Kỹ thuật khảo sát trực tiếp, Phạm Thái BÌnh

KỸ THUẬT LẤY VÀCHUYÊN CHỞBỆNH PHẨM
TRONGXÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG
KỸ THUẬT LẤY VÀCHUYÊN CHỞBỆNH PHẨM
TRONGXÉT NGHIỆM VI SINH LÂM SÀNG
PhạmTháiBình
KỸ THUẬT
KHẢO SÁT TRỰC TIẾP
PhạmTháiBình
Bệnhphẩmlàmẫuthửlấytừbệnhnhân
đểpháthiệnbằngchứnggiúpxácđònh
đượctácnhângâynhiễmtrùng.
KỸ THUẬT SOI TƯƠI
KỸ THUẬT SOI TƯƠI
Bệnhphẩmthườnggặptrongxétnghiệmvi sinh
Máu
Dòchnãotủy
Nướctiểu
Đườnghôhấptrên
Hầuhọng
Mũihầu
Tai
Xoang
Đườnghôhấpdưới
Đàm
Dòchphế
quản
Dòchkhí
quản
Mủvàtiếtdòch
Phân
Đườngsinhdục

Soitươikhôngnền
Mụcđích
 Quansátdiđộngcủavi khuẩn.
 Pháthiệnphẩykhuẩntả.
Huyềndòch
(vi khuẩn,
bệnhphẩm)
Hạtụquang,
quansátở ×40
Phươngpháp
Vìbệnhphẩmđượclấybởinhiềunguồnkhácnhaunênphảilấy
bệnhphẩmđạtyêucầutrongxétnghiệmvi sinh
Soitươicónền
Mụcđích
 Pháthiệnvi khuẩn, vi nấm, ký
sinhtrùng, hồngcầubạchcầu
trongdòchnãotủy, phân
Phươngpháp
Huyềndòch
(vi khuẩn,
bệnhphẩm)
Nigrosin(2%)
Methylenblue
(0.001%)
Hạtụquang,
quansátở ×40
C. neoformans
(nigrosin)
C.meningitidis
(nigrosin)

D. Church, 2005, The seven principle of accurate microbiology specimens collection, Microbiology
newsletter a publication of the division of microbiology, CargaryLaboratory Services
Nguyênnhânlàmchobệnhphẩmkhôngđạt
yêucầutrongxétnghiệmvi sinh
Calgary Laboratory Services, Canada
KỸ THUẬT
CHUẨN BỊ PHẾT NHUỘM
KỸ THUẬT
CHUẨN BỊ PHẾT NHUỘM
Phảichỉđònhlấybệnhphẩmsớm
-
ngaykhibệnhnhâncó ấuhiệunhiemtrùng
1
Chuẩnbòphếtnhuộmkhithựchiện:
 NhuộmGram (Gram stain).
 Nhuộmkhángacid (Acid fast stain).
 Nhuộmđơn(simple stain).
Khilàmphếtnhuộmcầnlưuý:
 Phảidànđềuphếtnhuộmtrênlame
 Phảiđểphếtnhuộmkhôtựnhiên.
 Phảicốđònhphếtnhuộmbằng
cáchhơnhẹqua ngọnlửèncồn.
 Khôngđượcnướngphếtnhuộm
Máu
Chỉđònhcấymáungaykhi
códấuhiệunhiễmtrùng
huyết(septicemia) hoặcdu
khuẩnhuyết(bacteremia).
 Sốt, ớnlạnh, lạnhrun, tiếngthổitim
(cardiac murmur).

 Nghingờviêmnộitâmmạc.
 Có xuất huyết ở da hay niêm
mạc, xuất huyết dạng sao
(splinder) trênmóngtay, choáng.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
KỸ THUẬT
NHUỘM GRAM
KỸ THUẬT
NHUỘM GRAM
Hans Christian Gram
Dòchnãotủy
Chỉđònhcấydòchnãotủykhicócáctriệu
chứngnghingờviêmmàngnão.
Khôngchỉđònhchọc dòDNT:
 trẻsơ sinh bò suy tim, suy hô hấp.
 bệnh nhân códấuhiệugiatăngáplựcnộisọ(soi
đáymắtthấygaithòbòphùnề).
 bệnh nhân bò nhiễm trùng vùng da nơi kim chọc dò
đi qua đểlấy DNT.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Nguyêntắc
Váchcủatếbàovi khuẩnGram (+) giữđượcmàucủaphứchợp
Crystal violet-Iodine khibòtẩybằngalcohol
Nướctiểu
Chỉđònhcấynướctiểukhinghingờ
nhiễmtrùngtiểucấptính, mạntínhcó
hoặckhôngcótriệuchứng
 Nhiễmtrùngbàngquang(đáira

mủ, ramáu, đáikhó, đáiđau,
đau tức vùng xương mu hay
bụngdưới).
 Nhiễmtrùngthận(đaulưng, tức
căngvùnggócsống-sườn).
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Thuốcnhuộm
Dung dòchCrystal violet
 Hòa tan amonium oxalate (0.8g)
trong nướccất (80ml).
 Nghiền
crystal violet (2g) trongcối
vàchotừtừ ethanol95% (20ml) vào
đểlàmtan hoàntoàn crystal violet.
 Trộnđềuhaidung dòchvớinhau.
 Bảoquảntránhánhsáng.
Dung dòchLugol
 Nghiền iodine (1g) và potassium
iodine (3g) trongcốivới nướccất
(100ml) chotan hoàntoàn.
 Bảoquảntránhánhsáng.
Dung dòchAlcohol
 Dùngalcohol 96%
Dung dòchSafranine
 Nghiền safranine O (0.25g) với
ethanol95% (10ml) trongcốicho
tan hoàntoàn.
 Thêmvào90ml nướccất, trộnđều.
 Bảoquảntránhánhsáng.

Phân
Chỉđònhcấyphânkhibòtiêu
chảyhoặcbòrốiloạntiêu
hoánghingờdo nhiễmtrùng
 Tiêuchảy.
 Lỵvớiphâncómủ, nhầy
hoặcmáu.
 Bòđaubụngcơn.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Phươngphápthựchiện
Phếtnhuộmđược
cốđònhtrênlame
PhủCrystal violet
lênphếtnhuộm
trong1 phút
Rửabằngnước
chosạchthuốc
nhuộm
Phủ Lugol lên
phếtnhuộmtrong
1 phút
Rửabằngnước
chosạchthuốc
nhuộm
Tẩymàubằng
alcohol
PhủSafraninelên
phếtnhuộmtrong
1 phút

Rửabằngnước
chosạchthuốc
nhuộm
Thấmkhôphết
nhuộm
Rửabằngnước
Quansátở
vậtkínhdầu
Chỉđònhcấườnghôhấptrênkhicó
nhiễmtrùngvùnghầuhọng, tai, mũixoang
Đườnghôhấptrên
 Viêmtai ngoàicấptính.
 Viêmtai giữacấptínhhoặcmạntính.
 Viêmxoangcấptinhhoặcmạntính.
 Viêmmũicấptínhhoặcmạntính.
 Viêmnhiễmvùnghầuhọng(đaurátvùnghầu
họng, niêmmạchầuhọngsưngđỏ, phùnề,
viêmamydan, cómàngmủhay mànggiả,
phùnềtiểuthiệt, lõiđỏdâutây, vàsưng
hạchcổ).
 Tìmngườilànhmangtrùng.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
HệthốngnhuộmGram tựđộng
WescorModel 7320 Aerospray® Quick Slide AGS-1000
Chỉđònhcấườnghôhấpdướikhi
cóviêmnhiễmđườnghôhấpdưới
(viêmphổi, viêmphếquảncấp,
cơncấpcủaviêmphếquảnmạn).
Đườnghôhấpdưới

 Ho cómáu, ho nhiều, đau
ngực, khóthở.
 Có dấu hiệu đặc phổi,
phimphổicóthâmnhiễm
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Biệnluậnkếtquả
TínhchấtGram
 Vi khuẩnGram (-): bắt màuhồng
 Vi khuẩnGram (+): bắt màutím
Hìnhdạng
 Cầukhuẩn: vi khuẩnhìnhcầu
 Trựckhuẩn: vi khuẩnhìnhque
Cáchsắpxếp
 Xếpchùm
 Xếpchuỗi
 Xếpđôi
 Xếprờirạc
Cáctínhchấtkhác
 Sốlượng.
 Tạobàotử.
 Hình dạng hoặc cách sắp
xếp đặc biệt
(phẩy khuẩn,
xoắn khuẩn, xếp hình chữ
nho, dạngcầutrựckhuẩn )
Chỉđònhcấymủvàtiếtdòchtrongcác
trườnghợp:
Mủvàtiếtdòch
 Mủáp-xe.

 Vếtthươngnhiễmtrùng(vếtloét,
lở, mổhậuphẫu, loétdo nằmlâu).
 Mạchlươn; mạchdẫnxoanghay
hạchbạchhuyết.
 Dòch tiết (dòch màng phổi, dòch
màngbụng…).
 Mẫunạomủxươngkhigiảiphẫu
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Biệnluậnkếtquả
TrựckhuẩnGram (-) TrựckhuẩnGram (-), nhỏ
Song cầuGram (-)
PhẩykhuẩnGram (-)
Chỉđònhcấườngsinhdụcnghingờ
bệnhlâytruyềnbằngđườngsinhdục
(ởđànôngvàđànbà) hoặcbòhuyết
trắngnghido nhiễmtrùng(ởđànbà).
Đườngsinhdục
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Biệnluậnkếtquả
LiêncầuGram (+)
TụcầuGram (+)
TrựckhuẩnGram (+),
xếpchuỗicótạobàotử
TrựckhuẩnGram (+),
xếpchuỗi
TrựckhuẩnGram (+)
Song cầuGram (+)
Phảilấúngbệnhphẩm

-
nơimàcósựhiệndiệncủatácnhânnhiemtrùng
2
Cácsailầmthườnggặp
Mầmcấy
vi khuẩn
≥24h
Dung dòch
lugolkhông
đạt
chấtlượng
Tẩymàu
quálâu
Tẩymàu
bằng
alcohol
acid
Alcohol
acid
Vi khuẩnGram (+) bắtmàuhồng
Tìmtácnhângâynhiễmtrùngvết
thươngphảilấymủhoặcdòchtiết
gầnlớpmô, khônglấymủtrênbề
mặtvếtthương.
Tìmtácnhângâyviêmxoang
phảilấyquệtmũisau, không
lấyquệtmũitrước.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Phếtnhuộm

quádày
Tẩymàu
quángắn
Alcohol tẩy
màubòpha
loãng
Alcohol
70
o
Cácsailầmthườnggặp
Vi khuẩnGram (-) bắtmàutím
Tìmtácnhângâyviêmphổi
phảilấàmhoặcdòchhútkhí
phếquản, khônglấynướcbọt
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Saukhiphủcrystal violet,
khôngrửasạchmàuthừatrên
lame. Khiphủlugoltrênphết
nhuộmthìmàucrystal violet
thừasẽbòtủalạibámtrênbề
mặtphếtnhuộm. Kếtquảcó
thểlầmtưởnghìnhảnhvi nấm.
Phủsafranine quángắnnên
khôngthấyrõmàucủaGram (-).
Cácsailầmthườnggặp
Phảilấybệnhphẩmđúngthờiđiểm
-
vàolúcmàtácnhânnhiemtrùng
hiệndiệntrongbệnhphẩm

3
KỸ THUẬT
NHUỘM KHÁNG ACID
KỸ THUẬT
NHUỘM KHÁNG ACID
Tìm S. typhi gâythươnghàn
Cấymáunếûtuầnthứ
nhấtsaukhikhởibệnh
Cấyphânnếûtuần
thứbasaukhikhởibệnh
Nguyêntắc
Vi khuẩnkhángacid (Mycobacteria,
Nocardia…) cólớpvỏsápbaobọcnên
khinhuộmvớicarbofuchsinthìphứchợp
màukhôngbòtẩymàubởidung dòch
cótínhtẩymạnh(alcohol acid, acid…)
Cácphươngphápnhuộmkhángacid:
 PhươngphápZiehlNeelsen (Franz Ziehl
vàFriedrich Neelsen, 1882)
 PhươngphápKinyoun (Joseph Kinyoun,
1887)
Máu
Thờiđiểmtốtnhấtđể
lấymáulàkhibệnh
nhânbòớnlạnhhoặc
đanglạnhrun trướckhi
sốt, hoặc lúc bệnh
nhânđanglêncơnsốt.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau

Thuốcnhuộm
Dung dòchCarbon fuchsin
 Hòatan phenol (5ml) trong nướccất (85ml).
 Nghiền
carbon fuchsin (0.3g đốivớiphươngpháp
nhuộm nóng hoặc 1g đối với phương pháp
nhuộmlạnh) trongcốivàchotừtừ ethanol95%
(10ml) vàểlàmtan hoàntoàn.
 Trộnđềuhaidung dòchvớinhau.
 Bảoquảntránhánhsáng.
Dung dòchMethylenblue
 Nghiền methylen blue (0.3g) với ethanol 95%
(30ml) trongcốichotan hoàntoàn.
 Thêmvào
nướccất (70ml) vàtrộnđều
 Bảoquảntránhánhsáng.
Dung dòchAlcohol acid
 Hòatan 97ml alcohol 96% trong3ml HClđậmđặc
Nướctiểu
Thờiđiểmtốtnhấtđể
lấynướctiểulàvào
buổisáng, bệnhnhân
cốnhòntiểutrongđêm
chếnlúclấymẫu.
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Phươngphápnhuộmnóng
(ZiehlNeelsen)
Phếtnhuômđược
cốđònhtrênlame

PhủCarbon fuchsin
lênphếtnhuộm
Hơnóngtrong5 phút
bằngcáchđốtnhẹdưới
lame (khôngđượcđể
sôi) hoặcđuncáchthủy
nhưngkhôngđểkhô
thuốcnhuộm.
Rửabằngnước
chosạchthuốc
nhuộm
Tẩy màu
bằngalcohol
acid
Thấmkhôphết
nhuộm
Rửabằngnước
PhủMethylenblue
lên phết nhuộm
trong1 phút
Rửabằngnước
chosạchthuốc
nhuộm
Quansátở
vậtkínhdầu
Cácbệnhphẩmkhác
Thờiđiểmtốtnhấtđểlấy
mẫulàcàngvàogiai
đoạn sớm của bệnh
càngtốt, nghóalàngay

khicóchẩnđoán
Phạm Hùng Vân, 2005, Các kỹ thuật lấy vàlàm xét nghiệm
vi sinh lâm sàng các bệnh phẩm khác nhau
Phươngphápnhuộmlạnh
(Kinyoun)
Phếtnhuộmđược
cốđònhtrênlame
PhủCarbon fuchsin
lên phết nhuộm
trong30 phút
Rửabằngnước
chosạchthuốc
nhuộm
Tẩymàubằng
alcohol acid
Thấmkhôphết
nhuộm
Rửabằngnước
PhủMethylenblue
lên phết nhuộm
trong1 phút
Rửabằngnước
chosạchthuốc
nhuộm
Quansátở
vậtkínhdầu
Phảilấybệnhphẩmtrướckhibệnhnhân
sửdụngkhángsinh
-
đểtangkhảnangphânlậptácnhânnhiemtrùng

4
Hệthốngnhuộmkhángacid tựđộng
AFB-0010 (GG&B Company)
Việcđiềutròkhángsinhtheokinhnghiệm
cóthểkhôngtiệttrừhoàntoànnhưng
ứcchếsựpháttriểncủatácnhân
nhiễmtrùngkhinuôicấyvàcóthểcho
kếtquảâmtínhgiả.
Phảilấybệnhphẩmnuôicấy
trướckhiđiềutròkhángsinh, nhất
làvớikhángsinhphổrộng.
Biệnluậnkếtquả
Đọckếtquả
 Vi khuẩnkhángacid bắtmàuhồng.
 Vi khuẩnkhácbắtmàuxanh
Lưuý
 Nếukếtquảnhuộmkhángacid (+)
thìkhôngđượckếtluậnlàdương
tínhvới M. tuberculosis màphảiđọc
kếtquảlàAFB (+) hoặcBK (+)
AFB: acid fast bacilli
BK: Bacilli de Koch
5
Phảilấybệnhphẩmđúngphươngpháp
-
đểtránhbệnhphẩmbòngoạinhiemvàlấy
đượcbệnhphẩmcầnlấy
Biệnluậnkếtquả
Đốivớicácbệnhphẩmkhácthìtrả
kếtquảAFB (+) hoặcAFB (-)

Đốivớibệnhphẩmlàđàmcầnphải
đánhgiákếtquảtheosốlượngAFB
 (+/-): có1→2 vi khuẩntrong300 quangtrường.
 (1+): có1→9 vi khuẩntrong100 quangtrường.
 (2+): có1→9 vi khuẩntrong10 quangtrường.
 (3+): có1→9 vi khuẩntrong1 quangtrường.
 (4+): có > 9 vi khuẩntrong1 quangtrường.