Khảo sát sự đa dạng di truyền của nhóm vi khuẩn tích lũy poly-phosphate trong chất thải chăn nuôi heo và cá tra ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long và ứng dụng trong xử lý nước ao cá tra (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ




LÊ QUANG KHÔI




KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHÓM
VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-PHOSPHATE TRONG
CHẤT THẢI CHĂN NUÔI HEO VÀ CÁ TRA Ở
VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ
ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƢỚC AO CÁ TRA




TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62 42 01 07



Cần Thơ, 2015

Công trình được hoàn thành tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.


Ngƣời hƣớng dẫn
1. PGS.TS. Trương Trọng Ngôn
2. GS. TS. Cao Ngọc Điệp



Phản biện 1:
Phản biện 2:





Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường tại:
………………………………………………………………………
Vào lúc: giờ ngày tháng năm





Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện
 Trung tâm học liệu – Đại học Cần Thơ
 Thư viện Quốc gia Việt Nam

1

CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của luận án
Ngành chăn nuôi heo và cá tra ở ĐBSCL đã và đang phát triển
theo hướng tập trung và kết quả của xu thế đổi mới là làm tăng
cường hiệu quả sản xuất trên một đơn vị lao động và đất đai. Bên
cạnh sự phát triển đó là những nguy cơ ảnh hưởng đến môi trường
sống. Các nguồn gây ô nhiễm chủ yếu là chất thải bài tiết của cá và
heo, thức ăn tồn đọng… Thành phần các chất gây ô nhiễm chủ yếu là
protein, lipid, acid béo, phospholipid, carbohydrate, hàm lượng nitơ,
chất khoáng… (Lê Văn Cát, 2007). Thông qua quá trình phân hủy
của vi sinh vật, lượng thức ăn dư thừa và chất thải sẽ chuyển thành
các dạng Nitơ (N) và phốt-pho (P) vô cơ. Hàm lượng N và P hòa tan
cao trong môi trường nước sẽ kích thích mạnh mẽ khả năng tăng sinh
khối của thủy sinh vật như tảo và vi khuẩn lam là nhân tố chủ yếu
gây ra hiện tượng phú dưỡng hóa và tiến trình phân hủy tảo sẽ làm
cho môi trường nước bị ô nhiễm, thiếu oxy cung cấp cho hoạt động
hô hấp của cá, cá sẽ suy yếu và dễ nhiễm bệnh.
Để xử l‎ý P hòa tan, một số biện pháp được sử dụng là xử lý
hóa học và sinh học. Trong biện pháp xử lý bằng sinh học, nhóm vi
khuẩn có khả năng hấp thu và tồn trữ P nội bào giữ vai trò quan
trọng và chúng được xem như là vi khuẩn tích lũy poly-phosphate
(Poly-phosphate Accumulating Bacteria-PAB). Loại bỏ P hoà tan
dạng PO
4
3-
thông qua hoạt động vi khuẩn ngày càng được ứng dụng
bởi vì các đặc tính hữu dụng của chúng là dễ ứng dụng, hiệu quả về
mặt kinh tế và thân thiện với môi trường sống (Mino et al., 1998).

Hiện nay chưa có nghiên cứu về cấu trúc quần thể của nhóm vi
khuẩn tích lũy poly-phosphate (poly-P) trong chất thải chất thải chăn
nuôi heo đã qua xử lý biogas (sau đây gọi là chất thải chăn nuôi heo)
và ao nuôi thâm canh cá tra (sau đây gọi là chất thải ao cá tra) ở
ĐBSCL. Chính vì vậy việc phân lập, tuyển chọn vi khuẩn tích lũy
poly-P có hiệu suất loại bỏ phosphate cao sẽ tạo nên cơ sở dữ liệu
cho đánh giá tính đa dạng di truyền của PAB là một nghiên cứu cần
thiết nhằm đưa các giải pháp khai thác và sử dụng bền vững nguồn vi
khuẩn tích lũy poly-P bản địa, có lợi trong tự nhiên để ứng dụng vào
trong xử lý P hòa tan dư thừa trong nước.
1.2 Mục tiêu tổng quát
Đánh giá sự đa dạng di truyền của nhóm vi khuẩn tích lũy
poly-P được phân lập từ chất thải chăn nuôi heo và cá tra ở các tỉnh


2

ĐBSCL dựa trên trình tự gen 16S rRNA và tìm ra nguồn vi khuẩn có
khả năng loại bỏ phosphate cao để ứng dụng trong việc xử lý phốt-
pho hòa tan trong nước ao nuôi cá tra ở qui mô phòng thí nghiệm.
1.3 Những điểm mới và ý nghĩa thực tiễn của luận án
Trong quá trình phân lập, tiến trình cấy chuyền làm ròng vi
khuẩn được thực hiện luân phiên giữa hai môi trường phân lập (có
nguồn carbon) và môi trường cấy chuyền (không có nguồn carbon)
để sàng lọc và tuyển chọn nguồn vi khuẩn ban đầu là phương pháp
mới để phân lập PAB. Sự kết hợp các phương pháp vừa định tính và
định lượng poly-P nội bào và nhận diện gen poly-phosphate kinase 1
bằng các cặp mồi đặc hiệu là phương pháp tin cậy để tuyển chọn vi
khuẩn có khả năng tích lũy poly-P cao. Thông qua các phương pháp
này, đã phân lập và tuyển chọn được 48/439 dòng vi khuẩn phân lập

có khả năng tích lũy poly-P cao làm cơ sở cho việc đánh giá tính đa
dạng di truyền và chọn lọc các dòng vi khuẩn có hiệu suất loại bỏ P
hoà tan cao để ứng dụng xử lý phosphate trong nước ao cá tra.
‎Ứng dụng các kỹ thuật sinh học sinh tử hiện đại (thực hiện
trên gen 16S rRNA và gen ppk 1) và kết hợp phương pháp truyền
thống để định danh vi khuẩn cho thấy 48 loài vi khuẩn tích lũy poly-
P phân lập được thuộc 5 lớp Bacilli, Actinobacteria, Alpha-
proteobacteria, Beta-proteobacteria và Gamma-proteobacteria. Kết
quả chụp TEM và PCR cho thấy rằng các dòng vi khuẩn này có gen
đồng hóa phosphate thành dạng hạt poly-phosphate nội bào.
Các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập có sự phong phú
loài và sự đa dạng nucleotide. Phân tích các chỉ số đa dạng di truyền
cho thấy tính đa hình (=0,11) và sự đa dạng nucleotide (Pi=0,16)
vùng 16S rRNA của nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P tương đối cao.
Sự biến thiên các chỉ số  và Pi tạo nên các dạng haplotype khác
nhau, có 25 haplotype (kiểu gen) được tạo ra từ 48 trình tự
nucleotide. Sự khác nhau về cấu trúc của các haplotype tạo nên sự đa
dạng cao giữa chúng (Hd=0,91). Điều này làm xuất hiện nhiều kiểu
gen có tính biến dị di truyền và khả năng thích nghi với môi trường
sống trong quá trình tiến hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng tích
lũy poly-P. Đây là cơ sở khoa học trong việc lựa chọn nguồn mẫu để
phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P có khả
năng thích nghi cao với môi trường.
Đề tài đã tuyển chọn được các dòng vi khuẩn có hiệu suất loại
bỏ phốt-pho hòa tan cao. Đặc biệt là hai 2 dòng vi khuẩn


3

Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia sp. TGT025L cho

hiệu suất loại bỏ PO
4
3-
đạt 85,1% trong nước ao nuôi cá tra sau 36
giờ thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu mang lại nhiều triển vọng trong
thực tiễn ứng dụng 2 dòng vi khuẩn tích lũy poly-P này để xử lý
phốt-pho hòa tan trong mô hình nuôi cá tra công nghiệp có ứng dụng
công nghệ sinh học vi sinh.
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Trong phần tổng quan tài liệu, luận án đã lược khảo và phân
tích những vấn đề liên quan đến tác động của phốt-pho đến chất
lượng môi trường nước. Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn tích lũy
poly-P và các biện pháp loại bỏ phốt-pho hòa tan, cụ thể là:
- Tổng quan về tình hình chăn nuôi heo, cá tra ở ĐBSCL và
tác động chất thải chứa phốt-pho đến chất lượng nước.
- Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về phân
lập, tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P.
- Tổng quan tình hình nghiên cứu cấu trúc quần thể vi khuẩn
tích lũy poly-P trong hệ thống xử lý nước thải và ao-hồ tự nhiên.
- Tổng quan về cơ chế trao đổi chất của vi khuẩn tích lũy poly-
P và sự điều hòa. Các phương pháp định tính và định lượng poly-P.
- Cơ sở khoa học phân tích sự đa dạng di truyền của vi khuẩn
tích lũy poly-P dựa trên gen 16S rRNA và gen poly-P kinase 1.
- Các biện pháp xử lý phốt-pho hòa tan bằng con đường hóa
học và sinh học.
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Nguyên liệu
Mẫu chất thải chăn nuôi heo sau biogas và ao nuôi thâm canh
cá tra ở 13 tỉnh ĐBSCL.
Môi trường phân lập: acetate (5 g/L), glucose (0,5 g/L),

succinate (0,5 g/L), NH
4
Cl (0,02 g/L), KH
2
PO
4
(0,088 g/L), pepton
(0,5 g/L), MgSO
4
.7H
2
O (0,01 g/L), CaCl
2
(0,005 g/L), agar (20 g/L).
Khoáng vi lượng (0,5 mL/L) (Smolders et al., 1994).
Môi trường cấy chuyền: NH
4
Cl (0,02 g/L), KH
2
PO
4
(0,088
g/L), pepton (0,5 g/L), MgSO
4
.7H
2
O (0,01 g/L), CaCl
2
(0,005 g/L),
agar (20 g/L). Khoáng vi lượng (0,5 mL/L) (Smolders et al., 1994).

Môi trường nuôi vi khuẩn tích lũy poly-P (Sidat et al., 1999)
Môi trường tổng hợp kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate (Filipe
et al., 2001)
3.2. Phƣơng pháp


4

3.2.1 Phân lập
Mẫu nước và bùn khi đem về phòng thí nghiệm được trộn đều
theo tỉ lệ (1 g bùn+50 mL nước mẫu) lắc đều để tạo huyền phù mẫu.
Huyền phù mẫu được tiến hành pha loãng ở nhiều nồng độ khác
nhau (theo tỷ lệ 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
).
Dùng micropipet hút 50 µL dịch huyền phù đã pha loãng nhỏ
và trải đều lên bề mặt agar đĩa petri chứa môi trường phân lập. Mẫu
được ủ ở 30
o
C trong tủ ủ vi sinh vật (Incucell 55-Đức) 1 tuần để vi
khuẩn phát triển thành khuẩn lạc. Các khuẩn lạc có hình thái khác
nhau trên môi trường phân lập sẽ được cấy chuyền sang môi trường
thiếu nguồn carbon (môi trường cấy chuyền). Thao tác trên được lặp
đi lặp lại và luân phiên giữa 2 môi trường phân lập và cấy chuyền

cho đến khi khuẩn lạc rời, đồng nhất và đều nhau. Chọn một khuẩn
lạc riêng biệt cấy chuyền vào môi trường phân lập trong ống thạch
nghiêng ủ 30
0
C, 4 ngày sau đó trữ trong ủ lạnh (10
0
C) để kiểm tra độ
ròng dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần).
3.2.2 Định tính và định lƣợng poly-P nội bào
3.2.2.1 Định tính
Quan sát sự hiện diện hạt poly-P nội bào thông qua chụp TEM.
Dịch huyền phù tế bào được xử l‎ý theo Boswell et al., (2001). Mẫu
được xem dưới kính hiển vi điện tử (JEOL 1400-Nhật) ở điện thế gia
tốc 100 kV tại trường Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh.
3.2.2.2 Định lƣợng
Xác định hàm lượng poly-P theo Eixler et al., (2005) và
Buzoleva et al., (2006).
3.2.3 Nhận diện gen poly-phosphate kinase 1
Cặp mồi 5’-GACGAAGAAGCGGTCAAG-3’, 5’-AACGGTCA
TCTTGATGGC-3’; 5’- AGTTCAATCTCACCGAGAGC-3’,5’-GGAA
CTTCAGGTCGTTGC-3’; 5’-GATACCCAGTTCCTGCTCG-3’, 5’-
CGGCACGAACTTCAGATCG - 3’ và 5’- TCACCACCGACGGCAA
GAC-3’, 5‘-CCGGCATGACTTCGCGGAAG-3’ được sử dụng
khuếch đại gen ppk 1. Phản ứng PCR thực hiện theo He et al.,
(2007).
3.2.4 Định danh vi khuẩn tích lũy poly-P
Ly trích DNA thực hiện theo Carr et al., (2001). Cặp mồi 27F
và 1492R (Lane et al., 1991) được sử dụng khuếch đại 16S rRNA.
Phản ứng PCR thực hiện theo Ivanov et al., (2005). Sản phẩm PCR
được tinh sạch với bộ kít Qiagen PCR. Trình tự 16S rRNA được xác

5

định thông qua phản ứng dideoxy chain termination chemistry dưới
máy giải trình tự động ABI 310A (Applied Biosystems, USA).
Sử dụng BLASTN để tìm sự tương đồng giữa trình 16S rRNA
các dòng vi khuẩn phân lập với trình tự 16S rRNA trên ngân hàng
gien. Tất cả các trình tự 16S rRNA của các dòng vi khuẩn phân lập
cũng như các trình tự 16S rRNA thu nhận từ GenBank sẽ được so
sánh cặp với nhau (multi-aligned) bằng CLUSTALW 1.6. Cây phát
sinh loài được xây dựng dựa trên sự khoảng cách tiến hóa bằng phần
mềm phân tích MEGA5 (Tamura et al., 2011). Định danh loài vi
khuẩn phân lập dựa trên loài gần nhất trên cây phát sinh loài. Phân
loại và xếp lớp vi khuẩn dựa trên Bergey’s Manual of determinative
Bacteriology, 2nd edition (New York: Springer) (Garrity, 2005).
3.2.5 Phân tích sự đa dạng di truyền
3.2.5.1 Phân tích sự đa dạng nucleotide
Đa dạng nucleotide được đánh giá thông qua nhiều chỉ số khác
nhau như trung bình sự khác biệt nucleotide và tổng số các vị trí
khác biệt, đa dạng nucleotide (Pi, ). Haplotype và sự đa dạng
haplotype.
Trung bình sự khác biệt nucleotide (k) trong các chuỗi trình tự
được tính theo công thức (Tajima, 1993).

Kij là số nucleotide khác biệt giữa 2 trình tự i và j, n số trình
tự DNA trong quần thể và = n(n-1)/2 là tổng số trình tự DNA được
so sánh.
Trị số trung bình và sự biến thiên số k trong n chuỗi trình tự
DNA được tính theo công thức:

, trong đó m là chiều dài đoạn trình tự DNA
Trị số trung bình và sự biến thiên số SNP trong n trình tự
DNA được tính theo công thức Hall (1999).

Trong đó S là số SNPs, n số trình tự DNA trong quần thể và m
là chiều dài DNA (bp).
n
2


6

Kiểm định sự chênh lệch giữa chỉ số Theta () và Pi (Tajima,
1993) theo công thức:

Trong nghiên cứu này, các chỉ số k, , Pi (Watterson, 1975;
Tajima, 1993; Hall,1999) và haplotype được xác định bằng phần
mềm DNASP 5.10 (Rozas et al., 2003).
3.2.5.2 Phân tích sự đa dạng loài
Chỉ số đa dạng sinh học loài H′ (Shannon and Weiner’s index,
1963) được tính theo công thức (Richard, 2005).
s
H
′
= - ∑ P
i
* ln(P
i
), trong đó:
i=1

P
i
: tần số xuất hiện của loài thứ i, S: tổng số loài
Phân tích định lượng các chỉ số đa dạng loài và độ đồng đều
bằng phần mềm Biodiversity Pro. (Neil McAleece et al., 1997).
3.2.6 Các thí nghiệm ứng dụng vi khuẩn tích lũy poly-P xử
lý phosphate trong nƣớc ao nuôi cá tra










Sơ đồ tóm tắt các bƣớc ứng dụng vi khuẩn xử lý phosphate trong
nƣớc ao nuôi cá tra
3.2.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu được được xử ý sơ bộ trên Excel và phân tích
thống kê bằng Minitab 16.
Kiểm tra khả năng loại bỏ phosphate hòa tan trong Filipe et al., 2001
Kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate hòa tan trong nước ao nuôi cá tra
(qui mô 10 lít)
Kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate hòa tan trong nước ao nuôi cá tra
(qui mô 500 lít)
Đánh giá hiệu quả xử l‎ý của 2 dòng vi khuẩn
trong mô hình nuôi cá tra trong bể

7

CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của vi khuẩn
4.1.1 Kết quả phân lập
Kết quả phân lập được 439 dòng vi khuẩn từ 261 mẫu chất thải
chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra thuộc 13 tỉnh ĐBSCL. Kết quả kiểm
tra hàm lượng poly-P nội bào có 391/439 dòng vi khuẩn phân lập có
khả năng tích lũy poly-P với hàm lượng từ 0-19,5 mg/L (chiếm
89,1%). Chỉ có 48/439 dòng vi khuẩn phân lập có hàm lượng poly-P
tích lũy nội bào từ 19,6-149,5 mg/L (trong đó có 29/439 dòng tích
lũy từ 19,6-50 mg/L, 14/439 dòng có hàm lượng từ 50-100 mg/L và
5 dòng tích lũy từ 100-149,5 mg/L). Các dòng này được tuyển chọn
cho nghiên cứu về các đặc tính sinh học của vi khuẩn tích lũy poly-P.
4.1.2 Đặc điểm sinh học các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P
Kết quả nhuộm Gram cho thấy đa số vi khuẩn tích lũy poly-P
có dạng Gram dương (37/48 dòng chiếm 77,1%), còn lại Gram âm
(5/48 dòng chiếm 22,9%).
Hình dạng tế bào các dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-
P có dạng que với nhiều trạng thái khác nhau như que chuyển động
có kích thước từ 0,3-1,3 m; que thẳng hoặc hơi cong chuyển động
có kích thước từ 0,6-1,3 m; que ngắn có kích thước từ 0,4-0,9 m
chuyển động; que thẳng hoặc hơi cong không chuyển động; que đơn
hoặc dính cặp (Hình 4.3).

Hình 4.3: Hình dạng
và kích thước các
dòng vi khuẩn phân
lập

Ghi chú: Ảnh chụp
SEM ngày 2/5/2012
tại phòng thí nghiệm
chuyên sâu-Trường
Đại học Cần Thơ. (a)
dòng CTT002L
(x10,000), (b) dòng
BTT003L (x15,000),
(c) dòng LAH002L
(x15,000) và (d) dòng
CTH008L (x15,000)


8

Khuẩn lạc vi khuẩn có nhiều màu sắc khác nhau. Khuẩn lạc
thường có dạng trắng nhạt, trắng đục, trắng sữa hoặc trắng xám. Một
vài khuẩn lạc có sắc tố bắt màu vàng sáng, rìa sáng giữa hồng cam,
cam sáng, vàng nhạt. Chi tiết màu sắc khuẩn lạc của vi khuẩn phân
lập được trong minh họa Hình 4.4 và Hình 4.5).

Hình 4.4: Khuẩn lạc một số dòng vi
khuẩn tích lũy poly-P phân lập trong
chất thải ao nuôi cá tra

Hình 4.5: Khuẩn lạc một số dòng vi
khuẩn tích lũy poly-P phân lập trong
chất thải chăn nuôi heo
Hình dạng khuẩn lạc các dòng
đa số có dạng tròn, lồi hoặc nhẵn

với kích thước khác nhau. Bìa
khuẩn lạc có dạng nguyên đều
hoặc không đều. Một số khuẩn lạc
có bề mặt nhày hoặc ẩm ướt. Chi
tiết hình dạng khuẩn lạc của 22
dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải
ao nuôi cá tra và 26 từ chất thải
chăn nuôi heo được minh họa
trong Hình 4.4 và Hình 4.5.
Để nghiên cứu mối liên quan giữa các đặc điểm về hình dạng
và cấu trúc các hạt poly-P nội bào, các dòng vi khuẩn được xác định
thông qua chụp TEM. Chụp TEM được thực hiện theo Boswell et al.


9

(2001). Mẫu được xem dưới kính hiển vi điện tử (JEOL 1400-Nhật)
tại trường Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh.


Hình 4.7: Hình dạng và cấu trúc
bên trong các dòng vi khuẩn phân
lập trong chất thải chăn nuôi heo
Ghi chú: Ảnh chụp TEM. (E)
AGH006L (x10,000), (F) CMH002L
(X10,000), (G1+G2) CMH012L
X10,000) và (H1) BTH014L
(X30,000), (H2) BTH014L (X40,000)
Các dòng vi khuẩn khác
nhau thể hiện sự khác biệt nhau

về kích thước và số lượng các
hạt poly-P. Kết quả chụp TEM
trình bày Hình 4.6 và Hình 4.7.
Hình 4.6: Hình dạng và cấu trúc bên
trong các dòng vi khuẩn phân lập
trong chất thải ao nuôi cá tra
Ghi chú: Ảnh chụp TEM: (A1) tế bào
dạng que dòng TVT003L (x5000), (A2)
que, thẳng dòng TVT003L (x10,000),
(B1, B2) tế bào dạng que dòng
TGT018L (x20,000, 10,000), (C1, C2)
tế bào dạng que ngắn dòng TGT013L
(x10,000), (D1, D2) tế bào dạng que hơi
cong dòng TGT025L [(D1) (x20,000)],
[(D2) (x50,000)]


10

Dòng TVT003L [(Hình 4.6 (A1), CMH012L (Hình 4.7 (F),
TGT025L (Hình 4.6) và dòng AGH006L (Hình 4.7 (E)] có hạt poly-
P nhỏ li ti hiện diện và phân bố đều khắp trong tế bào. Các dòng
khác nhau cho thấy sự khác nhau về kích thước. Dòng BTT003L và
BTH014L chỉ quan sát thấy có các hạt màu đen ở trung tâm tế bào
[Hình 4.6 (B1, B2) và Hình 4.7 (H2)]. Trong khi dòng TGT013L và
CMH012L có các vùng sậm màu phân bố đều trong tế bào xen kẽ là
các thể vùi trong suốt [Hình 4.6 (C1, C2) và Hình 4.7 (G1)] và vi
khuẩn đang trong giai đoạn phân chia tế bào [Hình 4.7 (G2)]. Dòng
TGT025L cho thấy mối tương quan giữa đặc điểm hình thái và cấu
trúc bên trong tế bào. Tế bào dòng TGT025L có dạng que hơi cong

[Hình 4.6 (D1)], bên trong có sự hiện diện các hạt sậm màu đen. Các
hình này cũng thể hiện sự tương quan giữa hàm lượng poly-P (Bảng
4.7) được xác định thông qua phương pháp định lượng bằng phương
pháp ly trích của Eixler et al., (2005) và số lượng, kích thước hạt
poly-P thông qua chụp TEM theo phương pháp của Boswell et al.
(2001). Bên cạnh đó, dưới kính hiển vi điện tử truyền quét cho thấy
các hạt poly-P hiện diện ở các vị trí khác nhau trong tế bào tuỳ thuộc
vào từng dòng vi khuẩn.
Phương pháp định tính theo Boswell et al. (2001) cho thấy
được kích thước và sự hiện diện các hạt poly-P nội bào. Tuy nhiên,
phương pháp này không xác định được hàm lượng poly-P nội bào.
Chính vì thế, việc kết hợp giữa định tính và định lượng sẽ xác định
cụ thể khả năng và hàm lượng poly-P nội bào của các dòng vi khuẩn
phân lập. Hạt poly-P nội bào của 48 dòng vi khuẩn phân lập được ly
trích thông qua phương pháp của Eixler et al., ( 2005) và Buzoleva et
al., (2006), kết quả được trình bày trong Bảng 4.7 và 4.8.
Bảng 4.7 cho thấy 22 dòng vi khuẩn phân lập được trong chất
thải ao nuôi cá tra có tiềm năng tích poly-P cao. Khả năng tích lũy có
sự khác biệt lớn, dao động từ 19,6-148,1 mg/L. Bên cạnh đó, mật số
của các dòng này khác nhau khi nhân sinh khối (dao động từ 10
7
đến
10
9
CFU/mL). Do đó hàm lượng poly-P nội bào tuỳ thuộc vào mật số
vi khuẩn trong dịch nuôi, khả năng hấp thu phosphate và đồng hoá
chúng thành poly-P. Khả năng tích lũy poly-P nội bào của từng dòng
dao động từ 2,90x10
-12
mg/tế bào (dòng DTT021L) đến 4,36x10

-9

mg/tế bào (dòng CTT004L).




11

Bảng 4.7: Hàm lượng poly-P nội bào các dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải ao
nuôi cá tra
Tên dòng vi
khuẩn phân lập
Hàm lượng
poly-P (mg/L)
Mật số
(CFU/mL)
Hàm lượng poly-P
(mg/tế bào)
AGT004L
31,1
2,03x10
9
1,53x10
-11
AGT005L
25,8
8,67x10
7
2,98x10

-10
BTT003L
39,1
1,43x10
9
2,73x10
-11
BTT006L
76,1
1,63x10
8
4,66x10
-10
CTT002L
53,1
1,50x10
8
3,54x10
-10
CTT004L
87,1
2,00x10
7
4,36x10
-9
DTT001L
36,5
1,50x10
9
2,43x10

-11
DTT021L
38,6
1,33x10
10
2,90x10
-12
DTT025L
24,9
2,55x10
7
9,76x10
-10
HGT005L
34,4
3,33x10
8
1,03x10
-10
HGT018L
39,1
8,50x10
7
4,60x10
-10
KGT004L
32,4
4,00x10
7
8,10x10

-10
KGT005L
73,4
1,70x10
9
4,32x10
-11
STT009L
28,9
8,67x10
8
3,33x10
-11
STT011L
32,4
1,33x10
8
2,43x10
-10
TGT013L
148,1
1,63x10
9
9,07x10
-11
TGT018L
25,5
8,50x10
7
3,00x10

-10
TGT025L
74,5
9,35x10
8
7,97x10
-11
TVT003L
144,2
8,67x10
8
1,66x10
-10
TVT005L
19,6
4,03x10
9
4,86x10
-12
VLT002L
92,3
2,03x10
9
4,55x10
-11
VLT003L
28,5
1,93x10
8
1,47x10

-10
Tương tự, kết quả kiểm tra hàm lượng poly-P nội bào của 26
dòng vi khuẩn phân lập được trong chất thải chăn nuôi heo (Bảng
4.8) có khả năng tích lũy poly-P từ 1,58x10
-12
mg/tế bào (dòng
VLT013L) đến 2,3x10
-9
mg/tế bào (dòng CTH020L).
So sánh khả năng hấp thu phosphate với các dòng trong
nghiên cứu của Sidat et al., (1999) như Acinetobacter calcoaceticus
(1,84x10
-10
mg/tế bào), Bacillus cereus (3,19x10
-11
mg/tế bào) và A.
calcoaceticus ATCC (3,43x10
-11
mg/tế bào) cho thấy rằng 48 dòng vi
khuẩn phân lập và tuyển chọn được xem là các vi khuẩn có khả năng
tích lũy poly-P với hàm lượng cao và là các đại diện của PAB hiện
diện trong chất thải ao nuôi cá tra và chăn nuôi heo ở ĐBSCL. Trong
đó, dòng CTT004L, CTH008L, CTH020L và TGH001L cho thấy có
khả năng tích lũy poly-P nội bào cao (10
-9
mg/tế bào) nhưng khả
năng tăng sinh khối thấp (10
7
CFU/mL).

12

Bảng 4.8: Hàm lượng poly-P nội bào các dòng vi khuẩn phân lập từ chất
thải chăn nuôi heo
Tên dòng vi
khuẩn phân lập
Hàm lượng poly-P
(mg/L)
Mật số
(CFU/mL)
Hàm lượng poly-P
(mg/tế bào)
AGH005L
22,7
1,70x10
9
1,34x10
-11
AGH006L
21,8
1,02x10
10
2,14x10
-12
BLH002L
92,1
1,11x10
8
8,33x10

-10
BLH006L
149,1
6,80x10
8
2,19x10
-10
BTH008L
30,5
1,53x10
8
1,99x10
-10
BTH014L
28,7
8,5x10
7
3,38x10
-10
CMH002L
44,3
1,62x10
8
2,74x10
-10
CMH012L
148,1
9,35x10
9
1,58x10

-11
CTH008L
149,5
8,50x10
7
1,76x10
-9
CTH015L
46,8
9,35x10
7
5,01x10
-10
CTH020L
97,9
4,25x10
7
2,30x10
-9
DTH004L
32,7
7,65x10
9
4,27x10
-12
DTH006L
44,7
1,62x10
9
2,77x10

-11
KGH007L
87,1
5,95x10
8
1,46x10
-10
KGH008L
35,4
8,50x10
9
4,16x10
-12
LAH002L
148,4
1,02x10
9
1,45x10
-10
LAH003L
92,3
1,11x10
8
8,35x10
-10
STH008L
30,2
6,80x10
8
4,44x10

-11
STH009L
28,9
1,53x10
8
1,89x10
-10
TGH001L
97,5
8,50x10
7
1,15x10
-9
TGH003L
53,5
1,62x10
8
3,31x10
-10
TGH021L
53,1
9,35x10
9
5,68x10
-12
TVH002L
30,4
4,25x10
7
7,15x10

-10
TVH003L
22,5
2,55x10
7
8,82x10
-10
VLH002L
25,8
7,65x10
9
3,37x10
-12
VLH013L
25,5
1,62x10
10
1,58x10
-12
Dòng tham khảo
PO
4
3-
hấp thu
(mg/L)
Mật số
(CFU/mL)
PO
4
3-

hấp thu
(mg/tế bào)
Acinetobacter
calcoaceticus
18,4
1,00x10
8
1,84x10
-10
Bacillus cereus
13,7
4,30x10
8
3,19x10
-11
ATCC
20,6
6,00x10
8
3,43x10
-11
Ghi chú: Acinetobacter calcoaceticus, Bacillus cereus và ATCC (Acinetobacter
calcoaceticus var. Iwoffi, ATCC No. 23055) (Sidat et al., 1999).
4.2 Định danh và phân tích sự đa dạng của PAB
4.2.1 Nhận diện gen 16S rRNA và gen ppk 1


13

Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA (Ivanov et al., 2005) bằng sử

dụng cặp mồi tổng 27F và 1492R (Lane et al., 1991) để nhận diện vi
khuẩn. Các dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P cao được sử
dụng để nhận diện gen tích lũy poly-P. Phổ điện di sản phẩm PCR
được nhân lên từ gen 16S rRNA và gen pkk 1 của 48 dòng vi khuẩn
tích lũy poly-P được trình bày ở các Hình 4.12 và 4.14.

Hình 4.12: Phổ điện di (5) sản phẩm PCR
(a) của gen 16S rRNA (b) gen PPK1 trên
gel agarose 1,2 % của 5 dòng vi khuẩn
tích lũy poly-P [(3) TGT025L, (4)
BTT006L, (5) TGT013L, (6) AGH006L
và (7) VLH013L] có băng tương ứng ở vị
trí 1,500 bp và gen ppk 1 hai dòng (10)
TGT013L và (11) TGT025L có băng
tương ứng vị trí 105 bp so với thang
chuẩn DNA 100 bp ladder marker (1); (2,
9) đối chứng âm

Hình 4.14: Phổ điện di sản phẩm
PCR của gen PPK1 trên gel
agarose 1,2 % của 5 dòng vi
khuẩn tích lũy poly-P [(3)
STT011L, (4) BTT003L, (5)
CTH010L, (6) DTT021L và (7)
VLH002L) có băng tương ứng ở
vị trí 207 bp so với thanh chuẩn
DNA 100 bp ladder marker (L);
(1) đối chứng âm.
Sản phẩm PCR gen 16S rRNA của 48 dòng vi khuẩn tích lũy
poly-P, sau khi kiểm tra bằng kỹ thuật điện di được gửi giải trình tự

bằng mồi xuôi tại công ty Macrogen (Hàn Quốc).
4.2.2 Định danh và phân tích sự phát sinh loài của PAB
phân lập trong chất thải chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra
Định danh loài dựa trên trình tự 16S rRNA của các dòng vi
khuẩn được có độ tương đồng cao (>97%) với trình tự 16S rRNA
trên ngân hàng gen NCBI cho thấy 22 dòng vi khuẩn phân lập trong
chất thải ao nuôi cá tra chia thành 4 nhóm chiếm tỉ lệ phần trăm như
sau: Gram dương với hàm lượng G+C thấp thuộc lớp Bacilli (12
dòng; 54,6%), Gram dương với hàm lượng G+C cao thuộc lớp
Actinobacteria (5 dòng; 22,7%), Gram âm thuộc lớp Gamma-
proteobacteria (3 dòng; 13,6%) và Beta-proteobacteria (2 dòng;
9,1%) (Bảng 4.9) và 26 dòng vi khuẩn phân lập được trong chất thải
chăn nuôi heo nằm trong 4 lớp (Bảng 4.10): Bacilli (15 dòng;


14

57,7%), Actinobacteria (4 dòng; 19,2%), Gamma-proteobacteria (1
dòng; 3,9%) và Alpha-proteobacteria (5 dòng; 19,2%). Giống
Bacillus trong lớp Bacilli luôn chiếm tỉ lệ cao về số lượng trong cả 2
địa điểm lấy mẫu.
Bảng 4.9: Kết quả định tên các dòng vi khuẩn phân lập trong chất thải ao
nuôi cá tra có khả năng tích lũy poly-P cao theo trình tự gen 16S rRNA
Nhóm xếp
loại các dòng
Loài có quan hệ gần gũi
Tỉ lệ tương
đồng (%)
Chiều dài
(bp)

Bacilli
Bacillaceae
DTT021L
Bacillus megaterium (JQ229803)
99
1249
DTT001L
Bacillus megaterium (JQ229803)
99
1227
BTT003L
Bacillus megaterium (DQ365564)
97
923
AGT005L
Bacillus megaterium (FJ976535)
99
1274
STT009L
Bacillus megaterium (FJ976535)
98
1304
VLT003L
Bacillus aryabhattai (HQ908708)
98
1344
STT011L
Bacillus aryabhattai (JN084155)
99
1248

BTT006L
Bacillus aryabhattai (HQ242767)
98
1352
AGT004L
Bacillus sp. (HQ024491)
99
1202
CTT002L
Bacillus sp. (DQ275185)
98
1345
TVT005L
Bacillus ginsengihumi (FJ357590)
98
1275
Planococcaceae
TGT025L
Kurthia sp. (JQ398850)
99
1114
Actinobacteria
Micrococcaceae
HGT005L
Arthrobacter sp. (AB638330)
98
1150
KGT004L
Arthrobacter sp. (EU571174)
99

1226
VLT002L
Arthrobacter protophormiae (AB210984)
98
1366
Mycobacteriaceae
TGT018L
Mycobacterium phocaicum (EF551407)
98
1053
Gordoniaceae
HGT018L
Gordonia polyisoprenivorans (DQ154925)
98
1155
Gamma-proteobacteria
Moraxellaceae
TGT013L
Acinetobacter radioresistens (GU145275)
99
1277
CTT004L
Acinetobacter sp. (AJ633641)
98
1268
Xanthomonadaceae
KGT005L
Stenotrophomonas maltophilia (AJ295671)
99
784

Beta-proteobacteria
Burkholderiaceae
TVT003L
Burkholderia vietnamiensis (JF922108)
98
1182
DTT025L
Cupriavidus sp. (AB266608)
99
1148


15

Bảng 4.10: Kết quả định tên các dòng vi khuẩn phân lập trong chất thải trại
chăn nuôi heo có khả năng tích lũy poly-P cao theo trình tự gen 16S rRNA
Nhóm xếp loại
các dòng
Loài có quan hệ gần gũi
Tỉ lệ tương
đồng (%)
Chiều dài
(bp)
Bacilli
Bacillaceae
AGH005L
Bacillus aryabhattai (HQ908708)
99
1096
DTH006L

Bacillus aryabhattai (HQ908708)
99
1017
DTH004L
Bacillus aryabhattai (JN084155)
99
1254
STH008L
Bacillus aryabhattai (JN084155)
99
1273
KGH007L
Bacillus aryabhattai (JN128236)
99
1315
VLH002L
Bacillus barbaricus (JN700207)
99
845
TGH003L
Bacillus cereus (JN676164)
99
1250
TVH003L
Bacillus cereus (JX544748)
99
1119
BTH014L
Bacillus megaterium (GU257960)
99

1181
KGH008L
Bacillus megaterium (JQ229803)
97
1170
CMH002L
Bacillus megaterium (JQ996420)
99
1139
BLH002L
Bacillus sp. (AB733531)
99
1181
LAH003L
Bacillus sp. (AB733531)
98
1345
TGH021L
Bacillus sp. (AB733531)
98
1410
VLH013L
Bacillus subtilis (HQ647257)
98
1172
Actinobacteria
Nocardiaceae
BLH006L
Rhodococcus sp. (EU912458)
97

1363
CTH008L
Rhodococcus sp. (HM004214)
99
1384
CTH015L
Rhodococcus sp. (GU357742)
98
1151
LAH002L
Rhodococcus pyridinivorans (JQ229777)
98
1243
Corynebacteriaceae
AGH006L
Corynebacterium sp. (JX290304)
98
1069
Gamma-proteobacteria
Moraxellaceae
CMH012L
Acinetobacter sp. (AJ633641)
98
1269
Alpha-proteobacteria
Hyphomicrobiaceae
BTH008L
Xanthobacter flavus (AB680656)
99
1130

TVH002L
Xanthobacter sp. (HQ235023)
98
1041
Rhizobiaceae
STH009L
Agrobacterium tumefaciens (JX110605)
98
1248
Brucellaceae
CTH020L
Ochrobactrum tritici (AM490636)
97
1099
TGH001L
Ochrobactrum tritici (AM490636)
98
1324


16

Qua tiến trình phân lập, tuyển chọn và mô tả các đặc tính sinh
học của các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P trong chất thải trại chăn
nuôi heo và ao nuôi cá tra; kết quả nghiên cứu đã tạo ra được nguồn
vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P cao bao gồm 48 dòng với các
đặc tính chủ yếu như: chúng có dạng hình que dài hoặc que ngắn;
chuyển động, dao động tại chổ hoặc không chuyển động; có sự hiện
diện các hạt poly-P bắt màu đen khi quan sát tế bào dưới kính hiển vi
điện tử truyền quét; sự tích lũy poly-P là hoạt động của gen ppk1 chủ

yếu thuộc hai dạng là IIA và IIC; khả năng tích lũy poly-P nội bào
với hàm lượng từ 10
-9
đến 10
-12
mg/tế bào. Thành phần giống loài rất
đa dạng thuộc nhiều lớp vi khuẩn khác nhau như Bacilli,
Actinobacteria, Gramma-proteobacteria, Beta-proteobacteria, Alpha-
proteobacteria. Bên cạnh đó, thành phần và số lượng loài vi khuẩn
tích lũy poly-P cao có sự khác nhau giữa địa điểm thu mẫu là chất
thải trại chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra.
4.2.3 Phân tích sự đa dạng di truyền PAB
Đánh giá sự đa dạng di truyền thông qua phân tích các chỉ số
đa dạng nucleotide và chỉ số đa dạng loài Shannon. Việc sử dụng các
trình tự gen 16S rRNA để nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và là
dấu hiệu (marker) di truyền được sử dụng rộng rãi nhất (Janda và
Abbott, 2007). Phân tích tính đa hình và sự đa dạng nucleotide trên
vùng gen 16S rRNA bằng phần mềm DNASP 5.10 (Rozas et al.,
2003) kết hợp với chương trình BioEdit (Hall, 1999) kết quả được
trình bày trong Bảng 4.11.
Bảng 4.11: Đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA 48 dòng vi khuẩn
Chỉ số
Giá trị
Số trình tự 16S rRNA
48
Đoạn nucleotide phân tích
1-988
Số vị trí nucleotide bắt cặp
716
Số vị trí đa hình nucleotide và tỉ lệ (%) so với chiều dài DNA

364 (50,8%)
Số Haplotype (h)
25
Đa dạng (gen) Haplotype (Hd)
0,90
Trung bình sự khác biệt nucleotide (k)
116,60
Số vị trí nucleotide khác biệt (số SNPs)
82,02
Pi (π)
0,16
Theta ()
0,11
Tajima’s D
-0,41


17

Kết quả từ Bảng 4.11 cho thấy số vị trí đa hình/chiều dài trình
tự gen 16S rRNA là 364/716 (chiếm 50,8%). Số vị trí đa hình khác
biệt (SNPs) trong quần thể là 82,02 với chỉ số đa hình trung bình
=0,11 và có sự biến thiên tương đối cao ở đoạn trình tự từ vị trí 100
đến 816 (Hình 4.20). Đoạn nucleotide từ vị trí 112 đến 236 có tính đa
hình cao nhất =0,17 và đoạn từ vị trí 277 đến 377 có tính đa hình
thấp nhất =0,06.

Hình 4.20 Sự biến thiên chỉ số  Hình 4.23: Sự biến thiên chỉ số Pi
vùng nucleotide từ có vị trí 100 vùng nucleotide có vị trí từ 100
đến 816 trên trình tự 16S rRNA đến 816 trên trình tự 16S rRNA

của 48 dòng vi khuẩn của 48 dòng vi khuẩn
Sự biến thiên dấu SNP dẫn đến sự biến đổi chỉ số đa dạng Pi
(Hình 2.23). Bảng 4.11 cho thấy trung bình sự khác biệt nucleotide,
k=116,60 với chỉ số đa dạng trung bình Pi=0,16 và có sự biến động
lớn từ vị trí 100 đến 816 (Hình 4.23). Đoạn có đa dạng nucleotide
cao nhất Pi=0,3 nằm trong khoảng từ 112 đến 236 và đoạn có đa
dạng nucleotide thấp nhất Pi=0,07 nằm trong khoảng 277 đến 377.
Kết quả kiểm định Tajima’s D có chỉ số D= - 0,41. Điều này
cho thấy cấu trúc quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P trong chất thải
chăn nuôi heo và ao nuôi cá tra ở khu vực ĐBSCL có sự phong phú
về loài nhưng mức độ tương đồng của gen ở một số loài thì cao và
tần số xuất hiện các đột biến nucleotide mới giữa các gen trong quần
thể thấp.
Dựa trên kiểu nhóm dấu SNPs để xác định các dạng haplotype
bằng phần mềm DNASP 5.10 (Rozas et al., 2003). Kết quả phân tích
có tổng cộng 25 haplotype khác nhau được tạo ra từ 48 trình tự
nucleotide. Phân tích sự đa dạng của 25 dạng haplotype được tạo ra
từ 48 trình tự DNA cho thấy chúng có sự đa dạng cao (Hd=0,9, Bảng
816
100
Vị trí
đa hình cao
(a)
816
100
Vị trí
đa dạng cao
(b)

18

4.11). Điều này cho thấy quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P ở ĐBSCL
có sự đa dạng haplotype (đa dạng gen) cao.
Bảng 4.12: Đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA
Chỉ số
Giá trị
Ao nuôi cá tra
Trại chăn nuôi heo
Số trình tự 16S rRNA
22
26
Đoạn nucleotide phân tích
1-919
1-981
Số vị trí nucleotide bắt cặp
766
729
Số vị trí đa hình nucleotide và tỉ lệ (%)
so với chiều dài DNA
387 (50,5%)
308 (42,2%)
Số Haplotype (h)
16
14
Đa dạng (gen) Haplotype (Hd)
0,91
0,91
Trung bình sự khác biệt nucleotide (k)
139,20

115,48
Số vị trí nucleotide khác biệt (số SNPs)
106,16
80,71
Pi (π)
0,18
0,16
Theta ()
0,14
0,11
Tajima’s D
- 0,59
- 0,02
So sánh tính đa hình và sự đa dạng nucleotide của gen 16S
rRNA giữa 2 nhóm vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập ở hai địa điểm
lấy mẫu, kết quả trình bày trong Bảng 4.12.
Ao nuôi cá tra
Trại chăn nuôi heo
22 trình tự gen 16S rRNA có số
vị trí đa hình/chiều dài trình tự
gen là 387/766 (chiếm 50,5%).

Hình 4.27: Sự biến thiên chỉ số 
trong vùng có vị trí từ 100 đến 866
Hình 4.27 cho thấy trị số trung
bình =0,14 và có sự biến thiên
tương đối cao ở đoạn trình tự từ
vị trí 100 đến 866. Đoạn
nucleotide từ 119 đến 229 có
26 trình tự gen 16S rRNA có số

vị trí đa hình/chiều dài trình tự
gen là 308/729 (chiếm 42,2%).

Hình 4.28: Sự biến thiên chỉ số 
trong vùng có vị trí từ 100 đến 829
Hình 4.28 cho thấy trị số trung
bình =0,11 và có sự biến thiên
tương đối cao ở đoạn trình tự từ
vị trí 100 đến 829. Đoạn
nucleotide từ 108 đến 230 có tính
829
100
Vị trí
đa hình cao
866
100
Vị trí
đa hình cao


19

tính đa hình cao nhất =0,33 và
đoạn 270 đến 369 có tính đa hình
thấp nhất =0,084.
Bảng 4.12 cho thấy trung bình sự
khác biệt nucleotide, k=139,20
với chỉ số Pi=0,18 và có sự biến
động lớn trong chuổi trình tự từ
vị trí 100 đến 866 (Hình 4.29).

Đoạn có đa dạng nucleotide cao
nhất Pi=0,32 nằm trong khoảng
từ 119 đến 229 và đoạn có đa
dạng nucleotide thấp nhất
Pi=0,08 nằm trong khoảng 270
đến 369.

Hình 4.29: Sự biến thiên chỉ số Pi
trong vùng có vị trí từ 100 đế 866
Kết quả phân tích có tổng cộng
16 haplotype khác nhau được tạo
ra từ 22 trình tự nucleotide. Phân
tích sự đa dạng của 16 dạng
haplotype cho thấy chúng có sự
đa hình và đa dạng cao
[Hd=0,91. Điều này cho thấy
quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P
phân lập từ chất thải ao nuôi cá
tra có sự đa dạng haplotype (đa
dạng gen) cao.
đa hình cao nhất =0,28 và đoạn
271 đến 371 có tính đa hình thấp
nhất =0,072.
Trung bình sự khác biệt k=115,48
với chỉ số Pi=0,16 và có sự biến
động lớn trong chuổi trình tự từ vị
trí 100 đến 829 (Hình 4.30). Đoạn
có đa dạng nucleotide cao nhất
Pi=0,28 nằm trong khoảng từ 108
đến 230 và đoạn có đa dạng

nucleotide thấp nhất Pi=0,07 nằm
trong khoảng 271 đến 371.

Hình 4.30: Sự biến thiên chỉ số Pi
trong vùng có vị trí từ 100 đến 829
Kết quả phân tích có tổng cộng
14 haplotype khác nhau được tạo
ra từ 26 trình tự nucleotide. Phân
tích sự đa dạng của 14 dạng
haplotype cho thấy chúng có sự
đa hình và đa dạng cao [Hd=0,91.
Điều này cho thấy quần thể vi
khuẩn tích lũy poly-P phân lập từ
chất thải chăn nuôi heo có sự đa
dạng nucleotide và đa dạng
haplotype thấp và tính bảo tồn
gen cao hơn nhóm vi khuẩn phân
lập từ chất thải ao nuôi cá tra.
866
100
Vị trí đa
dạng cao
829
100
Vị trí đa
dạng cao


20

So sánh tính đa dạng loài giữa hai quần thể vi khuẩn tích lũy
poly-P được phân lập từ hai địa điểm thu mẫu là chất thải chăn nuôi
heo và ao nuôi cá tra (Bảng 4.13) cho thấy tổng số dòng vi khuẩn
phân lập có khả năng tích lũy poly-P cao thì khác nhau ở hai địa
điểm lấy mẫu nhưng chỉ số đa dạng (H
′
) giống nhau.
Bảng 4.13: Chỉ số H
′
và J
′
của 2 quần thể vi khuẩn tích lũy poly-P trong
nước ao nuôi cá tra và chất thải trại chăn nuôi heo
Địa điểm thu mẫu
Tổng số dòng vi khuẩn
H
′

J
′

Ao nuôi cá tra
22
1,07
0,933
Chất thải trại nuôi heo
26
1,07
0,928
Chỉ số đa dạng loài (H

′
) giữa hai quần thể vi khuẩn tích lũy
poly-P trong nước ao nuôi cá tra và chất thải trại chăn nuôi heo
tương đối cao [H
′
=1,07; (Bảng 4.13)]. Kết quả này có sự tương đồng
với nghiên cứu của He et al., (2007) khi nghiên cứu sự đa dạng vi
khuẩn tích lũy poly-P trong các hệ thống xử lý nước thải ở Hoa kỳ,
có chỉ số đa dạng loài Shannon H
′
dao động từ 0,2 đến 1,45 và chỉ số
độ đồng đều J
′
biến thiên từ 0,25 đến 0,95.
Nhìn chung, các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P phân lập được
thể hiện sự phong phú về loài và sự đa dạng gen tương đối cao nhưng
tần số xuất hiện các đột biến nucleotide mới trong cùng một loài
thấp. Bên cạnh đó, trình tự 16S rRNA của các vi khuẩn trích lũy
poly-P phân lập trong chất thải chăn nuôi heo có tính bảo trồn gen
cao hơn nhóm vi khuẩn trích lũy poly-P phân lập trong chất thải ao
nuôi cá tra.
4.3 Tuyển chọn và ứng dụng các dòng vi khuẩn xử lý
phosphate trong nƣớc ao nuôi cá tra
Thông qua quá trình tuyển chọn ban đầu từ 20 dòng vi khuẩn
phân lập, 5 dòng có khả năng làm giảm nhanh hàm lượng phosphate
với hiệu suất loại bỏ từ 55,3% tới 76,6% sau 36 giờ (Bảng 4.14)
chủng vi khuẩn bổ sung vào môi trường. Năm dòng vi khuẩn này
được sử dụng trong nghiên cứu khả năng loại bỏ phosphate trong
môi trường tổng hợp (môi trường Fillipe et al., 2001).
Chỉ số OD trong dịch huyền phù vi khuẩn được đo ở bước

sóng 600nm. Thông qua sự xác định mật số tế bào [CFU/mL-Hoben
và Somasegaran (1982)], phương trình tuyến tính giữa chỉ số OD.600
nm và mật số vi khuẩn (CFU) được thiết lập, làm cơ sở để tính toán
mật số vi khuẩn dựa trên chỉ số OD.600 nm [Hình 4.3 (f)].


21

Bảng 4.14: Hiệu suất loại bỏ phosphate trong môi trường của 6 dòng vi
khuẩn
Tên dòng
Hàm lượng PO
4
3-

ban đầu mg/L
Hàm lượng PO
4
3-
còn
lại 36 giờ (mg/L)
Hiệu suất bỏ (%)
TGT025L
19,8
4,6
76,6
VLH013L
19,1
8,2
57,3

TGT013L
19,7
5,6
71,3
AGH006L
20,3
9
55,8
BTT006L
20,7
9,2
55,3
DTT001L
20,5
13,6
33,5
Năm dòng vi khuẩn đều tăng sinh tốt trên môi trường Filipe et
al., (2001) và đạt mật số >10
8
sau 25 giờ nuôi cấy (Hình 4.33)






Hình 4.33: Sự biến đổi hàm lượng PO
4
3-
và chỉ số OD.600 nm

Ghi chú: (a) dòng TGT025L, (b) dòng AGH006L, (c) dòng TGT013L, (d)
dòng BTT006L, (e) dòng VLH013L và (f) trương quan giữa chỉ số OD.600
nm và mật số vi khuẩn dòng TGT025L
(f)


22

Trong 10 giờ đầu 3 dòng TGT013L, TGT025L và AGH006L
tăng sinh nhanh nhất (OD.600 nm>0,4; tương đương mật số>10
6
CFU/mL) và khác biệt (P<0,01) với 2 dòng BTT006L và VLH013L
(OD.60nm>0,2; tương đương mật số>10
4
CFU/mL). Sự tăng nhanh
sinh khối của 3 dòng TGT013L, TGT025L và AGH006L kéo theo
hàm lượng phosphate còn lại trong môi trường thấp (hàm lượng
PO
4
3-
<14 mg/L) và có sự khác biệt (P<0,001) với 2 dòng BTT006L
và VLH013L (hàm lượng PO
4
3-
>15 mg/L) [Hình 4.33 (a), (b), (c),
(d), (e)]. Sau 10 giờ TGT013L, TGT025L dòng đều có xu hướng tiếp
tục tăng sinh và đạt mật số tối đa [OD.600 nm>0,6; tương đương mật
số >10
8
CFU/mL) sau 25 giờ nuôi cấy.

Khi so sánh hiệu suất loại bỏ phosphate của từng dòng vi
khuẩn trong thí nghiệm, Hình 4.33 cho thấy 2 dòng TGT025L và
TGT013L có ái lực cao trong khả năng hấp thu PO
4
3-
dẫn đến hiệu
suất loại bỏ phosphate cao đạt 85,3% đối với dòng TGT025L và
76,6% đối với dòng TGT013L sau 25 giờ cấy bổ sung vi khuẩn, và
khác biệt có ý nghĩa thống kê (P<0,001) với dòng BTT006L (51%),
VLH013L (39,4%) và AGH006L (29,4%). Hai dòng vi khuẩn
Acinetobacter radioresistens TGT013L và Kurthia sp. TGT025L
được chọn để ứng dụng xử lý phosphate trong nước ao nuôi cá tra.
Theo dõi sự biến đổi hàm lượng PO
4
3-
trong nước ao nuôi cá
tra theo thời gian khi ứng dụng từng dòng riêng rẽ hay có sự kết hợp
giữa 2 dòng vi khuẩn A. radioresistens TGT013L và Kurthia sp.
TGT025L ở qui mô 10 lít. Kết quả trình bày trong Hình 4.36

Hình 4.36: Hiệu suất loại bỏ phosphate của 2 dòng vi khuẩn sau 25 giờ
Ghi chú: Dòng vi khuẩn có cùng mẫu tự theo sau chỉ sự khác biệt không có ý nghĩa
thống kê ở mức 5% (phép thử Turkey, Minitab 16)


23

Hình 4.36 cho thấy hàm lượng PO
4
3-

có xu hướng giảm mạnh
theo thời gian giữa các nghiệm thức và có sự khác biệt (P<0,01) so
với đối chứng. Sau 36 giờ hàm lượng PO
4
3-
còn lại giữa các nghiệm
thức DC, TGT025L, TGT013L và TGT013L+TGT025L lần lượt là
11,6; 4,3; 3,7 và 2,1 mg/L và có sự khác biệt lớn giữa các nghiệm
thức (P<0,001) với hiệu suất loại bỏ lần lượt là 45,6; 75,6; 80,0 và
88,7%. Sự tương tác giữa 2 dòng vi khuẩn TGT013L và TGT025L
mang lại kết quả tốt hơn khi bổ sung từng dòng riêng rẽ. Tổ hợp 2 dòng
vi khuẩn này được sử dụng để xử lý nước ao nuôi cá tra qui mô 500 lít.
Theo dõi sự biến đổi hàm lượng PO
4
3-
theo thời gian giữa 2
nghiệm thức DC và thí nghiệm (TGT025L+TGT013L) trong nước ao
nuôi cá tra ở qui mô 500 lít. Kết quả Hình 4.37 cho thấy hàm lượng
PO
4
3-
có xu hướng biến đổi khác nhau giữa 2 nghiệm thức DC và thí
nghiệm. Ở nghiệm thức đối chứng có sự tăng nhẹ hàm lượng PO
4
3-
sau
24 giờ đầu, sau đó giảm nhẹ và duy trì hàm lượng ở khoảng 4,6 mg/L.
Ngược lại, ở nghiệm thức thí nghiệm hàm lượng PO
4
3-

giảm theo thời
gian. Hiệu suất loại bỏ phosphate trong môi trường ở nghiệm thức thí
nghiệm đạt 33,69% sau 24 giờ và 80,9% sau 36 giờ cấy bổ sung vi
khuẩn. Hàm lượng phosphate hòa tan còn lại trong môi trường thấp
(PO
4
3-
= 0,5 mg/L tương đương P=0,16 mg/L, đạt loại B1 QCVN08-
2008). Ở hàm lượng PO
4
3-
này sẽ hạn chế sự tăng trưởng và phát triển
mạnh mẽ của tảo, nguyên nhân gây ra sự phú dưỡng hóa và hạn chế
hàm lượng oxy hòa tan.

Hình 4.37: Biến đổi hàm lượng PO
4
3-
theo thời gian giữa 2 nghiệm thức
Khi ứng dụng tổ hợp 2 dòng vi khuẩn này trong mô hình nuôi
cá tra trong bể cho thấy hai dòng vi khuẩn TGT025L và TGT013L
có khả năng tồn tại, hoạt động cạnh tranh trong quá trình hấp thu
PO
4
3-
với các vi sinh vật hiện diện trong môi trường và không ảnh
hưởng đến sự tăng trưởng của cá tra khi nuôi trong bể.