Phân tích đặc điểm sinh học phân tử Gen NP, Gen NS của một số chủng virus cúm A H5N1 mới xuất hiện năm 2011 tại Việt Nam

I HC QUI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN








Phạm Thị Duyên






PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ
GEN NP, GEN M VÀ GEN NS CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 MỚI XUẤT HIỆN
NĂM 2011 TẠI VIỆT NAM







LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

i - 

I HC QUI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN






Phạm Thị Duyên






PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ

GEN NP, GEN M VÀ GEN NS CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 MỚI XUẤT HIỆN
NĂM 2011 TẠI VIỆT NAM



t hc
: 60 42 40




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC




NG DN KHOA HC: PGS.TS. LÊ THANH HÒA





i - 

i

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA
VI

DANH MỤC CÁC BẢNG
VIII

DANH MỤC CÁC HÌNH
XI

MỞ ĐẦU
1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1.
BỆNH CÚM GIA CẦM A/H5N1
3

1.1.1. T h bnh c A/H5N1 trn th gii
3

1.1.2. T h bnh c A/H5N1 ti Vit Nam
3
1.2.
ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1
5

1.2.1. 
5

1.2    m c       t
ch
6

1.2.3. Dch t h 
8
1.3.
ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN CỦA VIRUS
CÚM A/H5N1
12

1.3.1. u to c
12

m sinh h h 
13

1.3.3. Hing ct   v
17
1.4.
CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG CÁC PROTEIN NP, M VÀ NS CỦA
VIRUS CÚM A/H5N1

21

1.4.1. Protein NP
21

m M (matrix protein)
22

1.4.3. Protein phi c
24
1.5.
TẦM QUAN TRỌNG CỦA NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VÀ BIẾN
ĐỔI DI TRUYỀN CÁC GEN NP, M VÀ NS CỦA VIRUS CÚM
A/H5N1
25

ii


CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
27
2.1.
Nguyên liệu
27

2.1.1. Mu bnh phm
27

2.1.2. Dng c, trang thit b
27

t
27
2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu
27

2.2.1. t RNA tng s (genomic RNA)
28

2.2.2. Thc hin phn ng RT-PCR
30

2.2.3. 
31

2.2.4. Gi
32

2 2.5. i chi  liu
33

2.2.6. X  liu b-sinh hc
33

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
34
3.1.
Thu nhn, ging
Dk-VN--VN-QT1603
34

3.1.1. ng s c hin phn ng RT-PCR
34

3.1.2. Thc hin RT-PCR, thu nh gen NP
35

3.1.3. Thc hin RT-PCR, thu nh gen M
37

3.1.4. Thc hin RT-PCR, thu nh gen NS
39
3.2.
Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của
chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 với các chủng của Việt Nam và
thế giới

41

NP
41

M
48

NS
56
3.3.
Thảo luận chung
64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
67

TÀI LIỆU THAM KHẢO
69


PHỤ LỤC


iii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA
Ký hiệu
Tiếng Anh
Thuật từ/Cách dùng hoặc nghĩa
tiếng Việt
Aa
Amino acid
Axit amin
Bp
Base pair
C
Ck
Chicken

Da
Dalton
      
protein
Dk
Duck

Vt
DNA
Deoxyribonucleic Acid
Axit deoxyribonucleic
dNTP
Deoxy Nucleotide Triphosphate nt
nucleotide
Tin cht dNTP cho phn ng PCR
u to
Gs
Goose
Ngng
HA
Haemagglutinin
t hng cu
Kb
Kilo base

LB
Luria-Bertani
ng Luria-y
vi khun
LPAI
Low Pathogenic Avian Influenza
m th c lc thp
M
Matrix
m
MDk
Muscovy duck

Ngan
MEGA
Molecular Evolutionary Genetics
Analysis

gen
NA
Neuraminidase
i sialic
NT
Nucleotide
Nucleotit
NEP
Nuclear Export Protein
Protein vn chuyn
NP
Nucleoprotein

NS
Non structural protein

PA
Polymerase acidic protein

PCR
Polymerase Chain Reaction
Phn ng PCR

iv

RNA
Ribonucleic Acid
Axit ribonucleic
RNP
Ribonucleoprotein
T ht ribonucleic
RT-PCR
Reverse Transcription-Polymerase
Chain Reaction
Phn c
(-)ssRNA
Negative single-strand Ribonucleic
Acid
ARN s
TAE
Tris-Acetate-EDTA
Tris-Acetate-EDTA
TNF-
Tumor Necrosis Factor-
Yu t i t khi u
WHO
World Health Organization
T chc Y t th gii

v

DANH MỤC CÁC BẢNG
TT
Tên bảng
Trang
1.1
Th     m ti Vit Nam t  -
2

4
2.1
i s dng trong thu nh 

29
2.2
n phn ng RT-
30
2.3
n phn ng n
31
3.1
  a Vit Nam 

gii s dng gen NP 
mi quan h ngun gc ph h 


42
3.2
V  ca gen NP chng Dk-
VN-ng Dk-VN-QT1603 vi 20 ch


44
3.3
T l ng nht v 
ng v       NP gia mt s
cha Vi gii 


46
3.4
  a Vi
gic s dng gen M n gen
i quan h ngun gc ph h


49
3.5
V  
chng Dk-VN-  ng Dk-VN-QT1603 so vi 20
ch

50
3.6
T l ng nht v 
ng v amino acid    a gen M1 gi 
cha Vi th gii


53
3.7
T l ng nht v 
ng v amino aci    a gen M2 gi 
cha Vi th gii


54

vi

3.8
  a Vi
gic s dng gen NS n gen
i quan h ngun gc ph h


57
3.9.
V a gen NS1 chng Dk-
VN-  ng Dk-VN-QT1603 so vi 20 chng virus


58
3.10
T l ng nht v nuc
ng v amino acia gen NS1 gi
cha Vi th gii

61
3.11
T l ng nht v 
ng v amino acid (da gen NS2 gi
cha Vi th gii


62

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
TT
Tên hình
Trang
1.1
 c t 
6
1.2
 m ca virus  t  
7
1.3
 c lc cao ti Vit
Nam t 2001  2007
11
1.4
nh chu ph
12
1.5
 
13
1.6
 hing ct  n 7
(gen M)   
18
1.7
 p phn polymerase cn
ng chuyi cc v i ct - t 


19
1.8
 hing ct  n 8
(gen NS)   

20
1.9
      a protein NP c  
A/H5N1 

22
1.10
S i pH nh i


23
1.11
Cc 2 cc h
24
2.1
 u n NP, gen

28
2.2
 b  thu nhn gen P, gen M,
c 
29
2.3
 cu to vector pCR


2.1TOPO (Invitrogen) 
31
3.1
Kt qu n di kim tra RNA tng s ca chng Dk-VN-QT-
ng Dk-

34
3.2
Kt qu n di kim tra sn phm RT-
 hp 

35

viii

3.3
n gia gen
NP chng Dk-VN-

36
3.4
Kt qu n di kim tra sn phm RT-
 hp 

37
3.5
n gia gen M
chng Dk-VN-

38
3.6
Kt qu n di kim tra sn phm RT-
 hp 
39
3.7
n gia gen
NS chng Dk-VN-

40
3.8
 h biu th mi quan h ngun gc ph h gia 
ch d nucleotide gen
NP s d
47
3.9
 h biu th mi quan h ngun gc ph h gia 
ch d nucleotide gen
M1 v gen M2 s d

55
3.10
 h biu th mi quan h ngun gc ph h gia 
ch d nucleotide ca
gen NS1 v NS2 s d
63

1
MỞ ĐẦU
        h Orthomyxoviridae, b
Mononegaviralest ch yu  qun th
p ph bi
A/H5N1  gia cm t  n nay.
Di t 
n bin phc tp ti nhiu quc gia. Vi 
ngi nhi  gii, c
nh i xy ra di 
ngi cn c bing ch.
H gen ca h A,
ga virus.
nh, v bii
   n gen    t bin ho      
ch, d 
ng vt ch mi ca virus. nh c
th c l gii hn  chtm ct protease ca protein
heagglutinin (HA) enzyme ca protein neurominidase (NA)
kh  hp to virus mi, vi c l.
   t bi           
chng virus m so vi chu, s xut
hit bin gen NP, c chng virus
 c l nh ca
chng virus mi. n 5 (gen NP) ng hp nucleoprotein
NP chm vn chuyn RNA gi  , cha

ng ca thuc c ch c epitope ca vaccine. n 7 (gen M)
m t c m protein nn M1 chm bao
bribonucleoprotein (RNP) y chi
ca virus;  chuym cn h


2
t ch. Mt s chng virus A/H5N1 xut hin
t bi protein M2 dn tc c ch Amantadine. 
n 8 (gen NS) - n ngn nht trong h 
protein phi cu t c lc ca virus
nh kh c ch tng hp interferon ca t c l
bnh ca virus.
t ch s ti gen 
cu ht sc cn thit hin nay. Qua 
d ch t hc virus A/H5N1  mc  sinh h nh hng s
dn a bin lc
 n vacxin th h mi (c bi  cine   hp s d  t di
truyn ngc (reverse genetics-based vaccine)) c hiu vi chng A/H5N1 ng
nhim.
u    cho 
hiu c im bin n nucleotid i 
a virus A/H5N1, nh hng ca nhng bin i  n c lc, kh nng
t chi quan h tinh
e c
Xu nh 
Phân tích đặc điểm sinh học phân tử gen NP, gen M và gen NS của một số
chủng virus cúm A/H5N1 mới xuất hiện năm 2011 tại Việt Nam”.
V
1- Thu nhn c on

a mt s chp t bnh phm 
gia cm  Vit Nam nm 2011.
2-  bin i  nucleotid cn gen NP,
t amino acid suy din cp vi mt s
ch ca Vi gi.
3- i quan h ph h ci
 gii d n gen NP, M, NS.
 c thc hin tn dch hc - Vi sinh hc.



3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh cúm gia cầm A/H5N1
1.1.1. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới
  m  Qu
Quc). M) dm A/H5N1 xut hin  H
i t vong trong tng s nh nhi
v dn trc tii [75].
m  9 qu
t Nam.
n nay, dch bng 
nhi gii [36]. Nhn d
tru gia c t hi nng n v kinh t.
c bi i, v
i nhi  dm xy ra  c gia
 gii [77], [80]. V c lc cao nht
n nay [2], [70].  vng chng sinh hc cho thy chng
  m t gia

ci vng hp i nhi
A/H5N1 nh c tip vi gia cm bnh, hou t
sinh h hay gia h n kh m th vi virus [7],
[41], [80].
1.1.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 tại Việt Nam
Dc             
 52/64 t 
i nhi u b t vong (100%) trong v d [53].
n nay, dch b nhia
 



4
tr li   , Ngh Qung Tr vi 2
ng hp t vong i  [79].
Theo s liu th dch xy ra ti Vin
; i t vong trong tng s c nh nhim
ng th 2 sau Indonesia (156/188) trong s  l
i nhim t th gii [79]. T l i t
vong/nhic th  dch xy ra  Vit
Nam t n nay, gim t 
Vit Nam khng ch    m A/H5N1;  l   i
 [7],
[41], [79], [80].
S gia cm mc b gia cm ch trong nhng
tnh xy ra dm vi
s ng gia cm mc bng gia cm cht ho n
 (Bng 1.1) [85].
Bảng 1.1. Thm ti Vit Nam t -2010 [85].

Năm
Số
tỉnh
Số huyện
có dịch
Số xã, phƣờng
có dịch
Số gia cầm mắc
bệnh (con)
Số gia cầm chết,
tiêu huỷ (con)
2007
33
115
283
69.207
314.268
2008
27
54
80
13.007
106.058
2009
17
35
71
68.463
105.601
2010

23
41
68
59.809
87.590
2011
22
43
82
110.311
151.356

c bit tnh Qung Tr c xy ra dm trong nhng
 t  tnh Qung Tr y ra dch
gia cm ta 4 huyn (huyn Hu Phong, th 
Qung Tr) vi 35.000 con b bnh. c bit  huyn H dxut
hin ti Qu, Hi Ba, H



5
22.120 con gia cm t i ph. T 
22/2/2012 dy ra  3ng ca 29 qun/huyn thuc 12
tnh ca c nh Qung Tr vi tng s gia cm mc bnh, ch
b   [85]. y r ch
c lc tr li ho s u tr,
  [7], [41], [79], [80]. 
nh Viđiểm nóng  xi d
cn, u kin thun
l tii [77], [79].

1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1
1.2.1. Phân loại và danh pháp virus cúm A/H5N1
- Vị trí phân loại của virus cúm A/H5N1
        h Orthomyxoviridae, b
Mononegavirales [6], virus t ch yu 
qun th p ph bi gia
cm t n nay [21].
(subtype), 
t bi s  
mt ca  [50], [73]. u H1  H16) 
type NA u N1  N9) n, v t s t hp gi
 t[75], [77].
- Kí hiệu và danh pháp virus cúm A/H5N1


 u theo ki
(serotype)  , vit tye virus
/H5N1 thu



 , ki






H5 1, vit t [6], [49].





 /





 


     [88], hoc Tr   li     :
Influenza Sequence Database) [86] a T chc Y t



6
(A)
(B)
Th gii (WHO)   t     ng vt b
nhip/S hip/Loi 
[77]. :  /H5N1 

 




Giang - 


 2005, 



 /05 



:
A/Duck/Vietnam/AG/05/H5N1. i v  ch     p
c  i b nhim, 

ng vt b nhi
d: A/Vietnam/1194/04/H5N1 [77].








Hình 1.1.  c t 
(A: p  ng vt; B: i).

1.2.2. Cơ chế xâm nhiễm của virus cúm A/H5N1 trong tế bào vật chủ
t bu
ca virus xy ra ch yu   
th nhim [49], [54].

m cc m u bng s kt hp
ca HA(H5) vi th th  m 
h gen ca t 
 xa t
t so vy ra trong
t virus ra khi t m nh
a enzym neuraminidase.



7
Thi gian mt virus mi ca virus
 kho ). S tt virus m
   ri lon h thng tng hi

c vt ch [72], [75].

Hình 1.2.   t  [49].

c gi m, h gen ca virus
s dng b c ca t ng hrotein cn
chuyn ph thuc RNA (RNA-dependent RNA transcription). Phc hp protein 
RNA cc vn chuy [11].
  gen ca virus tng h
a h gen virus, t ng h
gen ca virus mi nh RNA-       
(g- polyA)  - -t hp vi nucleoprotein
(NP) tc hp ribonucleoprotec vn chuyn



8
 ng th h
thng enzyme  tn gen cc enzyme PB2 g-
12 nucleotid Adenin  -c vn chuyn ra bi
i n tng ha virus.
 a virus sau khi tng hc vn chuyn g
m m nh b y ch
(budding) ca virus. NP sau khi tng hc vn chuyn tr l  kt
hp vi RNA tc hp nht
vy chn ch  bi

t gia HA vi th th cha s
gip t [49], [50].
1.2.3. Dịch tễ học phân tử virus cúm A/H5N1
- Trên thế giới
Ch      p l     c bnh ti
   .     u h
gen cho thy chn gc t i gen vi A/H9N2
n, thu[49]. Hii ta lo ng
th n t gia c  i trc ti   ng b  m, hoc
t ch n.
chng n
    i ch     u t   [33].  
lp t ngng ti mt  dch  Qung
y tm
    Ch        p ngun gen
HA(H5) cho ti hp tchng ch b
i  H
Hc kin to t  n gen NA(N1)
 c
cho 19 amino acid ho tu N ca



9
   t bi          
ng c thu ci [46]. i vi
gen t bi chui ni cm ct protease gi
n ti
 c l              -
RRRKK- [17], [46] hoc -RRRK-  i.

Sau mnh ti H m b t,
y gc Qum c 
bn mc t chn
tip tc tn ti trong ngng  c, tr  hp
chng mi [14], [76]. - 2002, nhiu chng virus
c
h tclade c lc cao vi vi v ri b
i trong nh 2002 [41]. Tip t- 2003, gen
   t bin mi do hu qu ca hi ng l  
(antigenic drift;  ri to chng nh cc k c bii vi
v i [67].  i
c li vt ch bao gm
v  ru
chng [26],
[57].
 n 1997 - n m
n v t ch, tr 
bnh ri vi gia c 2005 [41], [66]. Tuy
 di truyn hn 1997 -
2002 v   ng nh    i ch  
A/Gs/ n dt x-
2005 [20]. S xut hin ca genotype Z vt trong nh



10
 ng chng ca s t bi
c[41], [81].
Cuc
     xut hi    i (Qinghai and Qinghai-like

n (Fujian and Fujian-like sublineage; p
m Trung Quc, H      [41],
[66] i vi
[82]. ng thu
i nhi g ni cm ct protease
 -RRRK-, gim mt mt Lysine (K) so v      
[66]. - n d
nh  -   t hin nhiu ch    ng
kc lc, v dch t h  c
t[82].
- Tại Việt Nam
p ti Vit Nam trong nh- 2006, thu
Qup trung ch y vm u
b mi ni HA1  m ct protease) mang amino acid
t hit
 bin  Bc Vi
   min Nam [20], [66].       c
c
nh bng sinh h 
n. Ti hp mt
 nh  Nam Trung Quc [82].
n nay, ti Vin tnh
d  h
 2001)  -
2007)    ; clade 2.3.4 (VN6



11
   ; clade 2.3.4

-t hin  p lu ti Lng
 ) [19], [53].

Hình 1.3. virus  c lc cao ti Vit Nam t 2001 
2007 [54].

Virus H5N1 vp tc bii di truy h nghi nhn ti.
Mt s ch t bin mn  t



12
(A) (B)
s chng ch xut hin ri bin m i ngun gen
t s  tn t n
c [3].
1.3. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN CỦA VIRUS CÚM
A/H5N1
1.3.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của virus cúm A/H5N1
- Hình thái:       n ti
dt virus (virions). Ht virus (vng
ng 80  i ng
 200 - 300 nm   ng ca mt h
khong 250 triu dalton [49].
- Cấu tạo hạt virus cúm A/H5N1:
Thành phần hóa học: c ca 1 h/H5N1 bao
gm: RNA chim 0,8 -1,1%; protein 70 - 75%; lipid 20% -  - 8% carbon
hydratep cht h yu cp trung 

phn ln 
m     i enzym galactose, mannose, ribose, fructose,
glucosamin.
Cấu tạo hạt virus cúm A/H5N1: H1 u tn,
bao gm: v RNA s).






Hình 1.4. nh chu ph [2].
(A: nh chu phn t truyn qua. B
cu to h Hemagglutinin: phân tử kháng nguyên HA, Neuraminidase: phân



13
tử kháng nguyên NA, Capsid: vỏ virus, Lipid envelope: lớp màng bao lipid, RNA: hệ gen
virus).
V n chu to b
n gc t  c hiu h
protein c m mng gai m
- - 6 nm, bao g
m (MA  matrix).
Vt cht di truyn h 
u ss(-)RNA (negative single stranded RNA) [49].
1.3.2. Đặc điểm sinh học phân tử hệ gen virus cúm A/H5N1



 /H5N1  







 , 




 cn alpha ( helix)  


virus,  13,5 kilobases (kb).
H gen c/H5N1 8 













  RNP, m  n RNP kt hp vi phc hp
polymerase (PB1, PB2, PA) cha virus
trong t 












: PB2; PB1; PA; HA (H5); NP; NA (N1); 

 


- - ca mi ph

  



 o tn
- -UCG(U/C)UUUCGUCC.

Hình 1.5 [77]



14
(A: n gen cB: Cn gen (RNP) ca virus
ba dưới đơn vị phức hợp enzym polymerase của virus).

 
: PB2, PB1(PB1 1-F2); PA, HA; NP, NA; M (M1 
M2) (NS1 ) [49], [75].
Các phân đoạn tổng hợp phức hợp enzym polymerase
ng h
phc hp polymerase (RNA transcriptase) c  
bo tn cao, bao gm:
- Phân đoạn 1 (gen PB2) ch          
tng hp protein enzym PB2 gm 759 amino acid (aa) n
trong phc hp enzym polymerase ca virus, chm kh
RNA virus [54], [75].

 ng 84.10
3
c
t 
3
Da) [49].
  t ch c ch n
v  627  protein PB2 ( ia cm v - ng nhit
  gia cm khong 40
o
 - ng
nhi  i khong 37
o
C) [74].
- Phân đoạn 2 c 2431 bp, cha khung gen PB1
bo t ng hp enzym PB1 - ti a phc
hng hp RNA virus, chm gn
[49].
Gt protein (PB1-F2) chi mt
c m c 273 bp ca PB1 [72]. Protein PB1-
nhy cm vi TNF ( - t theo
a t 

u bing min
dch ca vt ch vi virus, 

 c lc


m trng c






/H5N1 [15], [18].



15
- Phân đoạn 3 (gen PA) (polymerase acidic) ch



  
ng hp protein PA gm 743 aa, mt trong 3 ti c




 , ch 
tng hp RNA ca virus [54], [75].
Các phân đoạn mã hóa tổng hợp protein kháng nguyên bề mặt
 mt capsid ca
ng chm:
- Phân đoạn 4 (gen HA) cha gen HA (H5) 



 i trong

1704 - ng hp protein HA(H5) cha 567 - 568 aa - mt
 m

 ng min dch
 vt ch [29], [54].
       khong 63.10
3
Da (n  c

3
Da (n
1
 48.10
3

HA
2

3
Da) [37], [45].
Protein HA -  mm hai tiu ph
1

HA
2
i gia HA
1

2
gm mt s aa i

mt chum ct c t
c lc ca virus [24].
nh loi th th 






  m nhin kh 
m r vt ch ca virus [29], [54].
- Phân đoạn 6 a virus) cha khung gen
NA(N1)  i trong khong t 1350 - 1410 bp  virus HPAI
A/H5N1, (N1) 

 m 449  469
aa [12], [26]. Protein NA c ng 50.10
3
Da
c t  60.10
3
Da) [13], [14].
 gen NA cy ph- ca gen
n tc tp