ giống nhƣ da và có một chút lá.
Chúng có tên gọi khoa học nhƣ sau:
 Hylocereus undatus thuộc chi Hylocereus, ruột trắng với vỏ hồng hay đỏ.
 Hylocereus polyrhizus thuộc chi Hylocereus, ruột đỏ với vỏ hồng hay đỏ.
 Hylocereus megalanthus, trƣớc đây đƣợc coi là thuộc chi Selenicereus, ruột trắng
với vỏ vàng.