Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


HOÀNG THỊ LAN ANH



NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI
TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM
MANGROVEI PQ6





LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC





HÀ NỘI, 2014

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Hoàng Thị Lan Anh

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ
KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN
DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6



Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Đặng Diễm Hồng
Viện Công nghệ sinh học





Hà Nội, 2013


i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đặng
Diễm Hồng, Trưởng phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam- người thầy đã định hướng, truyền dạy những kiến thức khoa học và
giúp đỡ tôi vượt qua những trở ngại và khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm

trọng điểm Công nghệ gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn
thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành PGS. TS. Vũ Mạnh Hùng- Học viện Quân Y, PGS. TS.
Nguyễn Văn Chương, Chủ nhiệm Bộ môn – Khoa Nội Thần kinh, Bệnh Viện 103, ThS. Nguyễn
Thị Hương-Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 3, TS. Đoàn Lan Phương- Viện Hóa học
các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm,
phân tích thành phần và hàm lượng các axít béo không bão hoà.
Bên cạnh đó, tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các cô chú, anh
chị, các bạn đồng nghiệp đã và đang làm việc tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Hoàng Thị Minh
Hiền, ThS. Ngô Thị Hoài Thu, ThS. Đinh Thị Ngọc Mai, KS. Lê Thị Thơm, KS. Nguyễn Cẩm
Hà, KTV. Đỗ Thị Là, ThS. Đinh Đức Hoàng, ThS. Bùi Đình Lãm, ThS. Hoàng Sỹ Nam, ThS.
Nguyễn Đình Hưng. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó.
Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam “Nghiên cứu đánh giá và khai thác hoạt chất từ tảo biển” (2007-2008) và đề
tài “Nghiên cứu xây dựng tập đoàn giống vi tảo biển quang tự dưỡng, dị dưỡng của Việt Nam
và nuôi sinh khối một số loài tảo dị dưỡng làm thức ăn trong nuôi trồng thuỷ sản” (2008-
2010) thuộc chương trình công nghệ sinh học trong thủy sản của Bộ NN và PTNT do PGS.
TS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên
cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn
thành luận án của mình.

Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Tác gi


Hoàng Th Lan Anh

ii

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả;
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Tác giả


Hoàng Thị Lan Anh







iii

MỤC LỤC


Trang
MỞ ĐẦU

1
Chƣơng I.
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
3
1.1.
Hệ thống phân loại, các kĩ thuật phân lập và định tên chi
Schizochytrium
3
1.1.1.
H thng phân loi
3
1.1.2.
t phân lnh tên
6
1.1.2.1.
Kĩ thuật phân lập
6
1.1.2.2.
Các kĩ thuật định tên
7
1.2.
Các axít béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 (-3 PUFA)
8
1.2.1.
Gii thiu chung v

-3 PUFA
8
1.2.2.
Vai trò ca


-i vi sc kho i
9
1.2.3.
Sn xut -3 PUFA t vi to
12
1.3.
Đặc điểm sinh học của chi Schizochytrium
14
1.3.1.
m sinh thái
14
1.3.2.
ng ca mt s yu t 

-3
PUFA  Schizochytrium
14
1.3.2.1.
Ảnh hưởng của nguồn C và N
14
1.3.2.2.
Ảnh hưởng của nồng độ muối
16
1.3.2.3.
Ảnh hưởng của nhiệt độ
17
1.3.3.
ng sinh tng hp DHA  chi Schizochytrium
20

1.4.
Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng nói chung và chi
Schizochytrium nói riêng cho sản xuất

-3 PUFA
23
1.4.1.
Công ngh nuôi trng vi to bin d ng cho sn xut

-3 PUFA
23
1.4.2.
Sn xut DHA  quy mô ln  chi Schizochytrium
25


iv

1.5.
Những ứng dụng sinh khối của chi Schizochytrium
27
1.5.1.
ng dng trong nuôi trng thy sn
27
1.5.2.
Sn xut thm
31
1.5.3.
Sn xut du sinh hc giàu omega-3
32

1.5.4.
Sn xut nhiên liu sinh hc
33
1.6.
Tình hình nghiên cứu vi tảo biển dị dƣỡng ở Việt Nam
34
Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
37
2.1.
Vật liệu
37
2.1.1.
Mu vt
37
2.1.2.
Vi sinh vt
37
2.1.3.
Các b sinh phm
37
2.1.4.
ng vt thí nghim
37
2.2.
Hoá chất
38
2.3.
Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
38
2.4.

Môi trƣờng
39
2.5.
Phƣơng pháp nghiên cứu
40
2.5.1.
Phân lp chi Schizochytrium
40
2.5.2.
Chp nh hình thái t i kính hin t quét (SEM)
40
2.5.3.
Các phng pháp sinh hc phân t
41
2.5.3.1.
Tách chiết DNA tổng số từ các chủng Schizochytrium spp.
41
2.5.3.2.
Nhân gen bằng kỹ thuật PCR
41
2.5.3.3.
Tinh sạch sản phẩm PCR
42
2.5.3.4.
Tách dòng gen
42
2.5.3.5.
Xác định trình tự gen
44
2.5.4.

ng ca các chng Schizochytrium spp.
44


v

2.5.5.
Nghiên c  m sinh lý, sinh hóa ca các chng
Schizochytrium spp.
45
2.5.6.
ng lipít trong sinh khi to
45
2.5.7.
Phân tích thành phng các axít béo trong sinh khi
Schizochytrium spp.
46
2.5.8.

46
2.5.9.
ng kh bng DNSA
46
2.5.10.
Nghiên cu tính an toàn viên Algal Omega -3
47
2.5.10.1.
Nghiên cứu độc tính cấp của Algal Omega -3
47
2.5.10.2.

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
47
2.5.11.
Nghiên cu hiu lc ca ch phm Algal Omega- 3
49
2.5.11.1.
Xác định phản xạ tìm kiếm thức ăn trong mê lộ
49
2.5.11.2.
Nghiên cứu trên mô hình phản xạ tránh shock chủ động có điều kiện
49
2.5.11.3.
Nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm năng lực tâm thần kinh
51
2.5.12.
Nghiên cu s dng sinh khi to S. mangrovei PQ6 làm giàu luân
trùng (Brachionus plicatilis) và Artemia
51
2.5.12.1.
Xác định lượng tảo và thời gian làm giàu thích hợp cho luân trùng và
Artemia
51
2.5.12.2.
So sánh việc sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 tươi, khô và chất
cường hoá Golden Power trong việc làm giàu Artemia
52
2.5.12.3.
So sánh việc sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 tươi, men bánh mì
và vi tảo biển quang tự dưỡng
52

2.5.12.4.
Sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn
cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790)
53
2.5.12.5.
Nghiên cứu sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 làm giàu Artemia
làm thức ăn cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775)
56
2.6.
Xử lý số liệu
57


vi

Chƣơng III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
58
3.1.
Đặc điểm sinh học của các đại diện thuộc chi vi tảo biển
Schizochytrium
58
3.1.1.
Phân lp các chng Schizochytrium spp. t các mu lá cây thu thp
 vùng rng ngp mn  Vit Nam
58
3.1.2.
Tuyn chn mt s chng thuc chi Schizochytrium ti
vic sn xut DHA
59
3.1.3.

Nghiên cm sinh hn ca mt s chng thuc chi
Schizochytrium ti
61
3.1.3.1.
Một số đặc điểm hình thái điển hình
61
3.1.3.2.
Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng tiềm năng
63
3.1.3.3.
Phân tích hàm lượng lipít, axít béo tổng số và DHA của các chủng tiềm
năng
68
3.1.3.4.
Bảo quản giống
70
3.1.4.
Phân loi các chng ti
72
3.1.4.1.
So sánh một số đặc điểm hình thái của các chủng tuyển chọn với một số
loài đại diện thuộc chi Schizochytrium
72
3.1.4.2.
Phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa 18S rRNA
74
3.2.
Công nghệ nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ
thống lên men
79

3.2.1.
Sng chng PQ6 trong bình lên men 5 và 10 lít
79
3.2.2.
ng chng PQ6 trong bình lên men 30 lít t to
83
3.2.3.
Xây dng quy trình nuôi trng chng PQ6 trong bình lên men 30 lít
t to
87
3.2.4.
Phân tích thành phng sinh khi vi tc
89
3.3.
Bƣớc đầu sử dụng sinh khối chủng PQ6 trong sản xuất viên thực
phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản
90


vii

3.3.1.
Sn xut viên Algal Omega- 3 t sinh khi khô chng PQ6
90
3.3.1.1.
Quy trình tạo viên Algal Omega-3
90
3.3.1.2.
Nghiên cứu tính an toàn và hiệu lực của viên Algal Omega-3 (AO-3)
93

3.3.2.
Ứng dụng sinh khối chủng PQ6 trong nuôi trồng thủy sản
102
3.3.2.1.
Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm giàu Artemia và luân trùng
(Brachionus plicatilis)
102
3.3.2.2.
Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu Artemia làm thức
ăn sống cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775)
117
3.3.2.3.
Thử nghiệm sử dụng sinh khối tươi chủng PQ6 làm giàu luân trùng và
Artemia làm thức ăn sống cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer
Bloch, 1790)
119
Chƣơng IV. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
121
4.1.
Đặc điểm sinh học của các chủng Schizochytrium đã phân lập
121
4.2.
Nuôi trồng chủng tiềm năng PQ6 ở các hệ thống lên men
127
4.3.
Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm thực phẩm chức năng và nuôi trồng
thủy sản
135
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
139

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ
142
TÀI LIỆU THAM KHẢO
143
PHỤ LỤC









viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt
Tên đầy đủ
Tiếng Việt
AA
Arachidonic acid (C20:4-6)
Axít arachidonic
AO-3
Algal Omega- 3
Algal Omega- 3
ALT
Alanine aminotransferase
Alanine aminotransferase
AST

Aspartate aminotransferase
Aspartate aminotransferase
ASTM
American Society for Testing and
Materials
Hiệp hội vật liệu và thử nghiệm Hoa
Kỳ
CCT
Chuột cống trắng
Chuột cống trắng
CNT
Chuột nhắt trắng
Chuột nhắt trắng
DHA
Docosahexaenoic acid (C22:6-3)
Axít docosahexaenoic
DNA
Deoxyribonucleic acid
Axít deoxyribonucleic
DO
Dissolved oxygen
Oxy hòa tan
DPA
Docosapentaeoic acid (C22:5-6)
Axít docosapentaeoic
E.coli
Escherichia coli
Vi khuẩn E.coli
EPA
Eicosapentaenoic acid (C20:5-3)

Axít eicosapentaenoic
FAME
Fatty acid methyl ester
Các axít béo dạng methyl ester
GPYc
Glucose-Polypepton- Yeast
extract- chloramphenicol
Môi trường phân lập Schizochytrium
gồm glucose-polypepton- cao nấm
men- chloramphenicol
IPTG
isopropylthio-β-galactoside
isopropylthio-β-galactoside
KLCT
Khối lượng cơ thể
Khối lượng cơ thể
KLK
Khối lượng khô
Khối lượng khô


ix

KLT
Khối lượng tươi
Khối lượng tươi
LB
LCPUFA
Lauria Betani
Long Chain Polyunsaturated Fatty

Acid
Môi trường LB
Axít béo không bão hòa mạch dài đa
nối đôi
LD
50
Lethal dose
Liều gây chết 50% số động vật thực
nghiệm
MĐTB
Mật độ tế bào
Mật độ tế bào
MUFA
Mono-unsaturated fatty acid
Axít béo không bão hòa một nối đôi
NTTS
Nuôi trồng thủy sản
Nuôi trồng thủy sản
PCR
Polymerase chain reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
PUFA
Polyunsaturated fatty acid
Axít béo không bão hòa đa nối đôi
rRNA
Ribosomal ribonucleic acid
ARN riboxom
SEM
Scanning electron microscope
Kính hiển vi điện tử quét

SFA
Saturated fatty acid
Axít béo bão hòa
TFA
Total fatty acid
Axít béo tổng số
TLS
Tỷ lệ sống
Tỷ lệ sống
VTBDD
Vi tảo biển dị dưỡng
Vi tảo biển dị dưỡng








x

DANH MỤC CÁC BẢNG


Trang
Bảng 1.1.
Những thay đổi trong việc phân loại một số loài thuộc chi
Schizochytrium
6

Bảng 1.2.
Hàm lượng lipit và thành phần axít béo của một số loài vi tảo
13
Bảng 1.3.
Tóm tắt một số điều kiện quan trọng cho sự tổng hợp DHA ở
Schizochytrium
18
Bảng 1.4.
Tóm tắt một số nguồn C và N đã được sử dụng để sản xuất -3
PUFA ở một số chủng Schizochytrium
19
Bảng 2.1.
Thời gian và địa điểm thu mẫu
37
Bảng 2.2.
Sơ đồ thí nghiệm nuôi và làm giàu luân trùng
53
Bảng 2.3.
Sự tương quan giữa mật độ (cá thể/ml) với thức ăn A1 DHA Selco
54
Bảng 3.1.
Một số đặc điểm của vị trí thu mẫu
58
Bảng 3.2.
Sinh trưởng và hàm lượng lipít tổng số của các chủng thuộc chi
Schizochytrium đã phân lập
60
Bảng 3.3.
Hàm lượng lipit, thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh
khối của 4 chủng Schizochytrium spp. tiềm năng

69
Bảng 3.4.
So sánh một số đặc điểm sinh học của 4 chủng tiềm năng với hai loài
đại diện của chi Schizochytrium
73
Bảng 3.5.
Các loài thuộc chi Schizochytrium có trình tự đoạn gen 18S rRNA đã
công bố trên GenBank được sử dụng để phân loại các chủng tiềm
năng
76
Bảng 3.6.
Lượng sinh khối khô, hàm lượng lipit và DHA trong sinh khối chủng
PQ6 nuôi ở các hệ thống lên men 5 và 10 lít ở thời điểm 96 giờ
82
Bảng 3.7.
Sự thay đổi thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh khối
chủng PQ6 nuôi trong bình lên men 30 lít thu tại các thời điểm khác
nhau
85
Bảng 3.8.
Thành phần dinh dưỡng, và kim loại nặng trong sinh khối chủng
PQ6 (% KLK)
89


xi

Bảng 3.9.
Thành phần dinh dưỡng của viên Algal Omega-3 (% KLK)
91

Bảng 3.10.
Các chỉ tiêu lý hoá, vi sinh và kim loại nặng của viên Algal Omega-3
92
Bảng 3.11.
Ảnh hưởng của AO- 3 lên một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa máu
của thỏ thí nghiệm
95
Bảng 3.12.
Ảnh hưởng của AO-3 đối với điện tim thỏ ghi ở đạo trình DII
97
Bảng 3.13.
Thời gian đáp ứng phản xạ tìm kiếm thức ăn trong mê lộ của chuột
nhắt trắng (s)
99
Bảng 3.14.
Kết quả đo phản xạ tìm kiếm thức ăn trong mê lộ trên chuột nhắt
trắng non
100
Bảng 3.15.
Kết quả đo đáp ứng phản xạ trên mô hình tránh shock chủ động có
điều kiện ở chuột cống trắng
101
Bảng 3.16.
Thời gian đáp ứng phản xạ của chuột nhắt trắng non trong thử
nghiệm nhảy khỏi phiến nóng
101
Bảng 3.17.
Hàm lượng lipit và axít béo ở Artemia sau khi làm giàu bằng sinh
khối khô chủng PQ6 với các nồng độ khác nhau
104

Bảng 3.18.
Hàm lượng lipit và axít béo ở luân trùng sau khi làm giàu bằng sinh
khối khô chủng PQ6 với các nồng độ khác nhau
107
Bảng 3.19.
Thành phần axit béo của Artemia ở các lô thí nghiệm làm giàu bằng
Golden Power và sinh khối chủng PQ6 sau 15 giờ
111
Bảng 3.20.
Mật độ luân trùng khi nuôi bằng vi tảo biển quang tự dưỡng và men
bánh mì sau 7 ngày
113
Bảng 3.21.
Hàm lượng lipit và thành phần axít béo trong sinh khối luân trùng
sau quá trình nuôi và làm giàu khác nhau
115
Bảng 3.22.
So sánh kích thước của ấu trùng Zoea ở các lô thí nghiệm
119






xii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Trang
Hình 1.1.
Vị trí phân loại chi Schizochytrium
3
Hình 1.2.
Chu trình sống của các chi đại diện thuộc ngành Labyrinthulomycota
4
Hình 1.3.
Cấu trúc hoá học của DHA và EPA
9
Hình 1.4.
Con đường tổng hợp PUFA ở động vật có vú, thực vật và chi
Schizochytrium
22
Hình 3.1.
Khuẩn lạc nuôi cấy trên đĩa thạch (A) và chụp dưới kính hiển vi
quang học (B, độ phóng đại 100 X) của chủng Schizochytrium sp.
PQ6, PQ7, TH16 và TB17
59
Hình 3.2A.
Hình thái tế bào chụp dưới kính hiển vi điện tử quét- SEM (A) và
kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần (B)
62
Hình 3.2B.
Một số giai đoạn trong chu trình sống của chủng PQ6
62
Hình 3.3.
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng
63
Hình 3.4.

Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng
63
Hình 3.5.
Ảnh hưởng của nguồn cácbon lên sinh trưởng
65
Hình 3.6.
Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng
65
Hình 3.7.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng
66
Hình 3.8.
Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng
67
Hình 3.9.
Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng
68
Hình 3.10.
Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số và PCR nhân một phần gen 18S
rRNA của 4 chủng tiềm năng
74
Hình 3.11.
Plasmid sau khi tách chiết và cắt kiểm tra bởi enzyme giới hạn
76
Hình 3.12.
Cây phát sinh chủng loại của 4 chủng Schizochytrium spp. nghiên cứu
với một số loài thuộc chi Schizochytrium đã công bố trên GenBank
78
Hình 3.13.
Sinh trưởng của chủng PQ6, sự thay đổi pH và hàm lượng glucose

còn dư trong môi trường nuôi trong bình lên men 5 lít
80
Hình 3.14.
Sinh trưởng của chủng PQ6, sự thay đổi pH và hàm lượng glucose
còn dư trong môi trường nuôi trong bình lên men 10 lít
81


xiii

Hình 3.15.
Hình thái tế bào chủng PQ6 trong bình lên men 5 lít (A), 10 lít (B) ở
các giai đoạn nuôi cấy khác nhau
82
Hình 3.16.
Sinh trưởng của chủng PQ6, sự thay đổi pH và hàm lượng glucose
còn lại trong môi trường nuôi trong bình lên men 30 lít
83
Hình 3.17.
Ảnh chụp tế bào chủng PQ6 nuôi ở bình 30 lít tự tạo ở các thời điểm
khác nhau dưới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi huỳnh
quang (B) sau khi nhuộm Nile Red
84
Hình 3.18.
Sơ đồ quy trình nuôi theo mẻ chủng PQ6 trong bình lên men 30 lít
87
Hình 3.19.
Quy trình tạo viên Algal Omega-3 từ sinh khối chủng PQ6
91
Hình 3.20.

Ảnh hưởng của AO-3 lên sự tăng khối lượng cơ thể thỏ
94
Hình 3.21.
Ảnh chụp hình thái của gan, lách, thận thỏ trước và sau khi uống AO-
3 dưới kính hiển vi huỳnh quang
98
Hình 3.22.
Tỷ lệ sống (%) (A) và thời gian chuyển giai đoạn (B) của ấu trùng cua
xanh ở các giai đoạn khi ăn Artemia được và không được làm giàu
bằng sinh khối tươi chủng PQ6
118
Hình 3.23.
Tỷ lệ sống của cá Chẽm giai đoạn 1 tháng tuổi khi ăn bằng luân trùng
và Artemia được làm giàu bằng sinh khối chủng PQ6 và A1 DHA
Selco
120
Hình 3.24.
Tăng trưởng về chiều dài của cá Chẽm giai đoạn 3 ngày tuổi đến 1
tháng tuổi khi ăn bằng luân trùng và Artemia làm giàu bằng sinh khối
chủng PQ6 và A1 DHA Selco
120





1

MỞ ĐẦU
Được coi là nền công nghiệp mang lại hàng tỷ đô la hàng năm, công nghệ sinh

học vi tảo ngày càng mở ra nhiều lĩnh vực nghiên cứu mới. Mặc dù vậy, việc sử dụng
vi tảo nhằm tăng cường giá trị dinh dưỡng của thực phẩm cho con người và thức ăn
cho động vật vẫn là những lĩnh vực chiếm ưu thế, mang lại lợi nhuận cao và có một
lịch sử phát triển tương đối lâu dài.
Schizochytrium là một chi vi tảo biển dị dưỡng phân bố rộng rãi trong hệ sinh
thái biển và rừng ngập mặn. Chúng đóng vai trò là những sinh vật phân huỷ, mắt
xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn ở những hệ sinh thái nói trên. Loại vi tảo này có
khả năng tích lũy hàm lượng cao lipit (có thể lên tới 70% khối lượng khô) và các axít
béo không bão hoà thuộc nhóm omega-3 (-3 PUFA) như axít eicosapentaenoic
(EPA, C20: 5-3), axít docosahexaenoic (DHA, C22: 6-3). Những tác động tích
cực cũng như tầm quan trọng của các -3 PUFA này đã được chứng minh ở nhiều
khía cạnh như sự phát triển toàn diện của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tim mạch, hệ
thần kinh, và trong nhiều liệu pháp điều trị các bệnh ung thư, mất trí nhớ, trầm
cảm…. Hiện nay, loại vi tảo này được coi là ứng cử viên tiềm năng thay thế nguồn
sản xuất -3 PUFA truyền thống từ dầu cá. Việc nuôi cấy chúng có thể được thực
hiện ở quy mô lớn bằng những hệ thống lên men thông thường với hiệu quả cao.
Nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ loại vi tảo này dành cho con người, và động vật đã
có mặt trên thị trường quốc tế và dần trở nên quen thuộc với người tiêu dùng ở khắp
nơi trên thế giới.
Việt Nam đang sở hữu một khu hệ động thực vật biển rất đa dạng về thành
phần loài/chủng và giàu các hợp chất tự nhiên có thể dùng trong công nghiệp, thực
phẩm, nông nghiệp, y dược trong đó có vi tảo. Vi tảo biển quang tự dưỡng là một
trong những đối tượng truyền thống đã được các nhà nghiên cứu trong nước quan
tâm cho nhiều mục đích khác nhau trong đó có nuôi trồng thuỷ sản
(Nannochloropsis, Isochrysis, Chaetoceros…). Tuy nhiên, những nghiên cứu nhằm
khai thác và ứng dụng các chi vi tảo biển dị dưỡng, đặc biệt là chi Schizochytrium
vẫn còn là rất mới, hứa hẹn sẽ mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống con
2

người. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh

học và khả năng ứng dụng của chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium
mangrovei PQ6”.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
 Có được bộ sưu tập chủng vi tảo biển dị dưỡng thuộc chi Schizochytrium phân
lập từ một số vùng biển, vùng rừng ngập mặn của Việt Nam và sàng lọc các
chủng tiềm năng cho việc sản xuất -3 PUFA.
 Lựa chọn được một chủng tiềm năng để nuôi thu sinh khối tạo viên thực phẩm
chức năng và thử nghiệm trên một số đối tượng thuỷ hải sản.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
 Phân lập các chủng Schizochytrium spp. từ các mẫu lá cây thu thập ở ven bờ
biển, vùng rừng ngập mặn ở Việt Nam;
 Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của một số chủng tiềm năng đã phân
lập;
 Nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ thống lên men khác
nhau (5, 10 và 30 lít);
 Sản xuất viên Algal Omega- 3 từ sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6,
đánh giá tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm này trên động vật thực
nghiệm;
 Sử dụng sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6 làm giàu Artemia và luân
trùng (Brachionus plicatilis) để ương nuôi ấu trùng cua xanh (Scylla serrate
Forskal, 1775) và cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790).
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
 Bổ sung thêm chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mới vào danh sách các
chi vi tảo biển có nguồn gốc từ Việt Nam;
 Có được những dẫn liệu khoa học về các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
của một số loài/chủng tiềm năng thuộc chi Schizochytrium đã được phân lập;
 Chứng minh được khả năng ứng dụng chủng vi tảo Schizochytrium mangrovei
PQ6 trong lĩnh vực sản xuất thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản.

3
Chương I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Hệ thống phân loại, các kĩ thuật phân lập và định tên chi Schizochytrium
1.1.1. Hệ thống phân loại
Trong những nghiên cứu trước đây, chi Schizochytrium được xếp vào bộ
Saprolegniales thuộc ngành Oomycota do có nhiều nét tương đồng với nấm động
bào tử. Tuy nhiên, ngày nay với những bằng chứng về siêu cấu trúc và trình tự
nucleotit của đoạn gen 18S rRNA thu được, các nhà khoa học đã xếp chúng vào
một giới riêng - giới Chromista. Chi Schizochytrium được xếp vào ngành
Labyrinthulomycota, lớp Labyrinthulea, bộ Labyrinthulida, họ Thraustochytriidae
(Porter, 1990; Cavalier- Smith, 1998). Sơ đồ phân loại chi Schizochytrium được chỉ
ra trên hình 1.1.












Chi Schizochytrium được đặc trưng bởi tế bào hình cầu, mạng lưới ngoại
chất rất phát triển, khuẩn lạc sinh dưỡng lớn, động bào tử có dạng ovan hoặc dạng
trứng, sinh trưởng bằng hình thức tế bào sinh dưỡng phân đôi liên tiếp tạo thành 4,
8 hoặc một cụm tế bào (có thể lên tới 100 tế bào). Cũng như nhiều chi thuộc ngành
Heterokontophyta, trong chu trình sống của tế bào có giai đoạn hình thành động bào
Hình 1.1. Vị trí phân loại chi Schizochytrium (Porter, 1990)

…
Labyrinthuloides
Thraustochytrium
Schizochytrium
Labyrinthula
Thraustochytriidae
Labyrinthulidae
L




Họ
Ukenia
Chi
Ngành
Labyrinthulomycota
Lớp
Labyrinthulea
Bộ
Labyrinthulida


4
tử có hai roi lệch. Hình 1.2 là hình mô tả chu trình sống của một số chi đại diện
(Porter, 1990).

Hình 1.2. Chu trình sống của các chi đại diện thuộc ngành Labyrinthulomycota
(Porter, 1990)
Chú thích: chi Schizochytrium: tế bào non với mạng lưới ngoại chất (a) phân chia liên tiếp
tạo thành 4 tế bào (b) và tạo thành một khối các tế bào (c); Mỗi tế bào phát triển thành túi
động bào tử (d) và giải phóng động bào tử (e), động bào tử biệt hóa thành tế bào non.

Thành tế bào có chứa sulphate polysacharide với thành phần chủ yếu là
galactose hoặc fructose và protein (Chamberlain, 1980). Hệ thống mạng lưới ngoại
chất (EN) được sinh ra từ một hoặc nhiều điểm trên thành tế bào. EN hình thành
nên một mạng lưới nhánh của màng sinh chất kéo dài, liên quan đến một bào quan
gọi là bothrosome hoặc sagenogenetosome (sagenogen) ở phía bề mặt ngoài tế bào
(Porter, 1990). EN góp phần làm tăng vùng bề mặt tế bào, có chứa enzyme thủy


5
phân gắn trên bề mặt hoặc nằm chìm trong môi trường xung quanh đã giúp cho việc
tiêu hóa dễ dàng các vật liệu hữu cơ. EN cũng gắn tế bào với môi trường và tiến
hành phân hủy các cơ chất hữu cơ. Tế bào hầu như không sản xuất EN khi phát

triển trên môi trường lỏng giàu dinh dưỡng, đặc biệt là trong điều kiện nuôi lắc
(Raghukumar, 2008).
Hiện có 5 loài thuộc chi Schizochytrium đã được mô tả bao gồm S.
mangrovei Raghukumar, S. aggretatum Goldstein & Belsky, S. octosporum
Raghukumar, S. minutum Gaertner và S. limacinum Honda & Yokochi
(Raghukumar, 1988; Honda và cs, 1998). Trong cả một thời gian dài sự phân loại
của chi Schizochytrium nói riêng và lớp Labyrinthulea nói chung chỉ dựa vào duy
nhất các đặc điểm hình thái và hình thức giải phóng động bào tử. Khóa phân loại chi
tiết của các họ và chi thuộc lớp Labyrinthulea dựa trên các đặc điểm hình thái (hình
dạng tế bào, mạng lưới ngoại chất, tế bào amip), sự hình thành động bào tử và tổng
hợp sắc tố (chủ yếu là beta-caroten) đã được Yokoyama và cộng sự đưa ra năm
2007 (Yokohama và cs., 2007; Jones & Pang, 2012). Ngày nay, các công cụ sinh
học phân tử hiện đại đã hỗ trợ đắc lực trong việc phân loại chính xác hơn các loài
thuộc các chi khác nhau. Mặc dù còn là lĩnh vực khá non trẻ, hệ gen của các sinh
vật đơn bào ở biển giúp chúng ta hiểu biết nhiều hơn về sinh vật nhân chuẩn
(Worden & Allen, 2010). Hệ gen này có thể là những công cụ vô giá cho việc khai
thác mối quan hệ tiến hóa, chức năng gen, trao đổi chất và sự phát triển của các đặc
điểm phức tạp giữa các nhóm vi sinh vật (McGrath & Katz, 2004) và sẽ tiếp tục làm
sáng tỏ những điểm còn đang tranh cãi. Nhìn chung, các sinh vật biển đơn bào có
độ đa dạng cao do chúng là kết quả của các hiện tượng nội cộng sinh khác nhau
diễn ra từ xa xưa (Worden & Allen, 2010).
Yokoyama và cộng sự đã đề xuất bổ sung thêm 5 chi mới nâng tổng số lên
12 chi thuộc họ Thraustochytriidae (Yokoyama & Honda, 2007; Yokoyama và cs,
2007). Điều này dẫn đến sự sắp xếp lại một số loài trong đó có 4 loài thuộc chi
Schizochytrium (bảng 1.1). Tuy nhiên, đây vẫn còn là vấn đề đang gây tranh cãi đối
với các nhà khoa học.


6
Bảng 1.1. Những thay đổi trong việc phân loại một số loài thuộc chi

Schizochytrium (Jones & Pang, 2012)
Chi
Tên mới
Tên gốc

Oblongichytrium
Oblongichytrium minutum
(A. Gaertn.) R. Yokoyama và D. Honda
Schizochytrium minutum
Gaertn.
Oblongichytrium octosporum
(Raghuk.) R Yokoyama và D. Honda
Schizochytrium octosporum
Raghuk.
Aurantiochytrium
Aurantiochytrium limacinum (D. Honda và
Yokochi) R. Yokoyama và D. Honda
Schizochytrium limacinum
D. Honda và Yokochi
Aurantiochytrium mangrovei
(Raghuk.) R. Yokoyama và D. Honda
Schizochytrium mangrovei
Raghuk.

1.1.2. Kĩ thuật phân lập và định tên
1.1.2.1. Kĩ thuật phân lập
Phương pháp dùng mồi là phấn thông (pine pollen baiting) và trải trực tiếp
trên đĩa (direct plating) là phương pháp hiệu quả, được sử dụng để phân lập các loài
thuộc họ Thraustochytriidae nói chung và chi Schizochytrium nói riêng (Bremer,
2000; Burja và cs, 2006; Jakobsen và cs, 2007). Các hạt phấn thông được khử trùng

được rải trên bề mặt mẫu nước biển có chứa kháng sinh, chất kháng nấm và được ủ
1–2 tuần. Khi quan sát thấy các tế bào phát triển trên bề mặt phấn thông, chúng sẽ
được trải trên đĩa thạch để thu nhận các khuẩn lạc đặc trưng trước khi đưa vào môi
trường lỏng nuôi cấy nhằm thu chủng sạch (Wilkens & Maas, 2012).
Nhiệt độ có thể ảnh hưởng lên quá trình phân lập thành công hay không vì
khi tiến hành phân lập ở 18-30
o
C cũng là nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của cả
các vi sinh vật tạp nhiễm như nấm và vi khuẩn. Các chất kháng sinh như penicillin
và streptomycin (Burja và cs, 2006; Quilodran và cs, 2010), rifampicin và các thuốc
kháng nấm như nystatin (Jakobsen và cs, 2007; Wilkens & Maas, 2012) và
amphotericin B (Taoka và cs, 2010) đã được bổ sung vào môi trường thạch và lỏng
để hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và các khuẩn lạc sợi nấm.


7
1.1.2.2. Các kĩ thuật định tên
* Kĩ thuật hóa sinh
Kĩ thuật nhuộm huỳnh quang đã được phát triển nhằm xác định số lượng tế
bào nhờ phản ứng giữa fluorochrome (acriflavine), thành tế bào và nhân. Khi đó,
thành tế bào bắt màu đỏ, nhân bắt màu xanh. Tuy nhiên, kĩ thuật này trong một số
trường hợp không thể phát hiện được các tế bào Schizochytrium ở giai đoạn động
bào tử (do hầu hết các loài không có thành tế bào) hoặc khi các tế bào có thành
mỏng (Gupta và cs, 2012). Một phương pháp đặc hiệu để phát hiện họ
Thraustochytriidae là lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) đã được thiết lập với việc sử
dụng một đầu dò ThrFL1 đối với rRNA đích đã cho phép giải quyết được những
hạn chế nêu trên (Takao và cs, 2007). Trong kĩ thuật FISH có quá trình lai giữa đầu
dò ThrFL1 với rRNA sẽ cho phép phát hiện các động bào tử và các tế bào sinh
dưỡng còn non. Phương pháp nhuộm bằng Sudan Black cũng đã được sử dụng để
phát hiện ra các tế bào thuộc họ Thraustochytriidae nói chung (Wong và cs, 2008;

Gupta và cs, 2012).
* Định tên bằng kĩ thuật sinh học phân tử
Kĩ thuật định tên bằng sinh học phân tử dựa trên việc đọc và phân tích trình
tự của gen hoặc đoạn gen 18S rRNA đã được sử dụng để xác định mối quan hệ di
truyền của các chủng phân lập chưa biết và những chủng đã được biết thuộc họ
Thraustochytriidae. Phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen 18S rRNA cần một cặp
mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên các trình tự gen đã biết của các chủng nghiên
cứu. Sau đó việc so sánh và phân tích mối quan hệ di truyền sẽ được tiến hành để
tìm ra loài mới (Mo và cs, 2002; Yokoyama & Honda, 2007). Đây là công cụ tương
đối chính xác cho phép xác định hoặc thiết lập các mối quan hệ giữa các loài thuộc
họ Thraustochytriidae.
* Phân tích siêu cấu trúc
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) đã cho phép phát hiện nhiều
thể lipit trong phần tế bào chất của tế bào thuộc họ Thraustochytriidae. Các thể lipit
này sau đó được xác định lại bằng phương pháp nhuộm với Sudan Black B


8
(Subramaniam & Chaubal, 1990). Nghiên cứu siêu cấu trúc tế bào bằng TEM đã
cho phép dựng nên những nét chung về cấu tạo tế bào thraustochytrid với kích
thước rất khác nhau, đường kính xấp xỉ 6–21 μm, phần tế bào chất dạng hạt có chứa
các hạt dầu hình cầu. Dưới kính hiển vi TEM có thể quan sát thấy một thể lipit liên
kết với các cấu trúc mảnh, rỗng có chứa các băng sáng, tối. Dạng cấu trúc mảnh này
đã được mô tả như là tỷ lệ của các axít béo bão hòa, không bão hòa một nối đôi trên
các axít béo không bão hòa đa nối đôi (Wong và cs, 2008). Người ta cũng đã quan
sát thấy có một mối liên hệ giữa sự hình thành thể lipit và mạng lưới nội chất (ER)
ở S. limacinum SR21 (Morita và cs, 2006). Các thể lipit bao quanh bởi ER đã được
nghiên cứu rộng rãi ở nấm Mortierella ramanniana (Kamisaka và cs, 1999) trong
khi những nghiên cứu tương tự thì chưa được thực hiện đối với họ
Thraustochytriidae.

1.2. Các axít béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 (-3 PUFA)
1.2.1. Giới thiệu chung về

-3 PUFA
Trong những thập niên gần đây, các axít béo không bão hoà đa nối đôi
(polyunsaturated fatty acid - PUFA) đã được đặc biệt quan tâm nghiên cứu và ứng
dụng trong dinh dưỡng và dược phẩm. PUFA là các axít béo mạch dài (18 - 22
nguyên tử cácbon) có chứa hai hoặc nhiều hơn các liên kết cácbon đôi. Chúng được
phân loại theo vị trí của liên kết đôi đầu tiên được tính từ đầu methyl. Để chỉ vị trí
nối đôi đầu tiên trên mạch cacbon, người ta có thể sử dụng ký hiệu “n” hay “ω”.
Hiện PUFA được phân thành hai nhóm chính là -3 (liên kết đôi đầu tiên tại vị trí
cácbon thứ 3) và -6 (liên kết đôi đầu tiên tại vị trí cácbon thứ 6). Các liên kết đôi
trong PUFA có thể cũng được tính từ nhóm carboxyl và khi đó được ký hiệu là “Δ”.
Axít docosahexaenoic (DHA, 22:6 Δ 4,7,10,13,16,19) và axít eicosapentaenoic
(EPA, 20:5 Δ 5,8,11,14,17) là hai thành viên thuộc họ ω-3 PUFA được quan tâm
nghiên cứu nhiều nhất bởi vai trò đặc biệt quan trọng của chúng đối với con người
và động vật. Cấu trúc hoá học của hai ω-3 PUFA này được chỉ ra trên hình 1.3
(Sijtsma & de Swaaf, 2004).



9

1.2.2. Vai trò của

-3 PUFA đối với sức khoẻ con người
Các PUFA có ba vai trò sinh học chủ yếu. Đầu tiên phải kể tới việc tham gia
vào sự điều hòa quá trình trao đổi lipít, vận chuyển và hướng tới các mô. Ví dụ các
hoạt động bao gồm sự ức chế quá trình sinh tổng hợp triacylglycerol ở gan bởi các
-3 PUFA. Bên cạnh đó, các PUFA còn tham gia vào thành phần cấu trúc nên
thành tế bào. Sự có mặt của chúng trong thành phần phospholipit góp phần tạo nên
tính linh động của màng. Điều này góp phần quan trọng trong việc điều chỉnh hoạt
động của các protein màng. Màng phospholipit cũng là nguồn các phân tử thông tin
thứ hai như diacylglycerol, phosphatidic, inositol–1, 4, 5- trisphosphate, ceramide
và AA (axít arachidonic) - những phân tử chịu trách nhiệm cho các hoạt động tín
hiệu của màng tới vùng nguyên sinh chất và nhân để điều chỉnh tương ứng các phản
ứng đáp lại; và các phân tử tín hiệu ngoại bào như yếu tố hoạt hoá tiểu cầu. Ngoài
ra, một số PUFA còn đóng vai trò là cơ chất cho việc tổng hợp các phân tử có hoạt
tính sinh học như prostaglandin (PG), thromboxan (TX) và leukotrien (LT) (Calder,
2003).
Trong thập niên 80, những hiểu biết của con người về PUFA nói chung đã
được mở rộng, đặc biệt là các -3 PUFA. Con người không tự tổng hợp được -3
và -6 PUFA do thiếu enzyme delta-12 và delta-15 desaturase và vì vậy, chúng
phải được lấy từ ngoài vào thông qua chế độ ăn (Calder, 2003). Việc tiêu thụ EPA
và DHA đã được chứng minh là có thể ngăn ngừa bệnh tim mạch, hệ thần kinh và
tình trạng viêm. Do liên quan đến sức khỏe tim mạch nên nếu thường xuyên tiêu thụ
Hình 1.3. Cấu trúc hoá học của DHA và EPA (Sijtsma & de Swaaf, 2004)


10
-3 PUFA có thể sẽ giúp giảm nguy cơ huyết áp cao, nghẽn mạch, nhồi máu cơ tim
và rối loạn nhịp tim. Điều này là do các -3 PUFA đã có tác dụng làm tăng tỷ lệ
lipoprotein tỷ trọng cao/lipoprotein tỷ trọng thấp (HDL/LDL) và giảm tỷ lệ

cholesterol tổng số/HDL (Adarme-Vega và cs, 2012). DHA và EPA cũng ức chế sự
tăng sinh của các tế bào cơ trơn mạch máu vì vậy, góp phần phòng ngừa bệnh xơ
vữa động mạch (Horrocks & Yeo, 1999). Li và cộng sự (2003) đã chỉ ra rằng việc
thu nhận đầy đủ -3 PUFA trong đó có DHA ở giai đoạn trẻ nhỏ sẽ giúp ngăn ngừa
nguy cơ tăng huyết áp khi về già.
Ngoài những lợi ích đối với tim mạch, -3 PUFA cũng được chứng minh có
ảnh hưởng tích cực đến chức năng của não và hệ thần kinh. Sự tích lũy DHA trong
màng tế bào thần kinh là một chỉ số quan trọng cho sự phát triển của não và khả
năng chịu đựng (Kim, 2008). EPA và DHA có khả năng điều chỉnh một cách hiệu
quả hàm lượng cholesterol trong huyết thanh. Do đó, nó góp phần ngăn chặn sự rối
loạn về tâm thần (Narayan và cs, 2006). Vai trò của EPA và DHA trong việc làm
giảm nguy cơ rối loạn tâm thần có thể là do chúng có tác động đến thụ thể dẫn
truyền thần kinh và G-protein thông qua sự tác động lên các tính chất sinh lý của
màng tế bào, các tín hiệu thứ cấp và trên các protein kinase.
Ở phụ nữ mang thai, người mẹ được hấp thụ đủ lượng EPA và DHA có vai
trò rất quan trọng cho sự phát triển khỏe mạnh não bộ của thai nhi. Ở trẻ sơ sinh,
arachidonic acid (ARA) - một loại -6 PUFA và DHA cũng cần cho sinh trưởng và
phát triển các chức năng bình thường của cơ thể (Adarme-Vega và cs, 2012). Cơ thể
trẻ không thể tổng hợp DHA đủ nhanh để đáp ứng cho sự phát triển nhanh chóng
của não nên axít béo này phải được nhận từ khẩu phần ăn hàng ngày. Nhìn chung,
nuôi con bằng sữa mẹ sẽ đáp ứng và cung cấp đầy đủ nhu cầu nguồn PUFA cho trẻ
nhỏ. Mặc dù từ lâu đã có những khuyến cáo là nên bổ sung DHA vào tất cả các
công thức dinh dưỡng cho trẻ, nhưng thực tế DHA chỉ mới được bổ sung trong một
số công thức dinh dưỡng cho trẻ mới gần đây (Birch và cs, 2007; Innis, 2008). Các
thử nghiệm lâm sàng với chế độ ăn giàu DHA có thể cải thiện khả năng học tập của
trẻ em trong độ tuổi đến trường (Richardson & Montgomery, 2005). Tác động tích