Lựa chọn các điều kiện lên men xốp tối ưu và nghiên cứu các đặc tính xylanase từ các chủng vi khuẩn ưu nhiệt


nh x
 



i hc Khoa hc T nhiên
 ngành: ; 60 42 40

 2011

Abstract: 





Keywords: ; ; Lên men; 

Content
MỞ ĐẦU


1. Lý do lựa chọn đề tài


 
 
 




                 







2



        

 

      -amylase, fructosyl transferase, lipase, pectinase,





     
“Lựa chọn các điều kiện lên
men xốp tối ưu và nghiên cứu đặc tính xylanase từ các chủng vi khuẩn ưa nhiệt”.
2. Nhiệm vụ và mục đích nghiên cứu
-                 
enzyme xylanase cao.
- 


-                  

- 
3. Những đóng góp mới của đề tài











 , 











. 







Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. XYLAN
1.1.1. Xylan

Xylan
và giúp lignocellulose 
--1,4,
-
-
            

3
- trong    -
khô 

1.1.2. Cấu trúc của xylan
-xylose l
 -1,4--1,4- D-


(a)

(b)
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của xylan [35]


1.2.3. Tính chất của xylan
   
- 200
o

-130
o




4

(a)
(b)
Hình 1.2. Cấu trúc xylan trong cây gỗ
(b) 
1.2. ENZYME PHÂN GIẢI XYLAN - XYLANASE



này ngo
khác tham gia vào quá trình tách dòng.
1.2.1. Nguồn gốc xylanase


                  

là các quá trình ph
     



1.2.2. Phân loại xylanase
Xylan


5




 
[7].

gia

amic (Sinnot,



-glycosyl (Collin &





phân các liên 


nhóm alkaline xylanase [36].

1.2.3. Cấu trúc
                


11


  
trên. Trung tâm
  
ngón tay cái,
lòng bàn tay và
ngón tay.






6

Hình 1.3. Cấu trúc không gian xylanase của Bacillus subtilis [18]
Xylanase 
-1,4--
nhau.
1.2.4. Đặc tính của xylanase
              
enzyme là axit glutamic [2].
 
enzyme xylanolytic.

Hình 1.4. Các enzyme cần thiết phân cắt hoàn toàn xylan [36]
1.2.5. Ảnh hƣởng của một số yếu tố đến hoạt động của enzyme xylanase
1.2.5.1. 1.2.5.1. Ảnh hưởng của một số ion kim loại
1.2.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
1.2.5.3. Ảnh hưởng của pH
1.2.5.4. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và các chất tẩy rửa

7
1.2.6. Ứng dụng của xylanase
1.2.6.1. Ứng dụng của xylanase trong công nghiệp thực phẩm
1.2.6.2. Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
1.2.6.3. Ứng dụng của xylanase trong sản xuất nguyên liệu sinh học
1.2.6.4. Ứng dụng trong công nghiệp vải sợi
1.2.6.5. Ứng dụng trong nông nghiệp
1.2.6.6. Ứng dụng của xylanase trong xử lý môi trường
1.2.7. Vi sinh vật sinh xylanase
      

     Streptomyces,
Bacillus, Trichoderma, Aspergillus, Thermobacillus …[36].

              Bacillus và
Streptomyces Bacillus 
Bacillus 


-
      
Bacillus  

chi này [3].
Chi Streptomyces 
 Streptomyces 










 

, 








 , 
 , 





  .  ,
Streptomyces  , trong

1.3. LÊN MEN XỐP
1.3.1. Khái niệm lên men xốp
             




1.3.2. Ƣu điểm của kỹ thuật lên men xốp




8


  
trì





- 

- 
- 
 
- 
- 


- 

- 
2


-  
1.4. TINH SẠCH ENZYME XYLANASE
Tinh sch enzyme là mt chui các quá trình liên tip nhm tách riêng mt loi
enzyme t hn hu. Tinh sch enzyme là quá trình thit y c các
c tính v cu trúc - chng lc h xúc tác và s a các loi
enzyme quan trng. Nguyên liu khc s dng cho quá trình tinh sng là mt
loi mô sinh hc hoc dch nuôi cy vi sinh vt. Quá trình tinh sch enzyme cho phép tách
chit mt loi enzyme t mt hn hu có cha lon
có bn cht là protein và phn không có bn cht là protein trong hn hp. Quá trình tách
chit này là mt quá trình khá phc tc tách chit này dc phân t,
c tính lý hóa, kh ho sinh hc ca tng loi enzyme.
Ma vic tinh sch enzyme nhm tho xúc tác ca enzyme, tinh

sch tc enzyme và nghiên cc tính ca chúng. Tinh sc
ng dng rc y t và công nghip.
Mun tinh sc enzyme mà vn gi c tính ca nó thì chúng ta có
th s dng nhia vào nhi, n proton (pH), hoc các
tác nhân hóa hc (các mui trung tính (NH
4
)
2
SO
4
, Na
2
SO
4


9
 tinh sng s dng kt hng thi nhiu k thut
khác nhau: thu hi enzyme bng mui ammonisunfat, sn di SDS-PAGE
n di trên gel hot tính.
1.4.1. Tủa enzyme bằng muối ammonisunfat
1.4.2. Tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ
1.4.3. Sắc ký

a pha


 
n các cht nh quá trình sc ký.
1.4.3.1. Sắc ký lọc gel

1.4.3.2. Sắc ký trao đổi ion
1.4.3.3. Sắc ký ái lực
1.4.3.4. Sắc ký tương tác kỵ nước
1.4.3.5. Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC
1.4.4. Điện di

           



1.4.4.1. Điện di trên gel agarose
1.4.4.2. Điện di trên gel polyacrylamide
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƢỜNG VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Chủng vi sinh vật
-  

 
- N
2.1.2. Môi trƣờng nghiên cứu
2.1.2.1. Môi trường nhân giống (g/l)
- Xn m( -10, Glucose-- 1, pH-7).
ùng 121
o
C trong 15 phút.
- V m(Peptone - - -
1, pH 7.0). K
o
C trong 15 phút.

2.1.2.2. Môi trường nuôi dịch thể

10
a. Môi trường nuôi vi khuẩn- V5. 
0
C, 15
phút.
b. Môi trường nuôi xa
̣
khuâ
̉
n: 5 







 1 

5. 
0
C,
15 phút.
2.1.2.3. Môi trường kiểm tra hoạt độ enzyme
 (g/l): Xylan - 1, agar - 16, -HCl 50 mM, pH 7.0, k
trùng 121
o
C trong 15 phút.

2.1.2.4. Môi trường nuôi xốp






: 

, , , malt, 


( này 



).
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu

-
- -3100 Avant .
- - .
- - Centrif.
- -.
- Máy soi gel Bio-.
- - AES 1010 Speed Vac System-.
- - .
- ernational -.
- -Dry, FTS Systems, Inc. -
- Máy rung (Eyela Cute Mixer-1000 -.

- Máy ly tâm (A15-B.Braun-.
- Máy cô quay chân không (RV05-ST, KIKA Labortechnik -.
- -).
- -.
- -.
-  - .
- ,
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp xác định hoạt tính xylanase
2.2.1.1. Phương pháp định tính (khuếch tán trên thạch)




0
C
 xylanase 
(VPG) (D-d, m


11
2.2.1.2. Phương pháp định lượng
            
Bailey, 1992.
Phương pháp DNS
a. Chuẩn bị hóa chất
b. Cách tiến hành
c. Dựng đường chuẩn
- 
o

C.
- 
1.2; 1.4; 1.6; 1.8 và 2.
- Hòa 300  

- 

Bảng số liệu nồng độ OD của đường xylose
N
Xylose
(mg/l)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0

0
0.245
0.461
0.656
0.910
1.070
1.287

1.506
1.747
1.960
2.197

 

Xác định hoạt độ của xylanase

 


12
X × 1000 × 5 × 20
 U/ml  = 
150 × 10
 - 
- X × 

- 
- 20 là  tính theo 1ml enzyme
- 
- 
2.2.2. Tuyển chọn chủng
2.2.3. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh trƣởng
2.2.4. Phƣơng pháp phân loại
2.2.4.1. Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN
a. Tách chiết ADN của vi khuẩn
b. Phản ứng khuếch đại ADN
c. Tinh sạch sản phẩm PCR.

d. Phản ứng khuếch đại ADN cho đọc trình tự
e. Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự
f. Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại
2.2.4.2. Quan sát hình thái
a. Hình thái tế bào và khuẩn lạc vi khuẩn
b. Quan sát hình thái xạ khuẩn
2.2.5. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở các
chủng vi sinh vật nghiên cứu
2.2.5.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở
các chủng nghiên cứu
a. Môi trường thích hợp
b. Nhiệt độ thích hợp
c. pH thích hợp
d. Thời gian thích hợp cho giống khởi động
2.2.5.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp xylanase ở
các chủng nghiên cứu
a. Lựa chọn cơ chất
b. Lựa chọn thời gian nuôi cấy
c. Lựa chọn độ ẩm
d. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy
e. Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung
f. Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung

13
g. Lựa chọn nguồn khoáng
2.2.6. Thu hồi enzyme
2.2.6.1. Chiết enzyme
2.2.6.2. Thu hồi enzyme bằng các dung môi hữu cơ
2.2.6.3. Thu hồi enzyme bằng muối ammonisunfat
2.2.7. Tinh sạch xylanase của chủng 118

2.2.7.1. Tủa enzyme trong dung môi hữu cơ
2.2.7.2. Tủa enzyme trong muối ammonisunfat
2.2.7.3. Sắc ký trao đổi ion
2.2.8. Điện di
2.2.8.1. Điện di trên gel SDS-PAGE
2.2.8.2. Điện di trên gel hoạt tính
2.2.9. Nghiên cứu đặc tính enzyme
2.2.9.1. pH thích hợp cho hoạt động của enzyme
2.2.9.2.Nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme
2.2.9.3. Khả năng bền nhiệt của enzyme
2.2.9.4. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ enzyme
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN
3.1.1. Lựa chọn các chủng có hoạt độ xylanase cao
3.1.2. Lựa chọn các chủng vi sinh vật bền nhiệt có hoạt tính xylanase cao
 26 chúng 
2
H
2
và 118, 
 
3.2. PHÂN LOẠI
3.2.1. Chủng B
2
H
2

3.2.1.1. Phân tích trình tự ADNr 16S

14


Hình 3.1. Vị trí phân loại của chủng B
2
H
2
với các loài có quan hệ họ hàng gần
3.2.1.2. Đặc điểm hình thái


Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng B
2
H
2

 , ,
-5 mm.
 -4.52 µm, 
0.43-0.92 µm.
ng ADN nghiên
n, B
2
H
2
Bacillus subtilis.
Staphylococcus aureus_X68417
Bacillus flexus_AB021185
Bacillus megaterium_D16273
Bacillus koreensis_AY667496

100
Bacillus weihenstephanensis_AB021199
93
Bacillus sonorensis_AF302118
Bacillus licheniformis_X68416
Bacillus atrophaeus_AB021181
Bacillus subtilis_AB042061
B2H2
Bacillus malacitensis_AY603656
Bacillus axarquiensis_AY603657
Bacillus mojavensis_AB021191
97
96
7
8
Bacillus vallismortis_AB021198
Bacillus velezensis_AY603658
Bacillus methylotrophicus_EU194897
Bacillus nematotocita_AY820954
59
Bacillus amyloliquefaciens_X60605
53
64
83
77
70
100
100
65
100

Z
0.01

15
3.2.2. Chủng 118
3.2.1.3. Phân tích trình tự ADNr 16S


Hình 3.3 .Vị trí phân loại của chủng XK-118 với các loài có quan hệ họ hàng gần
3.2.1.4. Đặc điểm hình thái


Kitasatosporia setalba_U93332
Streptomyces padanus_AF455813
Streptomyces gougerotii_AB184742
Streptomyces phaeoluteichromatogenes_AJ391814
XK-118
Streptomyces misionensis_EF178678
Streptomyces rajshahiensis_GQ500975
Streptomyces owasiensis_AB184515
88
53
80
83
Streptomyces levis_DQ442517
Streptomyces purpurascens_AB045888
Streptomyces viridochromogenes_DQ442555
Streptomyces ambofaciens_AB184182
Streptomyces flaveolus_AB184764
71

Streptomyces tendae_D63873
Streptomyces tritolerans_DQ345779
Streptomyces violaceoruber_AF503492
Streptomyces coelescens_AF503496
Streptomyces humiferus_AF503491
99
79
99
Streptomyces violaceorubidus_AJ781374
64
64
96
Streptomyces glaucescens_AB184843
Streptomyces pharetrae_AY699792
58
100
Streptomyces brunneogriseus_AB184509
Streptomyces eurythermus_D63870
Streptomyces ansochromogenes_AB184448
65
Streptomyces nodosus_AF114033
Streptomyces achromogenes_AY999846
66
76
56
100
58
55
66
82

0.01

16


Hình 3.4 . Hình thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng 118
, chia múi, , 
, 1 - 7 mm.
, 

q118
Streptomyces misionensis.
3.3. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY
3.3.1. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống
3.3.1.1. Môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng
 hai , ,

2
H
2
1.917; VPG xylan
VPG xylan: 28 mm). Trên 4 môi
, 
2
H
2
 - 25),
VPG xylan -  , chúng tôi 
ng V5 cho


2
H
2
và 
 sau.
3.3.1.2. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng
C
o
C, và sinh

o
, 

o
C.
3.3.1.3. pH thích hợp cho sự sinh trưởng
X
 
2
H
2

 

3.3.1.4. Thời gian thích hợp cho giống khởi động

17
T 
2
H

2
24h. Sau 24 
 , 

3.3.2. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp
3.3.2.1. Lựa chọn cơ chất
Các chng vi khun và x khut xi vi
chng vi khun B
2
H
2
, ho xylanaset cao nht malt (2154 U/g),
ti t go (587 U/gi vi chng x khun 118, ho xylanase thu
c cao nhcht go (2386 U/g ), 184 U/g).
3.3.2.2. Lựa chọn độ ẩm thích hợp

, ,   khá
 , B
2
H
2
thì  
,  
3.3.2.3. Lựa chọn thời gian nuôi cấy
, B
2
H
2
 tính
2154 U  U/g.

3.3.2.4. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp
T 
,  
3.3.2.5. Lựa chọn nguồn nitơ bổ sung

2
H
2
, , nitrit, (NH
4
)
2
SO
4
,  , ,

 
  , 



cao men

, 
n nin ni 
(NH
4
)
2
SO

4,
cao men, pepton và ure.  xylanase
t %), %);
Tuy nhiên,  , nitrit,  xylanase
, 
3.3.2.6. Lựa chọn nguồn cacbon bổ sung
K          c 2 chng vi
khun và x khun gây ra s c ch kh ng hp enzyme xylanase ca 2 chng
này. Ho xylanase ca chng vi khun B
2
H
2
gim t 2147 U/g xung còn 1711 U/g khi
t nuôi ci vi chng x khun 118, khi b sung thêm ngun

18
cacbon ho c gim mnh (ho xylanasegim t 2379 U/g 
1679 (U/g).
3.3.2.7. Lựa chọn loại khoáng thích hợp
C
2
H
2
ng 
 3637 U/g) t 1027 U/g)
xylanasU/g) 
khoáng MA4 (1417 U/g).
3.4. THU HỒI ENZYME
3.4.1. Điều kiện thích hợp cho chiết enzyme
Trong 5             -HCl

0.05M, pH 7.0; , 

2
H
2
, pH7
, 
hành c, 
, 

3.4.2. Thu hồi enzyme
Sau  , u
 . Các n 100%, aceton
, ,  
K%, aceton  
, h
, 
 
3.5. TINH SẠCH ENZYME
3.5.1. Tinh sạch enzyme xylanase chủng 118 theo phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion
, n hành thu
, , 4
o


trong aceton, chúng tôi tra 2ml
 sepharose DEAE.  Tris-HCl pH
8, 
1000mM. 
n trong hình sau:

19

Hình 3.18. Sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE mẫu enzyme tủa aceton
chủng 118
trong hình 3.18 cho , xylanase 
, 5, , 29, 30, 31). , 
18 sinh ra ,  i xylanase không bám
sepharose DEAE và sepharose DEAE 
, chúng tôi n
   4, 5, 6) 


Hình 3.19. Sắc ký trao đổi ion sử dụng dịch enzyme ở các phân đoạn có hoạt độ xylanase
cao ở bước rửa cột
trong hình 3.19 , g enzyme xylanase tra lên

sepharose
DEAE sepharose DEAE.

20
theo, chúng tt tính xylanase trên gel t tính
-
không  c tra , enzyme này 
. 3.20:



Hình 3.20. Điện di đồ trên gel hoạt tính các mẫu enzyme xylanase
1- thô có ME; 2- ; 3- Ma aceton

có ME; 4- on không có ME.
3.20 - - 

.
, , , 
 
, d, 
an khác nhau, này 
khác , 
phân tán nên 
, xylanase, 
 khác nhau, , 65, 75, 85 và
95
o
C trong 4 phút 
. 3.21:



Hình 3.21. Điện di trên gel hoạt tính mẫu enzyme xylanase tủa aceton
1
2
3
4
1
2
3
4
5
6

E2
E1

21
1- t; 2- 
o
C; 3- 65
o
C; 4- 
75
o
C; 5-  85
o
C; 6-  95
o
C.
Theo k 3.21 ,   1, aceton 
t, 3.20 các  2, 3, 4, 
   (55, 65, 75
o
C), ng không còn
 ,  do protein 

 5 và 6, enzyme có ME 85 và 95
o
C
(  -PAGE), chúng ta  
sáng rõ 
3.18) và 3.21),
chú kích

xylanase có .
3.5.2. Tinh sạch xylanase của chủng 118 bằng phƣơng pháp tủa trong muối
ammonisunfat bão hòa kết hợp với sắc ký trao đổi ion sepharose DEAE.
, ammonisunfat bão hòa
, bão
hòa c trình bày
trong hình sau:

Hình 3.22. Hoạt độ xylanase chủng 118 thu hồi được khi tủa trong muối
ammonisunfat bão hòa từ 30 đến 90%
Qua hình 3.22 y,  ,
, 
n 30 và 80%  khác, 
 (500 U),  (460 U), n 50% (80 U).

22
  bão hòa  tra vào
-PAGE và gel t tính, trong hình
3.23:
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3

4
5
6
7
8




E2
E1






E2
E1

(a)
(b)

Hình 3.23. Điện di trên gel SDS - PAGE (a) và điện di trên gel hoạt tính (b)
1- - 
0
C trong 4 phút; 2- 
30%; 3-  40%; 4- 50%;
5- 60% ; 6- 70% ;
7- 80%; 8- 

90%.
 trong hình 3.23 cho , trên -PAGE 
t tính.
Ngoài ra, , khi xylanase bão
hòa  ,  bão
hòa  , 
bão hòa 50%, chúng tôi tách 
 ammonisunfat bão hòa 
enzyme E1 và E2.
c
ion, chúsepharose DEAE , 29,
30, 31) 
sau:

23

Hình 3.24. Sắc ký trao đổi ion dịch enzyme tủa ammonisunfat 50%
  trong hình 3.24  y,        
ammonisunfat c sepharose DEAE 
, bão hòa 60
 tra 


Hình 3.25. Kết quả sắc ký trao đổi ion mẫu enzyme tủa ammonisunfat
bão hòa 60 đến 80%
Qua hình 3.25,  xylanase không bám sepharose DEAE là
xylanase  , 

24
               trong

ammonisunfat bão hòa.
, chúng t
trên gel SDS-PAGE. a ammonisunfat 80%
và enzyme E1, ( hình 3.26).


, o
      

 là 22 kDa (hình 3.26).
3.5. ĐẶC TÍNH ENZYME


3.6.1. Đặc tính enzyme xylanase từ chủng 118
3.6.1.1. pH thích hợp
Xylanase ng

1
và E
2
), E
1
có

2
và , 
,  92Ung 19
U,  
2



1

2
không có .
3.6.1.2. Nhiệt độ thích hợp
Hn khi  

o
C,   











E2 (36 kDa)
E1 (22 kDa)




Hình 3.26. Điện di SDS-PAGE
M- marker (BSM0661; Biobasic);
1-   

ammonisunfat 80%; 2- ch
xylanase E1 và 3- 

DEAE.

M
1
2
3
10 kDa

40 kDa

30 kDa

20 kDa

50 kDa

70 kDa

100 kDa


25
50
o
C, 
50
o

,  3 
3.6.1.3. Ảnh hưởng của các ion kim loại
, ion Fe
2+
    
, 
2 , Mn
2+
và Fe
2+

chúng, ion Fe
2+
, 
là Na
+
, Ca
2+
và Mn
2+
,     
2
, ion Mn
2+

 ,  
, 
2+

3.6.1.4. Khả năng chịu nhiệt của enzyme

K
o

nhau 10 phút, 20 phút và 30 phút,  
Tuy nhiên,  60
o
C trong
10 phút,  E2 còn 93%,  còn 50% và enzyme xylanase
, enzyme E2    
60
o
C.
H 
o
C, 80
o
C, 90
o
C và 100
o
C

o
C,  
 
o
C.
3.6.2. Đặc tính xylanase từ B
2
H

2

3.6.2.1. pH thích hợp
X
2
H
2
sinh ra không 
, , 
2
H
2
n 9.
3.5.2.2. Nhiệt độ
N 
2
H
2
khi 

o
, , hay nói cách khác

o
C.
3.5.2.3. Bền nhiệt
K
o
C trong 10 phút, 
2

H
2
m 10%
,  
 70
o

o
C,   
100
o

3.5.2.4. Ảnh hưởng của ion kim loại
M

2+
 
, 
2+
và ion Fe
2+
, ion Mg
2+

.