Tiểu luận tìm hiểu về về độc tố Ochratoxin

1

LỜI MỞ ĐẦU


Như ta đều biết ,con người là sinh vật dị dưỡng nên các nhu cầu về dinh dưỡng
của mình thường được thỏa mãn bằng các thực phẩm từ nguồn động vật và thực
vật.Việc chọn lựa những loài động vật và thực vật làm thức ăn xuất phát từ khả năng từ
khả năng cung cấp bởi một môi trường sinh thái xác định cùng là cách chế biến tương
hợp đã tạo nên nét văn hóa ẩm thực cho các cư dân ở từng vùng khác nhau .Tiêu chuẩn
cho sự lựa chọn này ,ngoài chất lượng cảm quan ,khả năng cung cấp và bảo quản thì sự
vắng mặt các độc tính được coi là yếu tố quyết định .Trong quá trình này ,những sản
phẩm tuy có lợi ích nào đó về mặt dinh dưỡng nhưng hàm chứa một độc tính nội tại
cao thì thường bị loại khỏi bộ sưu tập thực phẩm của con người .Thực ra bên cạnh các
chất dinh dưỡng ,một số thực phẩm thường dùng luôn chứa những chất không có giá
trị dinh dưỡng hoặc thậm chí có những chất gây nguy hiểm cho cơ thể .

Trong đời sống hàng ngày ,con người luôn đối đầu với nhiều hợp chất tự nhiên
hoặc nhân tạo . Trong những điều kiện nhất định ,sự đối mặt này có thể là nguyên nhân
dẫn đến những hậu quả tai hại cho sức khỏe : từ những rối loạn sinh học tối thiểu đến
những bệnh nguy hiểm .Do vậy con người luôn mong muốn hiểu biết chất độc và
phòng ngừa được các hiệu ứng độc .

Ở đây nhóm em tìm hiểu chi tiết về độc tố Ochratoxin . Theo Tổ chức Nghiên
cứu ung thư quốc tế (International Agency for Research on Cancer), trong thực phẩm ,
độc tố Ochratoxin có thể gây ung thư cho người mà trong quá trình chế biến cũng
không thể loại bỏ hoàn toàn được.

Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




2
MỤC LỤC

I/ TỔNG QUAN
1. Giới thiệu chung 3

2. Độc tố ochratoxin 4
2.1. Sơ lược 4
2.2. Cấu trúc 4
2.3. Nấm mốc tổng hợp OTA 5
2.4. Độc tính 5
II/ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1. Phân tích vi sinh vật 7
2. Cơ sở khoa học 7
2.1. Phạm vi áp dụng 8
2.2. Nguyên tắc 8
2.3. Thuốc thử 8
2.4. Chuẩn bị dung dịch gốc OTA 9
2.5. Dung dịch chuẩn OTA 9
2.6. Dung dịch hiệu chuẩn OTA 9
2.7. Cách tiến hành 9
2.7.1. Khái quát 10
2.7.2. Chuẩn bị mẫu thử 10
2.7.3. Chiết OTA ra khỏi mẫu 10
2.7.4. Điều kiện vận hành HPLC 10
2.7.5. Đường chuẩn 11
2.8. Định tính 11
2.8.1. Nhận biết 11
2.8.2. Xác định 11
2.8.3. Khẳng định 12
2.9. Định lượng 12
3. Phương pháp Kit Veratox 13
3.1. Mục đích sử dụng 13
3.2. Thử nghiệm 13
3.3. Phương pháp 13
3.4. Thông số kĩ thuật 13

3.5. Các vật liệu khuyến cáo 14
3.6. Những vật liệu Neogen không cung cấp 14
III/ ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP
1. Hạn chế 14
2. Biện pháp 15.







Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




3
Hình 1 . Nấm mốc Fusarium
I / TỔNG QUAN VỀ ĐỘC TỐ OCHRATOXIN:

1. Giới thiệu chung :

Mycotoxin là các hợp chất trao đổi bậc hai có độc tính do một số vi nấm tổng
hợp nên trong các điều kiện xác định .Thuật ngữ mycotoxin thường được áp dụng
hạn chế cho các độc tố nấm mốc ngoại bào có độc tính đối với động vật máu nóng.
Sự nhiễm nấm mốc trên nông sản thực phẩm gây mất mát ,tiêu hao nguyên liệu/
sản phẩm trong suốt dây chuyền sản xuất ra sản phẩm .Đặc biệt nghiêm trọng hơn ,sự

nhiễm nấm mốc có khả năng tổng hợp mycotoxin ở các nông sàn – thực phẩm làm
nhiễm độc chuỗi thực phẩm và gây ra các vấn đề nghiêm trọng cho sức khỏe vật nuôi
,người tiêu dùng .Theo đánh giá của FAO năm 1996 ,hàng năm có hơn 25% nông sản
bị nhiễm nấm mốc .Hiện nay các báo cáo cho thấy không chỉ một loại mà đồng thời
nhiều loại mycotoxin như aflatoxin B,fumonisin hay ochratoxin cùng được phát hiện
trên một nông sản thực phẩm.
Mycotoxin có thể gây độc ở các cấp độ khác
nhau : cấp tính hay trường diễn .Sự nhiễm độc cấp
tính do mycotoxin gây nên rất nhiều đợt dịch bệnh
và kèm theo tỉ lệ tử vong rất cao . Trong chiến
tranh thế giới thứ hai ,do tình trạng đói kém ,người
Nga buộc phải ăn gạo còn sót lại trên đồng ruộng
.Hàng ngàn người đã bị nhiễm độc ,có làng hoàn
toàn bị xóa sổ do nhiễm độc tố T-2 của nấm mốc
Fusarium sporotrichioides phát triển trên các hạt
lúa ướt trên ruộng.
Bên cạnh sự nhiễm độc cấp tính ,mycotoxin
còn gây nên các bệnh lý rất khác nhau do ăn phải
thức ăn có độc tố trong một thời gian dài .Tùy vào
bản chất của từng loại ,mycotoxin có thể gây độc cho các hệ thống khác nhau của cơ
thể như gan ,thận ,hệ thần kinh ,hệ tiêu hóa của động vật tiêu thụ các sản phẩm nhiễm
các độc tố nấm mốc.
Nhiều mycotoxin như aflatoxin ,ochratoxin,funomisin có thể là các chất gây
biến dị ,gây hội chứng ung thư và quái thai .Ngoài ra, mycotoxin còn có thể gây ra sự
mất cân bằng trong chuyển hóa thức ăn và giảm tỉ lệ sinh sản của vật nuôi .Bên cạnh
đó ,các dẫn xuất của mycotoxin thường độc đối với hệ thần kinh và do vậy gây tổn
hại hệ thống cơ và gây rất nhiều hội chứng khác như bệnh ngoài da ,chứng tăng sừng
hóa ,tác động gây động đực ,sẩy thai .Ngoài các tác động trực tiếp ,mycotoxin còn có
khả năng gây các hội chứng gián tiếp như ức chế vitamin,ăn không ngon miệng ,hoặc
biến đổi các chất khác thành các chất độc .Tuy nhiên,bệnh do mycotoxin gây nên

không có tính di truyền ,không lây nhiễm ,không gây nhiễm trùng .

Do đặc tính các mycotoxin là khác nhau ,và có thể do các nấm mốc khác
nhau tổng hợp nên ,không có một lý thuyết chung cho các mycotoxin về khả năng
nhiễm ,độc tính ,khả năng loại trừ ,phương pháp phân tích …Vì thế Ochratoxin là một
độc tố điển hình của mycotoxin.




Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




4
2. Độc tố ochratoxin :

Sơ lược :

Độc tố Ochratoxin, là một sản phẩm chuyển hoá thứ cấp của một số loài nấm .
Ochratoxin có mặt trong khắp các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia,
cà phê và cả trong các sản phẩm có nguồn gốc
động vật do đã bị lây nhiễm trước. Ochratoxin được
tạo ra từ nấm Aspergillus (ví dụ: A. ochraceus) và
một vài loài Penicillium. Độc tố nấm mốc thuộc
nhóm này gọi là Ochratoxin A (= OTA hay OA). Có
các phức hợp khác trong nhóm này, nhưng chúng ít

độc hơn. Nấm Aspergillus ochraceus (tạo ra độc tố
OTA) thích hợp trong điều kiện khí hậu nóng, trong
khi nấm Penicillium verrucosum tạo ra độc tố OTA
trong vùng khí hậu ôn đới. Ví dụ A. ochraceus được
tìm thấy ở Brazil, Chile, Egypt, Senegal, Tunisia,
India và Indonesia. Penicillium verrucosum được
quan sát thấy ở Canada, Mỹ, Châu Âu, và Nam Mỹ
(theo nguồn FAO).
Hình 2. Độc tố nấm mốc ochratoxin

Các nghiên cứu của Pháp và Châu Âu mới đây cho thấy rằng các mẫu thực
phẩm chứa OTA ở nồng độ ít nhất vượt quá 10 ppb,lớn hơn 10 lần ngưỡng an toàn
.Mới đây ,nghiên cứu của các nhà khoa học Pháp cho thấy rằng trong số 450 mẫu
rượu nho của Châu Âu ,vang đỏ được phát hiện nhiễm OTA nhiều hơn so với vang
trắng hay vang hồng .Ngoài ra sự nhiễm OTA phụ thuộc rất nhiều vào xuất xứ địa lí
của nguyên liệu .

2.2. Cấu trúc :

Ochratoxin là một độc tố rất phổ biến bên cạnh các mycotoxin khác như
aflatoxin là các ochratoxin A,B,và C và các dẫn xuất của chúng . Về cấu tạo hóa học
OTA là hợp chất của izocoumarin liên kết với một nhóm L-phenylalanin.Độc tính
của các ochratoxin khác nhau liên quan tới việc nhóm hydroxyl phenol được tách ra
khó hay dễ.

– C – C – N – C –

H COOH
H H H O
OH
Cl
O

O

CH
3

Ochratoxin A
Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




5

Cấu trúc hóa học OTA

2.3.Nấm mốc tổng hợp OTA :

Các chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp OTA còn chưa được xác định
.Nhưng các nghiên cứu về OTA cho tới nay cho thấy rằng các chủng nấm mốc có thể
rất khác nhau trên các đối tượng khác nhau ,và thuộc vào các giống nấm mốc phổ
biến Aspergillus và Penicillium .Ví dụ: các chủng gặp rất phổ biến trên lương thực và

thực phẩm như Aspergillus carbonarius và Aspergillus ochraceus .Các nghiên cứu đã
chỉ ra rằng ,sự phát triển của các nấm mốc sinh OTA khác nhau và việc hình thành
OTA từ chúng phụ thuộc rất khác nhau vào nhiệt độ ,độ ẩm ,hoạt độ nước của sản
phẩm ,bản chất sản phẩm .Các chủng sinh OTA rất khác nhau theo khu vực địa lí ,khí
hậu và bản chất của sản phẩm bị nhiễm .Hơn thế nữa ,các chủng tổng hợp OTA cũng
có thể tổng hợp đồng thời nhiều loại mycotoxin như axit penicilic hoặc citrinin.

2.4. Độc tính :

Trong số các ochratoxin , ochratoxin A ( OTA) có tính độc cao nhất .Đây là
hợp chất không mùi, kết tinh, hòa tan trong dung môi phân cực và trong dung dịch
bicabonat, hòa tan hạn chế trong nước.



– C – C – N – C –

H COOH
H H H O
OH
H
O

O

CH
3

Ochratoxin B
– C – C – N – C –

H COOH
H H H O
OH
O

O

CH
3

Ochratoxin C
Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




6
2.4.1. Đối với các loại ngũ cốc :
Ngay từ khi gieo trồng, tất cả các loại ngũ cốc đều bị nhiễm nấm mốc. Loại
nấm mốc này có tên là Fusarium. Trong quá trình thu hoạch và lưu giữ tại kho, ngũ cốc
lại có nguy cơ cao bị nhiễm một loại nấm mốc có tên là Aspergillus … Chính những
loại nấm mốc này sẽ tạo nên những độc tố nấm mốc( như ochratoxin).
Độc tố nấm mốc là sản phẩm phụ của
quá trình trao đổi chất tự nhiên của nấm mốc và
gây nên một số bệnh cho gia súc cũng như con
người . Độc tố nấm mốc có tính bền vững ở nhiệt
độ cao, đến 340

o
C mà không bị phân hủy. Hầu
hết các loại nguyên liệu thức ăn gia súc đều là
các loại hạt cốc đã mang sẵn nấm mốc và các
loại độc tố, quá trình chế biến nhiệt cũng không
làm ảnh hưởng đến sự tồn tại của các loại độc tố
nấm mốc này, đây chính là nguyên nhân làm gia
súc mắc bệnh và gây nên những thiệt hại không
nhỏ.
Hình 3 . Độc tố nấm mốc ở ngũ cốc

2.4.2. Tác động đối với vật nuôi :

OTA là độc tố nấm mốc liên quan tới bệnh thận cấp tính của lợn, gây quái
thai cho chuột, và phôi gà. LD
50
cuả OTA là 20mg/kg đối với chuột và 3,6mg/kg đối
với gà con 10 ngày tuổi .
* Trên heo, OTA gây tổn thương thận. Thực ra, OTA thu hút các protein
huyết tương bao quanh nó, tạo ra một hợp chất khá bền vững . Hợp chất này được tìm
thấy ở thịt heo và các sản phẩm từ thịt. OTA cũng ảnh hưởng đến sự sinh sản của heo
nọc. Nó được truyền qua nhau thai, và có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của bào thai.
Hiện tượng chết hàng loạt ở heo con mới sinh đôi khi một phần là do với nhiễm độc tố
OTA.
Stoev và cộng tác viên quan sát thấy độc tố ochratoxin A có trong thức ăn
sẽ làm tăng độ nhạy cảm của heo đối với bệnh thương hàn. Thí nghiệm được thực hiện
trên 18 con heo, có sự bộc phát tức thời do S. choleraesuis trên toàn bộ số heo cho ăn
với khẩu phần có chứa 3 ppm ochratoxin A và trên 1/3 số heo cho ăn với khẩu phần
1ppm ochratoxin. Trong cùng thí nghiệm, không có heo nào bị mắc bệnh ở lô đối
chứng. Sự xuất hiện tức thời của bệnh thương hàn có thể giải thích rằng nếu quan sát

bằng mắt thường thì tất cả heo ở các trại đều khoẻ mạnh, nhưng thực tế thì mọi cá thể
heo đều có nhiễm S. cholerasuis. Trong một thí nghiệm khác, tất cả các heo đều được
tiêm vaccin chống lại S. choleraesuis (nguyên nhân gây bệnh hồng lị). Tuy nhiên, độc
tố nấm mốc lại gây bùng phát bệnh do ảnh hưởng của Serpulina hyodysenteriae và
Campylobacter coli (Stoev và cộng sự, 2000). Một số tác giả khác (Muller và cộng sự,
1999; Verma và Mathew, 1998; Baudrimont và cộng sự, 1994) đã trình bày về một số
ảnh hưởng khác của Ochratoxin A trên sự miễn dịch của thú: làm giảm tế bào lympho
(tế bào miễn dịch), tăng apoptotic thực bào (làm chết các bạch cầu trung tính và đại
thực bào), tăng lượng bạch cầu ưa acid (tế bào có liên quan đến sự đáp ứng miễn dịch),
làm tăng lượng bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa bazơ và làm giảm sự thực bào (khả
năng tiêu diệt vi khuẩn của cơ thể thú).
Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




7

* Ở gà: chậm phát triển, khả năng trao đổi giống giảm, sản lượng và chất
lượng trứng giảm, tiêu chảy.

2.4.3. Tác động đối với cơ thể người :

Đối với người, OTA gây chứng bệnh suy thận vùng Bancang ở người
.Những trường hợp nhiễm độc OTA cấp tính có thể bị tử vong .Từ 1993, Cơ quan
nghiên cứu Quốc tế về ung thư đã xếp OTA vào các hợp chất nhóm 2B là nhóm các hợp
chất có thể gây ung thư .OTA còn bị nghi ngờ là chất có thể gây nhiễm độc thần kinh.
Các khuyến cáo cho rằng ngưỡng hấp thu hàng ngày cho phép đối với

OTA là 1,2 - 1,4 mg/kg/ngày. Ngưỡng qui định cho OTA trong một số sản phẩm
như nước quả hoặc vang nho được khuyến cáo là 0,2 – 1mg/ kg.

II / PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH :
1. Phân tích vi sinh vật :
Để phân lập các nấm mốc nhiễm trên thực phẩm, phương pháp phân lập trực
tiếp hiệu quả hơn phương pháp gián tiếp đối với các sản phẩm dạng hạt .Hạt ngũ cốc
được đặt trực tiếp lên môi trường thạch sau khi đã được làm sạch trong dung dịch tẩy
clo 0,4% để loại bỏ chất bẩn trên bề mặt mà không ảnh hưởng tới nấm mốc. Đối với các
sản phẩm dạng bột, có thể tiến hành đồng hóa hoặc lắc mẫu trong các dung môi thích
hợp và sử dụng kĩ thuật pha loãng để xác định nấm mốc nhiễm trên sản phẩm .
Vấn đề cơ bản khi phân tách nấm mốc nhiễm trên sản phẩm là sự phát triển rất
nhanh chóng của 1 số loài nấm như Mucor, Rhizopus và các loài Zygomycetes làm cho
việc phát hiện hoặc định lượng các nấm mốc khác rất khó khăn. Có thể sử dụng các môi
trường nghèo như Potato Dextro agar hoặc môi trường có chứa chất ức chế một số nấm
mốc như dicloran, hoặc sử dụng các môi trường chọn lọc để ức chế một số nấm mốc có
khả năng sinh hệ sợi nhanh chóng như Rhizopus.
2. Theo cơ sở khoa học :
Các ochratoxin phát huỳnh quang và hấp thụ UV cực đại tại 365nm.Do vậy có
thể phân tách OTA bằng TLC, bằng HPLC, phát hiện mẫu dưới tia UV.
Theo TCVN 7595-07 thì có 2 phương pháp xác định ochratoxin A trong ngũ
cốc và sản phẩm ngũ cốc bằng phương pháp sắc kí lỏng :


Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn

8
+ Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao làm sạch bằng sillicagel
+ Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao làm sạch bằng bicacbonat.
Ở đây nhóm em tìm hiểu về phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao làm sạch
bằng sillicagel.
2.1. Phạm vi áp dụng :
Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định ochratoxin A với các hàm
lượng lớn hơn 0,4 µg/kg. Phương pháp này đã được đánh giá thành công trong hai
nghiên cứu liên phòng thử nghiệm theo ISO 5725 : 1986, thực hiện trên bột mì có
chứa hàm lượng ochratoxin A từ 0,4µg/kg đến 1,2 µg/kg.
Nguyên tắc :
Sau khi đã axit hóa bằng axit clohydric và nồng độ ion được tăng bằng cách
bổ sung magie clorua, dùng toluene để chiết ochratoxin A (OTA ). Làm sạch dịch
chiết trên một cột nhỏ sillicagel và xác định OTA bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao
HPLC ( High-Performance Liquid Chromatography ) trên cột pha đảo, nhận dạng
và sửa đổi bằng huỳnh quang. Kết quả được xác minh lại bằng dẫn xuất với bo
triflorua trong dung dịch metanol nếu cần .
 Chú ý : OTA gây độc đến gan, thận và có thể gây ung thư . Phải tuân thủ
các yêu cầu phòng ngừa về an toàn thích hợp khi xử lí các hợp chất như thế
và đặc biệt là tránh xử lí chúng dưới dạng khô vì bản chất tĩnh điện học có
thể dẫn đến sự phân tán và hít phải. Các dụng cụ thủy tinh có thể khử nhiễm
bằng dung dịch natri hypoclorit 4%.
2.3. Thuốc thử :
Trong suốt quá trình phân tích, chỉ sử dụng thuốc thử được công nhận đạt
chất lượng tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước loại 1 của TCVN
4851 (ISO 3696 ), trừ khi có qui định khác. Dung môi phải đạt chất lượng để dùng
cho phân tích HPLC.
2.3.1. Natri sunfat, dạng khan.
2.3.2. Axit acetic băng, ( CH

3
COOH)≈ 98%.
2.3.3. Dung dịch HCl = 2 mol/l
2.3.4. Dung dịch MgCl
2
= 0,4 mol/l
Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




9
2.3.5. Axetonitril
2.3.6. Toluen.
2.3.7. n-Hexan.
2.3.8. Diclorometan.
2.3.9. Axeton.
2.3.10. Metanol.
2.3.11. Bo triflorua.
2.3.12. Ochratoxin A, dạng tinh thể hoặc dưới dạng viên nang.
2.4.Chuẩn bị dung dịch gốc OTA :
Hòa tan 1mg ochratoxin (tinh thể ) hoặc lượng chứa trong một viên nang
(nếu OTA thu được dưới dạng màng mỏng) vào trong hỗn hợp dung môi I ( gồm :
toluen và axit acetic băng với các phần tương ứng là 99 + 1 theo các phần thể tích )
để có được dung dịch chứa khoảng từ 20 µg/ml đến 30 µg/ml OTA.
2.5.Dung dịch chuẩn OTA :
Cho bay hơi dưới dòng khí nito cho đến khô : 1 ml dung dịch chuẩn gốc
hoặc một phần tương đương với một lượng chính xác 100 µg OTA đến khô, rồi

dùng pha động ( trộn 99 phần thể tích axetonitril với 99 phần thể tích nước và 2
phần thể tích axit acetic băng và khử khí dung dịch này trước khi sử dụng ) để pha
loãng đến 100 ml.
Dung dịch này có thể bảo quản ở 4
o
C trong tủ lạnh. Cần kiểm tra tính ổn
định của dung dịch.
2.6. Dung dịch hiệu chuẩn OTA :
Dùng pipet lấy các dung tích thích hợp của dung dịch chuẩn OTA, ví dụ :
1ml ; 2,5ml; 4ml và 5ml cho vào bình định mức 100ml và dùng pha động để pha
loãng đến vạch mức.
Nồng độ OTA trong các dung dịch hiệu chuẩn cần nằm trong dãy 0,2 ng
đến 1,0 ng trong 20 µl thể tích bơm.

Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




10
2.7. Cách tiến hành :
2.7.1. Khái quát :
Toàn bộ qui trình phân tích cần được thực hiện trong ngày. Nếu một số mẫu
được chuẩn bị cùng một lúc thì toàn bộ các mẫu đó cần được phân tích cùng một
thời điểm trong suốt cả đêm bằng cách sử dụng bộ bơm mẫu tự động.
2.7.2. Chuẩn bị mẫu thử :
Dùng máy nghiền phòng thử nghiệm nghiền nhỏ mẫu cho đến khi lọt qua
sàng và trộn kĩ . Đối với bột mì có cỡ hạt tối đa là 250 µm thì không cần thiết phải

nghiền.
2.7.3. Chiết OTA ra khỏi mẫu :
- Cân 20g ( m
o
) mẫu đã chuẩn bị chính xác đến 0,1g cho vào ống li tâm. Tiếp
theo , cho 30 ml dung dịch axit clohydric, 50 ml dung dịch MgCl
2
, dùng đũa thủy
tinh để khuấy và thêm 100 ml toluen ( V
1
).
- Lắc trong 60 phút và sau đó cho li tâm huyền phù. Thời gian li tâm phụ
thuộc vào hiệu quả của máy li tâm, việc làm lạnh tránh thất thoát toluen. Lấy ra 50
ml (V
2
) ra khỏi lớp toluen phía trên và nạp vào cột pha rắn loại nhỏ sử dụng một lần
đã được chuẩn bị và cột này được nối với xiranh làm nơi chứa dung môi.
- Rửa cột hai lần, mỗi lần bằng 10 ml n-hexan và rửa tiếp 2 lần, mỗi lần bằng
10 ml hỗn hợp dung môi II ( axeton và toluen với các phần tương ứng là 5 + 95 ).
Tiếp theo, rửa bằng 5 ml toluen. Loại bỏ tất cả nước rửa.
- Rửa giải OTA bằng 2 phần hỗn hợp dung môi III ( toluen và axit acetic băng
với các phần tương ứng là 90 + 10 ) mỗi phần 15 ml cho vào bình quả lê 50 ml. Cho
bay hơi dịch rửa giải dưới áp suất giảm cho đến khô, chú ý không để nhiệt độ vượt
quá 40
o
C. Lấy phần cặn ra, dùng pipet hút 1 ml (V
3
) pha động cho vào bình hình
quả lê và lọc qua bộ lọc màng, vào lọ.
2.7.4. Điều kiện vận hành HPLC :

Sử dụng cột tách HPLC pha đảo phân tích thì cài đặt như sau :
+ Tốc độ dòng : 1 ml/ phút

Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




11
+ Phát hiện huỳnh quang : Bước sóng kích thích : 330 nm
Bước sóng phát xạ : 460 nm
+ Thể tích bơm : 20 µl ( V
4
)
2.7.5. Đường chuẩn :
Chuẩn bị đường chuẩn ngay từ khi bắt đầu phân tích và bất cứ khi nào thay
đổi các điều kiện sắc kí .
Bơm ít nhất bốn dung dịch hiệu chuẩn có các nồng độ thích hợp khác nhau.
Vẽ đồ thị các giá trị phát huỳnh quang của các dung dịch hiệu chuẩn OTA
dựa theo các nồng độ khối lượng OTA tính bằng nanogam.
2.8. Định tính :
2.8.1. Nhận biết :
Nhận biết OTA bằng cách so sánh thời gian lưu của mẫu với thời gian lưu
của chất chuẩn.
Đôi khi có thể cần phải nhận biết pic của OTA bằng cách bơm đồng thời
dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn .
2.8.2. Xác định :
Chạy sắc kí ngay đối với mẫu thử. Tiến hành xác định bằng phương pháp

ngoại chuẩn , tích phân điện tích pic hoặc xác định chiều cao pic và so sánh các kết
quả thu được với các giá trị của chất chuẩn với diện tích pic/ chiều cao pic gần nhất,
hoặc sử dụng đường chuẩn. Trong trường hợp đường chuẩn thì các dung dịch bổ
sung có các nồng độ nằm trong dải tuyến tính có thể được chuẩn bị cho đường
chuẩn.
Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn được
dùng cho đường chuẩn .
Đọc khối lượng OTA (m
1
) ,tính bằng nanogam, tương ứng với huỳnh quang
của dung dịch mẫu thử từ đường chuẩn.
Nếu hàm lượng OTA của mẫu nằm ngoài đường chuẩn, thì điều chỉnh lượng
mẫu bơm bằng cách cô đặc hoặc pha loãng dung dịch mẫu thử.
Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




12
2.8.3. Khẳng định :
Nếu cần khẳng định việc nhận biết bằng cách làm biến mất pic tại thời gian
lưu đối với OTA và cho xuất hiện pic mới tại cùng thời gian lưu như thời gian lưu
của este metyl chuẩn của OTA.
- Lấy 500 µl dịch chiết đã chuẩn bị, chuyển sang bình hình quả lê và cho bay
hơi đến khô trong bộ cất quay. Cho 1 ml diclorometan và thêm 2 ml dung
dịch bo triflorua metanol vào phần cặn còn lại.
- Đậy chặt nắp bình và đun trên nồi cách thủy trong 15 phút ở 50-60
o

C. Sau
khi để nguội, chuyển dung dịch sang phễu chiết 50 ml có chứa 30 ml nước ,
lắc 3 lần, mỗi lần 30 giây sau khi đã thêm 10 ml diclorometan . Gộp các pha
hữu cơ vào phễu chiết 50 ml thứ hai, thêm 20 ml nước để rửa và lắc trong
30 giây.
- Tiếp theo, lọc pha diclorometan qua natri sunfat cho vào bình hình quả lê,
cho bay hơi đến khô, rồi cho thêm 500 µl pha động và dung dịch này dùng
để tách sắc kí dưới các điều kiện mô tả trong 2.6.4. Kết thúc việc tạo dẫn
xuất này có thể kiểm tra được từ sắc phổ. Có thể áp dụng qui trình này để
xác định hàm lượng OTA không nhỏ hơn 0,4 µg/kg
- Cần xử lí một dung dịch chuẩn riêng biệt để kiểm tra các thời gian lưu của
este metyl của OTA và kết thúc tạo dẫn xuất.
2.9. Định lượng :
Tính phần khối lượng w
OTA
của OTA bằng µg/kg, sử dụng phương pháp ngoại
chuẩn :
w
OTA
= V
1
* V
3
* m
1
/ ( V
2
*V
4
* m

0
)
Trong đó : V
1
: thể tích dung môi đã dùng để chiết ( ml ) , ở đây là 100 ml
V
2
: thể tích li tâm (thể tích của toluen) (ml) , ở đây là 50 ml
V
3
:tổng thể tích của dung dịch mẫu thử (ml) , ở đây là 1 ml
V
4
: thể tích bơm , (ml)
m
1
: khối lượng của OTA tương ứng với diện tích pic đo được hoặc
chiều cao pic đọc được từ đường chuẩn (ng ,nanogam )
m
0
: khối lượng của phần mẫu thử ( g).
Ghi lại kết quả theo qui tắc hiện hành sau khi làm tròn đến hai chữ số thập phân.
Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




13

3. Phương pháp KIT VERATOX ( định lượng Ochratyoxin )
Hãng sản xuất: NEOGEN - Mỹ (www.neogen.com)

3.1.Mục đích sử dụng

Kit Veratox được sử dụng để phân tích định lượng Ochratoxin trong ngũ cốc, cafe
xanh và các loại hoa quả sấy khô.

3.2. Thử nghiệm

Thử nghiệm này dùng phương pháp cạnh tranh Elisa để xác định nồng độ chính
xác của Fumonisin ở nồng độ cỡ phần tỉ (ppb). Phương pháp ELISA được sử dụng rất
thông dụng trong các phân tích sơ bộ mycotoxin. Phương pháp này bao gồm việc chiết
ochratoxin từ thực phẩm, pha loãng hoặc cô đặc mẫu trên cột, thực hiện phản ứng
ELISA và đánh giá kết quả dựa theo sự thay đổi màu của cơ chất trên phản ứng.Phương
pháp này đắt tiền, chỉ phù hợp khi cần phân tích rất nhiều mẫu cùng lúc. Ochratoxin tự
do trong mẫu và mẫu so sánh cạnh tranh với độc tố gắn enzyme liên kết (tiếp hợp) về
phía liên kết kháng thể. Sau khi rửa, chất nền phản ứng với chất tiếp hợp enzyme liên
kết tạo thành sản phẩm màu xanh lơ. Bằng phương pháp quang học xác định chính xác
nồng độ của Ochratoxin.

3.3. Phương pháp

Cần phải lấy mẫu chiết trước khi thử:

- Thêm 100 l chất tiếp hợp vào mỗi giếng trộn
- Thêm 100 l chất so sánh và mẫu thử vào mỗi giếng trộn.
- Trộn đều. Chuyển 100 l vào mỗi giếng kháng thể. Ủ trong khoảng 10 phút
- Trút chất lỏng từ mỗi giếng kháng thể ra.
- Rửa sạch hoàn toàn các giếng bằng nước loại ion

- Thấm nước bằng giấy thấm.
- Chuyển 100 l chất nền từ cốc phản ứng tới các giếng kháng thể sử dụng 12-đầu
pipet. Ủ trong 10 phút.
- Chuyển 100 l chất kìm hãm màu đỏ từ cốc phản ứng tới mỗi giếng kháng thể.
- Sử dụng bộ đọc bản giếng với kính lọc 650nm để đọc kết quả.

3.4. Thông số kỹ thuật của sản phẩm

Gi
ới hạn d
ò

th
ấp nhất

1ppb

Khoảng định lượng 2 ppb-25 ppb
N
ồng độ mẫu so sánh

0, 2, 5, 10, 25 ppb

Thời gian thử 20 pht
Kháng thể phản ứng 100% Ochratoxin , 18%
OchratoxinB
Số test/kit tới 38

Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn




14
3.5. Các vật liệu khuyến cáo nhưng không cung cấp cùng với Kit.

Có thể đặt từ Neogen:
1. Dung dịch methanol 70% tinh khiết.
2. Ống đong chia độ
3. Cốc đựng mẫu dung tích 125 mL
4. Syringe lọc Neogen, giấy lọc Whateman số 01 hoặc tương đương
5. Ống đựng mẫu
6. Máy nghiền Agri-Grind, hoặc tương đương.
7. Cân có thể cân với trọng lượng 5g 25g
8. Bộ đọc Mircowell với kính lọc 650 nm
9. Pipet 100 l, pipét 12 kênh và đầu típ.
10. Giá đỡ giếng
11. Đồng hồ bấm giờ
12. Lọ rửa
13. 02 thuyền thuốc thử cho pipét 12 đầu.

3.6. Những vật liệu Neogen không cung cấp:

1. Giấy làm khô hoặc vật thấm nước

2. Lọ chứa mẫu bằng nhựa dung tích ½ gallon (2,27 lít) để chứa chất thải.
3. Nước cất hoặc nước loại ion.
4. Bút ghi bền với nước.
III / ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP :
1 . Hạn chế :
Các hiểu biết hiện tại về OTA còn rất hạn chế so với aflatoxin. Các nghiên
cứu cho rằng có thể dùng khí quyển điều hòa 30% CO
2
ức chế hoàn toàn sự tạo
thành OTA. OTA rất bền vững với các xử lí nhiệt và hóa chất. Các thử nghiệm cho
thấy chỉ có 76% hàm lượng OTA giảm đi khi gia nhiệt ở 250
o
C trong 40 phút . So
với aflatoxin,OTA rất bền vững trong môi trường ẩm. Dung dịch OTA trong
methanol cũng không bị phân hủy khi bị chiếu xạ ( tới 7,5 Mrad )
Cho tới nay, chưa có một biện pháp hiệu quả để phân hủy độc tố nấm mốc loại
này. Vì vậy, mọi biện pháp góp phần làm giảm và hạn chế việc hình thành OTA
trong các sản phẩm đều cần được quan tâm và áp dụng.
2. Biện pháp :
Nấm mốc và độc tố nấm mốc rất phổ biến và rất bền, chúng ta không có biện
pháp gì để hạn chế chúng trong tự nhiên cũng như trong quá trình chế biến thức ăn gia
súc ( vì tốn kém và không mang lại hiệu quả kinh tế ).

Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn

15
Giải pháp duy nhất hiện nay cho việc hạn chế tác hại của độc tố nấm mốc là
việc sử dụng các chất hấp phụ. Trên thế giới hiện nay sử dụng nhiều loại chất hấp phụ
nhưng chủ yếu tập trung vào 3 nhóm chính : có nguồn gốc từ chất khoáng, enzym hay
nấm men. Tuy nhiên, sử dụng chất hấp phụ có nguồn gốc chất khoáng hiện được xem là
có hiệu quả hơn cả. Việc sử dụng các chất hấp phụ hiện nay là phổ biến trên thế giới,
nhất là tại các nước có nền chăn nuôi tiên tiến. Điều kiện bảo quản trong kho bãi cũng
giúp hạn chế sự phát triển của nấm mốc và độc tố nấm mốc rất nhiều .


















Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn

16
TÀI LIỆU THAM KHẢO

[ 1 ] Lê Ngọc Tư, Độc tố học và an toàn thực phẩm,2006.
[ 2 ] Tiêu chuẩn quốc gia, TCVN 7595-1 : 2007, ISO 15141-1 : 1998, Hà Nội,
2007
[3] />gnghiencuu&act=detail&id=83&ngay=2006-09-27










Sưu tầm bởi:

www.daihoc.com.vn