Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng L

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Phan Lạc Dũng


NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG
DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS
SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA
HOÀNG LIÊN


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


Hà Nội - Năm 2013


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Phan Lạc Dũng

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ TIỀM NĂNG ỨNG
DỤNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS
SUBSP. PLANTARUM SP 1901 PHÂN LẬP TẠI RỪNG QUỐC GIA
HOÀNG LIÊN

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. TRỊNH THÀNH TRUNG

Hà Nội - Năm 2013


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 3
1.1.1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens 3
1.1.2. Lịch sử phát hiện 4
1.1.3. Phân loại 5
1.1.4. Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên 5
1.2. ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 5
1.2.1. Sản xuất enzyme công nghiệp 5
1.2.2. Sản xuất chất kháng sinh 6
1.2.3. Sản xuất phân bón vi sinh 6
1.2.4. Sản xuất chế phẩm probiotics 7
1.3. MỘT SỐ ENZYME CÔNG NGHIỆP QUAN TRỌNG 7
1.3.1. Xylanase 7
1.3.2. α-amylase 10
1.3.3. Protease 13
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1. THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐÃ SỬ DỤNG 15
2.2. NGUYÊN LIỆU 15
2.2.1. Chủng vi sinh vật 15
2.2.2. Môi trƣờng 15
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.3.1. Nuôi cấy giống khởi động 16
2.3.2. Phân tích trình tự đa gen 16
2.3.3. Đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn nghiên cứu 18
2.3.4. Lựa chọn môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp cho khả năng
sinh enzyme ngoại bào cao 20


2.3.5. Phƣơng pháp xác định protein 21
2.3.6. Phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme ngoại bào 21
2.3.7. Tách chiết và tinh sạch enzyme ngoại bào 25
2.3.8. Xác định đặc tính enzyme ngoại bào 27
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
3.1. LỰA CHỌN CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU 28
3.1.1. Tuyển chọn chủng 28
3.1.2. Cây phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA 28
3.1.3. Cây phân loại dựa trên trình tự đa gen 29
3.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG SP 1901 30
3.2.1. Đặc điểm hình thái 30
3.2.2. Đặc điểm sinh học của chủng SP 1901 31
3.3. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME NGOẠI BÀO 38
3.3.1. Lựa chọn môi trƣờng và thời gian nuôi cấy thích hợp 38
3.3.2. Tinh sạch enzyme ngoại bào bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion 41
3.3.3. Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel 43
3.3.4. Xác định trọng lƣợng phân tử xylanase bằng điện di SDS-PAGE 44
3.3.5. Hiệu quả tinh sạch xylanase từ chủng SP 1901 45

3.4. ĐẶC TÍNH ENZYME 46
3.4.1. Nhiệt độ tối ƣu 46
3.4.2. Khả năng bền nhiệt 47
3.4.3. pH tối ƣu 48
3.4.4. Khả năng bền axít 49
3.4.5. Khả năng bền ion kim loại và hóa chất 50
3.4.6. Sắc ký lớp mỏng 51
KẾT LUẬN 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54



DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng của chủng SP 1901 ở các nhiệt độ khác nhau.
33
Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá các loại đƣờng………………………………….
34
Bảng 3.3. Khả năng lên men các loại đƣờng…………………………………
35
Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào theo phƣơng pháp sử dụng kit
API ZYM………………………………….……………………………………
37
Bảng 3.5. Tỷ lệ giữa hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) của
chủng SP 1901………………………………….………………………………
40
Bảng 3.6. Hoạt độ của xylanase sau các bƣớc tinh sạch………………………
46

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống
enzyme xylanolytic………………………………….…………………………
8
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin…………………….
11
Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide………

13
Hình 2.1. Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang BSA……………………………….
21
Hình 2.2. Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang xylose……………………………
22
Hình 2.3. Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang glucose…………………………….
23
Hình 2.4. Đồ thị đƣờng chuẩn theo thang L-tyrosine…………………………
24
Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của 37 chủng vi khuẩn Bacillus phân lập
tại rừng Quốc gia Hoàng Liên và 9 loài thuộc nhóm vi khuẩn B. subtilis dựa
trên phân tích trình tự 16S rDNA………………………………….…………
28
Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của các loài vi khuẩn thuộc nhóm B.
subtilis………………………………….……………………………………
30
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc chủng SP 1901 (a), hình thái tế bào khi nhuộm
gram (b) và soi nổi (c) ………………………………….…………………….
31
Hình 3.4. pH sinh trƣởng tối ƣu (a). Khả năng chịu muối NaCl (b). Khả năng
chịu dịch dạ dày (c). Khả năng chịu muối mật (d) ……………………………
31
Hình 3.5. Khả năng sinh chất kích thích sinh trƣởng IAA của chủng SP 1901
sau 24, 48 và 72 giờ………………………………….………………………
32
Hình 3.6. Khả năng sinh IAA làm cho dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ
(a). Ảnh hƣởng của chủng SP 1901 lên khả năng sinh trƣởng của cây ngô sau
10 ngày trồng (b) ………………………………….…………………………
32
Hình 3.7. Vòng phân giải cơ chất của các enzyme ngoại bào. Amylase (a).

Cellulase (b). Phytase (c). Protease (d). Xylanase (e) ………………………
36
Hình 3.8. Phản ứng thử nghiệm khả năng sinh enzyme trên thanh thử API
ZYM………………………………….………………………………………
37
Hình 3.9. Khả năng sinh kháng sinh của chủng SP 1901 theo phƣơng pháp
khuếch tán trên thạch. Đĩa thạch cấy sẵn vi khuẩn E. coli (a). Vi khuẩn
Shigella sp. (b). Vi khuẩn S. aureus (c) ………………………………………

38
Hình 3.10. Khả năng sinh trƣởng trên các môi trƣờng khác nhau (a, b) và hoạt
độ xylanase ngoại bào (c, d) của chủng SP 1901 khi nuôi cấy trên 10 loại môi
trƣờng ở các giờ khác nhau………………………………….……………….
39


Hình 3.11. Hoạt độ xylanase (U/ml) và nồng độ protein (mg/ml) khi nuôi cấy
trên môi trƣờng có bổ sung CMC và glucose và môi trƣờng NA dịch thể tại
các giờ khác nhau………………………………….…………………………
39
Hình 3.12. Hoạt tính amylase và protease của chủng SP 1901 trên môi trƣờng
có bổ sung CMC và glucose và môi trƣờng NA dịch thể……………………
40
Hình 3.13. Hoạt độ xylanase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký
trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….……………
41
Hình 3.14. Hoạt độ amylase và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký
trao đổi ion gel DEAE Sepharose………………………………….…………
42
Hình 3.15. Hoạt độ protease và nồng độ protein ở các phân đoạn trong sắc ký

trao đổi ion gel CM Sepharose………………………………….……………
42
Hình 3.16. Hoạt độ xylanase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………
43
Hình 3.17. Hoạt độ amylase ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………
44
Hình 3.18. Hoạt độ protease ở các phân đoạn trong sắc ký lọc gel…………
44
Hình 3.19. Điện di SDS-PAGE 2 mẫu xyl 29 và xyl 36……………………
45
Hình 3.20. Nhiệt độ hoạt động tối ƣu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease
từ chủng SP 1901……………………………………………………………
46
Hình 3.21. Khả năng bền nhiệt của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ
chủng SP 1901………………………………………………………………
47
Hình 3.22. pH hoạt động tối ƣu của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ
chủng SP 1901………………………………………………………………
48
Hình 3.23. Khả năng bền axít của xyl 29, xyl 36, amylase và protease từ
chủng SP 1901………………………………………………………………
49
Hình 3.24. Khả năng bền ion kim loại và hóa chất của xyl 29, xyl 36, amylase
và protease từ chủng SP 1901…………………………………………………
50
Hình 3.25. Bản chạy sắc ký lớp mỏng để phân tích sản phẩm thủy phân từ cơ
chất xylan bởi xylanase của chủng SP 1901……………………………………

52

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

BSA Bovine serum albumin
CMC Carboxymethyl cellulose
DNA Deoxyribonucleic axít
DNS Dinitrosalicylic
IAA Indole-3-acetic axít
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis
PCR Polymerase chain reaction
RNA Ribonucleic axít
SDS Sodium dodecyl sulfate
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào trong đời sống và sản xuất đã trở
nên rất phổ biến. Con ngƣời đã và đang khai thác triệt để nguồn tài nguyên vi sinh
vật trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà con ngƣời
đã tổng hợp thành công nhiều loại chế phẩm nhƣ vacxin, kháng sinh, hormone,
vitamin giúp phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh cho con ngƣời. Trong nông
nghiệp, nhiều chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật đã đƣợc sản xuất để
diệt trừ sâu bệnh hại cây và làm phân bón vi sinh. Trong công nghiệp thực phẩm,
con ngƣời đã ứng dụng vi sinh vật để sản xuất ra các loại protein, enzyme, chế
phẩm probiotic và các loại thực phẩm lên men truyền thống. Ngoài ra, vi sinh vật
còn đƣợc ứng dụng vào trong xử lý rác thải hữu cơ và nƣớc thải trong sản xuất công

nghiệp. Với khả năng chuyển hóa mạnh mẽ và sinh sản nhanh chóng, vi sinh vật
đóng một vai trò to lớn trong hệ sinh thái tự nhiên và trong các hoạt động cải thiện
chất lƣợng cuộc sống của con ngƣời.
Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên đƣợc phát hiện và mô tả
trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 19.
Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que và có khả năng sinh
nội bào tử. Chúng phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên, từ trên cạn đến
dƣới nƣớc, từ nƣớc ngọt đến nƣớc mặn và từ ven bờ đến đáy các Đại Dƣơng. Ngoài
các loài vi khuẩn gây bệnh cho con ngƣời nhƣ B. anthracis và B. cereus, nhiều loài
vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là nhóm B. subtilis có tính ứng dụng cao trong
nhiều lĩnh vực nhƣ y dƣợc học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và xử lý môi
trƣờng. Do đó, các loài thuộc chi Bacillus đã và đang ngày càng trở thành những vi
sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng.
Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức về chi Bacillus nói chung và ứng
dụng của các loài thuộc nhóm B. subtilis nói riêng, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi
khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum SP 1901 phân lập tại rừng
Quốc gia Hoàng Liên” với 4 mục tiêu chính sau:
(i) Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis phân lập tại rừng
Quốc gia Hoàng Liên.
(ii) Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác các chủng
vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài và dƣới loài.
2

(iii) Tìm hiểu các đặc tính sinh học quý của chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn.
(iv) Tách chiết, tinh sạch và đánh giá sơ bộ đặc tính các enzyme ngoại của chủng
vi khuẩn nghiên cứu.

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS
1.1.1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis
[45]. B. subtilis đƣợc Christion Erenberg phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835, tên
của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là ―Vibrio subtilis‖. Năm 1872, nhà sinh học
ngƣời Đức Ferdinand Cohn đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus subtilis.

Trong thế chiến thứ hai, tổ chức y học Nazi (Đức) đã dùng B. subtilis để phòng
bệnh lị cho các binh lính chiến đấu ở Bắc Phi. Từ đó đến nay, B. subtilis đã đƣợc
nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên Thế giới. Thuật ngữ ―Subtilis therapy‖ (điều trị
bằng subtilis) ra đời từ đó và B. subtilis ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi để phòng
ngừa và điều trị các loại bệnh về rối loạn đƣờng tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm
đại tràng và tiêu chảy. Hiện nay, B. subtilis đã đƣợc chứng minh có tiềm năng to lớn
trong nhiều lĩnh nhƣ chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trƣờng [8].
Vi khuẩn B. subtilis có mặt ở hầu hết các loại môi trƣờng tự nhiên. Phần lớn
cƣ trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô nên đƣợc gọi là ―trực khuẩn cỏ khô‖. Ngoài ra,
chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất nhƣ bột mì (trong bột mì B.
subtilis chiếm 75-79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo và trong các thực phẩm nhƣ
mắm, tƣơng và chao [12].
B. subtilis có vai trò to lớn trong việc giữ ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột
bằng cơ chế cạnh tranh sinh tồn và khả năng gây ức chế các vi khuẩn gây bệnh khác
do tác dụng của những sản phẩm ngoại bào của nó. Công trình nghiên cứu của
Work và cộng sự năm 1959 đã cho thấy B. subtilis có hệ thống enzyme tƣơng đối
hoàn chỉnh, có khả năng thủy phân carbohydrate và protein. Ngoài ra, B. subtilis
còn có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nhƣ bacitracin, bacilysin,
bacillomicin, bacillopectin, mycobacillin, subtilin và prolimicin. Những chất này có
tác dụng ức chế sinh trƣởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác. Chúng tác dụng
lên cả vi khuẩn gram âm, gram dƣơng và nấm gây bệnh [9].
Nhóm B. subtilis gồm ít nhất 9 loài vi khuẩn là B. amyloliquefaciens, B.
atrophaeus, B. axarquiensis, B. malacitensis, B. mojavensis, B. sonorensis, B.
tequilensis, B. vallismortis và B. velezensis. Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S
rRNA cho thấy mức độ tƣơng đồng giữa chúng rất cao (> 99%). Bên cạnh đó,
phƣơng pháp phân loại truyền thống dựa trên hình dạng khuẩn lạc, hình thái tế bào
4

và bào tử cũng nhƣ các đặc điểm sinh hóa không có khả năng phân tách các loài
này. Vì vậy, 9 loài vi khuẩn trên thƣờng đƣợc gọi theo một thuật ngữ chung là

nhóm vi khuẩn B. subtilis [45].
Gần đây, bên cạnh việc phân tích trình tự gen 16S rRNA các nhà khoa học
đã sử dụng phƣơng pháp phân tích trình tự đa gen trong việc phân loại vi khuẩn đến
cấp độ loài và dƣới loài [25]. Đặc biệt trong nhóm B. subtilis, bằng phƣơng pháp
phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại, nhiều loài trong
nhóm này đã đƣợc phân tách thành các loài phụ nhƣ B. subtilis đƣợc phân thành B.
subtilis subsp. subtilis, B. subtilis subsp. spizizenii và B. subtilis subsp.
inaquosorum; B. amyloliquefaciens đƣợc phân thành B. amyloliquefaciens subsp.
amyloliquefaciens và B. amyloliquefaciens subsp. plantarum [42].
Phân loại các loài trong nhóm B. subtilis nói chung và B. amyloliquefaciens
nói riêng đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều phƣơng pháp phân loại hiện đại. Hiện
nay ở Việt Nam hầu nhƣ chƣa có bất cứ một nghiên cứu nào công bố chính xác một
loài vi khuẩn phân lập trong hệ sinh thái tự nhiên đến cấp độ dƣới loài dựa trên việc
phân tích trình tự đa gen.
1.1.2. Lịch sử phát hiện
B. amyloliquefaciens đƣợc Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả năng
sinh α-amylase và protease. Tại thời điểm đó, loài vi khuẩn này chƣa đƣợc xếp loại
trong bảng Danh pháp Vi khuẩn. Cho đến năm 1975, theo điều 24a và 28a trong Bộ
luật Quốc tế về Danh pháp Vi khuẩn thì cái tên B. amyloliquefaciens mới đƣợc công
bố [43].
Thời gian đầu, loài vi khuẩn này đƣợc xem là dòng khác của B. subtilis hay
loài phụ B. subtilis subsp. amyoliquefaciens. B. amyloliquefaciens mang rất nhiều
đặc điểm tƣơng đồng với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus. Bằng
các phƣơng pháp phân loại thông thƣờng rất khó để phân biệt giữa chúng. Đến năm
1987, B. amyloliquefaciens mới đƣợc tách ra thành một loài riêng dựa vào kết quả
lai DNA lần lƣợt là 23, 15 và 5% so với các loài B. subtilis, B. licheniformis và B.
pumilus [43].
Từ đó đến nay, nhiều chủng B. amyloliquefaciens phân lập từ các hệ sinh
thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau đã đƣợc công bố. Năm 2010, Borriss và
cộng sự đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai DNA, chỉ số so sánh hệ gen bằng

kỹ thuật microarray, tính tƣơng đồng của toàn bộ hệ genome và phổ các chất hoạt
tính lipopeptide và polypeptide giữa một nhóm B. amyloliquefaciens DSM7 không
5

có khả năng và một nhóm B. amyloliquefaciens FZB42 có khả năng sống nội cộng
sinh rễ cây thực vật. Dựa vào kết quả thu đƣợc, Borriss đã đề xuất tách B.
amyloliquefaciens thành 2 nhóm loài phụ là B. amyloliquefaciens subsp. plantarum
(có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật) và B. amyloliquefaciens subsp.
amyloliquefaciens (không có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật) [23].
1.1.3. Phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974) [24], B. amyloliquefaciens thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành : Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Nhóm: Bacillus subtilis
Loài: Bacillus amyloliquefaciens
1.1.4. Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên
B. amyloliquefaciens thƣờng có mặt trong các mẫu đất tự nhiên. Đây là loài
vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram dƣơng, sinh nội bào tử, có khả năng di động và
kích thƣớc tế bào 3,0-4,0 × 0,7-1,5 µm. Đặc biệt, có một số chủng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật [23].
1.2. ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS
1.2.1. Sản xuất enzyme công nghiệp
Loài vi khuẩn này đƣợc biết đến từ rất sớm nhờ khả năng sản sinh các loại
enzyme ngoại bào đa dạng. Từ những năm 1943, B. amyloliquefaciens đã đƣợc sử
dụng để sản xuất 2 loại enzyme công nghiệp là α-amylase và protease [43]. Enzyme
từ B. amyloliquefaciens nhƣ amylase, xylanase, cellulase, protease và lipase có

nhiều đặc tính quý nhƣ khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và khả năng bền
nhiệt. Do đó, enzyme từ B. amyloliquefaciens đã đƣợc ứng dụng nhiều trong công
nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp
sản xuất chất tẩy rửa [21].
6

Bên cạnh đó, nhóm B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh rễ cây thực vật
có khả năng sinh phytase đã đƣợc công bố và gen mã hóa phytase của chúng đã
đƣợc biểu hiện thành công trên chủng B. subtilis MU331 [31]. Phytase là enzyme
phân giải phytate khó tan trong các loại rau, củ và quả thành myo-inositol và các
dạng phosphate hòa tan dễ hấp thụ trong hệ tiêu hóa động vật. Vì vậy, phytase đã
đƣợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho
nhóm động vật dạ dầy đơn và làm giảm nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng do hàm lƣợng
phosphate dƣ thừa thải ra môi trƣờng nƣớc [29].
1.2.2. Sản xuất chất kháng sinh
Các loài thuộc nhóm B. subtilis đã đƣợc biết đến nhờ khả năng sinh các chất
kháng sinh kháng vi khuẩn và nấm gây bệnh hoặc sản sinh các sản phẩm trao đổi
bậc hai khác nhƣ chất kháng virus, chất kháng ung thƣ và chất ức chế miễn dịch
[47]. Chất kháng sinh từ Bacillus có bản chất là các peptide đƣợc tổng hợp qua
ribosome (còn gọi là bacteriocin hoặc lantibiotics). Lantibiotics có phổ kháng khuẩn
hẹp và thƣờng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Nhiều chất kháng sinh có bản
chất peptide tổng hợp không qua ribosome cũng đã đƣợc công bố từ loài B.
amyloliquefaciens nhƣ bacylicin, lipopeptide (surfactin, fengycin, iturin và
bacillomycin) và polyketide (difficidin, bacillaene và macrolactin) [18] [38].
Bacylicin là chất dipeptide đƣợc tạo nên từ L-analine và một amino axít hiếm L-
anticapsin. Bacylicin có khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia amylovora gây bệnh
cháy lá trên táo và lê. Surfactin hoạt động nhƣ chất tẩy rửa trên màng tế bào. Chất
này có tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng viêm. Iturin, fengycin và
bacillomycin là các lipopeptide vòng có tính kháng nấm gây bệnh cây. Nghiên cứu
gần đây cho thấy, một số chất peptide giống iturin từ B. amyloliquefaciens có khả

năng diệt Paenibacillus larvae gây bệnh trên ong mật [22]. Difficin là chất kháng
sinh phổ rộng, chất này ức chế quá trình tổng hợp protein và có khả năng ức chế
Erwinia amylovora. Bacillaene cũng là một chất ức chế tổng hợp protein ở tế bào
prokaryotes. Macrolactin là một chất kháng khuẩn Gram dƣơng.
1.2.3. Sản xuất phân bón vi sinh
Một số chủng B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh trên rễ cây thực vật
có khả năng sinh chất kích thích sinh trƣởng Indole-3-acetic axít (IAA). Chất này sẽ
tác động tích cực đến những quá trình sinh lý của thực vật nhƣ quang hƣớng động,
địa hƣớng động, ƣu thế chồi ngọn và sự tƣợng rễ. Yao và cộng sự (2012) đã thử
nghiệm bổ sung chế phẩm chứa vi khuẩn B. amyloliquefaciens FZB24 lên cây bông.
7

Kết quả cho thấy, sản lƣợng bông thu hoạch đƣợc tăng 30% so với đối chứng bổ
sung đạm NPK [56]. Trong nghiên cứu Idris và cộng sự (2007), tác giả đã thử khả
năng sinh chất kích thích sinh trƣởng indole-3-acetic axít của chủng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens FZB42 lên bèo tấm. Kết quả cho thấy, trọng lƣợng tƣơi của bèo
tấm khi thu hoạch có sự gia tăng đáng kể so với đối chứng. Loài vi khuẩn B.
amyloliquefaciens đã đƣợc chứng minh có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất phân
bón vi sinh nhờ khả năng sinh các chất kháng nấm và chất kích thích sinh trƣởng
thực vật [31].
1.2.4. Sản xuất chế phẩm probiotics
B. amyloliquefaciens là những vi sinh vật an toàn (Generally recognized as
safe; GRAS) và có thể dùng nhƣ probiotics để bổ sung vào thức ăn hoă
̣
c nƣơ
́
c uống
nhằm cân bằng hê
̣
vi sinh đƣơ

̀
ng ruô
̣
t , qua đo
́
ngăn ngƣ
̀
a va
̀
pho
̀
ng chống ca
́
c bê
̣
nh
tiêu cha
̉
y thƣơ
̀
ng gă
̣
p . Ngoài ra , vi sinh vật trong probiotics co
̀
n tăng cƣơ
̀
ng kha
̉

năng chuyển hóa lactose, điều ho

̀
a hê
̣
thống miê
̃
n di
̣
ch va
̀
tăng cƣơ
̀
ng sƣ
́
c kho
̉
e con
ngƣơ
̀
i [48] [49]. Nhiều bằng chứng cho thấy B. amyloliquefaciens đã đƣợc sử dụng
trong chế phẩm probiotics [53].
1.3. MỘT SỐ ENZYME CÔNG NGHIỆP QUAN TRỌNG
1.3.1. Xylanase
1.3.1.1. Cấu trúc xylan
Xylan là thành phần chính của hemicellulose và là polysaccharide phổ biến
thứ hai trong tự nhiên chỉ sau cellulose. Chúng đƣợc tìm thấy trong thành tế bào
thực vật [50].
Xylan là một polysaccharide không đồng nhất, bao gồm các gốc D-xylose
liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-xylanosidic giữa đƣờng xylopyranose với
acetyl, arabinosyl và glucuronisyl [39].
8

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan và các vị trí tấn công của hệ thống enzyme
xylanolytic [34].
Thực vật trên cạn có xylan là chuỗi D-xylosyl đƣợc nối với nhau bằng liên
kết β-1,4, trong khi tảo biển tổng hợp xylan với một cấu trúc hóa học khác gồm các
monomer D-xylose nối với nhau bằng liên kết β-1,3. Thông thƣờng, xylan chiếm
khoảng 15-30% trọng lƣợng khô của cây hạt kín và khoảng 7-15% của cây hạt trần.
Đặc biệt trong cây lá rộng, xylan chiếm tới 35% tổng trọng lƣợng khô của chúng
[35].
Do xylan có cấu trúc không đồng nhất, để thủy phân cấu trúc này cần phải có
hệ thống enzyme xylanolytic. Tất cả các enzyme trong hệ thống này tác động tƣơng
hỗ với nhau để phân giải xylan thành các phân tử đƣờng [34].
1.3.1.2. Nguồn sản sinh xylanase
Xylanase đƣợc sinh tổng hợp bởi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và động vật
nguyên sinh. Trong các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp xylanase, nấm, vi
khuẩn và xạ khuẩn là các nhóm quan trọng nhất [57].
Các loại xylanase đƣợc sinh ra bởi vi khuẩn và nấm sợi ƣa kiềm có khả năng
chịu nhiệt tốt hơn và do đó chúng đƣợc ứng dụng rộng rãi và cho hiệu quả cao hơn
trong công nghiệp [39].
1.3.1.3. Đặc tính hoạt động của xylanase
Axít glutamic là axít amin quyết định sự hoạt động của xylanase [10]. Sự
thủy phân xylan đòi hỏi sự hỗ trợ hoạt động của các thành phần trong hệ thống
enzyme xylanolytic (hình 1.1.).

9

Vai trò của các enzyme chính trong hệ thống enzyme xylanolytic cụ thể nhƣ
sau:
 β-1,4-endo-xylanase và ferulic axít esterase

Enzyme β-1,4-endo-xylanase và ferulic axít esterase là hai enzyme có vai trò
chủ đạo trong quá trình thủy phân mạch chính của xylan. Trong đó, β -1,4-endo-
xylanase tấn công vào liên kết xylosidic của mạch chính còn ferulic axít esterase tấn
công các liên kết xylosyl còn lại và giải phóng ra các xylooligosaccharide. Hai
enzyme này là thành phần chính của hệ enzyme xylanolytic do các vi sinh vật sinh
ra, chẳng hạn nhƣ các loài thuộc Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum,
Bacillus, Clostridium và Streptomyces [55].
Ferulic axít esterase là enzyme ngoại bào exoglycosidase thủy phân các
oligosaccharide ngắn và xylobiose thành đƣờng xylose [57]. Trong số các cơ chất,
xylobiose thƣờng là cơ chất tốt nhất [39]. Hầu hết các ferulic axít esterase đƣợc
nghiên cứu cho đến nay đều bị ức chế ngƣợc bởi xylose, một sản phẩm thủy phân
của chúng.
 α-L-Arabinofuranosidase
α-L-Arabinofuranosidase có khả năng thủy phân cả hai liên kết 1,3 và 1,5-α-
L-arabinofuranosyl trong arabinoxylan giải phóng arabinose. Khi giải phóng
arabinose, mạch chính xylan không bị thủy phân và không tạo ra
xylooligosaccharide [55].
 α-D-Glucuronidase
α-D-Glucuronidase phân giải liên kết α-1,2 giữa axít glucuronic và gốc
xylose trong phân tử glucuronoxylan. Tính đặc hiệu của α-glucuronidase là khác
nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme [39].
 Acetyl xylan esterase
Acetyl xylan esterase là enzyme có thể cắt đứt liên kết giữa các nhóm acetyl
với 2 hoặc 3 vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân xylan trong tự
nhiên [34]. Enzyme này thƣờng đƣợc sinh ra từ một số loài vi khuẩn và nấm.
1.3.1.4. Ứng dụng của enzyme xylanase
Xylanase đƣợc ứng dụng trong sản xuất nƣớc hoa quả và làm trong rƣợu.
Hơn nữa, xylanase còn có thể hoạt động trong điều kiện nhiệt độ cao (khoảng 60-
10

70
o
C) nên có thể ngăn chặn đƣợc sự nhiễm vi sinh vật khi chế biến nƣớc hoa quả ở
nhiệt độ cao [27].
Xylanase còn đƣợc ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm nhƣ trong công
nghệ sản xuất bánh nƣớng, hỗ trợ quá trình đƣờng hóa lignocellulose (một
polysaccharide khó phân hủy trong thành tế bào thực vật). Xylanase còn đƣợc sử
dụng để loại lignin khỏi bột giấy.
Trong công nghiệp sản xuất giấy và vải sợi, xylanase tham gia vào quá trình
tách xylan và lignin để thu cellulose một cách nhanh chóng và dễ dàng. Xylanase
giúp tẩy màu và làm mềm sợi lanh và sợi gai [11].
Xylan là chất xơ khó phân hủy trong thực vật và là chất khó tiêu trong thức
ăn chăn nuôi. Vì thế việc bổ sung xylanase vào khẩu phần ăn của gia súc và gia cầm
sẽ giúp chúng dễ tiêu hóa và dễ hấp thụ thức ăn, đồng thời góp phần làm giảm ô
nhiễm môi trƣờng.
1.3.2. α-amylase
1.3.2.1. Cấu tạo tinh bột và glycogen
Cơ chất tác dụng của amylase và tinh bột và glycogen. Tinh bột là nhóm
carbohydrate ở thực vật. Chúng có chủ yếu ở trong các loại củ và hạt nhƣ khoai
lang, khoai tây, sắn, củ mì và các loại hạt ngũ cốc. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau
đều có cấu tạo từ 20-30% amylose và 70-80% amylopectin.
Amylose đƣợc cấu tạo từ 200-1.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên
kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch dài không phân nhánh. Amylopectin đƣợc
cấu tạo từ 600-6.000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside và
α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh.

11



Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của amylose và amylopectin [14].
Glycogen đƣợc ví nhƣ tinh bột của động vật. Glycogen có cấu tạo giống với
tinh bột nhƣng mức độ phân nhánh mạnh hơn. Cấu tạo của chúng gồm các phân tử
glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside. Ở các vị trí phân nhánh glucose
nối với nhau băng liên kết α-1,4-glucoside. Glycogen có ở động vật và ngƣời, chúng
tập trung chủ yếu ở gan.
1.3.2.2. Nguồn sản sinh α-amylase
Amylase là hệ enzyme rất phổ biến ở nhiều sinh vật. Vi khuẩn và nấm sợi là
những nhóm sinh amylase chính. Amylase của vi khuẩn có ƣu điểm chịu nhiệt tốt
hơn của nấm sợi, chúng có thể hoạt động ở nhiệt độ 85-95
o
C [34].
Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân. Có 6 loại amylase đƣợc xếp
vào 2 nhóm: endoamylase và exoamylase. Endoamylase gồm α-amylase và nhóm
enzyme khử nhánh. Exoamylasse gồm có β-amylase và glucoamylase.
1.3.2.3. Đặc tính hoạt động của α-amylase
Đây là một enzyme kim loại, nếu không có sự hiện diện của ion canxi trong
phân tử enzyme thì chúng sẽ không hoạt động đƣợc. α-amylase có khả năng phân
cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu
12

nhiên không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà
chúng còn có khả năng thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy.
Quá trình thủy phân tinh bột bở α-amylase là quá trình xảy ra qua nhiều giai
đoạn: dextrin hóa  đƣờng hóa  phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen
 sản phẩm thủy phân gồm maltotetrose, maltotriose và maltose.

Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy
phân tạo thành một lƣợng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh
bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh).
Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đƣờng hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị
thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất
này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide.
Dƣới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành
oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose.
Sau đó các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose,
maltotriose và maltose.
Sau phản ứng, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87%
maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tƣơng tự nhƣng vì
không phân cắt đƣợc liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử
amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng ngoài các đƣờng
nói trên còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose [1].
1.3.2.4. Ứng dụng của α-amylase
Với khả năng thủy phân tinh bột nên α-amylase đã đƣợc con ngƣời sử dụng
từ rất sớm. Trong công nghiệp thực phẩm, ngƣời ta thƣờng bổ sung α-amylase vào
bột chế biến trong quá trình sản xuất bánh kẹo. Hoạt động của α-amylase sẽ làm
tăng lƣợng đƣờng khử, lƣợng đƣờng khử này sẽ tham gia vào các phản ứng oxy hóa
khử. Kết quả của quá trình đó sẽ tạo cho bánh kẹo có mùi vị và màu hấp dẫn [2].
Cả α-amylase và β-amylase đều đƣợc sử dụng trong sản xuất bánh mì. Các
loại enzyme này tham gia thủy phân tinh bột thành đƣờng, nhờ đó nấm men
Saccharomyces cerevisiae sẽ dễ dàng chuyển hóa chúng thành cồn và CO
2
, làm
tăng thể tích, tạo ra màu sắc và mùi vị tốt cho bánh [2].
Trong sản xuất bia, các nhà sản xuất thƣờng sử dụng α-amylase có trong
mầm đại mạch để thủy phân tinh bột có sẵn trong đó. Cồn công nghiệp đƣợc sản

13

xuất bằng phƣơng pháp lên men. Cồn đƣợc lên men từ nguyên liệu chứa đƣờng
hoặc từ nguyên liệu chứa carbohydrate. Trong đó, α-amylase đóng vai trò chuyển
hóa tinh bột để tạo thành dextrin [15].
1.3.3. Protease
Protease là nhóm các enzyme có khả năng phân giải các liên kết peptide
trong phân tử protein tạo thành các đơn vị nhỏ nhƣ các đoạn peptide hay các phân
tử amino axít [5].

Hình 1.3. Phản ứng thủy phân liên kết peptide của chuỗi polypeptide [34].
1.3.3.1. Nguồn sản sinh protease
Protease đƣợc sản xuất chủ yếu từ 3 nguồn chính là động vật, thực vật và vi
sinh vật. Trong đó, nguồn enzyme từ vi sinh vật là phong phú nhất và là nguồn
nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô công nghiệp [16]. Ngày
nay, hƣớng sản xuất enzyme từ vi sinh vật đang dần thay thế enzyme từ động vật và
thực vật bởi: tốc độ sinh sản của vi sinh vật nhanh, enzyme đƣợc tách chiết từ vi
sinh vật có hoạt tính cao và vi sinh vật là giới sinh vật phù hợp cho sản xuất theo
quy mô công nghiệp. Các đối tƣợng vi sinh vật thƣờng đƣợc dùng để tách chiết
protease là nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn.
1.3.3.2. Phân loại protease
Protease đƣợc xếp vào nhóm enzyme thủy phân. Tuy nhiên, do sự đa dạng về
đặc tính hoạt động và cấu trúc nên protease còn đƣợc phân loại theo nhiều cách
khác nhau dựa vào pH hoạt động tối ƣu hay vị trí hoạt động trong tế bào [51].
 Dựa vào pH hoạt động tối ƣu: protease đƣợc phân thành protease axít,
protease trung tính và protease kiềm tƣơng ứng với pH tối ƣu < 7, = 7 và >7.
 Dựa vào vị trí phân bố trong tế bào: protease bao gồm protease nội bào và
ngoại bào (enzyme đƣợc tiết ra bên ngoài tế bào). Trong giới hạn luận văn này
chúng tôi tập trung nghiên cứu các protease ngoại bào.
 Theo vị trí xúc tác: protease đƣợc chia thành hai nhóm: exopeptidase và

endopeptidase. Exopeptidase là những enzyme có khả năng phân cắt từ hai đầu tận
14

cùng của chuỗi polypeptide. Endopeptidase là những enzyme có khả năng phân cắt
liên kết peptid nằm phía trong phân tử protein [44].
1.3.3.3. Ứng dụng của protease
Trong công nghiệp chế biến thủy sản, đồ hộp và đồ đông lạnh, protease đƣợc
dùng làm mềm thịt nhờ khả năng thủy phân một phần protein có trong thịt. Hoàn
toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân [3].
Trong công nghệ chế biến sữa, protease tham gia vào quá trình thủy phân
protein trong sữa tạo thành các sản phẩm nhƣ pepton, axít amin. Protease có mặt tự
nhiên trong sữa và chúng không bị phân hủy hoàn toàn khi thanh trùng ở nhiệt độ
76-78
o
C. Trƣơng Thị Hòa và cộng sự (1994) đã thử nghiệm sử dụng protease đƣợc
tách chiết từ Aspergillus oryzae để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều
kiện xử lý bia tốt hơn [7].
Trong công nghiệp thuộc da, trƣớc khi bị xử lý da thƣờng bị cứng do có
nhiều collagen. Protease đƣợc sử dụng làm mềm da nhờ khả năng thủy phân
collagen. Quá trình đó đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm
dẻo nhất định.
Ngoài ra, protease còn đƣợc phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme
đƣợc bổ sung vào thức ăn gia súc làm tăng khả năng tiêu hóa cao , có ý nghĩa lớn
trong chăn nuôi gia súc và gia cầm.

15

CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THIẾT BỊ VÀ MÁY MÓC ĐÃ SỬ DỤNG
Các thiết bị và máy móc của bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật, Viện Vi
Sinh Vật và Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
 Máy đọc trình tự ADN 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied
Biosystem, Mỹ).
 Máy khuếch đại gen Gene Amp PCR System 9700 (Eppendorf,
Mỹ).
 Máy ly tâm lạnh Centrifuge C30P (Satorius Group, Đức).
 Máy đo quang phổ UV 1600(Thermo, Mỹ).
 Máy lắc ổn nhiệt (B.Braun, Mỹ).
 Kính hiển vi (Olympus, Nhật).
 Máy ly tâm 6K15 (Sigma, Đức).
 Máy ly tâm Centrifuge 5417R (Eppendorf, Đức).
 Bộ chạy điện di đứng cho protein (Biorad, Mỹ).
 Máy lọc tiếp tuyến 17525-001 (Sartorius Stedim, Mỹ).
2.2. NGUYÊN LIỆU
2.2.1. Chủng vi sinh vật
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ vi sinh vật đƣợc phân lập tại
rừng Quốc gia Hoàng Liên và các ruộng canh tác nông nghiệp lân cận [13].
2.2.2. Môi trƣờng
 Môi trƣờng hoạt hóa: Môi trƣờng NA (g/l): pepton-5; cao thịt-3; thạch-16.
 Môi trƣờng nuôi giống khởi động: Môi trƣờng NA dịch thể (nhƣ môi trƣờng

NA nhƣng không có thạch).
 Môi trƣờng nuôi cấy: Môi trƣờng khoáng (g/l): CaCl
2
-0,5; NH
4
NO
3
-5; KCl-
0,5; MgSO
4
.7H
2
O-0,25; FeSO
4
.7H
2
O-0,01; MnSO
4
.H
2
O-0,01; KH
2
PO
4
-1
[33] có bổ sung một trong số các nguồn carbon: D-glucose, tinh bột tan,
casein, CMC, xylan, chitin, tributyrin và pectin.

16

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Nuôi cấy giống khởi động
Để nuôi cấy khởi động chủng giống, các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy qua
đêm trên môi trƣờng NA dịch thể ở nhiệt độ 37
o
C trong 24 giờ.
2.3.2. Phân tích trình tự đa gen
2.3.2.1. Tách chiết DNA của vi khuẩn
Phƣơng pháp tách chiết DNA của vi khuẩn đƣợc thực hiện theo Sakiyama và
cộng sự (2009) [46]. Vi khuẩn đuợc nuôi trên môi trƣờng dịch thể với thời gian
thích hợp. Sau đó hút 1,5 ml dịch vào ống eppendorf và ly tâm ở 15.000 v/p trong
15 phút để lấy sinh khối tế bào. Hòa sinh khối tế bào trong 100 µl TAE. Thêm 0,4
mg lysozyme rồi trộn đều, ủ ở 37
o
C trong 1 giờ.
Thêm 100 µl SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút, ủ ở 37
o
C trong 30 phút.
Thêm một thể tích tƣơng đƣơng phenol : chloroform : isoamyl alcohol, trộn đều. Ly
tâm 15.000 v/p trong 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendorf khác.
Bổ sung 8 µl RNAse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37
o
C trong 30 phút. Thêm 12 µl
proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ ở 56
o
C trong 15 phút. Tiếp tục thêm 1/10 thể
tích natri acetate 3M và 1 ml ethanol 100% rồi trộn đều. Đặt hỗn hợp trong đá 30
phút.
Ly tâm hỗn hợp 15.000 v/p trong 15 phút. Hút bỏ lớp dịch trên, rửa phần tủa
bằng ethanol 70%. Làm khô phần tủa bằng máy cô quay chân không. Hoà tan tủa

trong 50-100 l nƣớc MQ hoặc đệm TAE.
2.3.2.2. Phản ứng khuếch đại DNA
Thành phần phản ứng khuếch đại DNA bao gồm 10 µl đệm PCR 10x, 10 µl
dNTP 2 mM, 2 µl mồi xuôi, 2 µl mồi ngƣợc, 2 µl tag polymerase, 1-2 µl DNA
khuôn và bổ sung H
2
O đến thể tích tổng là 25 µl.
Trình tự cặp mồi đã sử dụng (xem phụ lục B).
Chu trình nhiệt của của phản ứng này bao gồm 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3
bƣớc: (i) gây biến tính DNA bằng cách đun hỗn hợp ở 95
o
C trong 30 giây, (ii) sau
đó gắn mồi bằng cách hạ nhiệt độ xuống 56
o
C trong 15 giây, (iii) tiếp theo để DNA
polymerase kéo dài chuỗi thì nhiệt độ tiếp tục đƣợc nâng lên 72
o
C trong 1 phút.

17

2.3.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sử dụng bộ kit QIAgen (Đức) theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Các bƣớc đƣợc
thực hiện nhƣ sau: đầu tiên, bổ sung dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1 và
trộn đều, chuyển hỗn hợp mẫu vào cột rồi ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút sau đó đổ
bỏ lớp dịch phía dƣới cột.
Bổ sung 750 µl đệm PE lên cột. Ly tâm cột 10.000 v/p trong 1 phút sau đó
đổ bỏ dịch dƣới cột. Cột đƣợc ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút. Chuyển cột sang
ống eppendorf mới sau đó thêm 30 µl nƣớc. Hỗn hợp đƣợc để ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút sau đó đem ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút. Phần dịch phía dƣới đƣợc

thu lại.
2.3.2.4. Phản ứng khuếch đại DNA cho đọc trình tự
Thành phần phản ứng PCR gồm 8 µl termix, 1 µl mồi, 1 µl DNA khuôn
(nồng độ 40-60 µg/ml) và bổ sung H
2
O đến thể tích tổng là 25 µl.
Phản ứng PCR khuếch đại 6 đoạn gen gyrase subunit A (gyrA), RNA
polymerase subunit B (rpoB), phosphoribosylaminoimidazolecarbox-amide
formyltransferase (purH), DNA polymerase III subunit alpha (polC), 60 kDa heat-
shock protein groEL (groEL) và 16S rRNA đƣợc thực hiện với các cặp mồi mô tả
theo Rooney và cộng sự (2009 (xem phụ lục B) [45].
Một chu trình nhiệt ở bƣớc này gồm 25 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc: (i)
gây biến tính DNA ở 96
o
C trong 10 giây, (ii) sau đó gắn mồi bằng cách hạ nhiệt độ
xuống 50
o
C, (iii) kéo dài chuỗi bằng cách tăng nhiệt độ lên 60
o
C trong 4 phút.
2.3.2.5. Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự
Chuyển 20 l sản phẩm PCR sang ống eppendorf sạch. Thêm 5 l EDTA
125 mM và 60 l ethanol 100% vào ống, để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau
đó hỗn hợp đƣợc ly tâm tốc độ 15.000 v/p trong 15phút.
Loại bỏ dịch, thêm 60 l ethanol 70% để rửa, ly tâm 15.000 v/p trong 10
phút sau đó làm khô. Thêm 10 l HiDi Formamide rồi đặt trong bể đun sôi ở 96
o
C
trong 2 phút sau đó ngâm ngay mẫu vào nƣớc đá lạnh trong 5 phút. Chuyển toàn bộ
mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự.

Sử dụng kit Bigdye® terminator v3.1 (Applied Biosystems, Mỹ) theo hƣớng
dẫn của nhà sản xuất để giải trình tự DNA. Trình tự DNA của các gen đƣợc đọc trên
máy giải trình tự 3100 Avant Genetic Analyzer sử dụng POP - 6 polymer. Sắc đồ