Bài giảng QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS

ĐHKT Y HD - TT KN ATTP
QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS
PGS Phạm gia Huệ
Hà Nội 24-11-2010


Ph H p Th UV-VISổ ấ ụ

Là phương pháp phân tích dùng phổ biến nhất trong các PTN

Ví dụ ứng dụng: PT nước, các màu thực phẩm, acid amin,
kháng sinh, kim loại


Ph H p Th UV-VISổ ấ ụ

Các đại lượng đặc trưng cho bức xạ ánh sáng

Sự hấp thụ ánh sáng và màu sắc

Các yếu tố ảnh hưởng lên độ hấp thụ

Các ứng dụng của phương pháp phổ hấp thụ UV-Vis

Máy quang phổ UV-VIS


Bức xạ ánh sáng UV-VIS
Tính chất sóng: Các đại lượng đặc trưng:


Bước sóng λ (nm) (1 nm =10
-9
m)

thay

đổi theo môi trường

Tần số
ν
(Hz) k
hông đổi

ν
=
Tính chất hạt:
photon có năng lượng: E = h
ν
= h
λ
c
λ
c


Bức xạ ánh sáng UV-VIS



Sự hấp thụ ánh sáng và màu sắc


Vùng tử ngoại (UV)

50 – 400 nm
•
Tử ngoại gần: 200 – 400 nm

Vùng khả kiến (Vis)

400 - 750 nm

Vùng hồng ngoại (IR)

750 nm – 100 μm


Sự hấp thụ ánh sáng và màu sắc
Vùng khả kiến:
AS trắng = 7 màu
Màu phụ nhau:
Vật màu đỏ H T màu lục
Vật màu lục H T màu đỏ
Lục-Đỏ = 1 cặp màu
phụ nhau
Chùm tia đơn sắc


Các yếu tố ảnh hưởng lên độ hấp thụ.

Cấu trúc phân tử


Môi trường:
•
Dung môi
•
thuốc thử
•
pH

Các yếu tố khác
Sự pha loãng, ánh sáng, thời gian, nhiệt độ


Các ứng dụng của pp phổ UV-Vis

Định tính và thử tinh khiết
Ít có ý nghĩa

Định lượng quan trọng
ứng dụng chủ yếu
định luật Lambert-Beer



Định tính b ng ph UV-VISằ ổ
Max 1
Max 2
Max 3

Đ nh l ngị ượ b ng ph UV-VISằ ổ

Định lượng ngay (đo A, tính C)

Chuẩn bị, xử lý mẫu (chiết, làm phản ứng ) trước khi đo A

Tách bằng sắc ký hay điện di rồi phát hiện và đo bằng phổ hấp thụ (phổ UV-
VIS dùng làm detector cho máy sắc ký, điện di)

Nguyên tắc: dựa vào định luật Lambert-Beer


nh lu t Lambert-BeerĐị ậ

A = kλ L C
A =log (Io/I) = log (1/T)

Độ hấp thụ A tỷ lệ thuận với nồng độ C
A = E = D
E = độ tắt
D = mật độ quang = OD
I
0
I
C
L


nh lu t Lambert-BeerĐị ậ

A = kλ L C

Hệ số hấp thụ kλ

phụ thuộc vào λ

(đường cong phổ hấp thụ)

thay đổi theo đơn vị của C
kλ=ε = hệ số hấp thụ mol nếu C = Cmol/L
kλ=E1%1cm=hệ số hấp thụ riêng nếu C = C%


Các kỹ thuật định lượng

Đo phổ trực tiếp

Phương pháp so sánh:

Phương pháp thêm

Phương pháp đường chuẩn

Phương pháp đường chuẩn thêm


Các kỹ thuật định lượng
Phương pháp đo trực tiếp :
Đo A của dung dịch, tính C
dựa vào

A = kλ L C

(biết L= 1 cm và biết
kλ:
VÍ DỤ với vitamin B12, đo ở 361 nm thì E
1
1=207, t
ính C%)
Cần kiểm tra độ chính xác của A và λ


Các kỹ thuật định lượng
Phương pháp so sánh:

Đo AC của dd chuẩn có nồng độ đã biết CC

Đo AX của dd thử có nồng độ chưa biết CX

Tính được CX


Các kỹ thuật định lượng
Phương pháp thêm

Đo AX của dd thử có nồng độ
chưa biết CX

Đo AX+a của dd thử có thêm lượng
chuẩn đã biết là a


Tính được CX


Các kỹ thuật định lượng
Phương pháp đường chuẩn



Các kỹ thuật định lượng
Phương pháp đường chuẩn thêm


Máy quang phổ UV-VIS
Khoảng đo: 200-800 nm
(hay 190-1100 nm)
Các bộ phận chính:

Nguồn sáng: đèn W, đèn D2

Bộ đơn sắc: cách tử

Detector: nhân quang

Cốc đo (cuvet): thuỷ tinh, nhựa, quartz


Máy quang phổ UV-VIS
1 chùm tia
1. Nguồn sáng 2. chùm tia

3. Cách tử 4. Tia đơn sắc
5. Chắn sáng 6. cốc đo (cuvet)
7. Detector


Máy quang phổ UV-VIS
1 chùm tia (detector DAD)
Nguồn sáng
Cuvet
Cách tử
Mảng diod


Máy quang phổ UV-VIS
2 chùm tia
1. Nguồn sáng 2. chùm tia
3. Cách tử 4. Tia đơn sắc
5. Chắn sáng 6,7. cốc đo (cuvet)
8. Detector


Điều cần chú ý !!!

Máy cần được thường xuyên bảo dưỡng
định kỳ hiệu chuẩn (KT A và bước sóng)

Dung dịch đo phải trong suốt, đủ loãng A trong khoảng thích hợp

Cuvet


Dung môi tinh khiết, pH, thời gian đo

Mẫu trắng