Nghiên cứu phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật ứng dụng xử lý nước thải giàu nitơ, photpho

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





Ngô Thị Kim Toán





NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH
VẬT ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI GIÀU NITƠ, PHOTPHO






LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012



ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




Ngô Thị Kim Toán




NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH
VẬT ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI GIÀU NITƠ, PHOTPHO



Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN QUANG HUY

Hà Nội – 2012


Lời Cảm ơn

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Quang Huy, ngời
Thầy đã tận tình hớng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, Trờng
Đại học Khoa học Tự Nhiên, ĐHQGHN đã dành tâm huyết giảng dạy, trang bị kiến thức cho
chúng em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, em đã nhận đợc rất nhiều sự giúp đỡ,
hỗ trợ. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, cán bộ, học viên, sinh viên trong Bộ
môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học; Phòng Enzym học và Phân tích hoạt tính
sinh học, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Protein và Enzym.
Đề tài thực hiện có sự hỗ trợ kinh phí của đề tài Nghiên cứu phát triển công nghệ màng
sinh học trong xử lý nớc thải giàu nitơ và photpho của Bộ Công thơng
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ
em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn, giúp em trởng thành hơn khi sắp bớc
đi trên những con đờng mới.

Hà Nội, tháng 12 năm 2012
Học viên



Ngô Thị Kim Toán

Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán i K19 – Sinh học thực nghiệm

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình trạng ô nhiễm môi trường nước hiện nay ở Việt Nam và thế giới 3
1.2. Các phương pháp xử lý ô nhiễm nước thải có chứa hợp chất nitơ, photpho
hiện nay 5
1.2.1. Phương pháp hóa học 5
1.2.1.1. Xử lý các hợp chất chứa nitơ bằng phương pháp hóa học 5
1.2.1.2. Xử lý các hợp chất photpho bằng phương pháp hóa học. 6
1.2.2. Phương pháp sinh học 7
1.3. Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ, photpho trong
xử lý ô nhiễm nước thải. 10
1.3.1. Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ 10
1.3.2. Vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho 12
1.4. Màng sinh học và ứng dụng của màng sinh học trong việc xử lý ô nhiễm nước
thải giàu nitơ, photpho. 14
1.4.1. Màng sinh học 14
1.4.1.1. Định nghĩa về màng sinh học 14
1.4.1.2. Thành phần và quá trình hình thành màng sinh học 14
1.4.2. Vai trò và ứng dụng của sự hình thành màng sinh học 18
1.4.2.1. Vai trò của sự hình thành màng sinh học 18
1.4.2.2. Ứng dụng của màng sinh học trong xử lý ô nhiễm 20
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Nguyên liệu 23
2.2. Hóa chất, thiết bị 23
2.2.1. Môi trường nuôi cấy 23

2.2.2. Máy móc thiết bị 24
2.3. Phương pháp nghiên cứu 25
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán ii K19 – Sinh học thực nghiệm

2.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn 25
2.3.2. Phương pháp đánh giá khả năng hình thành biofilm 25
2.3.3. Quan sát cấu trúc biofilm bằng chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét
(SEM) 26
2.3.4. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy lên sự hình thành
màng sinh học 26
2.3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy 26
2.3.4.2. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 27
2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram. 27
2.3.6. Phương pháp sử dụng kit APi 28
2.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng chuyển hóa các hợp chất nitơ 28
2.3.7.1. Phương pháp phân tích nitơ tổng số 28
2.3.7.2. Phương pháp phân tích hàm lượng amoni (NH
4
+
) 29
2.3.7.3. Phương pháp thử khả năng chuyển hóa nitrite 30
2.3.8. Phương pháp đánh giá khả năng tích lũy photpho 31
2.3.8.1. Phương pháp phân tích photpho tổng 32
2.3.8.2. Phương pháp phân tích hàm lượng Ortho photphate (PO
4
3-
) 32
2.3.9. Phương pháp phân loại vi sinh vật dựa trên gen 16S rRNA 33
2.3.10. Phương pháp thống kê sinh học 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3. 1. Nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ 34
3.1.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ và có khả năng
hình thành màng sinh học 34
3.1.1.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ 34
3.1.1.2. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng phân lập 36
3.1.2. Khả năng chuyển hóa nitơ 38
3.1.2.1. Khả năng chuyển hóa amoni 38
3.1.2.2. Khả năng chuyển hóa nitrite 39
3. 2. Nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho. 40
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán iii K19 – Sinh học thực nghiệm

3.2.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho và có khả
năng hình thành màng sinh học. 40
3.2.1.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho 40
3.2.1.2. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng phân lập 41
3.2.2. Khả năng xử lý photpho của các chủng nghiên cứu. 42
3. 3. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng nghiên cứu 43
3.3.1. Khả năng tạo hình thành màng sinh học trên một số giá thể 43
3.3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nghiên cứu 45
3.3.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên sự hình thành màng sinh
học 46
3.3.4. Khả năng chuyển hóa một số chất trong bộ kit APi 48
3.3.5. Trình tự 16S rRNA và cây phát sinh chủng loại 50
KẾT LUẬN 54
KIẾN NGHỊ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Luận văn thạc sĩ

Ngô Thị Kim Toán iv K19 – Sinh học thực nghiệm


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Hàm lượng thành phần nitơ và photpho trong mẫu phân tích. 34
Bảng 3.2. Địa điểm và số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nitơ 35
Bảng 3.3. Địa điểm và số lượng các chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho 41
Bảng 3.4. Một số đặc điểm sinh hoá của các chủng theo kit APi (BioMérieus) 48

Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán v K19 – Sinh học thực nghiệm

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Chu trình nitơ trong tự nhiên 8
Hình 1.2. Các giai đoạn chính của quá trình hình thành một biofilm 16
Hình 3.1. Hình ảnh các khuẩn lạc phân lập trên môi trường 35
Hình 3.2. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng trên môi trường
Winogradsky 1 được phân lập từ các mẫu nước thải thu từ bể biogas 36
Hình 3.3. Khả năng hình thành màng sinh học của các chủng trên môi trường
Winogradsky 1 được phân lập từ các mẫu nước thải khu tập trung rác thải 37
Hình 3.4. Khả năng tạo hình thành màng sinh học của các chủng trên môi trường
Winogradsky 2 được phân lập ở bể biogas 37
Hình 3.5. Khả năng chuyển hóa amoni của các chủng nghiên cứu. 38
Hình 3.6. Khả năng chuyển hóa nitrite của các chủng nghiên cứu 39
Hình 3.7. Một số khuẩn lạc phân lập trên môi trường AMM 40
Hình 3.8. Khả năng hình thàng màng sinh học của các chủng vi sinh vật có khả
năng tích lũy photpho 41
Hình 3.9. Khả năng tích lũy photpho của các chủng nghiên cứu trong môi trường
với hàm lượng photpho 6mg/l 42
Hình 3.10. Khả năng tích lũy photpho của các chủng nghiên cứu trong môi trường

hàm lượng photpho18mg/l 43
Hình 3.11. Khả năng hình thành biofilm trên giá thể nhựa ống eppendorf. 44
Hình 3.12. Màng biofilm nổi của chủng B11.11, B21.10, B23.2, A4.2. 44
Hình 3.13. Ảnh nhuộm Gram các chủng nghiên cứu ở độ phóng đại  1000 lần. 45
Hình 3.14. Cấu trúc hiển vi màng biofilm của chủng nghiên cứu 45
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng hình thành màng sinh học 46
Hình 3.16. Ảnh hưởng của pH môi trường 47
Hình 3.17. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng B11.11 50
Hình 3.18. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng B21.10 51
Hình 3.19. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng B23.2 52
Hình 3.20. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng A4.2 53
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán vi K19 – Sinh học thực nghiệm

BẢNG KÝ HIỆU VIẾT TẮT
ADH L-arginine
ADI Axit adipic
AMM Acetate mineral medium
ARA L-arabinose
BOD Biochemical oxygen demand (Nhu cầu oxy sinh học)
BTNMT Bộ Tài nguyên Môi trường
CAP Axit capric
CIT Trisodium citrate
COD Chemical oxygen demand (Nhu cầu oxy hóa học)
EPS Mạng lưới các hợp chất ngoại bào (Extracellular polymeric
substances)
ESC Esculin ferric citrate
GEL Gelatine
GLU D-glucose
GNT Potassium gluconate

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic
LB Môi trường Luria betani
MAL D-mantose
MAN D-mannitol
MLT Axit malic
MNE D-mannose
NAG N- acetyl- glucosamine
PAC Axit phenyl acetic
PNPG 4-nitrophenyl β D –galactopyranoside
QCVN Quy chuẩn Việt Nam
SEM Ảnh vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope)
TRP L- tryptophan
URE Urea
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 1 K19 – Sinh học thực nghiệm

MỞ ĐẦU
Hiện nay, ô nhiễm môi trường đang là vấn đề được quan tâm của nhiều quốc
gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Ô nhiễm nguồn nước không chỉ ảnh hưởng
đến đời sống con người mà còn ảnh hưởng đến đa dạng sinh học. Tình trạng ô
nhiễm nước thải trong đó có nguyên nhân từ các hợp chất nitơ và photpho đang có
chiều hướng gia tăng trong những năm gần đây cùng với sự phát triển của kinh tế,
xã hội. Để làm giảm mức độ ô nhiễm từ nước thải giàu nitơ và photpho, nhiều
phương pháp đã và đang nghiên cứu bằng cách kết hợp các biện pháp vật lý, hóa
học và sinh học. Xử lý nước thải dựa vào phương pháp hóa học, vật lý thường có
hiệu quả cao, nhanh nhưng chi phí lớn, không mang tính bền vững.
Xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học dựa trên cơ sở sử dụng các vi
sinh vật là một phương pháp được quan tâm nghiên cứu. Nhiều nhóm vi sinh vật
trong tự nhiên có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ và photpho trong
nước thải thành các chất không độc hại với môi trường. Màng sinh học được định

nghĩa là dạng sống tồn tại phổ biến trong tự nhiên và khác biệt với dạng tế bào sống
tự do bởi mạng lưới các hợp chất ngoại bào bao quanh và những thay đổi, biệt hóa
trong tế bào để vi sinh vật thích nghi với môi trường sống. Vi sinh vật hình thành
màng sinh học không chỉ giúp chúng tồn tại và chống chịu được với những điều
kiện bất lợi, tận dụng được nguồn dinh dưỡng của môi trường mà còn thông qua
mối quan hệ hợp tác giữa các loài khác để tăng quá trình phân giải các chất độc hại
trong môi trường.
Việc nghiên cứu xử lý ô nhiễm nguồn nước thải nói chung và nước thải có
hàm lượng nitơ, photpho cao bằng việc sử dụng các vi sinh vật tạo màng sinh học là
hướng nghiên cứu mới mang tính bền vững. Tuy nhiên, hiện nay chưa có nhiều
công trình công bố về kết quả phân lập cũng như khả năng chuyển hóa nitơ,
photpho của các các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh học. Chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài :”Nghiên cứu phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh
vật ứng dụng xử lý nước thải giàu Nitơ, Photpho” nhằm mục đích góp phần tìm
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 2 K19 – Sinh học thực nghiệm

hiểu sự đa dạng về các chủng vi sinh vật tạo màng trong tự nhiên cũng như khả
năng ứng dụng trong xử lý nước ô nhiễm.
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 3 K19 – Sinh học thực nghiệm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình trạng ô nhiễm môi trường nước hiện nay ở Việt Nam và thế giới
Hiện nay, ô nhiễm môi trường là vấn đề đang được quan tâm không chỉ ở
Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Nước thải là một trong những
nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường hiện nay. Ô nhiễm nguồn nước không chỉ ảnh
hưởng đến môi trường sống của con người, mà còn ảnh hưởng đến đa dạng sinh
học, đến môi trường sống của các loài động, thực vật trên trái đất.
Theo báo cáo môi trường Quốc gia năm 2010 của Bộ Tài Nguyên và Môi

Trường, từ năm 2007 đến năm 2009, ô nhiễm môi trường nước mặt ở tất cả các chỉ
số đều vượt quá tiêu chuẩn cho phép theo QCVN 08:2008. Các chỉ số COD, BOD
đều vượt quá tiêu chuẩn từ 5 đến 10 lần. Hàm lượng NH
4
+
trong môi trường nước
mặt của sông Nhuệ, sông Đáy và sông Cầu đều vượt quy chuẩn cho phép QCVN
08:2008/BTNMT cho nước mặt phù hợp với việc bảo tồn động thực vật thủy sinh là
là 0,2 mg/l. Năm 2009, hàm lượng NH
4
+
trong nước sông Nhuệ đo tại Cự Đà trên
10 mg/l vượt quá tiêu chuẩn 50 lần, sông Đáy đo tại Cầu Hoàng 3 mg/l vượt quá
tiêu chuẩn 15 lần, sông Cầu đo tại Thái Nguyên trên 22 mg/l vượt quá tiêu chuẩn
110 lần [2].
Theo Mulder, lượng hợp chất nitơ trong chuỗi thức ăn là 15 kg/người/năm,
một phần trong đó được con người tiêu thụ, phần lớn được thải ra ngoài môi trường.
Tính theo đầu người, mỗi người thải ra 4,75 kg nitơ một năm. Lượng nitơ trong
nước thải chiếm 30% lượng nitơ tiêu thụ [41]. Nước thải ở các đô thị chủ yếu ở
dạng nitơ hữu cơ và amoni, trong đó 60% ở dạng hữu cơ và 40% ở trạng thái amoni.
Ở Mỹ, hàm lượng nitơ có trong nước thải phụ thuộc vào số dân và lưu lượng nước
thải hằng ngày. Lượng nitơ thải vào nguồn nước trung bình là 16 g/người/ngày.
Hàm lượng và các loại hợp chất chứa nitơ thay đổi trong từng loại nước thải khác
nhau. Hàm lượng nitơ trong nước thải thường dao động trong khoảng 20 đến 85
mg/l trong đó nitơ ở dạng hợp chất hữu cơ trung bình từ 8 đến 35 mg/l, hàm lượng
N-NH
3
từ 12 đến 50 mg/l [56].
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 4 K19 – Sinh học thực nghiệm

Photpho là yếu tố quan trọng trong quá trình trao đổi chất và năng lượng của
sinh vật, khi nồng độ photpho quá cao trong môi trường làm tăng sinh của các loại
tảo gây hiện tượng phú dưỡng. Nồng độ photpho trong nước thải trung bình từ 6
đến 20 mg/l. Việc sử dụng các chất tẩy rửa trong sinh hoạt và sản xuất là một trong
số các nguyên nhân làm tăng hàm lượng photpho trong nước thải. Trong môi trường
nước mặt, nitrate, photphate là hai hợp chất của nitơ và photpho cần thiết cho sự
phát triển của rong, tảo. Hàm lượng photphate trong nguồn nước không ô nhiễm
nhỏ hơn 0,01 mg/l. Giá trị này ở sông Mêkông là nhỏ hơn 0,05 mg/l nhưng ở những
kênh rạch bị ô nhiễm nước thải do sinh hoạt và công nghiệp hàm lượng photphate
có thể lên tới 5 mg/l . Photphate là chất có nhiều trong phân, sản xuất phân lân, thực
phẩm, nước thải của các nhà máy chế biến phân lân, chế biến thủy sản. Theo quy
định của Hà Lan cũng như tiêu chuẩn của Việt Nam, hàm lượng photphate trong
nước uống không được vượt quá 6 mg/l. Theo tiêu chuẩn của cộng đồng chung châu
Âu, trong nước sinh hoạt, hàm lượng photphate không được vượt quá 2,18 mg/l [4].
Nước thải chăn nuôi là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm nguồn
nước. Ô nhiễm nước thải chăn nuôi đặc trưng là ô nhiễm hữu cơ, hàm lượng nitơ,
photpho cao và vi sinh vật gây bệnh, hàm lượng nitơ tổng số nằm trong khoảng từ
512 đến 594 mg/l, trong đó N-NH
3
trong nước thải từ 304 đến 471 mg/l, hàm lượng
photpho tổng số dao động trong khoảng từ 13,8 đến 62 mg/l [6].
Ngày nay, cùng với sự phát triển của dân số, rác thải sinh hoạt ngày một gia
tăng. Ở Việt Nam, phương pháp xử lý rác thải chính vẫn là sử dụng các hố chôn lấp.
Nước rỉ rác từ các hố chôn lấp tại khu xử lý rác thải gây ảnh hưởng rất lớn đến đời
sống của người dân xung quanh, gây ô nhiễm nguồn nước mặt và nước ngầm quanh
khu vực. Trong nước thải rỉ rác chứa rất nhiều thành phần độc hại khác nhau trong
đó đặc biệt là hàm lượng chất hữu cơ cao. Tổng hàm lượng nitơ trong nước thải rỉ
rác dao động trong khoảng từ 200 đến 2000 mg/l, hàm lượng amoni cao, trung bình
200 mg/l, trong khi đó tiêu chuẩn cho phép là 0,2 mg/l[6].

Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 5 K19 – Sinh học thực nghiệm

1.2. Các phương pháp xử lý ô nhiễm nước thải có chứa hợp chất nitơ, photpho
hiện nay
Hiện nay có nhiều phương pháp xử lý nước thải được áp dụng như phương
pháp cơ học, phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học. Tất
cả các phương pháp xử lý hiện nay đều có những ưu, nhược điểm. Trong thực tế,
quá trình xử lý nước thải cần có sự kết hợp của nhiều phương pháp nhằm nâng cao
hiệu quả và giảm thời gian xử lý. Ví dụ, có thể sử dụng phương pháp cơ học giúp
loại bỏ các chất thải có kích thước lớn ban đầu, sau đó có thể áp dụng các phương
pháp hóa học, sinh học nhằm loại bỏ các chất độc bảo đảm tính bền vững cho môi
trường.
1.2.1. Phương pháp hóa học
Cơ sở của phương pháp hóa học là dựa trên các phản ứng hóa học. Các phản
ứng hóa học được ứng dụng trong xử lý nước thải như phản ứng oxy hóa, phản ứng
trung hòa, phản ứng keo tụ… giữa chất ô nhiễm và các hóa chất bổ sung.
1.2.1.1. Xử lý các hợp chất chứa nitơ bằng phương pháp hóa học
Quá trình xử lý nước thải chứa nitơ dựa trên nguyên tắc hóa học, nước thải
được đưa đến pH trong khoảng từ 10 đến 11 bằng cách thêm vào Ca(OH)
2
để tạo
thành NH
4
OH, khi đó amoni chuyển từ trạng thái lỏng sang khí và sau đó được đưa
ra ngoài không khí qua các tháp làm lạnh [56]. Cheung và cộng sự đã sử dụng
Ca(OH)
2
với nồng độ là 10 g/l, sau thời gian xử lý là 24 giờ và ở nhiệt độ từ 20 đến
23

o
C. Kết quả cho thấy, đã xử lý 65 – 75% NH
4
+
khi lưu lượng không khí bằng với
môi trường, và 86 – 93% NH
4
+
khi lưu lượng không khí là 5l/ phút [16]. Ozturk và
cộng sự đã áp dụng phương pháp này, sau 2 giờ, đã xử lý được 72 – 85% lượng
amoni trong nước thải rỉ rác khi bổ sung Ca(OH)
2
với hàm lượng là 8 g/l và lưu
lượng không khí là 7,6 l/phút. Tuy nhiên phương pháp này có chi phí xử lý cao vì
đòi hỏi lượng không khí lớn và lượng Ca(OH)
2
sau đó phải được xử lý với H
2
SO
4

trước khi thải ra môi trường

[48].
Li và cộng sự đã thử nghiệm một phương pháp để loại bỏ amoni trong nước
thải thông qua việc kết tủa amoni dưới dạng (NH
4
)MgPO
4
.6H

2
O khi thêm MgCl
2
và
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 6 K19 – Sinh học thực nghiệm

Na
2
HPO
4
trong quá trình xử lý. Bằng phương pháp này, với tỷ lệ
Mg:NH
4
:PO
4
=1:1:1 và pH trong nước từ 8,5 đến 9, nồng độ amoni trong nước thải
rỉ rác giảm từ 5.600 mg/l xuống chỉ còn 110 mg/l trong 15 phút [38]. Phương pháp
này cũng đã được Yangin và cộng sự áp dụng đối với nước thải sinh hoạt, kết quả đã
loại bỏ được 66% lượng amoni trong nước thải và phương pháp này còn có thể ứng
dụng cho việc loại bỏ hợp chất chứa photpho trong nước thải [66]. Một phương
pháp để xử lý nitơ khác là bổ sung thêm clo vào nước thải trong quá trình xử lý. Khi
cho clo vào nước thải, NH
3
sẽ phản ứng với clo dưới dạng HOCl để tạo ra các sản
phẩm trung gian là NH
2
Cl, NHCl
2
, NCl

3.
Quá trình xử lý sẽ diễn ra liên tục khi
thêm HOCl vào phản ứng để tạo ra sản phẩm cuối cùng là nitơ phân tử [56]. Quá
trình này diễn ra phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, pH, thời gian xử lý và tỷ lệ
HOCl/NH
3
[49]. Với tỷ lệ HOCl/NH
3
được tính theo mol bằng 1 tại pH trong
khoảng từ 7 đến 8 tất cả NH
3
đều chuyển hóa thành NH
2
Cl. Với tỉ lệ HOCl/NH
3

bằng 2 sản phẩm chủ yếu là NHCl
2
, khi tỉ lệ trên bằng 3 thì sản phẩm xử lý tạo ra
chủ yếu là NCl
3
[3].
1.2.1.2. Xử lý các hợp chất photpho bằng phương pháp hóa học.
Photphate là một trong các hợp chất của photpho chiếm tỷ lệ cao trong nước
thải. Quá trình xử lý nước thải có chứa hợp chất photpho bằng phương pháp hóa
học dựa trên nguyên tắc chủ yếu là kết tủa photphate với các ion nhôm, sắt, canxi
tạo ra các muối có độ tan thấp và tách chúng dưới dạng chất rắn [4], [6].
Phương pháp hóa học được sử dụng trước tiên trong xử lý nước thải là sử
dụng kiềm hóa bằng Ca(OH)
2

. Khi thêm Ca(OH)
2
vào nước thải, pH sẽ tăng làm
dịch chuyển cân bằng về PO
4
3-
. Tỷ lệ Ca/P nằm trong khoảng 1,33 đến 2,0 và ion
Ca
2+
có khả năng loại bỏ photphate do nó tạo với photphate những hợp chất kém
hoà tan. Hydroxy apatit C
10
(PO
4
)
6
(OH)
2
không xuất hiện ngay trong quá trình hình
thành dù nó là thành phần ổn định nhất về mặt nhiệt động và kém hòa tan nhất trong
số các kết tủa của photphate canxi. Photphate canxi Ca
3
(PO
10
)
2
vô định hình là dạng
có cấu trúc tinh thể không ổn định và có độ tan thấp [4].
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 7 K19 – Sinh học thực nghiệm

Khả năng loại bỏ photphate trong nước thải có hiệu quả cao khi ở pH >10,
đặc biệt khi ở pH từ 10,5 đến 11. Đặc điểm của phương pháp dùng Ca(OH)
2
là làm
tăng độ kiềm của nước, thuận lợi cho phản ứng phân hủy sinh học của NH
4
+
, không
đưa anion mới vào nước thải so với cách dùng muối để kết tủa photphate. Ngoài
phương pháp sử dụng Ca(OH)
2
, loại bỏ phosphate bằng phương pháp hóa học có
thể bằng việc kết tủa sử dụng muối sắt, nhôm, các muối sắt sử dụng là: FeCl
3
,
FeClSO
4
, FeSO
4
khi bổ sung vào nước thải, sẽ xảy ra quá trình thủy phân tạo ra các
phức chất mang điện tích dương như Fe(OH)
2
+
, Fe(OH)
2+
và một số dimer, polymer
tích điện dương. Tại một giá trị pH không đổi, với tỷ lệ Fe
3+
/P từ 1,4 đến 1,6 có thể

kết tủa hoàn toàn photphate. Nếu tỷ lệ Fe
3+
/P tăng, sản phẩm kết tủa tạo thành là
Fe(OH)
3
tăng lên như vậy kết tủa đó không phải là kết tủa của muối photphate. Do
vậy nếu tỷ lệ Fe
3+
/P tăng lên thì hiệu suất của quá trình xử lý không thay đổi[55].
Quá trình xử lý nước thải giàu hợp chất nitơ, photpho bằng phương pháp hóa
học chủ yếu là thêm một số chất làm đông tụ, keo tụ chất thải thành các muối kết
tủa. Tuy nhiên, việc tách các muối này ra khỏi nước thải phải dùng đến các màng
lọc: màng nano, màng thẩm thấu ngược, màng thẩm điện tích. Các màng lọc thường
có giá thành cao nên việc áp dụng phương pháp hóa học chưa phù hợp với nhu cầu
ứng dụng trong xử lý nước thải hiện nay. Do vậy, cần có phương pháp khác có khả
năng xử lý tốt ô nhiễm mà chi phí phù hợp [4].
1.2.2. Phương pháp sinh học
Trong môi trường nước, hợp chất nitơ tồn tại chủ yếu ở dạng amoni (NH
4
+
),
nitrate (NO
3
-
), ít hơn ở dạng nitrite (NO
2
-
) và trong một số hợp chất hữu cơ khác.
Thành phần được xem là bền đối với trường và không gây hiệu quả xấu cho môi
trường là khí nitơ (N

2
). Nitơ hữu cơ có thể tồn tại trong các sinh vật sống hoặc các
sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy các vật chất hữu cơ [53], [54], [70]. Xử
lý nước thải có chứa hợp chất nitơ dựa trên các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa
thành các chất không độc như khí N
2
, trả lại môi trường không khí. Phương pháp
sinh học có những ưu điểm so với các phương pháp vật lý hóa học như: hiệu suất
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 8 K19 – Sinh học thực nghiệm

khử nitơ cao, sự ổn định và tương đối dễ vận hành, quản lý, chi phí đầu tư hợp lý và
quan trọng cho sự phát triển bền vững, bảo vệ môi trường và hệ sinh thái.
Để xử lý nước thải chứa nitơ theo phương pháp sinh học. Các nghiên cứu
dựa trên cơ sở là trong tự nhiên luôn tồn tại các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa
hợp chất nitơ. Quá trình chuyển hóa nitơ trong tự nhiên được trình bày ở hình 1.1
[53], [57].
Các quá trình trong chu trình nitơ chuyển đổi nitơ từ dạng này sang dạng
khác đều được tiến hành bởi các nhóm vi sinh vật khác nhau với mục đích lấy năng
lượng hoặc để tích tụ nitơ thành một dạng cần thiết cho sự phát triển của chúng.
Các dạng nitơ hữu cơ từ nguồn động thực vật sau khi chết được các vi khuẩn amoni
hóa chuyển hóa thành dạng NH
4
+
; sau đó NH
4
+
được chuyển hóa thành NO
2
-

nhờ vi
khuẩn nitrite hóa; NO
2
-
sinh ra được nhóm sinh vật nitrate hóa chuyển hóa thành
NO
3
-
; cuối cùng nitrate được nhóm sinh vật kỵ khí chuyển thành dạng nitơ phân tử
nhờ quá trình khử nitrate (Hình 1.1) [53], [54], [70].

Hình 1.1. Chu trình nitơ trong tự nhiên [69], [70]
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 9 K19 – Sinh học thực nghiệm

Xử lý nước thải có chứa các hợp chất photpho bằng phương pháp sinh học
dựa trên khả năng của một số nhóm vi sinh vật tích lũy lượng photpho nhiều hơn
mức cơ thể chúng cần trong điều kiện hiếu khí. Thông thường hàm lượng photpho
trong vi sinh vật chiếm từ 1,5 đến 2,5% khối lượng tế bào khô, một số loài có khả
năng hấp thu cao hơn, từ 6 đến 8%. Vì các hợp chất chứa photpho tồn tại trong
nước thải dưới ba dạng: photphate đơn (PO
4
3-
), polyphotphate và hợp chất hữu cơ
chứa photphate, hai hợp chất sau chiếm tỉ lệ lớn trong nước thải. Trong quá trình xử
lý vi sinh, lượng photpho hao hụt từ nước thải duy nhất là lượng được vi sinh vật
hấp thu để xây dựng tế bào. Trong quá trình xử lý hiếu khí, một số loài vi sinh vật
có khả năng hấp thu photphate cao hơn mức bình thường trong tế bào và tồn tại ở
dạng dự trữ [3], [14].
Nghiên cứu Van Bethum và cộng sự, cho thấy photpho trong cơ thể vi sinh

vật được tích lũy dưới dạng chủ yếu là photphate. Trong cơ thể của chúng,
photphate có thể chiếm đến 12% trọng lượng tế bào đối với vi khuẩn có tích lũy
polyphotphate, và với vi khuẩn không tích lũy polyphotphate, chỉ chiếm khoảng
1đến 3% trọng lượng tế bào [63]. Trong điều kiện yếm khí, với sự có mặt của chất
hữu cơ, lượng photphate dư lại được thải ra ngoài cơ thể vi sinh dưới dạng
photphate đơn. Một vài loại tảo cũng có khả năng tích trữ một lượng photphate dư
so với nhu cầu của tế bào [3].
Hiện nay, kết hợp phương pháp sinh học trong xử lý đối với cả nitơ, photpho
trong nước ô nhiễm đang là một hướng nghiên cứu mới. Trong nghiên cứu của
Jorgensen và Pauli, một số chủng vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho cũng có
khả năng khử nitrate [33]. Phương pháp kết hợp sử dụng bùn hoạt tính, các hợp
chất trong các quá trình xử lý thiếu khí (anoxic), xử lý hiếu khí (aerobic), xử lý yếm
khí (anaerobic) kết hợp hoặc riêng biệt trong quá trình khử nitơ và photpho [3].
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 10 K19 – Sinh học thực nghiệm

1.3. Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ, photpho
trong xử lý ô nhiễm nước thải.
1.3.1. Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ
Trong nước thải có nhiều thành phần khác nhau, bao gồm các hợp chất hữu
cơ và vô cơ. Trong đó các hợp chất chứa nitơ và photpho chiếm tỷ lệ lớn.
Nitrate hóa là quá trình oxi hóa NH
4
+
thành NO
3
-
, cung cấp năng lượng cho
vi sinh vật hoạt động. Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa
CO

2
. Hầu hết các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc
đều có khả năng thực hiện quá trình này. Nitrate hóa qua 2 giai đoạn:
Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa amoni (NH
4
+
) thành nitrite (NO
2
-
) bởi một số
đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrite hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis,
Nitrosococcus, Nitrosolobus Tất cả chúng khá giống nhau về mặt sinh lý, sinh
hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào. Các đại diện của chi
Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục. Trên môi trường
lỏng, quá trình phát triển của vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas trải qua một số giai
đoạn và phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường [12], [27].
Giai đoạn 2 của quá trình nitrate hóa oxi hóa nitrite (NO
2
-
) thành nitrate
(NO
3
-
) bởi một số vi khuẩn: Nitrobacter Winogradsky, Nitrospina gracilis,
Nitrococcus mobilis.
NH
4
+
+ 1,5 O
2

Nitrosomonas
NO
2
-
+ H
2
O + 2 H
+

NO
2
-
+ 0,5 O
2
Nitrobacter

NO
3
-

NH
4
+
+ 2 O
2
NO
3
-
+ H

2
O + 2 H
+
4 NO
3
-
+ 4 H
+
+ 5 C
hữu cơ
5 CO
2
+ 2 N
2
+ 2 H
2
O
Tế bào đặc trưng của nhóm vi khuẩn Nitrobacter trong dịch nuôi là dạng
hình que tròn, hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động.
Khi điều kiện không thuận lợi chúng có thể liên kết với nhau thành tập đoàn.
Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, thỉnh thoảng có dạng hình cầu,
không di động, và có đặc trưng là liên kết tạo thành tập đoàn. Nitrococcus mobilis
thì có dạng hình tròn, có tiêm mao [5].
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 11 K19 – Sinh học thực nghiệm

pH thích hợp cho nhóm vi khuẩn Nitrosomonas là từ 7,8 đến 8, Nitrobacter
là từ 7,3 đến 7,5. Nitrobacter sẽ tăng trưởng chậm hơn ở các mức pH cao đặc trưng
cho các thủy vực nước mặn. Nitrosomonas sống ở những nơi giàu NH
3

và các muối
vô cơ như trong bùn đáy ao, nước cống, nước ngọt, các thủy vực bị ô nhiễm chứa
nhiều hợp chất nitơ nhằm tránh ánh sáng. Nitrobacter không có khả năng di động và
cần phải bám vào bề mặt giá thể như đá, cát, hoặc một giá thể sinh học …
Nitrobacter không thể sống trong môi trường khô. Trong môi trường nước, chúng
có thể tồn tại trong khoảng thời gian ngắn ở các điều kiện bất lợi nhờ vào việc sử
dụng các chất dự trữ bên trong tế bào [31].
Oxy hóa amoni bao gồm hai phản ứng kế tiếp nhau nên tốc độ oxy hóa của
quá trình bị khống chế bởi gian đoạn có tốc độ thấp hơn. Tốc độ phát triển của
Nitrosomonas chậm hơn Nitrobacter do đó nồng độ NO
2
-
thấp hơn trong giai đoạn
ổn định. Vì vậy trong quá trình động học người ta chỉ sử dụng các thông số liên
quan đến vi khuẩn Nitrosomonas để đặc trưng cho quá trình oxy hóa amoni [31].
Quá trình chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ không chỉ diễn ra do các chi vi
khuẩn nói trên mà trong tự nhiên còn nhiều nhóm vi sinh vật khác cũng có khả năng
chuyển hóa như vậy. Nghiên cứu khả năng chuyển hóa amoni, nitrite, nitrate,
Zhang và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri không
chỉ có khả năng chuyển hóa nitrite mà còn có khả năng chuyển hóa amoni. Sau thời
gian 18 giờ, chủng vi khuẩn này đã chuyển hóa được amoni hoàn toàn thành dạng
khí N
2
với hiệu suất là 39% [67]. Một Nghiên cứu khác của Zhang và cộng sự về
việc sử dụng vi khuẩn Bacillus methylotrophicus trong xử lý nitơ cho thấy trong
môi trường ở điều kiện pH từ 7 đến 8 và nhiệt độ là 37
o
C, chủng B.
methylotrophicus đã làm nồng độ NH
4

+
ban đầu 146,71mg/l giảm xuống 38,29 mg/l
sau 9 ngày nuôi cấy, với tốc độ chuyển hóa là 51,58 mg/l/ngày [68].
Nghiên cứu của Broda cho thấy sự tồn tại của các vi khuẩn gọi là anammox
[15]. Các vi khuẩn này có thể oxy hoá amoni trong điều kiện kị khí (Anaerobic
Amoni Oxidation) hay còn gọi là anammox. Các nhà khoa học Hà Lan và Đức đã
nghiên cứu và phát hiện ra các vi khuẩn này thuộc năm chi gồm Brocadia,
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 12 K19 – Sinh học thực nghiệm

Kuenenia, Anammoxoglobus, Jettenia và Scalindua, bộ Planctomycetales, ngành
Planctomycetes [42], [52]. Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử cũng như đặc điểm
sinh lý, sinh hóa Schmid cùng cộng sự đã phân loại được vi khuẩn Kuenenia
stuttgartiensis thuộc nhóm vi khuẩn anammox [53]. Ngoài phương pháp xử lý sinh
học kết hợp hai quá trình nitrate hoá và khử nitrate có thể loại bỏ được amoni ra
khỏi nước thải trong thực tế còn tồn tại một số vi khuẩn có khả năng oxy hoá amoni
thành dạng khí N
2
sử dụng nitrite được hình thành từ quá trình xử lý thay thế cho
việc phải sử dụng oxy cấp từ nguồn bên ngoài vào [42], [52].
Trong tự nhiên, ngoài các chi Nitrosomonas, Nitrobacter có khả năng chuyển
hóa hợp chất chứa nitơ có trong nước thải là NH
4
+
, NO
2
-
, NO
3
-

còn có một số chi vi
sinh vật khác như Bacillus, Pseudomonas….
NO
3
-
là sản phẩm cuối cùng của quá trình oxy hóa amoni chưa được coi là
bền vững và còn gây độc cho môi trường nên cần phải chuyển hóa về dạng khí N
2
.
Vi sinh vật thực hiện quá trình chuyển hóa là các vi sinh vật khử nitrate bao gồm
một số vi sinh vật thuộc các chi như Bacillus, Pseudomonas, Methanomonas,
Thiobacillus [22]. Các vi sinh vật khử nitrate sử dụng oxy hoặc nitrate, nitrite làm
chất oxy hóa để cung cấp năng lượng cho các quá trình sinh hóa.
Quá trình khử nitrate thường được nhận dạng là khử nitrat kị khí, tuy nhiên
diễn biến quá trình sinh hóa không phải là quá trình lên men kị khí mà nó giống quá
trình hô hấp hiếu khí nhưng thay vì sử dụng oxy, vi sinh vật sử dụng nitrate, nitrite.
Để khử nitrate, vi sinh vật cần có chất khử (nitrate là chất oxy hóa), chất khử có thể
là chất hữu cơ hoặc vô cơ như H
2
, S, Fe
2
+
. Phần lớn vi sinh vật khử nitrate thuộc
loại dị dưỡng, sử dụng nguồn carbon hữu cơ để xây dựng tế bào ngoài phần sử dụng
cho phản ứng khử nitrate. Rất ít vi sinh vật khử nitrate thuộc loại tự dưỡng, ví dụ
Thiobacillus denitrificant sử dụng lưu huỳnh làm chất khử [3], [27].
1.3.2. Vi sinh vật có khả năng tích lũy photpho
Hợp chất photpho trong môi trường nước thải tồn tại trong các dạng:
photpho hữu cơ, muối photphate của các dạng H
2

PO
4
-
, HPO
4
2-
, PO
4
3-
tan trong
nước, polyphotphate hay còn gọi là photphate trùng ngưng, muối photphate và
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 13 K19 – Sinh học thực nghiệm

photpho trong tế bào sinh khối. Tất cả các dạng polyphotphate đều có thể chuyển
hóa về dạng orthophotphate (PO
4
3-
) trong môi trường nước đặc biệt là trong điều
kiện môi trường axit và ở nhiệt độ cao [4], [6].
Nhiều loài vi sinh vật tham gia vào quá trình hấp thu, tích lũy photpho vào
cơ thể của chúng được quy chung về nhóm vi sinh bio-P mà vi khuẩn thuộc chi
Acinetobacter là chủ yếu. [51], [60].
Trong điều kiện hiếu khí (O
2
) vi sinh bio-P tích lũy, tổng hợp photphate
trong cơ thể chúng từ photphate đơn tồn tại trong nước thải theo phương trình phản
ứng:
C
2

H
4
O
2
+ 0,16 NH
4
+
+ 1,2 O
2
+ 0,2 PO
4
3-
0,16 C
5
H
7
NO
2
+ 1,2 CO
2
+
0,2 (HPO
3
) + 0,44 OH
-
+ 1,44 H
2
O.
HPO
3

là photphate ở dạng trùng ngưng tồn tại trong cơ thể vi sinh vật. Trong
điều kiện thiếu khí (không có oxy, chỉ có mặt nitrat) quá trình tích lũy photpho xảy
ra:
C
2
H
4
O
2
+ 0,16 NH
4
+
+ 0,2 PO
4
3-
+0,96 NO
3
-
0,16 C
5
H
7
NO
2
+ 1,2 CO
2

+ 0,2 (HPO
3
) + 1,4 OH

-
+ 0,48 N
2
+ 0,96 H
2
O
Từ phương trình chuyển hóa trên cho thấy, các chủng vi sinh vật có khả năng
tích lũy photpho cũng có khả năng khử nitrate [36], [58].
Đã có nhiều công trình nghiên cứu, phân lập đối với các chủng vi sinh vật có
khả năng tích lũy photpho và khử nitrate trong việc loại bỏ một số hợp chất chứa
nitơ, photpho trong nước thải. Acinetobacter thường được quan tâm bởi khả năng
tích lũy photpho trong cơ thể, ít được biết đến hơn với vai trò khử nitrate. Một số
chi vừa có khả năng tích lũy photpho vừa có khả năng khử nitrate như:
Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, nhóm Comamonas –
Pseudomonas, nhóm Flavobacterium – Cytophaga, Moraxella, Xanthomonas,
Paracoccus, Bacillus, Corynebacterium và nhiều chủng vi khuẩn Gram dương
khác nữa. Acinetobacter là một trong những chi vi khuẩn được biết đến với khả
năng tích lũy photpho cao [33], [59], [61]. Bao và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu
khả năng thu nhận photpho của các vi khuẩn khác nhau trong điều kiện hiếu khí và
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 14 K19 – Sinh học thực nghiệm

thiếu khí [11], sau 20 giờ nghiên cứu, vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả năng
thu nhận đến 14,34 mg/l khi tiến hành ở điều kiện thiếu khí. Các chi
Enterobacteriaceae, Alcaligenes, Staphylococcus và Bacillus trong điều kiện hiếu
khí có khả năng thu nhận photpho lần lượt tương ứng là 8,91 mg/l, 6,43 mg/l, 6,23
mg/l và 4,41 mg/l.
1.4. Màng sinh học và ứng dụng của màng sinh học trong việc xử lý ô nhiễm
nước thải giàu nitơ, photpho.
1.4.1. Màng sinh học

1.4.1.1. Định nghĩa về màng sinh học
Màng sinh học (biofilm) được định nghĩa là một tập hợp của vi sinh vật liên
kết với nhau thông qua mạng lưới polymer ngoại bào [21].
Màng sinh học có thể hình thành do tập hợp các tế bào của cùng một vi sinh
vật hay các vi sinh vật khác nhau. Trong tự nhiên, màng sinh học thường là sự liên
kết của vi khuẩn, nấm, tảo, xạ khuẩn. Trong màng sinh học các tế bào tập hợp thành
các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc. Thành phần này đóng vai trò quan trọng
trong quá trình hình thành màng sinh học đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó quy
định đặc tính hình thành màng cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết
các hợp chất ngoại bào cũng như có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào như lông roi,
lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể [44].
1.4.1.2. Thành phần và quá trình hình thành màng sinh học
Cấu trúc của màng sinh học trong tự nhiên gồm hai thành phần chính là các
tập hợp tế bào vi sinh vật và mạng lưới các chất ngoại bào (Extracellular Polymeric
Substances - EPS). Các tế bào của một hay nhiều loài vi sinh vật khác nhau, bám
dính trên bề mặt nhất định (có thể là hữu sinh hay vô sinh). Các tế bào liên kết với
nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế
bào. Có thể nói màng sinh học là dạng sống khá phổ biến của nhiều loài vi sinh vật
[37], [39].
Mạng lưới các chất ngoại bào (EPS) bao quanh các tế bào, tạo nên cấu trúc
đặc trưng cho biofilm. Mạng lưới ngoại bào có độ dày từ 0,2 đến 1 µm. Ở một vài
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 15 K19 – Sinh học thực nghiệm

loài vi khuẩn độ dày của lớp EPS mỏng hơn nằm trong khoảng từ 10 đến 30 nm
[19]. Mạng lưới các chất ngoại bào có vai trò quy định sự sắp xếp tế bào đồng thời
tạo nên những kênh dẫn truyền nước bên trong biofilm nhờ đó mà các chất dinh
dưỡng cũng như nước có thể lưu thông trong biofilm tạo điều kiện cho việc khuếch
tán, phân phối chất dinh dưỡng đến khắp các tế bào vi sinh vật trong biofilm cũng
như loại bỏ đi những chất thải không cần thiết [35].

Về cơ bản màng sinh học được cấu tạo gồm rất nhiều tế bào của cùng một
loài hay từ các loài vi sinh vật khác, khối lượng tế bào vi sinh vật chiếm từ 2 đến
5% tổng khối lượng biofilm. Trong biofilm ngoài thành phần tế bào thì có tới 97%
là nước, 3 đến 6% còn lại là EPS và ion. Một tế bào vi khuẩn tùy thuộc vào điều
kiện môi trường khác nhau có thể hình thành biofilm ở các dạng khác nhau. Thành
phần polymer ngoại bào rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạng biofilm và điều kiện
hình thành nhưng về cơ bản đều bao gồm các polysaccharide chiếm khoảng từ 40
đến 95%, từ 1 đến 60% là protein, từ 1 đến 10% là axit nucleic, và từ 1 đến 40%
lipit về khối lượng [19], [25]. Các hợp chất này thay đổi theo không gian và thời
gian tồn tại của màng sinh học. Về cơ bản màng sinh học càng dày và thời gian tồn
tại càng lâu thì có hàm lượng EPS càng nhiều.
Mật độ tế bào tập trung cao nhất ở lớp đỉnh của biofilm và giảm dần theo độ
sâu. Trái lại, thành phần EPS lại phong phú hơn ở vùng phía trong biofilm. Thành
phần EPS trong biofilm cũng khác biệt so với ở dạng sống tự do của chính vi khuẩn
đó [19]. EPS có thể chiếm 50% đến 90% của tổng cacbon hữu cơ của các màng sinh
học và có thể coi là thành phần chính của màng sinh học. EPS có thể thay đổi một
vài tính chất hóa học và vật lý, nhưng thành phần chính của nó chủ yếu vẫn gồm các
polysaccharides. Có thể là các polysaccharides trung tính hay là polyanionic là
thành phần chính của EPS vi khuẩn gram âm. Một số vi khuẩn gram dương, thành
phần hóa học của EPS có thể khác nhau và chủ yếu là cation [62].
Dựa trên các phương pháp phân tích di truyền học, sinh học phân tử, cùng
với những phân tích về mặt cấu trúc của màng sinh học, các nhà khoa học đã đưa ra
một mô hình cấu trúc màng sinh học cơ bản [18]. Trong mô hình này, vi khuẩn hình
Luận văn thạc sĩ
Ngô Thị Kim Toán 16 K19 – Sinh học thực nghiệm

thành nên các vi khuẩn lạc và được bao quanh bởi một mạng lưới chất ngoại bào
giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi
thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền
dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật. Nhờ đó, dịch tế bào có thể đi qua màng

sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dưỡng đến khắp các
tế bào trong màng cũng như loại bỏ các chất thải. Sự hình thành biofilm là quá trình
phát triển mà trong đó vi khuẩn trải qua những thay đổi trong cách thức tồn tại để
chuyển từ dạng sống đơn bào, riêng rẽ sang dạng tập hợp nhiều tế bào, cố định một
chỗ và có sự sinh trưởng cũng như biệt hóa tế bào khác với dạng sống trôi nổi. Có
năm giai đoạn chính trong quá trình hình thành và phát triển của một biofilm (Hình
1.2) [40].

Hình 1.1. Các giai đoạn chính của quá trình hình thành một biofilm [40]
1. Giai đoạn gắn kết, 2. Hình thành lớp tế bào, 3. Hình thành mạng lưới ngoại bào,
4. Hình thành màng sinh học hoàn chỉnh, 5. Quá trình tách rời
Giai đoạn 1: Gắn kết thuận nghịch lên giá thể
Trong một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc tính lý hóa, các vi khuẩn
có thể di chuyển hướng đến bề mặt bởi hóa ứng động và hình thành mối tương tác
tạm thời với bề mặt thông qua các lực tương tác yếu như lực Van der Waals, lực hút