Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A H5N1 và A H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngược

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



LÊ THỊ THANH


TỔNG HỢP VIRÚT CÚM MỚI
TỪ VIRÚT CÚM A/H5N1 VÀ A/H3N2
BẰNG KĨ THUẬT DI TRUYỀN NGƢỢC



Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. LÊ THỊ QUỲNH MAI




Nội - 2012


MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG I
DANH MỤC HÌNH II
CÁC CHỮ VIẾT TẮT III
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 3
1.1. Khái quát về virút cúm 3
1.2. Hệ gen của virút cúm A 4
1.3. Quá trình nhân lên của virút cúm A 9
1.4. Vai trò của hiện tƣợng trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền trong các
vụ đại dịch cúm trên thế giới. 12
1.5. Ứng dụng kĩ thuật di truyền ngƣợc tổng hợp virút cúm A. 14
1.6. Cơ sở khoa học để thiết kế và thực hiện nghiên cứu. 16
1.7. Vấn đề đạo đức và An toàn sinh học trong nghiên cứu 19
CHƢƠNG 2 - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 20
2.2. Vật liệu nghiên cứu 20
2.2.1. Plasmid pHW2000 và hệ thống plasmid chứng dương 20
2.2.2. Sinh phẩm và hóa chất 21
2.2.3. Hệ thống cảm nhiễm virút cúm 25
2.2.4. Trang thiết bị và dụng cụ 26
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 27
2.3.1. Lựa chọn chủng virút gốc 28


2.3.2. Chuẩn bị vector nhân dòng 28
2.3.3. Chuẩn bị ADN nhân dòng 28
2.3.4. Nhân dòng ADN đích vào plasmid pHW2000 30
2.3.5. Phản ứng xác định trình tự chuỗi nucleotide (sequence) 31
2.3.6. Chuẩn bị plasmid cho quá trình chuyển nhiễm 32
2.3.7. Chuyển nhiễm plasmid vào tế bào 33

2.3.8. Khuếch đại virút 33
2.3.9. Xác định hiệu giá virút 34
2.3.10. Xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD
50
) 36
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38
3.1. TỔNG HỢP VIRÚT CÚM MỚI TỪ VIRÚT A/H5N1 VÀ A/H3N2. 38
3.1.1. Lựa chọn chủng virút gốc 39
3.1.1.1. Virút A/H5N1 39
3.1.1.2. Virút A/H3N2 39
3.1.2. Chuẩn bị vector nhân dòng và ADN đích 40
3.1.2.1. Chuẩn bị vector nhân dòng 40
3.1.2.2. Chuẩn bị ADN đích 41
3.1.3. Xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid tạo virút cúm 45
3.1.3.1. Nhân dòng ADN đích 45
3.1.3.2. Hệ thống chuyển nhiễm tám plasmid tổng hợp virút cúm rg-
A/H5N1 50
3.1.4. Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 từ hệ thống chuyển nhiễm plasmid. . 55
3.1.4.1.Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1 55
3.1.4.2. Hệ gen của virút cúm rg-A/H5N1. 58


3.2. Tìm hiểu đặc tính của virút cúm rg-A/H5N1 (gia cầm – ngƣời) 61
3.2.1. Khả năng thích ứng của virút rg-A/H5N1 với tế bào MDCK và trứng gà
có phôi. 61
3.2.2. Định lượng virút rg-A/H5N1 bằng kỹ thuật plaque (tạo đám hoại tử). 64
3.2.3. Khả năng gây bệnh của virút cúm rg-A/H5N1 trên động vật thí nghiệm
66
KẾT LUẬN 68
ĐỀ XUẤT 69

i

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN và protein của virút cúm A . 5
Bảng 2.1. Hệ thống mồi dùng khuếch đại các phân đoạn gen đích 22
Bảng 2.2. Hệ thống mồi dùng cho quá trình giải trình tự nucleotide 23
Bảng 3.1. Kết quả giải trình tự các đoạn ADN đích trước nhân dòng. 44
Bảng 3.2. Kích thước các plasmid được kiểm tra. 49
Bảng 3.3. Tám plasmid lựa chọn cho hệ thống chuyển nhiễm tạo virút cúm rg-A/H5N1
50
Bảng 3.4. Kết quả so sánh trình tự ADN đích sau nhân dòng với trình tự ADN đích
trước nhân dòng 51
Bảng 3.5. Đánh giá chức năng mỗi plasmid trong hệ thống chuyển nhiễm 54
Bảng 3.6. Phát hiện virút rg-A/H5N1 tổng hợp từ hệ thống tám plasmid thông qua khả
năng ngưng kết hồng cầu. 56
Bảng 3.7. Mức độ tinh sạch mẫu ARN của virút rg-A/H5N1 58
Bảng 3.8. Nguồn gốc các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N160
Bảng 3.9. Hiệu giá (HA) virút rg-A/H5N1 khuếch đại trên tế bào MDCK và trứng gà
có phôi 62
Bảng 3.10. Định lượng virút rg-3 và rg-4 bằng kĩ thuật plaque. 65
Bảng 3.11. Kết quả thí nghiệm xác định LD50 của virút rg-4 trên chuột Swiss. 66

ii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Mô hình cấu trúc virion virút cúm 4
Hình 1.2. Chu trình nhân lên của virút cúm. 10
Hình 1.3. Nguồn gốc các chủng virút cúm gây đại dịch. 13

Hình 2.1. Mô hình cấu trúc vector pHW2000. 21
Hình 2.2. Quy trình xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả năng tạo virút
cúm A và quy trình tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2. 27
Hình 3.1. Quy trình tổng hợp virút cúm mới rg-A/H5N1 từ virút cúm A/H5N1 và
A/H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngược 38
Hình 3.2. Sự lưu hành các phân típ virút cúm mùa theo năm. 40
Hình 3.3. Kiểm tra plasmid trên gel agarose. 41
Hình 3.4. Tổng hợp ADN đích bằng PCR 42
Hình 3.5. Sản phẩm ADN đích sau tinh sạch 43
Hình 3.6. Xác định vi khuẩn chứa plasmid trên môi trường chọn lọc. 46
Hình 3.7. Kiểm tra kích thước plasmid trên gel agarose 48
Hình 3.8. Kiểm tra mức độ tinh sạch mẫu ARN của virút rg-A/H5N1 59
Hình 3.9. Khả năng nhân lên của virút rg-A/H5N1 trong hệ thống cảm nhiễm. 63


iii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN DeoxyRibonucleic Acid
ARN Ribonucleic Acid
HA Haemagglutination Assay (Phương pháp ngưng kết hồng cầu)
HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza (virút cúm gia cầm độc lực cao)
MDCK Madin-Darby Canine Kidney Cells (tế bào thận chó thường trực)
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)
PTN Phòng thí nghiệm
rg Reverse genetic (di truyền đảo ngược)
RNP Ribonucleoprotein (phức hệ ribonucleoprotein)
TCTTTG Tổ chức Y tế thế giới
TPCK L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone

vRNA ARN của virut
vRNP phức hệ ribonucleoprotein của virút
1

MỞ ĐẦU
Trong lịch sử y học, các đại dịch cúm xảy ra đều có căn nguyên là virút cúm A
(Infuenza A virus). Virút cúm gây đại dịch / dịch là do có sự thay đổi đặc tính kháng
nguyên. Sự thay đổi này có thể theo kiểu biến thể kháng nguyên (antigenic drift) do đột
biến ngẫu nhiên xảy ra ở gen mã hóa cho haemagglutinin (HA) hoặc hoán vị kháng
nguyên (antigenic shift) [3] do trao đổi và tích hợp di truyền (reassortment) giữa các
chủng virút cúm khác nhau. Từ đầu thế kỷ XX đến nay đã có 5 đại dịch cúm được ghi
nhận, trong đó 3 đại dịch (các năm 1957, 1968 và 2009) xảy ra do xuất hiện virut cúm
mới nhờ hiện tượng trao đổi và tích hợp di truyền [2, 7, 14, 17, 25].
Trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền (reassortment) là một trong những đặc
điểm của virút cúm A. Nhờ đó, khi có hai hay nhiều chủng virút, khác biệt về mặt di
truyền, cùng lúc xâm nhiễm vào một tế bào sẽ tạo ra chủng virút mới có cấu trúc hệ
gen pha trộn giữa hệ gen virút “bố” và “mẹ” chúng. Virút mới (đặc tính kháng nguyên
mới) sẽ kháng lại kháng thể đã được hình thành trong đáp ứng miễn dịch lần trước và
có khả năng lây nhiễm vào vật chủ mới mà chủng “bố - mẹ” chúng không có khả năng
gây nhiễm. Chủng virút mới có thể là nguyên nhân gây dịch / đại dịch cúm [3].
Ở Việt Nam, ngoài các phân típ virút cúm A lưu hành ở người theo mùa
(A/H3N2, A/H1N1) đã ghi nhận nhiều bệnh nhân nhiễm virút cúm gia cầm độc lực cao
H5N1 (HPAI H5N1) [10, 12]. Sự xuất hiện virút cúm A/H5N1 thường xuyên trong đàn
gia cầm cùng với tập quán chăn nuôi gia cầm tại hộ gia đình của người Việt Nam có
thể sẽ làm tăng nguy cơ trao đổi và tích hợp di truyền giữa virút cúm gia cầm và virút
cúm người. Ngoài ra, tần suất thay đổi đặc tính kháng nguyên của virút cúm A/H3N2
(4 lần) nhiều hơn so với virút cúm A/H1N1 (2 lần) tại miền Bắc Việt nam (giai đoạn
2001-2008) [1,31], cho phép nghĩ đến khả năng dễ trao đổi và tích hợp giữa virút cúm
A/H3N2 với virút cúm A khác khi có điều kiện thuận lợi.
2

Trên cơ sở tiến bộ khoa học trong lĩnh vực sinh học phân tử, rất nhiều các phương
pháp mới đã được áp dụng trong nghiên cứu virút cúm, một trong số đó là di truyền
ngược (reverse genetic). Kỹ thuật di truyền ngược cho phép chủ động tổng hợp virút
cúm có đặc điểm hệ gen mong muốn nhằm tìm hiểu khả năng xuất hiện trong tự nhiên,
khả năng gây bệnh cho người của virut này, từ đó chủ động xây dựng các biện pháp
phòng chống hữu hiệu. Trên thế giới, di truyền ngược đã được áp dụng nhiều trong việc
nghiên cứu độc lực virút cũng như phát triển vaccine cúm [30, 38, 45, 48, 51].
Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài nghiên
cứu:
“Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 bằng kỹ thuật
di truyền ngƣợc”
với mục đích:
1. Xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả năng tạo virút cúm A.
2. Tổng hợp virút cúm mới từ virút cúm A/H5N1 (cúm gia cầm) và A/H3N2
(cúm người) bằng hệ thống chuyển nhiễm plasmid.
3. Tìm hiểu đặc tính cơ bản của virút cúm mới.
3

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN

1.1. Khái quát về virút cúm
Đặc điểm chung
Họ Orthomyxoviridae gồm năm chi: virút cúm A, virút cúm B, virút cúm C,
virút Isa và virút Thogoto [21]. Virút cúm A lưu hành phổ biến trên người, gia cầm,
chim hoang dại và một số động vật khác như lợn, ngựa, hải cẩu…, là căn nguyên gây
các đại dịch cúm trên toàn cầu. Virút cúm B và C lưu hành chủ yếu ở người và thường
chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ.
Virút cúm A được chia thành các phân típ (subtype) dựa trên hai glycoprotein
bề mặt là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). HA được chia thành 16 phân

típ (từ H1 đến H16) và NA được chia thành 9 phân típ (từ N1 đến N9). Các loài chim
thủy sinh là ổ chứa tự nhiên của tất cả các phân típ virút cúm A. Các phân típ gây bệnh
cho người chủ yếu là H1, H2, H3 và N1, N2 [5].
Danh pháp quốc tế được quy định cho virút cúm gồm những thông tin sau:
típ virút/viết tắt vật chủ (nếu là động vật)/nơi phân lập/mã số phòng thí nghiệm phân
lập/năm phân lập. Với virút cúm A, có thể bao gồm thêm thông tin về phân típ HA và
NA của chủng virút [53].
Ví dụ: A/swine/Taiwan/l/70 (H3N2).
B/EnglADN/5/66.
C/Paris/l/67.
Hình thái và cấu trúc virion virút cúm
Virion virút cúm đa hình, có thể hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi có hình sợi
kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm.
4


Hình 1.1. Mô hình cấu trúc virion virút cúm
Nguồn: [36] [20]
Virút cúm có hệ gen là ARN đơn, âm, phân đoạn. Mỗi sợi ARN liên kết với các
protein NP, PA, PB1, PB2 để tạo thành phức hệ ribonucleoprotein (vRNP) (mô hình a
hoặc b hình 1.1) có chức năng sao chép và phiên mã. Phức hệ này được bao bọc bởi
màng protein nền và lớp vỏ ngoài có nguồn gốc từ màng sinh chất tế bào chủ. Trên vỏ
có 2 gai glycoprotein là haemagglutinnin và neuraminidase.
1.2. Hệ gen của virút cúm A
Hệ gen virút cúm A gồm tám phân đoạn ARN có chiều dài không giống nhau,
đoạn ngắn nhất là 890 nucleotide (phân đoạn 8) và đoạn dài nhất là 2341 nucleotide
(phân đoạn 1 và 2). Trên tám phân đoạn ARN của virút cúm đều có những trình tự
nucleotide bảo tồn. Đầu tận cùng của tất cả các đoạn ARN đều có chung một trình tự
gồm 13 nucleotide ở đầu 5’ và một trình tự gồm 12 nucleotide ở đầu 3’. Hai vùng bảo
tồn này có trình tự ngược nhau và bổ sung một phần cho nhau. Đặc điểm này có vai trò

trong quá trình phiên mã và sao chép ARN: polymerase có thể nhận biết trình tự bảo
tồn ở đầu 3’của sợi ARN(-) và ở đầu 3’của sợi ARN(+) để khởi đầu quá trình tổng hợp.
Một trình tự phổ biến thứ ba có ở cả tám phân đoạn ARN là trình tự uridine cách đầu
5

5’ khoảng 15-21 nucleotide, đây là tín hiệu khởi đầu cho quá trình gắn chuỗi polyA
trong quá trình tổng hợp sợi ARN thông tin [27, 33, 52].
Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN và protein của virút cúm A [8, 9, 24, 26].
Phân đoạn
ARN
Nucleotide

Protein
Axit amin
1
2341

Polymerase cơ bản 2 (PB2)
759
2
2341

Polymerase cơ bản 1 (PB1)
PB1 – F2
757
87 / 90
3
2233

Polymerase acid (PA)

716
4
1778

Haemagglutinin (HA)
566
5
1565

Nucleoprotein (NP)
498
6
1413

Neuraminidase (NA)
454
7
1027

Protein matrix 1 (M1)
252

Protein matrix 2 (M2)
97
8
890

Protein không cấu trúc (NS1)
230

Protein không cấu trúc (NS2)
121


6

Phân đoạn 1, 2 và 3: protein PB2, PB1, PB1-F2 và PA
Phân đoạn ARN 1, 2 và 3 mã hóa cho các protein PB2, PB1, PB1-F2 và PA.
Phân đoạn ARN 1 và 2 có chiều dài 2341 nucleotide. Phân đoạn 1 mã hóa cho protein
tương ứng gồm 759 axit amin; phân đoạn 2 mã hóa cho hai protein là PB1 gồm 757
axit amin và PB1-F2 (87 hoặc 90 axit amin) [8, 26]. Phân đoạn 3 có chiều dài 2233
nucleotide và mã hóa cho protein gồm 716 axit amin. Kết quả từ một số nghiên cứu in
vitro về quá trình phiên mã và sao chép ARN đã gợi ý rằng PB2 tham gia vào quá
trình tổng hợp ARN thông tin, gắn vào cấu trúc mũ của ARN thông tin của tế bào
chủ; PA liên quan đến quá trình tổng hợp sợi ARN virút (vRNA); PB1 có vai trò khởi
đầu quá trình sao chép; PB1-F2 làm chết các tế bào miễn dịch đáp ứng quá trình
nhiễm virút [8].
Phân đoạn 4: Hemagglutinin (HA)
HA là một glycoprotein gắn trên màng virút, có vai trò trong quá trình hấp phụ
và xâm nhập vào tế bào của virút. Tên gọi của protein này bắt nguồn từ khả năng
ngưng kết hồng cầu bằng cách gắn vào glycoprotein đặc hiệu chứa acid neuraminic
trên bề mặt tế bào hồng cầu. HA là kháng nguyên virút quan trọng nhất chống lại các
kháng thể trung hòa, sự thay đổi về tính kháng nguyên của HA là nhân tố tạo thành vụ
dịch cúm. Chuỗi polypeptide HA tiền thân (HA0) có thể tạo thành hai chuỗi
polypeptide HA1 và HA2 nếu liên kết disµlfide bị cắt. Sự phân cắt này không ảnh
hưởng đến hoạt tính gắn vào thụ cảm thể mà ảnh hưởng đến quá trình dung hợp với
màng tế bào để virút xâm nhập vào tế bào vật chủ. HA1 chứa phần tận cùng N của HA,
HA2 chứa phần tận cùng C, là vùng kị nước, gắn vào màng virút và có tính bảo tồn cao
giữa các chủng virút. HA2 được cho rằng có vai trò giúp virút xâm nhập vào tế bào.
Phân đoạn ARN 4 dài 1765 nucleotide, HA1 gồm 328 axit amin, HA2 gồm 221

axit amin.

7

Phân đoạn 5: protein nucleocapsid (NP)
Protein NP tương tác không chỉ với chính nó và ARN trong phức hệ
nucleocapsid mà còn tương tác với các protein PB2, PB1 và PA để hình thành đơn vị
sao chép. Phân đoạn 5 có chiều dài 1565 nucleotidetide, chuỗi polypeptide gồm 498
axit amin. Nucleoprotein có vai trò bảo vệ vRNA khỏi sự phân huỷ của các enzyme
phân huỷ ribonucleotide (ribonuclease).
Phân đoạn 6: Neuraminidase (NA)
Phân đoạn 6 mã hóa cho neuraminidase - protein gắn màng. Neuraminidase sẽ
phân cắt liên kết glycosidic gắn với nhóm keto của acid N-acetylneuraminic (acid
sialic) thành D-galactose hoặc D-galactosamine. NA có dạng hình nấm, gồm 4 chuỗi
polypeptide giống nhau, gắn với nhau bằng liên kết disµlfide.
Trong quá trình nhân lên của virút, NA giúp giải phóng các hạt virút đang nảy
chồi ra khỏi màng tế bào vật chủ. NA có thể cũng giúp bộc lộ vị trí phân cắt của phân
tử HA. Hoạt tính neuraminidase cũng cho phép virút tránh các sialoglycoprotein ức chế
có mặt trong đường hô hấp, cho phép virút tìm đường đến các tế bào biểu mô đích.
Kháng thể kháng NA không trung hòa hoạt tính lây nhiễm của virút mà hạn chế chu
trình nhân lên của virút và làm suy giảm triệu chứng bệnh.
Trình tự nucleotide của đoạn ARN 6, với phân típ N1 và N2, có chiều dài 1413
nucleotide, protein gồm 453 axit amin.
Phân đoạn 7: protein M1 và M2
Phân đoạn 7 mã hóa cho hai protein là M1, M2 và có thể protein thứ ba là M3.
Trong đó một phân tử được phiên mã trực tiếp từ đoạn ARN, hai phân tử còn lại là
kết quả của quá trình chế biến nhờ bộ máy cắt ghép (splicing) ARN thông tin của tế
bào chủ.
8

Protein M1 tạo thành một lớp vỏ protein bao bọc bên ngoài để bảo vệ
ribonucleoprotein. Lớp vỏ protein này có khả năng tương tác với lipid để tạo thành lớp
vỏ ngoài (envelope). Protein M1 có thể nhận biết các glycoprotein virút và hình thành
nên một vùng ở bề mặt bên trong của màng tế bào chất, cung cấp vị trí gắn cho các
ribonucleoprotein trong quá trình đóng gói virút. M1 quyết định độ nhạy của virút với
thuốc kháng virút amatidine. M2 là kênh ion xuyên màng, có vai trò trong quá trình
dung hợp, cởi vỏ virút.
Chiều dài của đoạn 7 là 1027 nucleotide. Protein M1 gồm 252 axit amin, M2
gồm 97 axit amin.
Phân đoạn 8: protein không cấu trúc NS1 và NS2
Phân đoạn ARN nhỏ nhất mã hóa cho 2 protein là NS1 và NS2. Trong tế bào
chủ, NS1 được tạo thành với lượng lớn hơn, liên kết với polysome và hạch nhân. Chức
năng của NS1vẫn chưa rõ ràng, song người ta cho rằng có liên quan đến quá trình tổng
hợp vRNA và đến việc ngừng tổng hợp protein của tế bào chủ. NS2 được tổng hợp
trong giai đoạn nhiễm muộn, tham gia vào quá trình vận chuyển các vRNP từ nhân ra
tế bào chất [43].
Đoạn ARN 8 dài 890 nucleotide, protein NS1 gồm 230 – 237 axit amin (phụ
thuộc vào chủng virút), NS2 gồm 132 axit amin.

9

1.3. Quá trình nhân lên của virút cúm A
Quá trình nhân lên của virút cúm A có thể chia thành các giai đoạn sau: (1)
gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ, (2) phiên mã và sao chép ARN, (3) giải
phóng vRNP ra khỏi nhân và (4) đóng gói, nảy chồi và giải phóng virút thế hệ mới
[20, 24, 44].
(1) Gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ
Gai HA của virút sẽ phát hiện và liên kết với thụ cảm thể của nó trên bề mặt tế
bào chủ. Phân tử HA tiền thân, HA0, được tạo thành từ hai dưới đơn vị: HA1, có vùng
gắn thụ cảm thể và HA2 có peptide dung hợp; HA1 và HA2 liên kết với nhau bằng liên

kết disµlfide. Thụ cảm thể của virút cúm là axit sialic liên kết với đường galactose của
glycoprotein / glycolipid bằng liên kết alpha 2,6 (virút cúm người) hoặc alpha 2,3
(virút cúm gia cầm). Hai dạng liên kết này rất quan trọng đối với tính đặc hiệu của liên
kết HA – thụ cảm thể ở những loài khác nhau. Sau quá trình gắn màng, virút sẽ xâm
nhập vào tế bào bằng cách tạo bọng (endosome). Trong endosome, ở điều kiện pH thấp
(khoảng 5,5), phân tử HA0 sẽ bị thay đổi cấu trúc giúp bộc lộ peptide dung hợp HA2.
Peptide dung hợp gắn vào màng endosome khiến cho màng virút và màng endosome
hoà vào nhau. Môi trường acid trong endosome không những tạo điều kiện để quá trình
dung hợp diễn ra mà còn tác động đến kênh ion M2. Ion H+ sẽ đi vào virút qua kênh
M2, làm axit hoá lõi virút, giải phóng vRNP khỏi M1, các phân tử vRNP tự do này đi
vào tế bào chất của tế bào chủ [11].
Các protein cấu thành vRNP là NP, PA, PB1 và PB2 đồng thời là các tín hiệu
định vị nhân (NLS) [37]. Các tín hiệu định vị nhân này liên kết với các thành phần của
hệ thống xâm nhập vào nhân tế bào và do đó vRNP đi vào nhân tế bào chủ.

10

(2)Phiên mã vào sao chép

Hình 1.2. Chu trình nhân lên của virút cúm.
Nguồn: [34]
Virút cúm có hệ gen là RNA(-), quá trình sao chép để tạo các sợi vRNA(-) mới
sẽ được tổng hợp thông qua cRNA(+). cRNA(+) là sợi ARN có trình tự bổ sung với
vRNA(-), có chiều dài bằng sợi vRNA(-). Quá trình sao chép hệ gen virút cúm không
cần đến mồi mà thay vào đó, các ARN polymerase phụ thuộc ARN (RdRp) sẽ khởi đầu
quá trình tổng hợp ARN ngay trên sợi vRNA. Đầu 5’ và 3’ của mỗi sợi vRNA có trình
tự đảo ngược và bổ sung một phần với nhau do đó hình thành cấu trúc mở nút chai, cho
phép khởi đầu quá trình sao chép mà không cần sử dụng mồi.
Khác với nhiều virút khác có hệ gen là ARN(-), quá trình phiên mã của virút
cúm diễn ra trong nhân. Người ta nhận thấy rằng trong quá trình phiên mã của virút

11

cúm có cơ chế được gọi là “dành giật mũ” (cap-snatching): PB2 của virút có hoạt tính
endonuclease sẽ cắt các sợi ARN đã được gắn mũ (7-methylguanosine) của tế bào chủ
ở một gốc purin cách đầu tận cùng 5’ 10 – 13 nucleotide, đoạn ARN này sẽ được sử
dụng để khởi đầu quá trình phiên mã. Quá trình khởi đầu, kéo dài, kết thúc và gắn
polyA đều được xúc tác bởi phức hệ protein PB2, PB1, PA và NP. Các sợi mRNA có
chiều dài ngắn hơn các đoạn vRNA(-). mRNA sau khi được tổng hợp trong nhân tế bào
sẽ được vận chuyển ra tế bào chất để tổng hợp các protein của virút. Các protein màng
HA, NA M1 và M2 sẽ được vận chuyển đến màng sinh chất của tế bào trong khi các
protein NP, PA, PB1 và PB2 được chuyển vào trong nhân để cùng với vRNA(-) tạo
thành vRNP(-) mới [44].
Hệ gen của virút cúm gồm 8 phân đoạn ARN mã hoá cho 11 protein đã biết.
Mỗi phân đoạn 2, 7 và 8 mã hoá cho 2 protein; các phân đoạn còn lại mỗi phân đoạn
mã hoá cho 1 protein.
(3)Giải phóng vRNP(-) ra khỏi nhân tế bào
Trong nhân tế bào, chỉ các vRNP (-) được vận chuyển qua lỗ màng nhân ra tế
bào chất thông qua con đường vận chuyển phụ thuộc CRM1. Protein CRM1 là một thụ
cảm thể cho các tín hiệu vận chuyển từ nhân ra tế bào chất. Đầu tận cùng C của protein
M1 liên kết với vRNP, đầu tận cùng N của M1 liên kết với NS2; NS2 liên kết với
protein CRM1. Phức hệ gồm M1, vRNP (-) và NS2 sẽ được vận chuyển từ nhân ra tế
bào chất nhờ khả năng liên kết của NS2 với CRM1 [13].
(4)Đóng gói, nảy chồi và giải phóng virút thế hệ mới.
Virút cúm sử dụng màng sinh chất của tế bào chủ để tạo thành các hạt virút
hoàn chỉnh rồi rời khỏi tế bào và tiếp tục gây nhiễm các tế bào lân cận. Quá trình đóng
gói virút diễn ra tại vị trí màng sinh chất có các protein HA, NA và M2 của virút.
12

Người ta đưa ra hai mô hình giả thuyết cho quá trình đóng gói các đoạn ARN
virút: mô hình đóng gói ngẫu nhiên và mô hình đóng gói đặc hiệu. Theo mô hình đóng

gói ngẫu nhiên, các đoạn vRNA sẽ được đóng gói một cách ngẫu nhiên bên trong
virion. Mô hình đóng gói đặc hiệu dựa trên cơ sở các tín hiệu đóng gói virút được xác
định là các vùng mã hoá và không mã hoá ở đầu 5’ và 3’ trên đoạn vRNA. Protein M1
đóng vai trò quan trọng trong quá trình đóng gói và nảy chồi hạt virút.
Hạt virút chỉ đươc giải phóng ra ngoài màng sinh chất tế bào chủ khi liên kết
giữa acid sialic và glycoprotein / glycolipid được cắt đứt. Quá trình này được thực hiện
nhờ neuraminidasa (NA) trên bề mặt virút.
1.4. Vai trò của hiện tƣợng trao đổi và tích hợp vật liệu di truyền trong các
vụ đại dịch cúm trên thế giới.
Thế kỉ XX và đầu thế kỉ XXI đã ghi nhận có 5 đại dịch cúm xảy ra vào các năm
1918, 1957, 1968, 1977 và 2009. Tìm hiểu căn nguyên gây đại dịch cho thấy đại dịch
xảy ra khi xuất hiện chủng virút có tính kháng nguyên mới và cơ thể chưa có kháng thể
trung hòa virút đó. Trong 5 đại dịch đã xảy ra, 3 đại dịch cúm có căn nguyên là những
chủng virút được hình thành do hiện tượng trao đổi và tích hợp di truyền, đó là các đại
dịch năm 1957, 1968 và 2009 [2, 15].
13


Hình 1.3. Nguồn gốc các chủng virút cúm gây đại dịch.
Nguồn: />to-swine-how-h1n1-kicked-off-a-91-year-pADNemic-era/ [55]
14

- Đại dịch cúm năm 1957: xuất hiện vào tháng 2/1957 ở miền Nam Trung Quốc
rồi lan sang Singapore, Hongkong, Mỹ và Anh. Trong vụ dịch này đã có hơn 1 triệu
người tử vong. Căn nguyên được xác định là virút cúm A/H2N2, một chủng mới xuất
hiện do hiện tượng trao đổi và tích hợp (reassortment) các đoạn gen của chủng A/H1N1
năm 1918 và chủng virút cúm gia cầm. Chủng A/H2N2 mới lấy các đoạn gen PB2, PA,
NP, M, NS của A/H1N1 (1918) còn các đoạn PB1, HA, NA từ virút cúm gia cầm.
- Đại dịch cúm năm 1968: có căn nguyên là virút cúm A/H3N2; dịch xuất hiện
đầu tiên tại Hongkong vào tháng 6/1968 sau đó lan ra toàn thế giới vào mùa đông

1968, 1969 và 1970 với tỉ lệ tấn công khoảng 40% dân số, tập trung chủ yếu ở độ tuổi
10-14. Chủng A/H3N2 gây đại dịch là kết quả trao đổi và tích hợp genome giữa chủng
A/H2N2 gây đại dịch ở người năm 1957 và chủng virút gia cầm. Sự thay thế các đoạn
PB1, H2HA trong chủng A/H2N2 (1957) thành các đoạn PB1 và H3HA của gia cầm
đã tạo nên chủng A/H3N2 mới gây đại dịch.
- Đại dịch cúm năm 2009: bệnh nhân nhiễm virút cúm mới đầu tiên được phát
hiện ở Mexico, sau đó phát triển thành dịch lan sang các nước châu Mỹ, rồi bùng phát
trên toàn cầu. Căn nguyên của dịch là do một chủng virút A/H1N1 do trao đổi gen giữa
chủng virút cúm A/H1N1 và chủng A/H1N2 (chủng trao đổi và tích hợp bậc 3) gây
bệnh trên lợn.
1.5. Ứng dụng kĩ thuật di truyền ngƣợc tổng hợp virút cúm A.
Di truyền ngược là cách thức phục hồi chức năng của gen khi đã biết trình tự
nucleotide đầy đủ của gen (full length). Kĩ thuật di truyền ngược được áp dụng để
nghiên cứu sự thay đổi chức năng gen khi thay đổi trình tự nucleotide trên gen. Trong
nghiên cứu về virút cúm, kĩ thuật di truyền ngược được áp dụng để tổng hợp virút
nhằm nghiên cứu sự thay đổi về kháng nguyên, thay đổi độc tính của virút khi thay đổi
kiểu gen. Trong tế bào chủ, để tạo hạt virút cúm, cần sự có mặt của vRNA(-) và protein
virút, quá trình này cần hai loại sợi cRNA(+) và vRNA(-) [41].
15

Từ những năm 90 của thế kỉ trước, virút cúm A đã được tổng hợp bằng cách sử
dụng virút trợ giúp. Trong công trình nghiên cứu công bố năm 1996 của Palese, P. và
cs [40], virút cúm A được tạo ra nhờ một hệ thống phụ thuộc virút trợ giúp: phức hệ
vRNP được tạo ra bằng cách tổng hợp sợi ARN vi vitro cùng với sự có mặt của các
protein polymerase và NP tinh sạch. Phức hệ vRNP này được gây nhiễm cùng virút
cúm A trợ giúp để tạo virút mới [40]. Đến năm 1994, Neumann và cộng sự đã phát
triển một phương pháp khác, trong đó, vRNA được tổng hợp in vivo trong tế bào chủ
nhờ ARN polymerase I. Thực hiện chuyển nhiễm plasmid mang cDNA nhân dòng
cùng với virút trợ giúp sẽ tạo virút mới có đoạn gen tương ứng với cDNA nhân dòng.
Với cả hai phương pháp này, virút mang đoạn gen mong muốn được tạo ra đồng thời

với virút trợ giúp nên gây khó khăn trong việc sàng lọc virút đích.
Năm 1999, Neumann, G. và cs đã có những thay đổi về hệ thống tạo virút cúm
A [16]. Hệ thống mới không sử dụng virút trợ giúp mà gồm các plamid mang các đoạn
cDNA nhân dòng. Hai loại plasmid được sử dụng là plasmid biểu hiện vRNA(-) và
plasmid biểu hiện protein virút. Khi chuyển nhiễm đồng thời 8 plasmid biểu hiện 8
đoạn vRNA(-) và 4 plasmid biểu hiện 4 protein PB2, PB1, PA và NP vào tế bào 293T,
sẽ tạo ra 8 phức hệ vRNP, từ đó tổng hợp nên virút cúm A. Ngoài hệ thống gồm 12
plasmid như trên, tác giả cũng đã thử nghiệm với hệ thống 17 plasmid gồm 8 plasmid
biểu hiện vRNA(-) và 9 plasmid biểu hiện protein (PB1, PB2, PA, HA, NP, NA, M1,
M2 và NS2) để tạo virút cúm A. Kết quả cho thấy cả hệ thống 12 plasmid và hệ thống
17 plasmid đều tạo virút cúm A có khả năng gây nhiễm. Hệ thống chuyển nhiễm ADN
có ưu điểm hơn so với hệ thống cần virút trợ giúp, đó là tạo ra chính xác virút mong
muốn, không phải thực hiện sàng lọc virút đích.
Để hạn chế tối đa số lượng plasmid, có nghĩa đơn giản hóa quá trình xây dựng
hệ thống chuyển nhiễm plasmid, năm 2000 Hoffmann, E. và cs đã phát triển hệ thống
chuyển nhiễm gồm 8 plasmid [19]. Hệ thống này chỉ sử dụng một loại plasmid là
16

pHW2000. Plasmid pHW2000 được thiết kế để biểu hiện đồng thời vRNA(-) và
protein virút. Khi một đoạn gen của virút cúm được nhân dòng vào pHW2000,
vRNA(-) và protein của virút sẽ được tổng hợp từ cùng một plamid nhờ ARN
polymerase I và ARN polymerase II của tế bào chủ. Chính vì vậy, hệ thống mới chỉ
gồm 8 plasmid pHW2000 mang 8 đoạn cDNA của virút cúm. Hệ thống này có số
lượng plasmid ít hơn, đồng nghĩa với việc quá trình xây dựng đơn giản hơn so với hệ
thống chuyển nhiễm plasmid của Neumann, G. và cộng sự. Với ưu điểm này, hiện nay
hệ thống chuyển nhiễm 8 plasmid được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về đặc tính
phân tử khả năng gây bệnh của virút cúm.
1.6. Cơ sở khoa học để thiết kế và thực hiện nghiên cứu.
Theo kết quả giám sát cúm của PTN Cúm Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, từ
năm 2000 đến nay (tháng 8 năm 2012), ở Việt Nam, virút cúm gây bệnh cho người lưu

hành quanh năm, gồm các típ và phân típ cúm A/H1N1, A/H3N2, cúm B, A/H1N1-09
đại dịch (từ năm 2009).
Bên cạnh sự lưu hành các chủng virút cúm người, từ năm 1997 đến nay, dịch
cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 (HPAI H5N1) lây từ gia cầm sang người đã và đang
gây mối lo ngại cho các nước về nguy cơ bùng phát đại dịch. Theo ghi nhận của
TCYTTG, tử năm 2003 đến tháng 7/2012 đã có 608 người nhiễm virút cúm gia cầm
độc lực cao ở 15 quốc gia khác nhau, trong đó 359 trường hợp tử vong (59,0%) [12].
Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên người là những đợt dịch lẻ tẻ, với sự lưu
hành của các clade/ hoặc subclade kháng nguyên khác nhau của virút cúm A/H5N1.
Virút cúm gia cầm A/H5N1 gây bệnh cho người ở Việt Nam được xác định thuộc 2
clade kháng nguyên 1 và 2.3.4 [28].
Khả năng lây nhiễm virút cúm gia cầm từ người sang người chưa rõ ràng, song
nếu xuất hiện một virút cúm có độc lực cao như A/H5N1 đồng thời có khả năng lây
nhiễm nhanh chóng như virút cúm mùa hiện tại sẽ là mối nguy hiểm cho sức khỏe cộng
17

đồng. Chủng virút này có thể được hình thành do những thay đổi nhỏ trên các đoạn gen
của virút hoặc do hiện tượng trao đổi gen giữa chủng virút cúm gia cầm độc lực cao
với chủng virút cúm mùa đang lưu hành.
Theo kết quả giám sát cúm tại Hà Nội giai đoạn 2001-2005 và giám sát cúm tại
miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2006-2008, hai phân típ virút cúm mùa là A/H3N2 và
A/ H1N1 thường xuyên lưu hành và là căn nguyên của các dịch cúm vào mùa hè [1].
Kết quả thu thập được từ hai chương trình giám sát cúm trên cho thấy virút cúm
A/H3N2 được ghi nhận là căn nguyên chính của các vụ dịch năm 2002, 2004, 2005,
2007, tương tự virút cúm A/H1N1 là căn nguyên chính của các vụ dịch năm 2003,
2005 và 2008. Virút cúm A/H3N2 gây dịch vào các năm khác nhau có đặc tính kháng
nguyên khác nhau đã được ghi nhận đó là A/Panama/2007/99 (2001-2002);
A/Fujian/411/2002 (2004-2005); A/Wisconsin/67/2005 (2006-2007) đến
A/Brisbane/10/2007 (2007-2008). Trong khi đó, các virút cúm A/H1N1 gây dịch trong
giai đoạn trên có đặc tính kháng nguyên được xác định là A/New Caledonia/20/1999

(2003; 2005) và A/ Solomon Islands/3/2006 (2008) [1, 31]. Kết quả này đã khẳng định
sự tiến hóa về mặt di truyền của virút cúm A/H3N2 nhanh hơn virút cúm A/H1N1, vì
vậy virút cúm A/H3N2 dự tuyển cho vắc-xin cúm mùa hàng năm được cập nhật và
thay đổi nhiều lần hơn so với virút cúm A/H1N1 trong cùng giai đoạn.
Năm 2009, đại dịch cúm A/H1N1 xuất hiện và lan rộng trên toàn thế giới. Phân
tích cấu trúc hệ gen của virút cúm A/H1N-09 đại dịch cho thấy các gen M và NA có
nguồn gốc từ virut cúm lợn H1N1 dòng Á – Âu; còn các gen PB2, PB1, PA, HA, NP,
NS có nguồn gốc từ virút cúm lợn H1N2 dòng Bắc Mỹ. Virút cúm lợn H1N2 là virút
trao đổi và tích hợp bậc 3 (triple-reassortant virus) giữa virút gia cầm (gen PB2, PA),
virút cúm lợn (HA, NP, M, NS) và virut cúm người H3N2 (gen PB1, NA) [46].
Ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược chủ động tổng hợp virút cúm mới trao đổi
và tích hợp di truyền giữa virút cúm gia cầm và virút cúm người để tìm hiểu độc lực
18

virút, khả năng gây bệnh cho người, chủ động xây dựng các biện pháp phòng chống
hữu hiệu là các xu hướng nghiên cứu về virút cúm trên thế giới. Nghiên cứu của Li, C.
và cs năm 2009 đã tạo ra các virút mới trên cơ sở virút cúm A/H3N2 ở người và virút
cúm gia cầm A/H5N1. Kết quả cho thấy việc trao đổi và tích hợp giữa virút cúm
A/H5N1 và virút cúm có độc lực thấp trên người hoặc chuột (A/H3N2) có khả năng tạo
ra virút có độc lực cao và phân đoạn gen PB2 của virút cúm người có trong virút cúm
gia cầm A/H5N1 có thể làm tăng độc lực của virút cúm này [29]. Tương tự, nghiên cứu
của Jackson, S. và cs năm 2009 cũng xác định khả năng trao đổi và tích hợp vật liệu di
truyền của virút cúm A/H3N2 và H5N1 trên mô hình động vật là có thể. Thêm vào đó,
kết quả phát hiện tỷ lệ cao virút trao đổi và tích hợp trên biểu mô đường hô hấp trên
của chồn sương cho phép kết luận rằng: nếu hiện tượng phơi nhiễm của người hoặc
động vật với virút A/H5N1 cùng với virút cúm mùa trong cùng thời gian sẽ làm tăng
nguy cơ tạo virút cúm trao đổi và tích hợp, có thể đào thải qua đường hô hấp trên như
virút cúm mùa [23].
Từ các kết quả nghiên cứu trên, phối hợp với tình hình dịch tễ học bệnh cúm tại
Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid có khả

năng tổng hợp virút cúm A. Sau đó, từ hệ thống chuyển nhiễm này chúng tôi tiến hành
tổng hợp virút cúm A mới từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2. Hệ thống chuyển nhiễm
plasmid nếu thành công, sẽ tạo điều kiện phát triển các nghiên cứu sâu hơn về virút
cúm. Đó không chỉ là các nghiên cứu về độc lực virút, khả năng lây truyền của virút
mà còn về hiện tượng trao đổi và tích hợp diễn ra trong quần thể virút cúm A lưu hành
tại Việt Nam cũng như các nghiên cứu về phát triển vaccine cúm phòng bệnh trong
tương lai.