Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ vi khuẩn ưa nhiệt

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN






NGUYỄN THỊ NHIÊN






LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN XỐP TỐI ƯU VÀ NGHIÊN CỨU
ĐẶC TÍNH XYLANASE TỪ VI KHUẨN ƯA NHIỆT







LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012


1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





NGUYỄN THỊ NHIÊN






LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN XỐP TỐI ƯU VÀ NGHIÊN CỨU
ĐẶC TÍNH XYLANASE TỪ VI KHUẨN ƯA NHIỆT

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40



LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. ĐÀO THỊ LƯƠNG








Hà Nội - 2012


3

MỤC LỤC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
1.1.
T 
13
1.2.



18
1.3.
Mt s nhóm vi sinh vc dùng trong lên men xp (Raimbault,


28
3.1.
Hot tính xylanase ca 26 chng vi sinh vt nghiên c
55
3.2.
Kh u nhit ca các chng vi sinh vt
56
3.3.
ng ca các loi dch chin hiu qu thu hi enzyme
xylanase

73
3.4.
Kt qu ta enzyme xylanase ca chng 118 và B
2
H
2
bng các dung môi
h

73

4
MỤC LỤC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
1.1.
 
14
1.2.
 
16
1.3.
Cu trúc không gian xylanase ca Bacillus subtilis 
19
1.4.
Các enzyme cn thit phân c 
20
1.5.
S thy phân thành t bào thc vt b 
24
3.1.
V trí phân loi ca chng B
2

H
2
vi các loài có quan h h hàng gn
57
3.2.
Hình thái khun lc và t bào chng B
2
H
2
 
58
3.3.
V trí phân loi ca chng XK-118 vi các loài có quan h h hàng gn
59
3.4.
Hình thái khun lc và cung sinh bào t ch
60
3.5.
ng thích hp cho s ng và tng hp enzyme ca 2
chng B
2
H
2
và 118 

61
3.6.
Nhi thích hp cho s ng và tng hp enzyme ca 2 chng
B
2

H
2


62
3.7.
pH thích hp cho s ng và tng hp enzyme chng B
2
H
2
và


63
3.8.
Thi gian thích hp cho ging khng ca chng B
2
H
2
 
65
3.9.
t thích hp cho quá trình tng hp xylanase ca 2 chng B
2
H
2
và


66

3.10.
ng c n kh ng hp enzyme xylanase ca 2
chng B
2
H
2
và 118 

67
3.11.
Thi gian nuôi cy thích hp cho kh ng hp xylanase ca 2
chng B
2
H
2
và 118 

68
3.12.
T l ging cy thích hp cho kh a chng B
2
H
2
và
118 

69
3.13.
 




 ng hp xylanase ca

2
H
2
và chng 118

70
3.14.
M ng ca cao thn kh ng hp xylanase ca
chng B
2
H
2


71


5
3.15.
M ng cn kh ng hp xylanase ca chng
 

72
3.16.
 




 ng hp xylanase ca 2

2
H
2
và chng 18

73
3.17.
La chn hn hp khoáng thích hp cho kh ng hp
xylanase c


2
H
2
và chng 118


74
3.18.
Si ion DEAE sepharose mu enzyme ta aceton ca chng
118  

76
3.19.
Si ion s dng dch enzyme cn có ho
xylanase cao  c ra ct

77
3.20.
 trên gel ho mu enzyme thô có ME (1) và không có ME
(2); mu enzyme ta aceton có ME (3) và không có ME (4)

78
3.21.
n di trên gel hot tính mu enzyme ta aceton
79
3.22.
Ho xylanase chng 118 thu hc khi ta trong mui
ammonisunfat t n 90%

80
3.23.
n di trên gel SDS-n di trên gel ho mu enzyme ta
aceton và mu enzyme ta ammonisunfat t n 90%

80
3.24.
Si ion dch enzyme ta ammonisunfat 50%
81
3.25:
Kt qu si ion mu enzyme ta ammonisunfat 80%
82
3.26.
n di SDS-PAGE mu enzyme ta ammonisunfat 80%, E1 và E2
83
3.27.

Di pH thích hp cho hong ca xylanase t 118
83
3.28.
Nhi phn ng ta enzyme xylanase t chng 118
84
3.29.
ng ca các ion kim lon hong ca enzyme xylanase t
118

85
3.30.
Kh u nhit ca các enzyme xylanase t chng 118  60
0
C
86
3.31.
Kh n nhit ca hai loi xylanase tinh sch t chng 118 
86
3.32.
ng cn ho xylanase ca chng B
2
H
2

87
3.33.
Nhi thích hp cho phn ng enzyme xylanase t chng B
2
H
2

88
3.34.
Kh u nhit ca enyme xylanase t chng B
2
H
2

88
3.35.
ng ca các ion kim loi n ho xylanase
89



6
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 11
1. Lý do lựa chọn đề tài 11
2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu 12
3. Những đóng góp mới của đề tài 12
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13
1.1. XYLAN 13
1.1.1. Xylan 13
1.1.2. Cấu trúc của xylan 14
1.2.3. Tính chất của xylan 15
1.2. ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE 16
1.2.1. Nguồn gốc xylanase 16
1.2.2. Phân loại xylanase 17
1.2.3. Cấu trúc 18

1.2.4. Đặc tính của xylanase 19
1.2.5. Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt động của enzyme xylanase 21
1.2.5.1. Ảnh hưởng của một số ion kim loại 21
1.2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 22
1.2.5.3. Ảnh hưởng của pH 22
1.2.5.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa 23
1.2.6. Ứng dụng của xylanase 23
1.2.6.1. Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp thực phẩm 23
1.2.6.2. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 24
1.2.6.3. Ứng dụng của xylanase trong sản xuất nguyên liệu sinh học 24
1.2.6.4. Ứng dụng trong công nghiệp vải sợi 25
1.2.6.5. Ứng dụng trong nông nghiệp 25
1.2.6.6. Ứng dụng của xylanase trong xử lý môi trường 25
1.2.7. Vi sinh vật sinh xylanase 26
1.3. LÊN MEN XỐP 26
1.3.1. Khái niệm lên men xốp 26
1.3.2. Ưu điểm của kỹ thuật lên men xốp 27
1.4. TINH SẠCH ENZYME XYLANASE 30
1.4.1. Tủa enzyme bằng muối ammonisunfat 31
1.4.2. Tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ 32


7
1.4.3. Sắc ký 33
1.4.3.1. Sắc ký lọc gel 33
1.4.3.2. Sắc ký trao đổi ion 34
1.4.3.3. Sắc ký ái lực 35
1.4.3.4. Sắc ký tương tác kỵ nước 36
1.4.3.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC 36
1.4.4. Điện di 37

1.4.4.1. Điện di trên gel agarose 38
1.4.4.2. Điện di trên gel polyacrylamide 38
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40
2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƢỜNG VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 40
2.1.1. Chủng vi sinh vật 40
2.1.2. Môi trường nghiên cứu 40
2.1.2.1. Môi trường nhân giống (g/l) 40
2.1.2.2. Môi trường nuôi dịch thể 40
2.1.2.3. Môi trường kiểm tra hoạt độ enzyme 41
2.1.2.4. Môi trường nuôi xốp 41
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu 41
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41
2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính xylanase 41
2.2.1.1. Phương pháp định tính (khuếch tán trên thạch) 41
2.2.1.2. Phương pháp định lượng 42
2.2.2. Tuyển chọn chủng 44
2.2.3. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng 44
2.2.4. Phương pháp phân loại 44
2.2.4.1. Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN 44
2.2.4.2. Quan sát hình thái 48
2.2.5 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp
xylanase ở các chủng vi sinh vật nghiên cứu 49
2.2.5.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng tổng
hợp xylanase ở các chủng nghiên cứu 49
2.2.5.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp
xylanase ở các chủng nghiên cứu 49
2.2.6. Thu hồi enzyme 51


8

2.2.6.1.Chiết enzyme 51
2.2.6.2. Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ 51
2.2.7. Tinh sạch xylanase của chủng 118 52
2.2.7.1. Tủa enzyme trong dung môi hữu cơ 52
2.2.7.2. Tủa enzyme trong muối ammonisunfat 52
2.2.7.3. Sắc ký trao đổi ion 52
2.2.8. Điện di 53
2.2.8.1. Điện di trên gel SDS-PAGE 53
2.2.8.2. Điện di trên gel hoạt tính 53
2.2.9. Nghiên cứu đặc tính enzyme 54
2.2.9.1. pH thích hợp cho hoạt động của enzyme 54
2.2.9.2.Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme 54
2.2.9.3. Khả năng bền nhiệt của enzyme 54
2.2.9.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ enzyme 54
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55
3.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN 55
3.1.1. Lựa chọn các chủng có hoạt độ xylanase cao 55
3.1.2. Lựa chọn các chủng vi sinh vật bền nhiệt có hoạt tính xylanase cao 55
3.2. PHÂN LOẠI 56
3.2.1. Chủng B
2
H
2
56
3.2.1.1. Phân tích trình tự ADNr 16S 56
3.2.1.2. Đặc điểm hình thái 57
3.2.2. Chủng 118 58
3.2.1.2. Phân tích trình tự ADNr 16S 58
3.2.1.3. Đặc điểm hình thái 59
3.3. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 60

3.3.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống 60
3.3.1.1. Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng 60
3.3.1.2. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng 62
3.3.1.3. pH thích hợp cho sự sinh trưởng 63
3.3.1.4. Thời gian thích hợp cho giống khởi động 64
3.3.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp 65
3.3.2.1. Lựa chọn cơ chất 65
3.3.2.2. Lựa chọn độ ẩm thích hợp 65


9
3.3.2.4. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp 68
3.3.2.5. Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung 68
3.3.2.6. Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung 71
3.3.2.7. Lựa chọn loại khoáng thích hợp 72
3.4. THU HỒI ENZYME 72
3.4.1. Điều kiện thích hợp cho chiết enzyme 72
3.4.2. Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ 73
3.5. TINH SẠCH ENZYME 74
3.5.1. Tinh sạch enzyme xylanase chủng 118 theo phương pháp sắc ký trao
đổi ion 74
3.5.2. Tinh sạch xylanase của chủng 118 bằng phương pháp tủa trong muối
ammonisunfat bão hòa kết hợp với sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE. 77
3.6.1. Đặc tính enzyme xylanase từ chủng 118 81
3.6.1.1. pH thích hợp 81
3.6.1.2. Nhiệt độ thích hợp 82
3.6.1.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại 83
3.6.1.4. Khả năng chịu nhiệt của enzyme 84
3.6.2. Đặc tính xylanase từ B
2

H
2
86
3.6.2.1. pH thích hợp 86
3.5.2.2. Nhiệt độ 87
3.5.2.3. Bền nhiệt 88
3.5.2.4. Ảnh hưởng của ion kim loại 88
KÊ
́
T LUÂ
̣
N 90
KIẾN NGHỊ 91
TÀI LIỆU THAM KHẢO 92
 92
 92
PHỤ LỤC 96



10
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

HPLC : High Performance Liquid Chromatography (sc ký lng hi
cao)
ADN : Acid Deoxyribose Nucleic (acid deoxyribonucleic)
ADNr : Acid Deoxyribose Nucleic ribosome (acid deoxyribonucleic
ribosome)
ARN : Acid Ribose Nucleic (acid ribonucleic)
bp : base pair (cp base)

C : các bon
CMC : Carboxymethyl cellulose
Da : Dalton
DEAE : Diethylaminoethyl
DNS : Dinitro-salicylic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
EtBr : Ethidium Bromide
G : gram
GH : Glycoside Hydrolase
kb : Kilo-base
kDa : Kilo-Dalton
mA : mini Ampe
PCR : Polymerase Chain Reaction (Phn ng chui polymerase)
SDS : Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis
TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid
TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid
TEMED : Tetramethylethylenediamine
U : Unit )
v/p : Vòng /phút
VPG : Vòng phân gii
XK : X khun
YG : Yeast Glucose ng YG)



11
MỞ ĐẦU

1. Lý do lựa chọn đề tài
Trong nhiây, nhu cu s dng enzyme có ngun gc t vi sinh
v   c bi  c s dng trong
nhiu ngành sn xut trên toàn th gii [26, 15]. Mt trong nhng ng dng quan
trng c b sung vào th có mt ca
xylanase trong thy quá trình tiêu hóa, ci thin
h vi sinh vng rut cng vc ng
dng trong nhiy rác thi; ty trng trong công nghip
sn xut giy, sn xut nhiên liu sinh h
Xét  quy mô công nghip, sn xut enzyme là m
phát trin ca công ngh sinh hc nói chung và công ngh thc phm nói riêng. Nhu
cu s dng enzyme có ngun gc t vi sinh vc bit là
c s dng trong nhiu ngành sn xut trên toàn th gii [14].
Trong sinh ging vt và thc vt không có kh  sinh xylanase, do
y phân xylan ph thuc ch yu vào ngun vi sinh vc bit quan
trng là các nhóm vi khun, x khun và nc nghiên cu xylanase
ch yc ting nm si. Tuy nhiên, g i s
phát m ca khoa hc công ngh, ngày càng nhiu chng vi sinh vt có kh 
c phát hin và nghiên cng thc liên quan
n enzyme xylanase và ng dng ca loi enzyme này  vi khun và x khun
c các nhà khoa h
Lên men xng tt nh sn xut enzyme và các
sn phm bn nhit khác. Lên men xc s dng rng rãi trong sn
xuu vì nhng ng dng mang tính thc tin và kinh t
ca nó. Lên men xc dùng trong công nghip ch bin và sn xut thc phm
ch y   c sn xut các lo  u, sn xut enzyme (a-amylase,
fructosyl transferase, lipase, pectinase, xylanase), các acid h
citric) và các loi ko cao su [8].
g sn xung s dng k thut lên men
dch th. Tuy nhiên, khi tin hành so sánh hiu qu ca các loi

ta thng enzyme vi sinh vt có th sinh ra trong lên men x


12
nhiu ln so vi trong lên men dch th khi s dng cùng mt chng vi sinh vt
u kin lên men [14].
 góp phn b sung các s liu cn thit v vic ng dng k thut lên men
xp trong công nghip sn xut enzyme chúng tôi thc hi tài: “Lựa chọn các
điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ các chủng vi
khuẩn ưa nhiệt”.
2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu
- Kho sát và tuyn chn nhng chng vi khun và x khun bn nhit có hot
 enzyme xylanase cao.
- Nghiên cm sinh hc và phân loi các chng vi khun và x khun
nghiên cu.
- La chu kin lên men xp tng vi khun và x
khun nghiên cu.
- Nghiên cc tính và tinh sch enzyme ca các chng nghiên cu.
3. Những đóng góp mới của đề tài


 c hi 



 
g m




, 












c lp. 



  góp ph li





  quá
trình sn xut enzyme xylanase bng k thut lên men xp.

13
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. XYLAN
1.1.1. Xylan


 Xylan còn tham gia vào cu trúc và giúp lignocellulose b
Bảng 1.1: Thành phần chất khô trong thực vật [2]
Ngun gc
Cellulose (%)
Hemicellulose (%)
Lignin (%)
Thân g cng
40-55
24-40
18-25
Thân g mm
45-50

25-35
25-35
V lc
25-30
25-30
30-40
Lõi ngô
45
35
15
Giy
85-99
0
0-15
V tru
32.1
24
18
V tru ca lúa mì
30
50
15
i
60
20
20
Lá cây
15-20
80-85
0

Ht bông
80-95
5-20
0
Giy báo
40-55
25-40
18-30
Giy thi t bt giy hóa hc
60-70
10-20
5-10
Cht rc thi u
8-15
-
24-29
Cht thi ca ln
6
28
-
Phân bón gia súc
1.6-4.7
1.4-3.3
2.7-5.7
C  b bin Bermuda
25
35.7
6.4
C mm
45

31.4
12.0
Các loi c (tr s trung bình cho
các loi)
25-40
25-50
10-30
Bã thô
33.4
30
18.9
Thc vt trên cn có xylan là chui D-c ni vi nhau bng liên
k-1,4, to bin tng hp xylan vi mt cu trúc hóa h
D-xylose ni vi nhau bng liên k -1,3.  mt vài lp Chlorophycaea và
Rhodophycaea không có s hin din ca cellulose, xylan to nên vt liu hình si
trong sut. - trong
 - 
 



14
1.1.2. Cấu trúc của xylan
-xylose
       -1,4- -1,4- D- 


(a)

(b)

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan [35]

ng nht ca xylan, s thy phân ca nó phi cn mt h
thng enzyme phc tng bao gm hai loi: enzyme không phân
nhánh (-1,4-endoxylanse, ferulic acid esterases) và enzyme phân nhánh (-
arabinofuranosidase, -glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase axit
phenolic) (Hình 1). Tt c   chuyn hóa xylan
thành cu t ng ca nó. H thy phân xylan khá ph bin  vi
khun và nm. Các xylan khác loi cha các nhóm th khác nhau trong mch chui
chính và chui bên. S phân gii polysaccharide phc tp cn có hong h tr
gia các thành phn khác nhau ca h thng enzyme . 
endo--1,4-



15

150-    Các si xylan liên kt vi nhau nh các phân t acid
diferulic và bao quanh các vi si cellulose. Cùng vi lignin, xylan còn có tác dng
bo v các vi si cellulose [31].


           
arabinose: 4-O-methyl-         
            
-O-methyl-
 

    


 
               
1974; Mc 


               
phenon 
1.2.3. Tính chất của xylan
Xylan không mùi, không v. Nhi hòa tan ca xylan ph thuc vào ngun
gc. Xylan có ngun gc t g cng có nhi hòa tan là 150 - 200
o
i vi
g mm, nhi hòa tan ca nó là 70-130
o
C. Trong g cng, cu trúc ca xylan có
cha các nhóm acetyl, còn trong g mm nó không ch
trong g cc t


16

(a)
(b)
Hình 1.2. Cấu trúc xylan trong cây gỗ
(a) g (b) g cng
1.2. ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE
 ch mt phc h các enzyme cn thit cho quá trình
phân ht xylan, mng nht. Trong t
nhiên, mt s vi sinh vt s dng các ngung t sinh ra các loi xylanase
khác nhau. Các loi enzyme này ngoài chy thành t bào thc vt

còn kt hp vi các enzyme thy phân khác tham gia vào quá trình tách dòng.
1.2.1. Nguồn gốc xylanase
 c sinh tng hp bi nm, vi khun, x khu  ng vt
nguyên sinh. Trong các loài vi sinh vt có kh ng hp xylanase, nm, vi
khun và x khun là các nhóm quan trng nhc bit là nm si. Các nhóm vi
sinh vt có kh  khá rng rãi và tham gia tích cc vào
các chu trình tun hoàn vt cht, nht là các quá trình phân gii cht h hình
thành cht mùn [31].


17
Các loc sinh ra bi vi khun và nm sm có kh 
chu nhit tc ng dng rng rãi và cho hiu qu 
trong công nghip [22].
1.2.2. Phân loại xylanase
 c nghiên cu rng khp toàn cu trong sut  p k
va qua do chúng có nht trc ng dng trong công nghip,
chng h    p thc phm, sn xut th    
nghip sn xut bt giy và làm giy.
Xylanase thuc nhóm các enzyme thy phân liên kt glycoside (glycoside
hydrolase, GH), thy phân xylan. Glycoside hydrolase là mt nhóm enzyme phân
b rng rãi, thy phân các liên kt glycoside trong chui polysaccharide hoc
oligosaccharide. Do cu trúc phc tp ca các carbonhydrate trong t nhiên, nên các
c hin ti s ng ln song song vi nó. GH
t các nguc phân loi thành các h khác nhau da vào trình t axit
ng. Nguyên tn là t trình t axit amin bc mt có th thy
c mi liên kt trc tip gia cu trúc bc này và s cun gp ci
vi các thành viên trong mt h nhnh [7].
     c cho rng xylanase khác vi h enzyme
i ta nghiên cc rng xylanase

   m thuc h enzyme GH
5
, GH
7
, GH
8
, GH
10
, GH
11
và GH
43
[19].
  n xylanase thuc nhóm GH10 và GH11 [21]. Xylanase thuc h
GH10 có khng phân t nh nht là 30 kDa và thuc nhóm acid xylanase. Còn
xylanase thuc h GH11 có khng phân t ln nht là 30 kDa và thuc nhóm
alkaline xylanase [37].
Da vào s ng trình t acid amin và các kt qu phân tích v cu
trúc không gian, xylanase ch yc xp vào h 10 và 11 ca h enzyme thy
phân glycoside (Collin & cng s, 2005; Jeya & cng s, 2009; Sibtain & cng s,
2009). Xylanase c hai h u thy phân xylan b thay th hai
ln hai acid glutamic (Sinnot, 1990). Hai phân t acid này nm ti
trung tâm hong ca enzyme và quynh mt phn s hình thành cu trúc
ca xylanase. Mt phân t acid ho t cht xúc tác bng cách thêm
t, trong khi phân t acid th hai có ái lc mnh vi nhân, có vai
trò m u cho phn ng phân ct và trong s    -glycosyl
(Collin & cng s, 2005) [12].


18

Bảng 1.2. Các họ thuộc glyoside hydrolase (GHs) có hoạt động trên xylan
(Collin & cộng sự, 2005)

hydrolase


xylan


tác
Nhóm acid/base
chính
Nucleophilchase
chính
5
8

8


Glutamate
Glutamate
7
1
-Jelly roll

Glutamate
Glutamate
8
4


6


Glutamate
Aspartate
10
127

8


Glutamate
Glutamate
11
173
-Jelly roll

Glutamate
Glutamate
43
1
5--
propeller

Glutamate
Aspartate
Các thành viên h xylanase 10 có cp cun 8 ln và trng
phân t xp x 48 kDa, pI thp, và thy phân các liên kt glycoside vi s gi c
hình th nguyên vn, trong  xylanase 11 có cu trúc mp hình bánh

sandwich gn ging vi cu trúc bàn tay phi và có khng phân t nh 
vào khong 20 kDa, pI cao và thy phân các liên kt glycoside v xúc tác
i ch hai ln (Hakylinen & cng s, 2003; Zhou & cng s, 2009).
Xylanase thuc h GH10 thuc nhóm acid xylanase. Xylanase thuc h
GH11 thuc nhóm alkaline xylanase [36].
1.2.3. Cấu trúc
Cu trúc bc ba ca phân t nh bng cách s dng mô
hình Insight II Molecular. u trúc xylanase bao gm mt mi 
cha 2 vùng c t min có chui xo u trúc này ch có 
xylanase h GH
11
. Cu trúc chung ca phân t 
vi các ngón tay  i và ngón cái nm phía trên. Trung tâm hong là
ngón tay cái, lòng bàn tay và ngón tay.









19

Hình 1.3. Cấu trúc không gian xylanase của Bacillus subtilis [18]
Xylanase c báo cáo ly phân
xylan, phá v liên k-1,4-xylanosidic ca xylan thành nhiu xylo-oligosaccharide
 dài khác nhau.
1.2.4. Đặc tính của xylanase
Trong trung tâm hong ca xylanase, axit amin quynh s hong
ca enzyme là axit glutamic [2].
S thy phi s h tr hong ca các thành phn trong h
thng enzyme xylanolytic.


20

Hình 1.4. Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan [36]
Vai trò ca các enzyme chính trong h thng enzyme xylanolytic c th 
β-1,4-endo-xylanase và ferulic acid esterases
Hai enzyme -1,4-endo-xylanase và ferulic acid esterases là hai enzyme có
vai trò ch o trong quá trình thy phân mch chính c -1,4-
endo-xylanase tn công vào liên kt xylosidic ca mch chính còn ferulic acid
esterases tn công các liên kt xylosyl còn li và gii phóng ra các
xylooligosaccharides. Hai enzyme này là thành phn chính ca h enzyme
xylanolytic do các vi sinh vt phân hy sinh hc sinh ra, chng h

thuc các chi Trichoderma, Aspergillus, Schizophyllum, Bacillus, Clostridium và
Streptomyces [30].
Ferulic acid esterases là enzyme ngoi bào exoglyosidase thy phân các
oligosaccharide ngng xylose. Ferulic acid esterases có th
phân hy các cht nhân t  p-nitrophenyl -D-xyloside [31]. Trong s các
     t tt nht. Ái lc c  i vi
xylooligosaccharide gim theo m a phn ng polymer hóa [22]. Hu
ht các ferulic acid esterases c nghiên cn nay u b c ch bi xylose
- sn phm thy phân ca chúng. Nhiu ferulic acid esterases có ho transferase,
c bit là  các n t cao, to ra sn phm phân t ng cao.
α-L-Arabinofuranosidase


21
M trng trong quá trình thy
 có mc tinh sch và mô t. Có hai loi
enzyme arabinase, các enzyme -L-arabinofuranosidase ngoi bào (EC 3.2.1.55)
hoc li vi p-nitrophenyl--L-arabinofuranosida trên các arabinan phân
nhánh và các enzyme 1,5-alpha-L-arabinase ni bào (EC3.2.1.99), ch hot hóa các
arabinan dng thng.
-L-Arabinofuranosidase có kh y phân c hai liên kt 1,3- và 1,5--
L-    c báo cáo trong A. ninger và B.
subtilisc hii vi arabinoxylan và có th gii phóng mi
arabinose t arabinoxylan. Khi gii phóng arabinose, mch chính xylan không b
thy phân và không ti vi
-L-1,3 hoc -1,5 liên kt arabinose t arabinan, arabinogalactan, hoc p-
nitrophenyl-alpha-L-arabinofuranoside.
α-Glucuronidase
-D-Glucuronidase phân gii liên kt -1,2 gia axit glucuronic và gc
xylose trong phân t   c hiu ca -glucuronidase là khác

nhau ph thuc vào ngun gc ca enzyme.
Esterase acetylxylan
Enzyme esterase acetylxylan là enzyme có th ct gia các nhóm acetyl
vi 2 hoc 3 v trí ca gc xylose và góp phy phân xylan trong t
nhiên [20]. Trong các nghiên cc
chng minh là sinh ra t mt s loài vi khun và nm.
1.2.5. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến hoạt động của enzyme xylanase
1.2.5.1. 1.2.5.1. Ảnh hưởng của một số ion kim loại
Các ion kim loi có th kìm hãm hay hot hóa enzyme. Các ion kim loi
nng,  n gây bin tính protein, có tác dng kìm hãm không thun nghch
ho enzyme. Tác dng ca ion kim loi ph thuc nhiu vào n ca chúng.
M hot hóa ca enzyme ch  ion kim loi  nhng n
thp trong mt gii hng n này nhng ion kim
loi li có tác dng kìm hãm enzyme. Gii hn n  có tác dng hot hóa
enzyme ca mi ion kim loi có th khác nhau, vì vy  cùng nu
kin phn i vi mt enzyme, hai ion có th có tác dc nhau.
Hing xy ra gia các ion cùng hóa tr. ng ca mi ion


22
kim lon hong ca enzyme xylanase ca các loài khác nhau là không ging
nhau [1].
1.2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Do bn cht hóa hc ca enzyme là protein nên khác vi các phn ng hóa
hc, vn tc phn ng do enzyme xúc tác ch  trong mt
gii hn nhn cu trúc ca enzyme.
c ng ca nhi n vn tc phn ng là h
s Q
10
 l ca vn tc phn ng  mt nhi i vn tc phn

ng  nhi th
o
C. H s này càng ln, phn ng càng khó xy ra 
nhi ng.
Q
10
= k
t+10
/k
t
Kt qu nghiên cu ng ca nhi n vn tc phn ng enzyme
cho thy, nhi hong thích hp (t
opt
) ca nhiu enzyme vào khong 40-50
o
C;
trên 50
o
C ho ng b gim mnh do cu trúc phân t ca enzyme b phá v
[1].
c sinh tng hp bi nng có nhi thích hp là 40-
60
o
C. Ví d, xylanse ca Aspegillus niger hong tt nht  nhi t 45-50
o
C.
i vc sinh tng hp bi các loài vi khung có nhi
thích hp t 37-80
o
C [21]. Ví d, xylanase ca Bacillus sp. ho ng tt nht 

nhi t 50-80
o
C.
1.2.5.3. Ảnh hưởng của pH
Ho ca enzyme ph thung
n trng thái ion hóa gc R ca các gc acid amin trong phân t enzyme, ion hóa
các nhóm chc trong trung tâm hot, n t
phn ng biu din vn tc ca nhiu phn ng enzyme  các pH khác nhau
có dng hình chuông hnh chuông ng vy
pH thích hp (pH
opt
) ca phn ln enzyme vào khong 7. Tuy nhiên, mt s enzyme
có pH
opt
rt thp (pepsin, protease acid ca vi sinh vt), ho
(protease kim ca Bacillus), hoi trong mt khonh [1].
c sinh tng hp bi nm thng hong  khong pH t 3,5-
6,5. Ví d, pH ta Aspegillus niger i vi xylanase
c sinh tng hp bi các loài vi khuBacillus ng có khong pH rng
 4-10 [21].



23
1.2.5.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa
Các cht ty ra và dung môi hng rt mnh ti ho ca
enzyme, tùy tng loi enzyme mà s ng ca các dung môi ht
ty ra là khác nhau. Tru trên chng
Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thy các cht ty ra Tween 20, Tween 80, Trixton
X-u làm gim hot tính ca xylanase và SDS làm gim mnh

nht, ch còn 18-34%. Các dung môi h
u c ch hot tính xylanase, riêng n-butanol c ch ch còn 33-63%.
 Th Tuyên & cng s (2008) cho rng các dung môi h
ethanol, isopropanol không  ng mnh ti ho  xylanase t chng A.
ozyzae DSM1863, riêng n-butanol lm nh hot tính.
Tween 20 và Triton X-100 không  ng mnh  n  thp (0,2-1%)
m hot tính xylanase  n 
gim ho enzyme mnh  tt c các n [31].
1.2.6. Ứng dụng của xylanase
1.2.6.1. Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp thực phẩm
Công nghip thc phm là mt trong nhng ngành công nghip có giá tr
kinh t l i cht ca vi sinh vt có nhiu ng dng, doanh
thu trên toàn th gi a ngành này lên ti 10
9
 
nghiên c          n. Xét  quy mô công
nghip, sn xut enzyme là mn ca công ngh
sinh hc nói chung và công ngh thc phm nói riêng. Các enzy
cùng quan trng, nhu cu s dng enzyme có ngun gc t vi sinh vt ngày càng
c bic s dng trong nhiu ngành sn xut
trên toàn th gii [14].
 c ng dng trong sn xu c hoa qu và u.
i ta ch lc dch hoa qu ri b  sung xylanase vào
phn bã hoa qu sau khi lc s c mng dch hoa qu b 
na, xylanase còn có th hou kin nhi cao (khong 60-70
o
C)
nên có th c s nhim vi sinh vt khi ch bic hoa qu  nhit
 cao [15].
c ng dng trong công nghip thc ph

ngh sn xu  ng, h tr   ng hóa lignocellulose (mt
polysaccharide khó phân hy trong thành t bào thc vt).


24
1.2.6.2. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
c ty trng giy phi s dng mng rt ln chloride và các
hóa chu này ng nghiêm trng, vì vy vic thay
th chloride bng enzyme xylanase trong sn xut là rt cn thi gim thiu ô
nhing.
p k, vic s dng xylanase vào công nghip sn xut giy
c ng dng. Gc s
dng enzyme xylanase cho công nghip giy và bt giy, nhm gim giá thành và
gin 90%.

Hình 1.5. Sự thủy phân thành tế bào thực vật bằng enzyme [36]
Xylanase hong tt  nhi  5070
o
  ca quá
trình ty trng gic b sung vào quy trình sn xut ngay khi cho
nguyên liu vào trn.
1.2.6.3. Ứng dụng của xylanase trong sản xuất nguyên liệu sinh học
S tiêu th nhanh chóng ngu  ng hóa th  n s
thay th tc mt vi các ngung thay th, ngun này phi thân
thin v  ng và phi góp phn bo v  t thoát khi khng
hong nhiên li c bioethanol cn bii nguyên liu t thc vt
    n x lý bng hóa ch   y phân lignocellulose


25

ng kh (s dng enzym hoc hóa cht), ri lên men các
ng kh u, và cut và tinh ch bioethanol [11]. Tuy
c tin x lý và s dng hóa ch thy phân làm giá thành sn xut cn
còn cao và gây ng ln t
c gng s dng công ngh  thc hin quá trình này, vic nghiên cu to
ra các loi enzym có ho  cao, và phi hp s dng các enzyme 
y mnh nghiên cu.
1.2.6.4. Ứng dụng trong công nghiệp vải sợi
Xylanase có nhiu ng dng trong công nghip vi si. Xylanase tham gia
     thu cellulose mt cách nhanh chóng và d
dàng. Do xylan liên kt vi li c si màu nâu t lignin thì phi
tách xylan ra khi lignin. Xylanase giúp ty màu và làm mm si lanh và si gai
[4].
1.2.6.5. Ứng dụng trong nông nghiệp
Thành phn ch yu trong thc có b sung thêm các
nguyên lic nguyên liu giàu lipid. Nhiu th
thc vt có cha khong 30% cellulose, hemicelulose, pectin (nhng chng
vt không hc). Xylan là chy trong thc vt và là cht
khó tiêu trong th vic b sung xylanase phân gii xylan thành
các sn phm phân t thng vt d tiêu hóa, d hp th, và làm gim ô
nhing.



1.2.6.6. Ứng dụng của xylanase trong xử lý môi trường
Cùng vi s phát trin ngày càng nhanh ca xã hng cht th
khá nhanh. Bin pháp x lý rác thi ch yu cc ta là chôn l
này tn din tích, thi gian phân hng thi quá trình x c r t rác rt
t c quan tâm ti Vit nam hin nay. Vic b sung
xylanase giúp cho quá trình phân hy rác hn gim nguy

ng.
Ngun chc tng hp ht ln. Vì
vy, vic tn dng ngun cht h làm nguyên liên liu là