Xây dựng và đánh giá hệ thống chủng giống cho nghiên cứu phát triển vắc-xin sốt xuất huyết Dengue

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Hoàng Anh Đức

XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ HỆ THỐNG CHỦNG GIỐNG
CHO NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VẮCXIN SỐT XUẤT
HUYẾT DENGUE

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Đỗ Tuấn Đạt


Hà Nội - 2014
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Tuấn Đạt, người đã tận tình giúp
đỡ, hướng dẫn tôi trong công việc cũng như trong suốt quá trình học tập, và
thực hiện các nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh học, đặc biệt
là các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật học thuộc trường ĐH Khoa học Tự
nhiên, đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập tại
Trường .
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các anh chị và bạn các đồng
nghiệp đã giúp đỡ tôi, cùng chia sẻ các kinh nghiệm và kiến thức trong suốt

thời gian tôi thực hiện nghiên cứu tại phòng Công nghệ Cao, Công ty TNHH
MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1.
Cuối cùng, tôi muốn được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên khích lệ,
động viên tôi trong suốt thời gian vừa qua.

Học Viên


Hoàng Anh Đức
1

MỤC LỤC


MỤC LỤC 1
DANH MỤC HÌNH VẼ 5
DANH MỤC BẢNG BIỂU 6
BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT 7
MỞ ĐẦU 8
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 11
1.1 Đặc điểm dịch tễ học về bệnh sốt xuất huyết dengue 11
1.1.1 Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue trên thế giới 11
1.1.2 Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue tại Việt Nam 14
1.2 Virút dengue – tác nhân gây bệnh 16
1.2.1 Đặc điểm phân loại 16
1.2.2 Cấu trúc phân tử và thành phần chức năng 17
1.2.3 Quá trình lắp ráp và trưởng thành của virút 18
1.2.4 Sự sao chép ARN virút 21
1.3 Nguồn bệnh và đường lây truyền bệnh sốt dengue 22
1.3.1 Nguồn bệnh 22

1.3.2 Vector truyền bệnh 22
1.3.3 Sự lây truyền của virút dengue 23
1.3.4 Các biện pháp phòng ngừa dịch bệnh 24
2

1.4 Cơ chế bệnh sinh 25
1.4.1 Cơ chế 25
1.4.2 Lâm sàng 27
1.4.2 Các yếu tố nguy cơ dẫn đến sốt xuất huyết dengue 29
1.4.3 Miễn dịch đối với nhiễm virút dengue 29
1.5 Vắcxin phòng chống dengue 31
1.5.1 Vắcxin sống giảm độc lực 32
1.5.2 Vắcxin bất hoạt toàn virút 33
1.5.3 Vắcxin tiểu đơn vị tái tổ hợp 33
1.5.4 Vắcxin nuleic và vector sống 33
1.5.5 Tình hình nghiên cứu và phát triển vắcxin dengue trên thế giới 34
1.5.6 Nghiên cứu vắcxin dengue tại Việt Nam 36
1.5.7 Các triển vọng vắcxin dengue trong tương lai 36
1.6 Đặc điểm chủng dengue do viện sức khỏe Hoa Kỳ nghiên cứu và phát
triển 37
1.6.1 Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN4 38
1.6.2 Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN1 39
1.6.3 Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN2 40
1.6.4 Đặc điểm chủng tái tổ hợp DEN3 41
1.7 Xây dựng ngân hàng chủng gốc giống cho vắcxin dengue tại Việt Nam 43
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 45
2.1 Vật liệu 45
2.1.1 Tế bào Vero 45
3

2.1.2 Các chủng virút dengue tái tổ hợp 46
2.1.3 Môi trường nuôi cấy và các dung dịch trong nghiên cứu 46
2.1.4 Các hóa chất và sinh phẩm 47
2.1.5 Dụng cụ và trang thiết bị 47
2.2 Phương pháp 48
2.2.1 Phương pháp cấy chuyển tế bào Vero từ điều kiện bảo quản và nhân
số lượng tế bào Vero trên chai nuôi một lớp 48
2.2.2 Phương pháp gây nhiễm và nuôi cấy virút dengue trên tế bào 50
2.2.3 Phương pháp thu hoạch virút dengue sau gây nhiễm 51
2.2.4 Phương pháp chuẩn độ virút dengue bằng tạo đám hoại tử 52
2.2.5 Phương pháp nhuộm miễn dịch đám hoại tử 53
2.2.6 Phương pháp thử vô khuẩn 54
2.2.7 Phương pháp xác định trình tự genome virút dengue 55
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 59
3.1 Xây dựng quy trình gây nhiễm và nuôi cấy các chủng dengue trên chai
nuôi cấy một lớp 59
3.1.1 Liều gây nhiễm virút dengue trên tế bào Vero 59
3.1.2 Nhiệt độ và môi trường nuôi cấy virút 63
3.1.3 Quy trình sản xuất các chủng virút dengue gốc giống 65
3.2 Sản xuất các chủng virút gốc giống 67
3.2.1 Gây nhiễm chủng virút dengue trên tế bào Vero 67
3.2.2 Thu hoạch chủng virút dengue trên tế bào Vero 68
3.3 Đánh giá chất lượng các chủng gốc giống 68
3.3.1 Đánh giá hiệu giá virút 68
4

3.3.2 Đánh giá bộ gen của các chủng gốc giống virút dengue 71
3.3.3 Đánh giá tính ổn định hiệu giá virút qua các đời nuôi cấy 73
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

PHỤ LỤC 83
1. So sánh trình tự chủng rDEN1∆30 83
2. So sánh trình tự chủng rDEN2/4∆30(ME) 85
3. So sánh trình tự chủng rDEN3∆30/31 87
4. So sánh trình tự chủng rDEN3-3’D4∆30 89
5. So sánh trình tự chủng rDEN4∆30 91
6. So sánh trình tự chủng rDEN4∆30-200,201 93

5

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1. Các nước/khu vực có nguy cơ lây nhiễm virút dengue năm 2008. [46] 11
Hình 2. Số ca nhiễm sốt dengue và sốt xuất huyết dengue trung bình hằng năm được
Tổ chức y tế thế giới báo cáo, và số nước có ca bệnh được báo cáo, 1955-2007. [46]
13
Hình 3. Tình hình dịch sốt dengue tại Việt Nam 2002 – 2011 [3]. 15
Hình 4. Cấu trúc hạt virút dengue và các dạng khác nhau của protein E [36]: 20
Hình 5. Cấu trúc genome của virút dengue [36]: 21
Hình 6. Sự lây truyền của virút dengue [43] 23
Hình 7. Mô hình miễn dịch tăng cường nhiễm trùng bệnh dengue [43]. 27
Hình 8. Sơ đồ gen các chủng dengue tái tổ hợp được lựa chọn để làm vắcxin sống
giảm độc lực [12]. 42
Hình 9. Tế bào Vero sau khi nuôi cấy. 50
Hình 10. Hiệu giá virút dengue thu được ở các liều gây nhiễm khác nhau 60
Hình 12. Hình ảnh đám hoại tử trên tế bào Vero sau khi nhuộm miễn dịch 70

6

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1. Các mức độ trên lâm sàng bệnh do virút dengue gây ra 28
Bảng 2. Tóm tắt các vắcxin dengue dự tuyển đang được phát triển trên thế giới 35
Bảng 3. Hiệu giá virút dengue nuôi cấy tại các nhiệt độ khác nhau 64
Bảng 4. Hiệu giá virút rDEN3 nuôi trong các môi trường khác nhau 65
Bảng 5. Kết quả thu hoạch các chủng gốc giống 70
Bảng 6. Tóm tắt kết quả giải mã trình tự gen các chủng gốc giống 72
Bảng 7. Kết quả chuẩn độ hiệu giá virút dengue qua các đời nuôi cấy 75
7

BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT
Kí hiệu viết tắt
Diễn giải
1.
ADN
Axit deoxyribonucleic
2.
ARN
Axit ribonucleic
3.
cDNA
axit deoxyribonucleic bổ sung
4.
DEN

Virút dengue
5.
HCSD
Hội chứng sốc dengue
6.
HVĐT
Hiển vi điện tử
7.
KN
Kháng nguyên
8.
KT
Kháng thể
9.
MOI
Multiple of infection: liều gây nhiễm
10.
NIAID
National Institute of Allergy and Infectious Diseases:
Viện Quốc Gia về dị ứng và các bệnh nhiễm trùng
11.
NIH
National Institute of Health: Viện sức khỏe Hoa Kỳ
12.
PCR
Polymerase chain reaction: Phản ứng chuỗi trùng hợp
13.
PFU
Plague forming unit: Đơn vị tạo đám hủy hoại tế bào
14.

SD
Sốt dengue
15.
SXH
Sốt xuất huyết
16.
SXHD
Sốt xuất huyết dengue
17.
TCYTTG
Tổ chức Y Tế Thế Giới
18.
UTR
Unstranslated region: vùng không dịch mã
19.
VABIOTECH
Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1
8

MỞ ĐẦU
Sốt xuất huyết dengue là một trong những bệnh virút lây truyền qua muỗi phổ
biến nhất ở người, gây ảnh hưởng chủ yếu tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới
trên thế giới. Phạm vi và sự phân bố địa lý của bệnh này tăng nhanh chóng trong
vòng 50 năm qua và tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) ước tính virút dengue là
nguyên nhân gây ra khoảng 50-100 triệu ca mỗi năm trên toàn thế giới với khoảng 2
phần 5 dân số trên toàn thế giới có nguy cơ mắc bệnh này. Sốt xuất huyết dengue
(SXHD) và hội chứng sốc dengue (HCSD) hiện đang là nguyên nhân chủ yếu khiến
trẻ em nhập viện và tử vong tại ít nhất 8 nước Đông Nam Á [10]. Đây là hậu quả
của việc phơi nhiễm với muỗi tăng lên do quá trình đô thị hóa, đi du lịch, thay đổi
khí hậu và thiếu kiểm soát vector truyền bệnh [10].

Trước những năm 1970, chỉ có 5 nước Đông Nam Á báo cáo về sốt xuất huyết
dengue. Tuy nhiên, hiện tại đã có trên 60 nước đưa ra tài liệu về căn bệnh này. Và
virút dengue là loài đặc hữu ở hơn 100 nước, bao gồm hầu hết các nước Đông Nam
Á, Nam Trung Mỹ, Caribe và vùng Nam Thái Bình Dương. Sự lan truyền nhanh
chóng của dịch sốt dengue đang đòi hỏi các tổ chức, các quốc gia tăng cường nỗ lực
kiểm soát, phòng và điều trị bệnh này [46].
Nằm trong vùng Đông Nam Á, Việt Nam là một trong những nước lưu hành
dịch lớn nhất trên thế giới, với hàng triệu người có nguy cơ mắc bệnh. Hằng năm
Việt Nam đã phải đầu từ rất nhiều chi phí cho việc nghiên cứu, kiểm soát và phòng
chống dịch do virút dengue gây ra. Bên cạnh việc tăng cường ý thức giáo dục cộng
đồng, khống chế vector truyền bệnh là muỗi bằng các biện pháp phun hóa chất, diệt
ổ bọ gậy hiện được sử dụng phổ biến tuy vẫn còn nhiều hạn chế. Kiểm soát dịch
bệnh qua vector gây tốn kém và không triệt để. Hiện nay, tiêm vắcxin phòng bệnh
dengue được coi là biện pháp triệt nhất để giúp cho việc phòng chống dịch bệnh
trên người một cách chủ động và có thể khống chế sự bùng phát của dịch bệnh ra
toàn cộng đồng.
9

Cho đến nay hầu hết các vắcxin dengue dự tuyển trên thế giới đều đang ở giai
đoạn thử nghiệm lâm sàng, và vắcxin dự tuyển sớm nhất có thể được cấp phép vào
năm 2016. Một vắcxin phòng bệnh dengue được coi là lý tưởng khi vắcxin có khả
năng gây đáp ứng miễn dịch bền vững và đầy đủ với tất cả bốn týp huyết thanh virút
hoang dại, cần ít mũi tiêm nhắc lại và không gây ra các phản ứng trầm trọng trong
cơ thể [43]. Hơn nữa, giá thành vắcxin phải thấp để đáp ứng đòi hỏi của phần lớn
các nước nghèo nằm trong vùng dịch. Những yêu cầu này hiện đều có thể đạt được
với các công nghệ sản xuất vắcxin hiện nay.
Cho đến nay, tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào công bố liên
quan đến việc nghiên cứu vắcxin dengue. Là một trong những công ty hàng đầu
trong lĩnh vực sản xuất vắcxin, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1, Bộ
Y Tế hiện đã tiến hành các nghiên cứu sản xuất vắcxin dengue với công nghệ tiên

tiến. Vắcxin dengue sản xuất tại Việt Nam sẽ cần có đầy đủ các tiêu chí như: bảo vệ
được cả 4 týp huyết thanh dengue, an toàn với cộng đồng, giá thành rẻ, dễ bảo quản
và vận chuyển. Dựa trên chủng giống và giải pháp công nghệ cũng như kết quả
nghiên cứu vắcxin dengue của Viện Quốc Gia về dị ứng và các bệnh nhiễm trùng,
Viện Sức Khỏe Hoa Kỳ (NIAID, NIH), công ty đã tiếp nhận và triển khai các bước
nghiên cứu và phát triển để sớm có được vắcxin phục vụ cộng đồng.
Xây dựng hệ thống chủng giống virút dự tuyển vắcxin là một khâu quan trọng
đầu tiên trong quá trình nghiên cứu và phát triển vắcxin này. Các chủng được tiếp
nhận đã được tạo ra bởi công nghệ di truyền ngược từ ngân hàng cDNA nên trình tự
và các biến đổi gen của chủng có thể dễ dàng kiểm soát và đối chứng trong quá
trình sản xuất và thử nghiệm. Các chủng này đã giảm độc lực nhiều lần so với
chủng hoang dại qua các đánh giá trên động vật thí nghiệm. Việc làm giảm độc lực
bằng các đột biến mất đoạn nên rất bền vững, khả năng chủng bị biến đổi ngược trở
lại thành dạng độc lực là rất thấp.
Các mục tiêu chính của đề tài bao gồm:
10

1. Xây dựng được quy trình nuôi cấy và sản xuất 06 chủng virút vắcxin dengue
dự tuyển.
2. Thiết lập hệ chủng virút gốc giống của 6 chủng virút vắcxin dengue dự tuyển
đạt tiêu chuẩn cho sản xuất vắcxin
3. Đánh giá tính ổn định về hiệu giá và di truyền của hệ thống chủng virút
dengue gốc giống.
11

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Đặc điểm dịch tễ học về bệnh sốt xuất huyết dengue
1.1.1 Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue trên thế giới
Những báo cáo đầu tiên về một căn bệnh với các triệu chứng được mô tả
tương tự bệnh sốt dengue/sốt xuất huyết dengue (SD/SXHD) đã được thông báo

vào năm 1779 tại Batavia (Jakacta- Indonesia) và Cairo (Ai cập). Từ đó, các vụ
dịch tương tự đã xuất hiện trở lại tại các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tác
nhân gây bệnh sốt xuất huyết (SXH) chưa được biết cho đến tháng 5 năm 1945 khi
Alber Sabin phân lập được virút dengue (DEN) lần đầu tiên từ những người lính
[7]. Sau đó nhiều chủng virút dengue được phân lập từ các vùng khác nhau trên
thế giới và tính kháng nguyên đều được định dạng vào một trong 4 týp huyết thanh
DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4 [4,17,37].


Hình 1. Các nước/khu vực có nguy cơ lây nhiễm virút dengue năm 2008. [46]

Dengue là bệnh do muỗi lan truyền nhanh nhất thế giới. Trong vòng 50 năm
trở lại đây, các ca nhiễm bệnh đã tăng 30 lần cùng với sự mở rộng địa lý đến các
Nước có nguy cơ mắc bệnh

12

nước mới và từ vùng nông thôn đến thành thị [46]. Đến nay, dịch đã xuất hiện tại
trên 100 quốc gia ở Đông Nam Á, Tây Thái Bình Dương, khu vực Trung Đông,
Châu Phi, và Châu Mỹ (Hình 1).
Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) ước tính có 2.5 tỉ người trên thế giới hiện
đang sống trong vùng lưu hành dịch. Mỗi năm có khoảng 50 đến 100 triệu người
mắc bệnh, 500.000 trường hợp SXHD cần nhập viện (Hình 2) , phần lớn trong số
đó là trẻ em với tỉ lệ tử vong chung vào khoảng 2,5% [46]. Đông Nam Á và Tây
Thái Bình Dương là những khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề nhất. Dịch lan sang
các vùng mới và tăng lên ở các vùng đã bị ảnh hưởng trước đó. Từ năm 2001 đến
năm 2008, 1.020.333 trường hợp nhiễm dengue đã được báo cáo tại Campuchia,
Malaysia, Philippines và Việt Nam - 4 nước trong khu vực Tây Thái Bình Dương
với tỉ lệ nhiễm và tử vong cao nhất (theo báo cáo chính thức số tử vong ở cả 4
nước là 4.798 người ). Về mặt lịch sử, SD hay xảy ra giữa vùng đô thị và vùng ven

đô nơi có mật độ dân cư cao dễ lây truyền bệnh. Tuy nhiên, các bằng chứng từ các
dịch bùng phát gần đây như Campuchia năm 2007 cho thấy bệnh đang dần xuất
hiện cả các khu vực nông thôn [44, 46].
Năm 2003, 8 nước – Bangladesh, Ấn độ, Indonesia, Maldives, Myanmar,
Srilanka, Thailand và Timor-Leste đã báo cáo về dịch SD/SXHD [46]. Mức độ
nghiêm trọng của SD/SXHD có thể thấy tại một số quốc gia qua các báo cáo năm
2007:
- Indonesia có 150 000 trường hợp mắc bệnh, tỉ lệ tử vong khoảng 1%.
- Myanmar từ tháng 1 đến tháng 9 năm 2007 có 9578 trường hợp, tỉ lệ tử
vong hơn 1%.
- Tại Thái Lan, SD xuất hiện ở cả 4 vùng miền trên cả nước, từ tháng 1 đến
tháng 11 có 58 836 trường hợp mắc bệnh, tỉ lệ tử vong dưới 0.2%.
Dịch SD/SXHD cũng đã lây truyền khắp các quốc đảo Thái Bình Dương. Từ
năm 2001 đến 2008, các quốc đảo Thái Bình Dương bị ảnh hưởng mạnh nhất là
French Polynesia (35 869 trường hợp), New Caledonia (6 836 trường hợp), Cook
Islands (3 735 trường hợp), American Samoa (1.816 trường hợp) và Liên bang
13

Micronesia (664 trường hợp). Tổng số người chết được báo cáo chính thức ở 6 đảo
này là 34 [46].

Hình 2. Số ca nhiễm sốt dengue và sốt xuất huyết dengue trung bình hằng năm được Tổ
chức y tế thế giới báo cáo, và số nước có ca bệnh được báo cáo, 1955-2007. [46]

Tại châu Mỹ dịch lưu hành chủ yếu tại Caribean và các quốc gia Trung và
Nam Mỹ. Việc gián đoạn lan truyền SD tại các nước châu Mỹ là nhờ các chiến
dịch diệt trừ muỗi Aedes aegypti tại khu vực châu Mỹ trong suốt những năm 1960
và 1970. Tuy nhiên, các biện pháp khống chế và giám sát vector đã không được
duy trì và xảy ra hiện tượng muỗi tái xâm nhập, đi kèm các dịch bùng phát tại khu
vực này. SD do vậy đã lan ra với chu kỳ dịch xuất hiện 3-5 năm một lần. Dịch lớn

nhất xuất hiện vào năm 2002 với trên 1 triệu trường hợp được báo cáo.
Từ 2001 đến 2007 hơn 30 nước châu Mỹ đã thông báo 4.332.731 trường hợp
bị mắc SD/SXHD. Cả 4 týp huyết thanh của virút dengue (DEN-1, DEN-2, DEN-
3, DEN-4) đều lưu hành trong khu vực. Trong đó các nước phía nam như
Số ca mắc
Số nước
mắc
bệnh
VABIOTECH


14

Argentina, Brasil, Chile, Paraguay và Uruguay có 2.798.601 trường hợp, chiếm
64,6% khu vực Châu Mỹ. Các nước Bolivia, Ecuado, Peru và Venezuela báo cáo
819.460 trường hợp (19%). Các nước Trung Mỹ và Mexico có 545.049 trường
hợp (12,5%), còn các nước Caribean thông báo 168.819 trường hợp (3,9%) [46].
Mặc dù SD có xuất hiện tại khu vực châu Phi, nhưng các dữ liệu giám sát chưa
đầy đủ. Có các bằng chứng cho thấy dịch SD đang tăng về quy mô và tần số. Tuy
nhiên, hiện SD chưa được báo cáo chính thức với TCYTTG từ các nước trong khu
vực này. Biểu hiện bệnh giống nhiễm dengue đã được ghi chép tại châu Phi dù
không có sự xác nhận của phòng thí nghiệm và có thể do nhiễm virút dengue hoặc
các virút như chikungunya gây ra các hội chứng tương tự [46].
1.1.2 Tình hình mắc sốt xuất huyết dengue tại Việt Nam
Tại Việt Nam, những ca SD cổ điển ở miền Bắc và miền Trung đã được Gaide
báo cáo vào năm 1913 và một số vụ dịch ở miền Nam xảy ra được Boyle báo cáo
năm 1927. Trong những năm 60, dịch SXH lớn tại miền Nam với 60 trường hợp tử
vong. Các vụ dịch xảy ra theo khu vực hay toàn lãnh thổ với khoảng cách 4-5 năm
một lần. Đặc biệt năm 1998 dịch đã bùng nổ với quy mô lớn tới 57/61 tỉnh trong
cả nước có xuất hiện dịch với 324.866 ca mắc và 384 trường hợp tử vong, căn

nguyên của vụ dịch đó được xác định là virut dengue týp huyết thanh 3 [1,2].
Trong thời gian gần đây dịch xảy ra hằng năm ở hầu hết các tỉnh trong cả nước và
không còn tuân theo quy luật 4-5 năm xảy ra một chu kỳ dịch.
Theo thống kê của TCYTTG, từ 1963 đến 1988, ở Việt Nam số bệnh nhân
mắc SXHD là 1 111734 và số tử vong là 10 415, đây là số bệnh nhân lớn nhất so
với các nước ở Ðông Nam Á và Tây Thái Bình Dương. Ở 19 tỉnh phía Nam, từ
1985 đến 1996 đã có 490 541 bệnh nhân mắc SXHD và chết 3 421 trẻ [1]. Từ
1985 đến 1996, dịch SXHD đã luân phiên xảy ra ở các tỉnh thành phía Nam và
phát thành dịch lớn từ tháng 6 đến tháng 11 hàng năm, đỉnh cao của dịch là các
tháng 7-8-9 và có liên quan tới mùa mưa, là mùa sinh sản của muỗi Aedes aegypti.
15

Bệnh nhân mắc SXHD phần lớn là trẻ em, lứa tuổi mắc nhiều nhất là 5-9 tuổi và
không liên qua đến giới tính [1,2].
Virút DEN-1 gây dịch ở các tỉnh phía Nam được phát hiện có 3 loại: loại
virion chỉ mang kháng nguyên không thuộc thành phần cấu trúc, loại thứ 2 chỉ
mang kháng nguyên thuộc thành phần cấu trúc và loại virion hoàn chỉnh [1].
Virút DEN-2 gây dịch ở Việt Nam năm 1987 có cấu trúc gien được xác định
gần giống các chủng DEN-2 gây dịch ở vùng Trung Mỹ.
Ðiều tra huyết thanh người bình thường ở 9 tỉnh phía Nam cho thấy virút
dengue đã hoạt động mạnh ở tất cả các vùng điều tra. Phần lớn người dân đã bị
nhiễm các virút này, tỷ lệ huyết thanh dương tính với dengue thay đổi tùy theo
vùng và nhiễm dengue thể ẩn đã xảy ra trên tất cả các vùng điều tra.
Trong khoảng 10 năm trở lại đây (2002 – 2011) tình hình dịch sốt dengue diễn
biễn khá phức tạp với xu hướng tăng dần (Hình 3). Trong năm 2010 số ca nhiễm
lên cao nhất là 128 710 trường hợp. Các thống kê trong 10 năm trở lại đây cho
thấy có lưu hành cả 4 chủng dengue tại Việt Nam [3].

Hình 3. Tình hình dịch sốt dengue tại Việt Nam 2002 – 2011 [3].
Là một trong những nước lưu hành vùng dịch lớn nhất trên thế giới, hàng triệu

người Việt Nam đều có nguy cơ mắc bệnh này, hàng năm Việt Nam đã phải chi rất
16

nhiều tiền cho việc nghiên cứu, kiểm soát và phòng chống dịch sốt dengue. Bên
cạnh việc tăng cường ý thức giáo dục cộng đồng, việc khống chế vector truyền
bệnh là muỗi bằng các biện pháp phun hóa chất, diệt ổ bọ gậy vẫn còn nhiều hạn
chế [6].
1.2 Virút dengue – tác nhân gây bệnh
1.2.1 Đặc điểm phân loại
Virút dengue là một thành viên của nhóm Flavivirus, thuộc họ Flaviviridae
bao gồm 70 loài virút gây nhiều bệnh khác nhau ở người và động vật như virút
dengue gây bệnh SD/SXHD, virút viêm não Nhật bản, virút viêm não St.Louis,
virút viêm não West Nile, virút sốt vàng …[7]
Virút dengue có 4 týp huyết thanh gây bệnh cho người khác nhau về tính chất
kháng nguyên (KN) là DEN-1, DEN-2, DEN-3 và DEN-4. Các týp huyết thanh
khác biệt của virút dengue là do mỗi loại phản ứng khác nhau với các kháng thể
trong huyết thanh người. Bốn loại virút dengue này giống nhau khoảng 65% bộ
gen, tuy nhiên trong từng týp huyết thanh cụ thể, vẫn có sự khác biệt về di truyền.
Nhiễm một trong bốn týp virút dengue đều gây ra bệnh và có một loạt các triệu
chứng lâm sàng giống nhau.
Hạt virút dengue hoàn chỉnh có hình cầu với đường kính khoảng 50 nm chứa
nhiều bản sao của ba loại protein cấu trúc, một màng kép lấy từ vật chủ và một bản
sao đơn của sợi dương có cấu trúc ARN. Trong hạt virút, bộ gen ARN được bao
bọc bởi các protein cấu trúc (Capsid - C, prM protein tiền màng, protein M và vỏ
E), bên cạnh đó là bảy protein không cấu trúc (NS) [24, 46].
Các genotype khác nhau (các virút có quan hệ rất gần gũi về trình tự
nucleotide) đã được nhận dạng trong từng týp huyết thanh, cho thấy sự biến đổi
lớn của các týp huyết thanh dengue. Trong các dạng này, các genotype DEN-2 và
DEN-3 “châu Á” thường đi kèm bệnh cảnh trầm trọng khi bị nhiễm thứ cấp [28,
29, 32].

17

1.2.2 Cấu trúc phân tử và thành phần chức năng
Virút dengue chứa bộ gen sợi đơn ARN dương. Bộ gen virút dengue chứa
khoảng 10,600 nucleotides. Cả 2 vùng không dịch mã (Untranslated Region: UTR)
đều có vai trò quan trọng trong điều hòa dịch mã và tổng hợp bộ gen ARN [43].
Giống như các virút khác, virút dengue sử dụng bộ máy của tế bào để dịch mã
ARN virút tạo ra một polypeptide đơn lẻ, sau đó nó được phân cắt sau dịch mã bởi
các protease virút và tế bào, tạo ra ba protein cấu trúc (capsid, màng, và vỏ) cùng 7
protein không cấu trúc (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B và NS5) liên quan
đến quá trình sao chép ARN virút [36,40].
Protein E
Protein E (vỏ), được tìm thấy trên bề mặt virút, đóng vai trò quan trọng trong
việc gắn kết hạt virút vào tế bào chủ. Một vài phân tử tương tác với protein E
(ICAM3-, CD209, Rab 5, GRP 78 và thụ thể Mannose) là tác nhân quan trọng trợ
giúp quá trình gắn kết và xâm nhập của virút [36].
Protein prM/M
Protein prM (màng), có vai trò quan trọng trong định hình và sự trưởng thành
của hạt virút, bao gồm 7 sợi β đối song song bởi ba liên kết disulfide. Trong quá
trình tạo ra virút hoàn chỉnh, prM dưới tác động của protease furin trong mạng
lưới Golgi bị cắt thành peptide ‘pr’ và protein M. Trong khi protein M vẫn tồn tại
trên vỏ virút, peptide ‘pr’ được giải phóng khỏi hạt virút hoàn chỉnh [36].
NS3 protease-helicase
Protein NS3 của virút dengue là một serine protease, đồng thời cũng là ARN
helicase và RTPase/NTPase. Vùng protease bao gồm sáu sợi β sắp xếp thành hai
khối trụ bởi các thành phần 1-180 của protein. Bộ ba có tính xúc tác (His-51, Asp-
73, và Ser-135), được tìm thấy ở giữa hai khối này, và hoạt tính của chúng phụ
thuộc vào sự có mặt của đồng yếu tố NS2B. Các thành phần còn lại của NS3 (180-
618) tạo thành ba tiểu vùng helicase của virút dengue [36].
18

Protein NS5
NS5 là protein lớn nhất (900 axit amin, 104 KDa) và bảo toàn nhất trong virút
dengue (67% trình tự giống nhau giữa các týp huyết thanh virút dengue 1-4). Nó
cũng là một enzyme hai chức năng với vùng methyltransferase (MTase, từ vị trí 1-
296) ờ phía đầu N và polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp; từ vị trí 320-900)
ở vị trí đầu C [36].
Các protein không cấu trúc khác của virút
Cho đến nay không có nhiều dữ liệu về cấu trúc của các protein NS1, NS2A
và NS4A/4B. NS1 là một glycoprotein 45 kDa nằm bên trong mạng lưới nội chất
và được tiết từ tế bào. Các protein này được cho là có liên quan đến các chức năng
trong phức hợp sao chép ARN virút cũng như trong việc bảo vệ virút khỏi sự ức
chế bởi hoạt tính bổ thể. Mặc dù protein tạo thành oligomer bền vững (dimer và
hexamer) trong dung dịch, việc phân tích cấu trúc của protein này thực sự là thách
thức. Điều này cũng đúng với các protein kỵ nước NS2A và NS4A/4B. NS2A là 1
protein 22 kDa, được cho là tạo một phần của phức hợp sao chép.
NS4A (16kDa) và NS4B (27kDa) là các protein tích hợp màng. NS4A được
cho là kích thích sự thay đổi màng giúp virút sao chép. NS4B là protein phụ trợ
sao chép ARN virút thông qua tương tác trực tiếp của nó với NS3 [36].
1.2.3 Quá trình lắp ráp và trưởng thành của virút
Trong dịch nổi của các tế bào bị gây nhiễm, virút được tìm thấy cả dạng hạt
hoàn chỉnh và chưa hoàn chỉnh với đường kính 50 nm và 60 nm. Cả hai loại hạt
đều chứa lớp vỏ glycoprotein bên ngoài và lớp màng kép lipid bên trong nhận từ
vật chủ. Bên trong lớp màng kép này là lõi ARN-protein chứa bộ gen ARN và
protein capsid (C). Vỏ glycoprotein chứa 180 phiên bản mỗi loại của protein vỏ
(E) và protein màng (prM/M) [36]. Cả hai protein này có thể cấu tạo khác nhau
trong các hạt virút dengue hoàn chỉnh và chưa hoàn chỉnh. Do vậy, chúng tạo nên
các đặc tính đặc biệt đối với cả hai dạng hạt virút. Ở dạng hạt chưa hoàn chỉnh,
19

protein prM và E tạo thành 90 heterodimer dàn rộng thành 60 gai trimer trên bề
mặt ( Hình 4.A). Ở dạng hạt hoàn chỉnh, protein E dạng 90 homodimer nằm sát bề
mặt virút tạo thành vỏ protein trơn nhẵn ( Hình 4.D). Peptide ‘pr’ được cắt bỏ từ
protein prM trong quá trình hoàn chỉnh và protein M được giữ lại trong hạt virút
hoàn chỉnh như là một protein màng bên dưới vỏ protein E. Sự chuyển dạng cấu
trúc từ hình thái chưa hoàn chỉnh (‘gai nhọn’) sang hoàn chỉnh (‘trơn nhẵn’) (mô
tả ở Hình 4.) xảy ra trong quá trình di chuyển qua hệ thống mạng lưới Trans-Golgi
và được thúc đẩy chủ yếu bởi sự thay đổi cấu tạo bên trong của protein E. Các
thay đổi cấu trúc của protein E được kích hoạt bởi pH thấp và xảy ra trước quá
trình cắt bỏ của prM do protease furin của vật chủ ( Hình 4.B). Các tác giả đã
chứng minh rằng sự thay đổi cấu trúc này có thể đảo ngược (phụ thuộc vào pH).
Điều này gợi ý rằng các hạt chưa hoàn chỉnh có thể tồn tại hai dạng có thể đảo
ngược ‘gai nhọn’ hoặc ‘trơn nhẵn’ tùy thuộc vào pH của môi trường tế bào.
Protein E cũng là điểm tiếp xúc đầu tiên giữa virút và tế bào vật chủ. Một vài
protein tế bào khác và các phân tử carbonhydrate có chức năng trợ giúp sự xâm
nhập của virút đã được xác định. Các yếu tố gắn kết này giúp việc tập trung virút
trên bề mặt tế bào làm tăng sự tiếp cận của chúng với các thụ thể tế bào nhất định.
Tuy nhiên, một thụ thể tế bào đặc hiệu cho virút dengue hiện vẫn chưa được xác
định [36, 40]. Có thể là các phân tử gắn kết đóng vai trò như là các thụ thể tế bào
đặc hiệu cho dengue.
20


Hình 4. Cấu trúc hạt virút dengue và các dạng khác nhau của protein E [36]:
A. Cấu tạo phức hợp protein EM của hạt chưa hoàn chỉnh ở pH trung tính. Trong cấu
trúc này, protein E tồn tại như là một heterodimer với prM, và các heterodimer này tạo
thành 60 gai nhọn phủ khắp bề mặt virút. Cấu tạo của protein E bên trong gai nhọn,
peptide ‘pr’ màu xanh có chức năng bảo vệ phần peptide dung hợp trên protein E (màu
đỏ). B. Cấu tạo phức hợp EM của hạt chưa hoàn chỉnh ở pH thấp. Trong quá trình di
chuyển thông qua con đường tiết ra ngoài, virút gặp phải pH thấp trong mạng lưới

Golgi. Trong điều kiện này, heterodimer phân tách khỏi tổ chức gai nhọn trimer của
chúng và tạo thành 90 dimer nằm phẳng xuống bề mặt virút. Hướng không gian này
của protein prM-E tạo thành hình thái ‘trơn nhẵn’ của hạt virút. C. Khi ở trong mạng
lưới Golgi, protein prM bị cắt thành peptide ‘pr’ và protein M bới protease nội bào,
furin. Peptide ‘pr’ bị cắt duy trì vị trí của nó như là một cái ‘mũ’ trên protein E và các
protein E còn lại 90 homodimer nằm song song với bề mặt hạt virút. Protein M không
có trong hình này nằm chặt bên màng virút dưới lớp vỏ protein E. D. Sự thiết lập phức
hợp EM của hạt virút hoàn chỉnh. Sau khi furin phân cắt, hạt virút hoàn chỉnh được tiết
ra ngoại bào và peptide pr được giải phóng khỏi hạt hoàn chỉnh.

21

1.2.4 Sự sao chép ARN virút
Sự sao chép bộ gen virút ban đầu xảy ra trong tế bào chất của tế bào bị nhiễm.
Đầu tiên, ARN của virút xâm nhập được dịch mã thành một polyprotein, sau đó
được đưa đến lưới nội chất. Các trình tự tín hiệu bên trong polyprotein dời chỗ
NS1 và ectodomain của prM và E vào bên trong của mạng lưới nội chất trong khi
các protein C, NS3 và NS5 định vị tại tế bào chất. NS2A/B và NS4A/B còn lại là
các protein chuyển màng. Quá trình biến đổi polyprotein này là một quá trình nền
được thực hiện trước khi thực hiện sao chép ARN virút (Hình 5). Nhiệm vụ này
được thực hiện bởi signalase của vật chủ bên trong mạng lưới nội chất và protein
NS3 của virút cùng đồng yếu tố NS2B nằm trong tế bào chất. Nhiều nghiên cứu
siêu cấu trúc đã được tiến hành để chứng minh sự tái sắp xếp mạnh mẽ các màng
bên trong cho phép ARN virút tổng hợp và lắp ráp dễ dàng [36,40]. Protein NS4A
cũng liên quan đến sự biến đổi các màng nội bào vật chủ này nhưng bằng cơ chế
nào thì đến nay vẫn chưa rõ.

Hình 5. Cấu trúc genome của virút dengue [36]:
Vùng mã hóa các protein cấu trúc C (Capsid), prM (pr Membrane), E (Envelope);
Vùng mã hóa các protein không cấu trúc NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B,

NS5.
22

1.3 Nguồn bệnh và đường lây truyền bệnh sốt dengue
1.3.1 Nguồn bệnh
Người bệnh là ổ chứa chủ yếu virút dengue. Gần đây đã phát hiện được ở
Malaysia có loài khỉ hoang dại ở những khu rừng nhiệt đới có mang virút dengue.
Người bệnh nhiễm virút dengue bị muỗi đốt, sau đó muỗi mang virút truyền bệnh
cho người lành. Sau giai đoạn ủ bệnh từ 4-10 ngày, khi nhiễm bất kỳ týp huyết
thanh nào trong bốn loại đều có thể bị bệnh ở các mức độ khác nhau. Nhiễm bệnh
lần đầu có khả năng kích thích tạo ra miễn dịch bảo vệ lâu dài đối với týp huyết
thanh bị nhiễm [22]. Các cá thể bị nhiễm một týp huyết thanh dengue được bảo vệ
đối với các týp huyết thanh khác trong vòng 2-3 tháng từ lần nhiễm đầu tiên nhưng
không thấy miễn dịch bảo vệ chéo này tồn tại lâu dài.
Các yếu tố nguy cơ đối với từng cá thể có thể gây các mức độ bệnh trầm trọng
khác nhau đó là nhiễm thứ cấp, lứa tuổi, chủng tộc và các bệnh mãn tính. Đặc biệt
trẻ em thường có nguy cơ bị SD cao hơn người lớn gấp nhiều lần.
1.3.2 Vector truyền bệnh
Muỗi Aedes aegypti là vectơ chính truyền bệnh SD/SXHD, đây là loài muỗi
nhỏ, thân vằn có mật độ cao ở vùng đô thị và nông thôn ở các nước nhiệt đới. Điều
kiện khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều ở khu vực này rất thích hợp cho sự phát triển
của muỗi Aedes aegypti, chúng đẻ trứng trong các dụng cụ chứa nước sạch cạnh
nơi người sinh sống. Các nghiên cứu cho rằng phần lớn muỗi Aedes aegypti cái có
thể sống cả đời ở bên trong hoặc xung quanh các ngôi nhà nơi chúng trưởng thành,
chúng có các hoạt động hút máu vào ban ngày (cao điểm diễn ra lúc sáng sớm và
chiều tối). Điều này có nghĩa là con người chính là nguyên nhân mang virút ra
cộng đồng. Các dịch dengue cũng có thể gây ra bởi muỗi Aedes albopictus, Aedes
polynesiensis và một vài loài Aedes scutellaris. Mỗi loài này đều có sinh thái học,
tập tính và sự phân bố địa lý riêng biệt. Trong một vài thập kỷ gần đây Aedes
albopictus đã lan truyền từ châu Á sang châu Phi, châu Mỹ và châu Âu do quá

trình thương mại hóa quốc tế [46].
23

1.3.3 Sự lây truyền của virút dengue
Virút dengue tuần hoàn trong máu người bệnh được truyền sang muỗi cái khi
hút máu. Sau khi hút máu người bệnh, muỗi cái có thể truyền bệnh ngay nếu
chúng đốt sang người lành. Mặt khác, virút có thể nhân lên ở tuyến nước bọt của
muỗi trong vòng 8-10 ngày, sau đó muỗi đốt người lành và có thể lây truyền cho
họ. Muỗi bị nhiễm virút dengue có thể truyền bệnh suốt vòng đời của nó (5 - 6
tháng). Muỗi cái thường thực hiện hút máu nhiều người trong một “bữa ăn” của
chúng, chính vì vậy chúng có khả năng truyền virút dengue cho nhiều người trong
một thời gian ngắn. Đây cũng là giả thuyết cho rằng nhiều thành viên trong một
nhà bị mắc bệnh trong vòng 24-36 giờ là kết quả sau một lần truyền bệnh của
muỗi [5,44]
Virút dengue do muỗi truyền vào cơ thể sẽ ủ bệnh từ 3 đến 14 ngày sau đó sẽ
phát bệnh với những triệu chứng không đặc trưng ở giai đoạn đầu. Trong giai đoạn
sốt cấp tính, virút dengue có thể lặp lại vòng truyền bệnh từ máu ngoại vi của
người bệnh. Ở giai đoạn này muỗi Aedes aegypti hút máu người bệnh bị nhiễm
virút và truyền lại virút đó sang người lành [39, 44].

Hình 6. Sự lây truyền của virút dengue [43]