giáo trình cấy mô Lê Lý Thùy Trâm

Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 1 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
BÀI 1:
M UỞĐẦ
 ^ ! ^ 
1.CÁC THI T B C B N C A M T PHÒNG THÍ NGHI M NUÔI C Y MÔ VÀ T Ế Ị Ơ Ả Ủ Ộ Ệ Ấ Ế
BÀO TH C V TỰ Ậ
a. Phòng r a và c t n cử ấ ướ
- Máy c t n c 1 l nấ ướ ầ
- Máy c t n c 2 l nấ ướ ầ
b. Phòng h p – s yấ ấ
- Autoclave
- T s y 60 – 200ủ ấ
o
C
c. Phòng chu n b môi tr ngẩ ị ườ
- Cân phân tích (chính xác n 0,0001 g)đế
- Cân k thu t (chính xác n 0,01 g)ỹ ậ đế
- pH kế
- Máy khu y tấ ừ
- T l nhủ ạ
- Lò vi sóng (microwave)
d. Phòng thao tác nuôi c yấ
- T c y vô trùng (laminar)ủ ấ
- Qu t thông gióạ
- èn t ngo i treo t ngĐ ử ạ ườ
e. Phòng nuôi cây
- Các giàn k có g n èn hu nh quangệ ắ đ ỳ
- Máy i u hòa nhi t đ ề ệ độ
- Máy l c n m ngangắ ằ
- T mủấ
f. Phòng thí nghi mệ :

(phòng này dùng ti n hành các phân tích sinh hóa, phân t và di truy n)để ế ử ề
- Kính hi n vi 2 m t ( phóng i 1000 l n)ể ắ độ đạ ầ
Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 1 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 2 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
- Kính lúp 2 m t ( phóng i 75 l n)ắ độ đạ ầ
- Microtome
- Máy nh k thu t sả ỹ ậ ố
- H th ng èn chi uệ ố đ ế
- Quang ph k …ổ ế
Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 2 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 3 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
2.CÁC NHÂN T M B O THÀNH CÔNG Ố ĐẢ Ả TRONG NUÔI C Y Ấ MÔ T BÀO TH CẾ Ự
V TẬ
Có 3 nhân t chính:ố
- B o m i u ki n vô trùngả đả đ ề ệ
- Ch n úng môi tr ng và chu n b môi tr ng úng cáchọ đ ườ ẩ ị ườ đ
- Ch n mô c y và x lý mô c y thích h p tr c và sau khi c y.ọ ấ ử ấ ợ ướ ấ
2.1. Ý ngh a c a vô trùng ĩ ủ trong nuôi c yấ mô và t bào th c v tế ự ậ
Môi tr ng nuôi c y mô và t bào th c v t có ch a ng, vitamin, mu i khoáng… r t ườ để ấ ế ự ậ ứ đườ ố ấ
thích h p cho các lo i n m và vi khu n phát tri n. Do t c phân bào c a n m và vi khu n ợ ạ ấ ẩ ể ố độ ủ ấ ẩ
l n h n r t nhi u so v i t bào th c v t, n u trong môi tr ng nuôi c y ch nhi m m t vài bào ớ ơ ấ ề ớ ế ự ậ ế ườ ấ ỉ ễ ộ
t n m ho c vi khu n thì chử ấ ặ ẩ ỉ
sau vài ngày n m t tu n, toàn b b m t môi tr ng và mô nuôi c y s ph y m t ho c đế ộ ầ ộ ề ặ ườ ấ ẽ ủđầ ộ ặ
nhi u lo i n m và vi khu n. Thí nghi m ph i b i vì trong i u ki n này mô nuôi c y s ề ạ ấ ẩ ệ ả ỏđ đề ệ ấ ẽ
không phát tri n và ch t d n.ể ế ầ
2.2 Ngu n t p nhi mồ ạ ễ
Có 3 ngu n t p nhi m chính:ồ ạ ễ
- D ng c thu tinh, môi tr ng nuôi c y và nút y không c vôụ ụ ỷ ườ ấ đậ đượ
trùng tuy t iệ đố
- Trên b m t ho c bên trong mô c y t n t i các s i n m, bào t n mề ặ ặ ấ ồ ạ ợ ấ ử ấ

ho c vi khu nặ ẩ
- Trong quá trình thao tác làm r i n m ho c vi khu n theo b i lên bơ ấ ặ ẩ ụ ề
m t môi tr ngặ ườ
2.3 K thu t vô trùngỹ ậ
2.3.1 Vô trùng d ng c thu tinh, nút y và môi tr ngụ ụ ỷ đậ ườ
a. D ng c thu tinhụ ụ ỷ
Thông th ng các d ng c thu tinh dùng trong các thí nghi m th ng c x lý b ng ườ ụ ụ ỷ ệ ườ đượ ử ằ
dung d ch sulfocromate m t l n u tr c khi a vào s d ng; v sau ch c n r a s ch b ng ị ộ ầ đầ ướ đư ử ụ ề ỉ ầ ử ạ ằ
xà phòng, tráng s ch b ng n c c t và th t ráo tr c khi s d ng.ạ ằ ướ ấ để ậ ướ ử ụ
Trong tr ng h p các d ng c thu tinh dùng trong các thí nghi m nuôi c y mô và t bào ườ ợ ụ ụ ỷ ệ ấ ế
th c v t òi h i vô trùng, có th kh trùng trong t s y nhi t cao trong nhi u phút ho c ự ậ đ ỏ ể ử ủ ấ ở ệ độ ề ặ
Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 3 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 4 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
nhi u gi . Các d ng c này luôn c gói trong gi y nhôm ho c h p kim lo i tránh b ề ờ ụ ụ đượ ấ ặ ộ ạ để ị
nhi m tr l i sau khi ã khễ ở ạ đ ử
trùng.
B ng 1.1ả : Th i gian kh trùng d ng c thu tinh b ng nhi t và nhi t khờ ử ụ ụ ỷ ằ ệ ệ độ ử
trùng
Nhi t (ệ độ oC) Th i gian kh trùng(phút)ờ ử
160 45
170 18
180 7,5
190 1,5
Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 4 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 5 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
b. Nút yđậ
Th ng dùng nh t là các nút y làm b ng bông gòn không th m n c.Nút ph i t ng i ườ ấ đậ ằ ấ ướ ả ươ đố
ch t m b o b i không i qua c, ng th i n c t môi tr ng không b b c h i quá dặ đểđả ả ụ đ đượ đồ ờ ướ ừ ườ ị ố ơ ễ
dàng trong quá trình nuôi c y. Bông không th m n c là lo i nút n gi n nh t nh ng có các ấ ấ ướ ạ đơ ả ấ ư
nh c i m sau:ượ đ ể

- N u khi h p nút bông b t ho c dính môi tr ng thì v sau s r t d b nhi m n m, nh t ế ấ ị ướ ặ ườ ề ẽ ấ ễ ị ễ ấ ấ
là v i nh ng thí nghi m ti n hành trong m t th i gian dàiớ ữ ệ ế ộ ờ
- Thao tác làm nút bông ch m, không thu n ti n khi nuôi c y trên quiậ ậ ệ ấ
mô l nớ
- Ch dùng c vài l n là ph i bỉ đượ ầ ả ỏ
Hi n nay ng i ta s d ng nhi u lo i n p y khác thay th nút bông. Các hãng s n xu t ệ ườ ử ụ ề ạ ắ đậ ế ả ấ
d ng c nuôi c y mô cung c p lo i n p ng nghi m và bình tam giác b ng nh a ch u nhi t có ụ ụ ấ ấ ạ ắ ố ệ ằ ự ị ệ
th h p vô trùng nhi t 121ể ấ ở ệ độ 0C mà không b bi n d ng. M t s phòng thí nghi m dùng n p ị ế ạ ộ ố ệ ắ
ng nghi m b ngố ệ ằ
inox ho c cao su r t thu n ti n cho vi c vô trùng khô ho c t. C ng có th s d ng gi y ặ ấ ậ ệ ệ ặ ướ ũ ể ử ụ ấ
nhôm làm n p y…để ắ đậ
c. Môi tr ngườ
Môi tr ng nuôi c y th ng c h p kh trùng trong n i h p (autoclave), kh trùng b ng ườ ấ ườ đượ ấ ử ồ ấ ử ằ
áp su t h i n c bão hòa. Th i gian h p t 15-30 phút áp su t h i n c bão hòa là 103,4 kPaấ ơ ướ ờ ấ ừ ở ấ ơ ướ
(1atm) t ng ng v i nhi t 121ươ đươ ớ ệ độ 0C. nhi t 121Ở ệ độ 0C, h u h t các sinh v t có trong môi ầ ế ậ
tr ng u b tiêu di t, k c d ng bào t . Sau khi vô trùng c n ph i làm khô n p ng ườ đề ị ệ ể ảở ạ ử ầ ả ắ ố
nghi m ho c nút bông tránh b nhi m tr l i.ệ ặ để ị ễ ở ạ
B ng 2ả : Th i gian kh trùng dung d ch và các môi tr ng l ng b ngờ ử ị ườ ỏ ằ
n i h p (autoclave) 121ồ ấ ở oC t i 103,4 kPaạ
Th tích môi tr ng (mL)ể ườ Th i gian h p kh trùng(phút)ờ ấ ử
<50 15
75 20
250-500 25
1000 30
Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 5 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 6 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
Vi c h p kh trùng b ng n i h p thì không thích h p v i nhi u hoá ch t nh y c m v i nhi t ệ ấ ử ằ ồ ấ ợ ớ ề ấ ạ ả ớ ệ
nh : các acid amin, các vitamin, các hormon t ng tr ng, và các ch t kháng sinh. Các ch t độ ư ă ưở ấ ấ
nh v y th ng ph i c kh trùng b ng cách l c vô trùng. Màng l c c làm b ng màng ư ậ ườ ả đượ ử ằ ọ ọ đượ ằ
polyethylen ho c s I cellulose. Các l trên màng siêu l c này c thi t k hi u qu cho vi c ặ ợ ỗ ọ đượ ế ế ệ ả ệ

gi l i các vi sinh v t gây nhi m.ữ ạ ậ ễ
d. L c vô trùngọ
Ph ng pháp n gi n nh t là dùng các màng l c Millipore ho c dùng các ph u l c th y ươ đơ ả ấ ọ ặ ể ọ ủ
tinh x p s 5. ố ố M t s lo i màng l c vô trùng c a hàng Millipore. ây là lo i màng l c ã c ộ ố ạ ọ ủ Đ ạ ọ đ đượ
kh trùng b ng chi u x và ch dùng 1 l nử ằ ế ạ ỉ ầ
Ph ng pháp s d ng màng l c Millipore: hãng Millipore cung c p màng l c và giá ươ ử ụ ọ ấ ọ đỡ
b ng nh a h u nhi t. D i ây mô t màng l c lo i Millipore Swinex có ng kính 25mm. ằ ự ị ệ ướ đ ả ọ ạ đườ
B l c g m có giá b ng lo i nh a ch u nhi t g m n p và , vòng cao su và màng l c. t ộ ọ ồ đỡ ằ ạ ự ị ệ ồ ắ đế ọ Đặ
màng l c (có kích th c l 0,25µm) trên , t vòng cao su lên và v n ch t n p vào . Gói ọ ướ ỗ đế đặ ặ ặ ắ đế
toàn b b l c vào trong m t t gi y nhôm và kh trùng trong autoclave 121ộ ộ ọ ộ ờ ấ ử ở
o
C trong 15-20
phút. ng th i c ng h p vô trùng m t bình hu tinh h ng d ch l c. Dùng ng tiêm hút Đồ ờ ũ ấ ộ ỷ để ứ ị ọ ố
d ch l c và b m qua b l c.ị ọ ơ ộ ọ
2.3.2 Kh trùng mô th c v tử ự ậ
Mô c y có th là h u h t các b ph n khác nhau c a th c v t nh h t gi ng, phôi, noãn, ấ ể ầ ế ộ ậ ủ ự ậ ư ạ ố đế
hoa, lá, u r , thân c …tu theo s ti p xúc v i môi tr ng bên ngoài, các b ph n này ch a đầ ễ ủ ỳ ự ế ớ ườ ộ ậ ứ
nhi u hay ít vi khu n và n m. òng lúa non khi còn trong b , mô th t bên trong qu … th ng ề ẩ ấ Đ ẹ ị ả ườ
ít b nhi m vi sinh v t; ng c l i, lá, thân c bi t các b ph n n m sâu trong t nh r , ị ễ ậ ượ ạ đặ ệ ở ộ ậ ằ đấ ư ễ
c … có l ng n m, khu n t p r t cao. H u nh không th vô trùng mô c y c n u n m, ủ ượ ấ ẩ ạ ấ ầ ư ể ấ đượ ế ấ
khu n n m sâu các t bào bên trong mô ch không h n ch b m t. Lá khoai lang có th vôẩ ằ ở ế ứ ạ ếở ề ặ ể
trùng d dàng trong mùa khô nh ng không th làm c trong mùa m a. Ph ng pháp vô ễ ư ể đượ ư ươ
trùng mô c y thông d ng nh t hi n nay là dùng các ch t hoá h c có ho t tính di t n m khu n. ấ ụ ấ ệ ấ ọ ạ ệ ấ ẩ
Hi u l c di t n m khu n c a các ch t này ph thu c vào th i gian x lý, n ng và kh n ng ệ ự ệ ấ ẩ ủ ấ ụ ộ ờ ử ồ độ ả ă
xâm nh p c a chúng vào các k ngách l i lõm trên b m t mô c y, kh n ng y h t các b t ậ ủ ẽ ồ ề ặ ấ ả ă đẩ ế ọ
khí bám trên b m t mô c y. t ng tính linh ng và kh n ng xâm nh p c a ch t di t ề ặ ấ Để ă độ ả ă ậ ủ ấ ệ
khu n, thông th ng ng i ta x lý mô c y trong vòng 30s trong r u ethylic 70% sau ó m i ẩ ườ ườ ử ấ ượ đ ớ
x lý dung d ch di t khu n. ng th i ng i ta thêm các ch t gi m s c c ng b m t nh ử ị ệ ẩ Đồ ờ ườ ấ ả ứ ă ề ặ ư
Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 6 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 7 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ

Tween 80, Fotoflo, Teepol vào dung d ch di t n m khu n. có khái ni m v n ng và th iị ệ ấ ẩ Để ệ ề ồ độ ờ
gian s d ng các ch t di t n m khu n x lý mô c y, xin d n tài li u nghiên c u c a Street ử ụ ấ ệ ấ ẩ để ử ấ ẫ ệ ứ ủ
(1974) b ng sau:ở ả
Tác nhân vô trùng N ng %ồ độ Th i gian x lýờ ử Hi u quệ ả
( phút)
Calci hypochlorit 9 – 10 5 – 30 R t t tấ ố
Natri hypochlorit 2 5 – 30 R t t tấ ố
Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 T tố
N c Bromướ 1-2 2 – 10 R t t tấ ố
HgCl
2
0.1 – 1 2 – 10 Trung bình
Ch t kháng sinhấ 4 – 50 mg/l 30 – 60 Khá t tố
Trong th i gian x lý, mô c y ph i ng p hoàn toàn trong dung d ch di t khu n. i v i các ờ ử ấ ả ậ ị ệ ẩ Đố ớ
b ph n có nhi u b i cát, tr c khi x lý nên r a c n th n b ng n c xà phòng b t và r a s ch ộ ậ ề ụ ướ ử ử ẩ ậ ằ ướ ộ ử ạ
l i b ng n c máy. Khi x lý xong, mô c y c r a nhi u l n b ng n c c t vô trùng (t i ạ ằ ướ ử ấ đượ ử ề ầ ằ ướ ấ ố
thi u là 3 l n). Nh ng ph n trên mô c y b tác nhân vô trùng làm cho tr ng ra c n ph i c ể ầ ữ ầ ấ ị ắ ầ ả đượ
c t b tr c khi t mô c y lên môi tr ng. tránh nh h ng c a tác nhân vô trùng lên mô ắ ỏ ướ đặ ấ ườ Để ả ưở ủ
c y, nên ấ chú ý l i m t l p b c ngoài khi ngâm mô vào dung d ch di t khu n. L p ngoài để ạ ộ ớ ọ ị ệ ẩ ớ
cùng này s c l t b i tr c khi t mô c y lên môi tr ng. Vô trùng mô c y là m t thao ẽđượ ộ ỏđ ướ đặ ấ ườ ấ ộ
tác khó, ít khi thành công ngay t l n u tiên. Tuy v y, n u kiên trì tìm c n ng và th i ừ ầ đầ ậ ế đượ ồ độ ờ
gian vô trùng thích h p thì sau vài l n th ch c ch n s t k t qu . Có th dùng kháng sinh ợ ầ ử ắ ă ẽđạ ế ả ể để
ki m soát ho c lo i b s nhi m n m trên mô c y. H u h t các kháng sinh nh y c m v i nhi t ể ặ ạ ỏ ự ễ ấ ấ ầ ế ạ ả ớ ệ
do ó không th h p vô trùng. Chúng hoà tan c trong n c ho c dung môi thích h p khác, đ ể ấ đượ ướ ặ ợ
l c vô trùng và thêm vào môi tr ng vô trùng khi môi tr ng này ã c làm ngu i còn 45-ọ ườ ườ đ đượ ộ
50
o
C. Không ph i t t c các kháng sinh u thích h p cho s d ng ả ấ ả đề ợ ử ụ trong nuôi c yấ mô th c v t.ự ậ
Các kháng sinh nh Streptomycin, Kanamycin và Neomycin th ng c cho mô th c v t và ư ườ độ ự ậ
không ho t ng t t trong m t ph m vi pH nh t nh. Tetracylin c ng là c t th c v t, có ạ độ ố ộ ạ ấ đị ũ độ ố ự ậ

khuynh h ng c ch s t ng tr ng c a mô th c v t sau khi b x lý trong m t th i giandài. ướ ứ ế ự ă ưở ủ ự ậ ị ử ộ ờ
Chloramphenicol có ph ho t ng r ng nh ng c cho th c v t (và ng i) n ng th p. ổ ạ độ ộ ư độ ự ậ ườ ở ồ độ ấ
Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 7 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 8 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
Các kháng sinh th ng c dùng ườ đượ trong nuôi c yấ mô th c v t g m Rifampicin (th ng c ự ậ ồ ườ đượ
dùng k t h p v i các kháng sinh khác), các polymicin và vancomycin.ế ợ ớ
Công Ngh Sinh H c Vi t Namệ ọ ệ - 8 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 9 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
Các lo i kháng sinhạ
Aminoglycoside
- Streptomycin
- Kanamycin
- Neomycin
Quinolone
- Nalidixic acid
- Ofloxacin
- Norfloxacin
-Lactamβ
- Penicillin
- Ampicillin
- Carbenicillin
Tetracyclin
Trimehtoprim và sulphonamide
Chloramphenicol
Macrolide và lincosamide
- Erythromycin
-Lincomycin
Glycopeptide
- Vancomycin
Polymixin

- Polymixin B
- PolymicinE
Rifampicin
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 9 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 10 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
Kh n ng ho t ngả ă ạ độ
c ch s sinh t ng h p protein b ng cáchỨ ế ự ổ ợ ằ
tác ng lên các ribosome 30S ho c 50Sđộ ặ
Gây tr ng i cho quá trình sao chép DNA ở ạ
b ng cách c ch enzym DNA gyraseằ ứ ế
c ch s t ng h p vách t bào vi khu nỨ ế ự ổ ợ ế ẩ
c ch sinh t ng h p protein b ng cách Ứ ế ổ ợ ằ
tác ng lên ribosome 30Sđộ
c ch s sinh t ng h ptetrahydrofolateỨ ế ự ổ ợ
c ch s sinh t ng h p protein b ng cáchỨ ế ự ổ ợ ằ
tác ng lên Rbx 50Sđộ
c ch s sinh t ng h p protein b ng cáchỨ ế ự ổ ợ ằ
tác ng lên Rbx 50Sđộ
Tác ng lên s sinh t ng h p vách t bào độ ự ổ ợ ế
vi khu n.ẩ
G n lên màng t bào làm thay i dòng ắ ế đổ
ion d n n s phá v t bàoẫ đế ự ỡ ế
Tác ng lên RNA b ng cách g n vào độ ằ ắ
RNA polymerase
2.3.3 K thu t c y vô trùngỹ ậ ấ
tránh b nhi m trong su t thao tác c y mô th c v t, các nhà khoa h c làm vi c trong t c y Để ị ễ ố ấ ự ậ ọ ệ ủ ấ
vô trùng (laminar). ó là các t c y có thi t b th i không khí ã l c vô trùng vào ch thao tác Đ ủ ấ ế ị ổ đ ọ ỗ
c y. T c y vô trùng lo i tr m t cách hi u qu ngu n t p nhi m t bên ngoài và t o i u ki n ấ ủ ấ ạ ừ ộ ệ ả ồ ạ ễ ừ ạ đề ệ
tho i mái chong i c y, nên hi n nay c s d ng r t ph bi ân trong các phòng thí nghi m. ả ườ ấ ệ đượ ử ụ ấ ổ ế ệ
Không khí t bên ngoài c qu t hút vào qua m t màng l c thô. 99% b i trong không khí c ừ đượ ạ ộ ọ ụ đượ

gi l i màng l c thô. Sau ó không khí c th i qua màng l c tinh và phân ph i u ra kh p ữ ạ ở ọ đ đượ ổ ọ ố đề ắ
b m t c a t c y, không t o nh ng xoáy không khí a b i vào ch c y. Màng l c tinh ng n c n ề ặ ủ ủ ấ ạ ữ đư ụ ỗ ấ ọ ă ả
các ph n t l n h n 0.3micron v i hi u qu 99,99% và do các hãng chuyên s n xu t màng l c ầ ử ớ ơ ớ ệ ả ả ấ ọ
cung c p. Tu i th c a màng l c thô tu theo s l ng b i n i làm vi c, th ng t 6 tháng n 1 ấ ổ ọ ủ ọ ỳ ố ượ ụ ơ ệ ườ ừ đế
n m và c a màng l c tinh t 2 n 3 n m. Khi th y hi u qu vô trùng c a t c y laminar kém i ă ủ ọ ừ đế ă ấ ệ ả ủ ủ ấ đ
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 10 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 11 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
thì c n ph i thay màng l c m i. kéo dài tu i th c a b màng l c trong t c y laminar- th ngầ ả ọ ớ Để ổ ọ ủ ộ ọ ủ ấ ườ
r t t ti n - nên b trí t c y trong các phòng riêng, càng ít b i càng t t. ấ đắ ề ố ủ ấ ụ ố
2.3.4 Kh trùng n i thao tác c y và d ng c c yử ơ ấ ụ ụ ấ
Ngu n nhi m t p quan tr ng và th ng xuyên nh t là b i r i vào d ng c thu tinh ch a môi ồ ễ ạ ọ ườ ấ ụ ơ ụ ụ ỷ ứ
tr ng trong khi m n p ho c nút bông thao tác c y. Ng i ta áp d ng nhi u bi n pháp khác ườ ở ắ ặ để ấ ườ ụ ề ệ
nhau ch ng l i ngu n nhi m t p này. Phòng c y th ng là bu ng có di n tích h p, r ng t 10-để ố ạ ồ ễ ạ ấ ườ ồ ệ ẹ ộ ừ
15m
2
, có hai l p c a tránh không khí chuy n ng t bên ngoài tr c ti p a b i vào. Sàn và ớ ử để ể độ ừ ự ế đư ụ
t ng lát g ch men có th lau chùi th ng xuyên. Tr c khi a vào s d ng, phòng c y c n ườ ạ để ể ườ ướ đư ử ụ ấ ầ
c x lý h i formol b ng cách rót formaldehyde (formalin) 4% ra m t s n p a petri r i đượ ử ơ ằ ộ ố ắ đĩ để ả
rác vài n i trong phòng cho b c h i t do. óng kín c a phòng c y trong 24h, sau ó b ơ ố ơ ự Đ ử ấ đ ỏ
formaldehyde i và kh h i formaldehyde còn th a b ng dung d ch NHđ ử ơ ừ ằ ị
3
25% c ng trong 24h. B ũ ề
m t n i chu n b c y, b m t bên trong và ngoài t c y ph i c kh trùng tr c khi c y b ng ặ ơ ẩ ị ấ ề ặ ủ ấ ả đượ ử ướ ấ ằ
cách lau s ch các b m t này b ng c n 90%. Tia UV c ng có th c s d ng kh trùng b ạ ề ặ ằ ồ ũ ểđượ ử ụ để ử ề
m t phòng c y và t c y nh ng nó ít hi u qu h n và nguy hi m h n là s d ng c n. Tia UV ch ặ ấ ủ ấ ư ệ ả ơ ể ơ ử ụ ồ ỉ
tiêu di t c các m m vi sinh n m tr c ti p ngay trên các b m t mà tia này chi u vào; nh ng nóệ đượ ầ ằ ự ế ề ặ ế ư
không th th m qua các l p b i tiêu di t các vi sinh v t n m bên d i các l p b i này. Tia UV ể ấ ớ ụ để ệ ậ ằ ướ ớ ụ
còn gây h i cho m t và gây ung th da. Các d ng c mang vào phòng c y u vô trùng tr c: t ạ ắ ư ụ ụ ấ đề ướ ừ
áo choàng, m v i, kh u trang c a ng i c y n dao, kéo, k p (forceps), gi y l c, bình ng ủ ả ẩ ủ ườ ấ đế ẹ ấ ọ đự
n c c t Trên bàn c y th ng xuyên có m t èn c n s d ng trong khi c y và m t c c ng ướ ấ ấ ườ ộ đ ồ để ử ụ ấ ộ ố đự

c n 90% nhúng các d ng c làm vi c. Tr c khi c y, ng i c y c n r a tay b ng xà phòng và ồ để ụ ụ ệ ướ ấ ườ ấ ầ ử ằ
lau k n khu u tay b ng c n 90%. m b o m c vô trùng cao trong phòng c y n có ỹ đế ỷ ằ ồ Đểđả ả ứ độ ấ ầ
m t èn t ngo i 40W treo tr n. Ch cho èn này làm vi c khi không có ng i trong phòng c y. ộ đ ử ạ ầ ỉ đ ệ ườ ấ
Nên b t èn t ngo i 30 phút tr c khi c y. C n gi m s chuy n ng c a không khí trong phòngậ đ ử ạ ướ ấ ầ ả ự ể độ ủ
c y n m c t i thi u, vì v y t t c các d ng c ph c v cho vi c c y u ph i chu n b y ấ đế ứ ố ể ậ ấ ả ụ ụ ụ ụ ệ ấ đề ả ẩ ị đầ đủđể
trong th i gian c y tránh i l i ra vào phòng c y quá nhi u. Các d ng c b ng kim lo i nh k p ờ ấ đ ạ ấ ề ụ ụ ằ ạ ư ẹ
c y, dao m , que c y vòng, kim m i nh n có th c kh trùng b ng cách t d i ng n l a ènấ ổ ấ ũ ọ ểđượ ử ằ đố ướ ọ ử đ
c n. Nh ng d ng c này tr c h t ph i c nhúng vào c n tuy t i r i m i t. Nh ráo i ồ ữ ụ ụ ướ ế ả đượ ồ ệ đố ồ ớ đố ớ để đ
các gi t c n th a r i m i a vào ng n l a èn c n. Khi m n p chai ho c n p ng nghi m môi ọ ồ ừ ồ ớ đư ọ ử đ ồ ở ắ ặ ắ ố ệ
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 11 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 12 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
tr ng nuôi c y, thì dùng ngón tay k út và ngón tay út c m l y n p gòn, và không ch m tay vào ườ ấ ế ầ ấ ắ ạ
b m t bên trong c a n p gòn c ng nh không th n p gòn xu ng b t c b m t nào cho n khi ề ặ ủ ắ ũ ư ả ắ ố ấ ứ ề ặ đế
g n nó tr l i chai môi tr ng.ắ ở ạ ườ

BÀI 2:
K THU T PHA CH MÔI TR NGỸ Ậ Ế ƯỜ
 ^ ! ^ 
1.V N L A CH N MÔI TR NGẤ ĐỀ Ự Ọ ƯỜ
Khi kh i s nuôi c y mô và t bào i v i m t s i t ng nh t nh, v n t ra là ch n ở ự ấ ế đố ớ ộ ố đố ượ ấ đị ấ đềđặ ọ
môi tr ng nào và trên c s nào ph i h p t l các ch t dinh d ng. Cách th ng làm là qua ườ ơ ở để ố ợ ỷ ệ ấ ưỡ ườ
các tài li u ã xu t b n, các công trình ã nghiên c u v i t ng ó ho c cùng h t ng ng ệ đ ấ ả đ ứ ềđố ượ đ ặ ọ ươ đươ
xem các tác gi ã s d ng môi tr ng lo i nào. B c u có th gi nguyên môi tr ng c a tác ảđ ử ụ ườ ạ ướ đầ ể ữ ườ ủ
gi ó ho c trên c s ó mà c i ti n cho phù h p qua các thí nghi m th m dò.ảđ ặ ơ ở đ ả ế ợ ệ ă
Trong hàng tr m môi tr ng do r t nhi u tác gi ngh cho nhi u lo i cây khác nhau, nhi u ă ườ ấ ề ảđề ị ề ạ ề
m c ích nuôi c y khác nhau. V c b n có th chia ra làm 3 lo i:ụ đ ấ ề ơ ả ể ạ
- Môi tr ng nghèo ch t dinh d ng: i n hình là môi tru ng White,Knop và Knudson C …ườ ấ ưỡ đ ể ờ
- Môi tr ng có hàm l ng ch t dinh d ng trung bình: i n hình làmôi tr ng B5 c a ườ ượ ấ ưỡ để ườ ủ
Gamborg …
- Môi tr ng giàu dinh d ng: i n hình là môi tr ng MS (Murashige-Skoog)…ườ ưỡ đ ể ườ

Vì v y khi b t u nghiên c u nuôi c y mô m t s i t ng m i, ch a có tài li u tr c thì nênậ ắ đầ ứ ấ ộ ố đố ượ ớ ư ệ ướ
th m dò so sánh 3 lo i môi tr ng trên xem i t ng nghiên c u phù h p v i lo i môi tr ng ă ạ ườ đố ượ ứ ợ ớ ạ ườ
nào nh t. Sau ó c n th tìm t l NOấ đ ầ ử ỉ ệ
3
/ NH
4
+
thích h p. Các tác gi ph ng Tây làm vi c v i cây ợ ả ươ ệ ớ
tr ng c n th ng không a NHồ ạ ườ đư
4
+
vào môi tr ng. Nh ng i v i nh ng cây dinh d ng NHườ ư đố ớ ữ ưỡ
4
+
m nh nh cây lúa, vi c thêm vào môi tr ng nuôi c y m t t l NHạ ư ệ ườ ấ ộ ỉ ệ
4
+
thích h p ch c ch n s có ợ ắ ắ ẽ
l i. Vi c s d ng mang tính kinh nghi m ch ngh a i v i m t s môi tr ng ã c n tr khá ợ ệ ử ụ ệ ủ ĩ đố ớ ộ ố ườ đ ả ở
nhi u s ti n b c a công tác m t s phòng thí nghi m nuôi c y mô th c v t. Thu c lá và car t ề ự ế ộ ủ ở ộ ố ệ ấ ự ậ ố ố
là 2 lo i cây kinh i n c aạ đ ể ủ
nuôi c y mô th c v t. Môi tr ng nuôi c y 2 lo i cây này ã c xây d ng khá hoàn ch nh. ấ ự ậ ườ ấ ạ đ đượ ự ỉ
Tuy v y, không th dùng nguyên các môi tr ng ó nghiên c u các cây hoà th o ho c các cây ậ ể ườ đ để ứ ả ặ
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 12 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 13 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
h u mà không có s c i ti n, s a i. i u này gi i thích s ti n b ch m ch p c a nuôi c y ọđậ ự ả ế ử đổ Đ ề ả ự ế ộ ậ ạ ủ ấ
mô m t s cây hoà th o so v i cây 2 lá m m.ộ ố ả ớ ầ
Hi n nay, môi tr ng MS c coi nh là môi tr ng thích h p v i nhi u lo i cây do giàu và ệ ườ đượ ư ườ ợ ớ ề ạ
cân b ng v m t dinh d ng. Vì v y, nh ng ng i t p s làm nuôi c y mô th ng b t u v i môiằ ề ặ ưỡ ậ ữ ườ ậ ự ấ ườ ắ đầ ớ
tr ng này tr c khi tìm c môi tr ng c a riêng mình.ườ ướ đượ ườ ủ

2.CHU N B MÔI TR NGẨ Ị ƯỜ
thu n ti n cho vi c pha các môi tr ng nuôi c y ng i ta không cân hoá ch t m i l n pha Để ậ ệ ệ ườ ấ ườ ấ ỗ ầ
mà th ng chu n b tr c d i d ng các dung d ch m c (còn g i là các stock), sau ó ch c n ườ ẩ ị ướ ướ ạ ị đậ đặ ọ đ ỉ ầ
pha loãng khi s d ng. Các stock này th ng c b o qu n dài ngày trong t l nh th ng ho c ử ụ ườ đượ ả ả ủ ạ ườ ặ
t l nh sâu.ủ ạ
2.1 Thành ph n môi tr ng dinh d ngầ ườ ưỡ
N c c tướ ấ
Ch t h u c ấ ữ ơ - ng- Acid amin- Vitamin (BĐườ 1, B6, H, PP…)- Các ch t i u hòa sinh tr ngấ đ ề ưở
th c v t (Auxin, Cytokinin,Gibberellin…)ự ậ
Ch t vô cấ ơ
a l ngĐ ượ N P K Ca Mg S
Vi l ng ượ Fe Zn B Co N Mn Cu Al Mo I
Các h p ch t không bi t rõ thành phợ ấ ế nầ
N c d a, n c khoai tây, n c chu i, casein,hydrolysalt, trypton, pepton…ướ ừ ướ ướ ố
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 13 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 14 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
THÀNH PH N MU I KHOÁNG C B N C A MÔI TR NG MSẦ Ố Ơ Ả Ủ ƯỜ
(Murashige và Skoog, 1962)
SKOOG I
NH4NO3
1650 mg/L
KNO3
1900 mg/L
KH2PO4
170 mg/L
MgSO4.7H2O
370 mg/L
CaCl2.2H2
440 mg/L
Na2EDTA

37,3 mg/L
SKOOG II
FeSO4.7H2O
27,8 mg/L
MnSO4
.4H2O
22,3 mg/L
H3BO3
6,2 mg/L
ZnSO4.7H2O
8,6 mg/L
SKOOG III
KI
0,83 mg/L
Na2MoO4.2H2O
0,25 mg/L
CuSO4.5H2O
0,025 mg/L
CoCl2.6H2O
0,025 mg/L
THÀNHPH N VITAMIN C A MORELẦ Ủ
Morel’sVitamin
Pirydox
ine (B6)
1 mg/L
Biotin
(H)
0,01
mg/L
Meso-

inositol
100
mg/L
Nicotini
c acid
(P.P)
1 mg/L
Thiami
n –HCl
(B1)
1 mg/L
Pantotat
e Calci
1 mg/L
2.2 Cách pha các dung d ch m (stock)ị ẹ
* Stock a l ng MS đ ượ : SKOOG I (x10)
(Pha thành 1Lv i n ng s d ng khi pha 1Lmôi tr ng MS là 100mL/L)ớ ồ độ ử ụ ườ
NH4NO3
16500 mg
KNO3
19000 mg
KH2PO4
1700 mg
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 14 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 15 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
MgSO4.7H2O
3700 mg
CaCl2.2H2O
4400 mg
Cân và dùng n c c t hoà tan l n l t t ng ch t trong bécher choướ ấ ầ ượ ừ ấ

tan hoàn toàn. Dùng ng ong 1L i u ch nh cho 1 lít.ố đ đ ề ỉ đủ
* Stock s t MS: ắ SKOOG II (x100 )
(Pha thành 200mL v i n ng s d ng khi pha 1L m i tr ng MS là 2mL/L)ớ ồ độ ử ụ ộ ườ
Na2EDTA
3730 mg
FeSO4.7H2O
2780 mg
Cân và hoà tan t ng ch t b ng 100mL n c c t trong m i bécher riêng.ừ ấ ằ ướ ấ ỗ
t 2 bécher dung d ch lên b p và gia nhi t cho dung d ch m lên v a có h iĐặ ị ế ệ ị ấ ừ ơ
nóng b c lên là c. Khu y u và dung d ch Naố đượ ấ đề đổ ị 2EDTA vào ng ongố đ
200 mL, r i cho t t dung d ch FeSOồ ừ ừ ị 4vào, v a cho v a khu y u. ngu I r i cho vào bình ừ ừ ấ đề Để ộ ồ
t i b o qu n trong t l nh.ố ả ả ủ ạ
* Stock vi l ng MS: ượ SKOOG III (x100)
Tr c tiên c n chu n b các stock con:ướ ầ ẩ ị
Dung d ch KIị : (83mg/mL)
Cân 8300 mg KI hoà tan v i n c c t cho 100mLớ ướ ấ đủ
Dung d ch Naị 2MoO4.2H2O: (25mg/mL)
Cân 2500mg Na2MoO4.2H2O hoà tan v i n c c t cho 100mLớ ướ ấ đủ
Dung d ch CuSOị 4.5H2O (2,5mg/mL)
Cân 250mg CuSO4.5H2O hòa tan v i n c c t cho 100mLớ ướ ấ đủ
Dung d ch CoClị 2.6H2O (2,5 mg/mL)
Cân 250 mg CoCl2.5H2O hòa tan v i n c c t cho 100 mLớ ướ ấ đủ
SKOOG III (x100): pha thành 500mL v i n ng s d ng khi pha 1L môiớ ồ độ ử ụ
tr ng MS là 5mL/Lườ
MnSO4.4H2O
2230 mg H3BO3
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 15 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 16 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
620 mg
ZnSO4.7H2O

860 mg
KI
83 mg/1 mL
Na2MoO4.2H2O
25 mg/1 mL
CuSO4.5H2O
2,5 mg/1 mL
CoCl2.6H2O
2,5 mg/1 mL
Cân 3 ch t u tiên và hoà tan v i n c c t trong t ng bécher riêng.Cho t ng dung d ch theo ấ đầ ớ ướ ấ ừ ừ ị
th t vào ng ong 500mL. Sau ó hút 1mL dungd ch trong stock con c a 4 ch t ti p theo cho ứ ự ố đ đ ị ủ ấ ế
vào ng ong, v a cho v a khu y u và thêm n c c t cho 500mLố đ ừ ừ ấ đề ướ ấ đủ
* Thành ph n vitaminầ
Pha các stock con
Dung d ch pirydoxine (Bị 6) (10mg/mL)
Cân 1000mg B6 hòa tan v i n c c t cho 100mLớ ướ ấ đủ
Dung d ch Biotin (H) ị (1mg/mL)
Cân 100mg biotin hòa tan v i n c c t cho 100 mLớ ướ ấ đủ
Dung d ch Nicotinic Acid (P.P) ị (10mg/mL)
Cân 1000 mg nicotinic acid hòa tan v i n c c t cho 100mLớ ướ ấ đủ
Dung d ch Thiamin-HCl (Bị 1) (10mg/mL)
Cân 1000 mg B1 hoà tan v i n c c t cho 100 mLớ ướ ấ đủ
Dung d ch Pantotheate-Ca ị (10mg/mL)
Cân 1000 mg Pantotheate-Ca hòa tan v i n c c t cho 100mLớ ướ ấ đủ
Vitamin Morel (x 100)
Pirydoxine
(B6)100g/10mL
Biotin (H)1 mg/1 mL Meso- inosito l10 g/10g
Nicotinic acid(P.P)
100mg/10mL

Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 16 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 17 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
Thiamin –
HCl(B1)100mg/10mL
Pantotate Calci 100 mg/10
mL
Cân meso-inositol r i hòa tan v i n c c t. ong t ng ch t theo th tồ ớ ướ ấ Đ ừ ấ ứ ự
cho vào ng ong có ch a n c c t , v a cho v a khu y u và thêm n cố đ ứ ướ ấ ừ ừ ấ đề ướ
cho 200mLđủ
* Thành ph n các ch t i u hòa sinh tr ng th c v tầ ấ đ ề ưở ự ậ (tính theo mg)
Dung d ch BAP (1mg/mL)ị
Cân 100 mg Benzylaminopurine (BAP) hoà tan trong 5mL NaOH 1N.Cho thêm n c c t cho ướ ấ
100 mL. M i mL dung d ch có ch a 1mg BAPđủ ỗ ị ứ
Dung d ch IAA (1mg/mL) ị Cân 100mg Indolacetic acid (IAA) hòa tan trong 5 mL NaOH 1N.
Cho thêm n c c t cho 100mL. M i mL dung d ch có ch a 1mg IAA.ướ ấ đủ ỗ ị ứ
Dung d ch IBA (1mg/mL) ị Cân 100mg Indolebutyric acid (IBA) hòa tan trong 5mL NaOH 1N.
Cho thêm n c c t cho 100mL. M i mL dung d ch có ch a 1mg IBAướ ấ đủ ỗ ị ứ
Dung d ch Kinetin (1mg/mL) ị Cân 100mg Kinetin (KIN) hòa tan trong 5 mL NaOH 1N. Cho
thêm
n c c t cho 100mL. M i mL dung d ch có ch a 1mg KIN. ướ ấ đủ ỗ ị ứ Dung d ch NAA ( 1mg/mLị )
Cân 100mg Naphthaleneacetic acid (NAA) hòa tan trong 5mL NaOH 1N. Cho thêm n c c t ướ ấ
cho 100mL. M i mL dung d ch có ch a 1mg NAA.đủ ỗ ị ứ
Dung d ch 2,4-D (1mg/mL)ị Cân 100mg 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) hòa tan trong
50mL ethanol 50%. Cho thêm n c c t cho 100mL. M i mL dung d ch cóch a 1mg 2,4-D. ướ ấ đủ ỗ ị ứ
* Các dung d ch ch t i u hòa sinh tr ng th c v tị ấ đ ề ưở ự ậ (tính b ng mol/l)ằ
BAP có tr ng l ng phân t (MW) là 225.26ọ ượ ử
- Hoà tan 225.26gr BAP trong 1l n c c t t c ta có 1l dung d ch BAP1M hay 1mol/lướ ấ ứ ị
- Cân 225.26 mg BAP hoà tan trong 1l n c c t t c ta có 1l dung d ch BAP 1mM hay 1mmol/lướ ấ ứ ị
- Cân 225.26x10
-3

mg BAP hoà tan trong 1l n c c t t c ta có 1l dung d ch BAP 1µM hay ướ ấ ứ ị
1µmol/l Dung d ch BAP ị ( MW 225.26) (10mM)
Cân 225.26 mg BAP hoà tan trong 5 mL NaOH 1N. cho thêm n c c t cho 100 mL , t c ta ướ ấ đủ ứ
có 100 mL dung d ch BAP 10mMị
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 17 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 18 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
Ví dụ: Cho 1mL dung d ch BAP 10mM vào môi tr ng MS pha c 1L môi tr ng. Nh ị ườ để đượ ườ ư
v y ta có 1L môi tr ng MS có ch a 10µM BAP. Mu n pha 1Lmôi tr ng MS có ch a 1µM ậ ườ ứ ố ườ ứ
BAP, ta s d ng 0.1mL dung d ch BAP 10 mM.ử ụ ị
T ng t nh v y pha cho các lo i kích thích t còn l i, bi t:ươ ự ư ậ ạ ố ạ ế
- IAA (MW 175.19)
- IBA (MW 203.24)
- Kinetin (MW 215.22)
- NAA (MW 186.21)
- 2,4-D (MW 221.04)
3. TH C HÀNHỰ
- Ti n hành pha Skoog I, II và III c a môi tr ng MSế ủ ườ
- Pha stock vitamin Morel, glycin và inosytol
- Pha các stock ch t i u hoà sinh tr ng nh ã h ng d n ph n trênấ đề ưở ưđ ướ ẫ ầ
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 18 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 19 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
BÀI 3:
GIEO H T Ạ IN-VITRO
 ^ ! ^ 
I.CH N MÔ C Y VÀ X LÝ MÔ C YỌ Ấ Ử Ấ
1.1 Ch n l a mô c yọ ự ấ
Không có nh ng h ng d n c th trong vi c ch n mô c y. V nguyên t c, tr nh ng mô c y ữ ướ ẫ ụ ể ệ ọ ấ ề ắ ừ ữ ấ
ã hóa g , các mô khác trong c th th c v t u có th dùng làm mô c y. Tuy v y có th nh n đ ỗ ơ ể ự ậ đề ể ấ ậ ể ậ
xét chung là các mô ang phát tri n, th t qu non, lá non, cu ng hoa, hoa, mô phân sinh… khi đ ể ị ả ố đế
t vào môi tr ng có ch a m t l ng ch t sinh tr ng thích h p u có kh n ng phân chia và đặ ườ ứ ộ ượ ấ ưở ợ đề ả ă

phân hóa. b t u nghiên c u nhân gi ng vô tính m t cây nh t nh, tr c tiên ng i ta Để ắ đầ ứ ố ộ ấ đị ướ ườ chú ý
n các ch i nách và mô phân sinh ng n. C n bi t r ng tuy mang m t l ng thông tin di truy n đế ồ ọ ầ ế ằ ộ ượ ề
nh nhau, các mô khác nhau trên cùng m t cây có th sinh tr ng và phát tri n v i kh n ng tái ư ộ ể ưở ể ớ ả ă
sinh ch i, r hay cây hoàn ch nh r t khác nhau. Vì v y, khi kh i s ch n gi ng, nhân gi ng m t ồ ễ ỉ ấ ậ ở ự ọ ố ố ộ
cây c th b ngph ng pháp nuôi c y môvà t bào th c v t, tr c h t c n thí nghi m tìm hi u ụ ể ằ ươ ấ ế ự ậ ướ ế ầ ệ ể
ph n ng c a các b ph n khác nhau c a c y ả ứ ủ ộ ậ ủ ấ trong nuôi c yấ các n ng ch t sinh tr ng khác ở ồ độ ấ ưở
nhau. Sau khi c y, mô c y c n c t trong i u ki n nhi t và ánh sáng n nh. Tu vào ấ ấ ầ đượ đặ đ ề ệ ệ độ ổ đị ỳ
các m c ích nghiên c u mà có các ch chi u sáng khác nhau, ch ng h n quá trình t o mô s o ụ đ ứ ếđộ ế ẳ ạ ạ ẹ
có th c n bóng t i hay ánh sáng, nh ng quá trình tái sinh và nhân gi ng vô tính nh t thi t ph i cóể ầ ố ư ố ấ ế ả
ánh sáng. Nhi t phòng nuôi nên gi n nh 25+2ệ độ ữổ đị
o
C b ng máy i u hòa nhi t . C ng ằ đ ề ệ độ ườ độ
chi u sáng kho ng t 2000 –3000 lux.ế ả ừ
1.2 X lý vô trùng m u c yử ẫ ấ
M u a vào nuôi c y invitro có nhi u ngu n g c khác nhau. Có th là nh ng m u c y ã vô ẫ đư ấ ề ồ ố ể ữ ẫ ấ đ
trùng nh cây con invitro cho n y m m trong i u ki n vô trùng; c ng có th ó là các m u c y ư ả ầ đ ề ệ ũ ểđ ẫ ấ
ch a vô trùng, l y tr c ti p t bên ngoài t nhiên nh ch i non, lá, thân, c , r … Thu n l i nh t làư ấ ự ế ừ ự ư ồ ủ ễ ậ ợ ấ
s d ng các m u c y ã vô trùng b i l các ph ng pháp vô trùng m u c y tr c ti p th ng ít ử ụ ẫ ấ đ ở ẽ ươ ẫ ấ ự ế ườ
nhi u gây h i cho m u c y do ch t kh trùng gây ra.ề ạ ẫ ấ ấ ữ
Có nhi u ph ng th c vô trùng m u c y:ề ươ ứ ẫ ấ
a. Vô trùng h t:ạ
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 19 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 20 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
- R a h t b ng xà phòng, l c u 2-3 phút. V i các lo i h t nh , th ngử ạ ằ ắ đề ớ ạ ạ ỏ ườ
ng h t trong túi v i mùng.đự ạ ả
- R a s ch xà phòng b ng n c máy d i vòi n c ch y m nhử ạ ằ ướ ướ ướ ả ạ
- Vô trùng s b b ng c n 70%, l c u 1-2 phútơ ộ ằ ồ ắ đề
- R a s ch c n b ng n c vô trùngử ạ ồ ằ ướ
- Cho h t vào dung d ch kh trùng NaOCl 1-15%. Thêm vài gi t bámạ ị ử ọ
dính Tween20. Kh trùng trong 15-20 phút tu m u.ử ỳ ẫ

- R a s ch ch t kh trùng nhi u l n b ng n c vô trùng (kho ng 5 l n)ử ạ ấ ử ề ầ ằ ướ ả ầ
cho n khi h t mùi javel.đế ế
- H t vô trùng ã có th nuôi c y trên môi tr ng t o m u vô trùng.ạ đ ể ấ ườ ạ ẫ
b. Các ph ng th c khác vô trùng h tươ ứ ạ
- Kh trùng l n th nh t v i NaOCl 5,25%ử ầ ứ ấ ớ
- Kh trùng l n th hai v i HgClử ầ ứ ớ 2 0,1 –1%, thêm vài gi t HCl 0,5% trong 10 phút.ọ
- R a m u v i Hử ẫ ớ 2O2 6% vô trùng tr c khi r a l i b ng n c vô trùngướ ử ạ ằ ướ
- Có th kh trùng s b h t b ng acid sulfuric trong 2-10 phútể ử ơ ộ ạ ằ
- V i h t có v c ng, có th dùng ph ng pháp t kh trùng s b .ớ ạ ỏ ứ ể ươ đố để ử ơ ộ
c. Vô trùng ch i non, lá và thân cồ ỏ:
- Vô trùng s b b ng cách ngâm m u vào c n 70% trong 1-3 phút, th I gian x lý này c ngơ ộ ằ ẫ ồ ờ ử ũ
còn tu thu c vào c ng hay m m c a m u ỳ ộ độ ứ ề ủ ẫ
- Vô trùng m u v i ch t kh trùng NaOCl 1% hay v i javel th ng ph m theo t l 1:4 hay ẫ ớ ấ ử ớ ươ ẩ ỉ ệ
1:5 trong th i gian 5-20 phút tu theo m u ờ ỳ ẫ
- R a l i b ng n c vô trùng cho s ch hoàn toàn ch t kh trùngử ạ ằ ướ ạ ấ ử
d. Vô trùng c , rủ ễ
- M u nuôi c y ph i c r a d i vòi n c ch y m nh cho th t s ch t cát bám trên m u, ẫ ấ ả đượ ử ướ ướ ả ạ ậ ạ đấ ẫ
sau ó ngâm trong n c xà phòng loãng 10 phútđ ướ
- Vô trùng s b b ng c n 70% trong 1-5 phútơ ộ ằ ồ
- Vô trùng v i ch t kh trùng có n ng và th i gian thay i tu m uớ ấ ử ồ độ ờ đổ ỳ ẫ
- R a l i b ng n c vô trùng cho th t s ch ch t kh trùngử ạ ằ ướ ậ ạ ấ ử
e. Tránh ho i m uạ ẫ
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 20 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 21 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
Trong quá trình nuôi cây th ng xu t hi n nhi m là do trong quá trình nuôi c y ã bào t ườ ấ ệ ễ ấ đ để ử
trong không khí r i vào hay m u c y ch a c vô trùng hoàn toàn. Sau m t th i gian thì bào t ơ ẫ ấ ư đượ ộ ờ ử
phát tri n nhanh chóng và có th s làm ch t m u ho c c nh tranh ch t dinh d ng làm m u ể ể ẽ ế ẫ ặ ạ ấ ưỡ ẫ
không phát tri n. Ho i m u th ng do n m m c (khu n l c có d ng s i) ho c do khu n (khu n ể ạ ẫ ườ ấ ố ẩ ạ ạ ợ ặ ẩ ẩ
l c có d ng ván nh y). N u n m ho c khu n ch m c tr6en b m t môi tr ng, ó th ng là ạ ạ ầ ế ấ ặ ẩ ỉ ọ ề ặ ườ đ ườ
nhi m do thao tác c y ch a t t; n u có kh p trong môi tr ng là nhi m do môi tr ng ch a c ễ ấ ư ố ế ắ ườ ễ ườ ư đượ

ti t trùng hoàn toàn; còn n u khu n và n m xu t phát t g c m u lan ra thì ó là do m u ch a ệ ế ẩ ấ ấ ừ ố ẫ đ ẫ ư
c kh trùng tri t . Tu theo quan sát và d a vào kinh nghi m c a ng i c y mà có nh n đượ ử ệ để ỳ ự ệ ủ ườ ấ ậ
nh chính xác v nguyên nhân gây ho i m u tìm cách kh c ph c tình tr ng này. Trong tr ng đị ề ạ ẫ để ắ ụ ạ ườ
h p các bình nuôi c y ã b nhi m, c n c h p b tr c khi em i r a s ch tránh lây lan ợ ấ đ ị ễ ầ đượ ấ ỏ ướ đ đ ử ạ để
ngu n nhi m trong khu v c c y.ồ ễ ự ấ
2.TH C HÀNHỰ
2.1 M c íchụ đ
Giúp cho sinh viên làm quen v i thao tác vô trùng m u c y và k thu t c y vô trùngớ ẫ ấ ỹ ậ ấ
2.2 D ng c , thi t b và hóa ch tụ ụ ế ị ấ
2.2.1 D ng cụ ụ:
- Bình tam giác (250mL)
- Gi y c y vô trùngấ ấ
- Bécher (c c t thu ố đố ỷ
tinh) 500mL, 1000mL
- Forceps (k p), dao c y, ẹ ấ
èn c nđ ồ
- a petri vô trùngĐĩ
2.2.2 Thi t bế ị:
- Autoclave
- T s yủ ấ
- T c y (laminar)ủ ấ
- T l nhủ ạ
- Cân k thu tỹ ậ
- Máy c t n c 2 l nấ ướ ầ
- Máy khu y tấ ừ
- pH kế
2.2.3 Hoá ch tấ
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 21 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 22 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
- Dung d ch Skoog I, II ị

và III c a môi tr ng MSủ ườ
- Stock vitamin Morel
- Stock glycin
- ng saccharoseĐườ
- Agar
- N c c t vô trùngướ ấ
- C n 90%, 70%ồ
- Dung d ch ị
hypochloride calcium 10%
- Xà phòng b tộ
2.3 Các b c ti n hànhướ ế
2.3.1 Chu n b môi tr ngẩ ị ườ
(thành ph n cho 1L môi tr ng)ầ ườ
- Skoog I (MS):100mL
- Skoog II (MS): 2mL
- Skoog III (MS): 5mL
- Vitamin Morel: 2mL
- Glycine: 2mL
- Sucrose: 30g
- pH :5,8
- Agar:7g
2.3.2 Nguyên li u th c vệ ự ật:
- Các h t cam chanh còn nguyên v n, không b h h iạ ẹ ị ư ạ
2.3.3. Các b c th c hi nướ ự ệ
- Cho h t vào bécher có ch a n c xà phòng loãng, r a h t cho s ch ch t nh t bám xung quanhạ ứ ướ ử ạ ạ ấ ớ
h tạ
- R a h t cho s ch xà phòng b ng n c c t. Ngâm h t 2phút trong c n 70%ử ạ ạ ằ ướ ấ ạ ồ
- R a h t s ch etanol b ng n c c t. Sau ó ngâm h t 10phút trong dung d ch hypochloride ử ạ ạ ằ ướ ấ đ ạ ị
calcium 10%
- Trong t c y vô trùng, r a h t cho s ch ch t kh trùng b ng cách l c h t trong n c c t vô ủ ấ ử ạ ạ ấ ử ằ ắ ạ ướ ấ

trùng (3 l n)ầ
- Ti n hành tách áo h t b ng k p và dao m vô trùng. Cho các h t v a tách b v áo vào a ế ạ ằ ẹ ổ ạ ừ ỏ ỏ đĩ
petri vô trùng có ch a gi y th m vô trùng và làm m gi y th m b ng m t ít n c c t vô trùng.ứ ấ ấ ẩ ấ ấ ằ ộ ướ ấ
- Gieo h t: gieo 4-5 h t vào các bình tam giác ch a môi tr ng nuôi c y ã c h p kh ạ ạ ứ ườ ấ đ đượ ấ ử
trùng.
- y n p bình c y và ghi rõ h tên, ngày c y, s nhóm, tên gi ng và môi tr ng.Đậ ắ ấ ọ ấ ố ố ườ
2.4 Yêu c uầ
- Th c hi n pha môi tr ng gieo h tự ệ ườ ạ
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 22 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 23 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
- Th c hi n các thao tác vô trùng ự ệ trong nuôi c yấ và k thu t gieo h tỹ ậ ạ
- Thu c các cây con vô trùng trong ng nghi mđượ ố ệ
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 23 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 24 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
BÀI 4:
NUÔI C Y Ấ NH SINH TR NGĐỈ ƯỞ
 ^ ! ^ 
1.GI I THI UỚ Ệ
Trong nuôi c yấ invitro, m t ph ng th c n gi n và th ng hay c s d ng tái sinh ch i ộ ươ ứ đơ ả ườ đượ ử ụ để ồ
invitro là nuôi c y ấ nh sinh tr ngđỉ ưở . Hi u m t cách úng ngh a thì nuôi c y ể ộ đ ĩ ấ nh sinh tr ngđỉ ưở là sử
d ng ph n mô phân sinh ng n v i 3-4 ti n phát kh i lá, t c là các ụ ầ ọ ớ ề ở ứ nh sinh tr ngđỉ ưở có kích th c ướ
t 0,1 –0,15mm tính t chóp sinh tr ng. K thu t này khá ph c t p, ph i th c hi n d i kính lúp ừ ừ ưở ỹ ậ ứ ạ ả ự ệ ướ
và kh n ng s ng sót c a m u c y có kích th c nh nh th th ng không cao, do ó ch c ả ă ố ủ ẫ ấ ướ ỏ ư ế ườ đ ỉ đượ
ti n hành khi c n nuôi c y v i m c ích t o các cây con ế ầ ấ ớ ụ đ ạ invitro s ch virus.ạ
Trên th c t ng i ta th ng nuôi c nh ch i non v i kích th c kho ng vài mm. ó có th làự ế ườ ườ ảđỉ ồ ớ ướ ả Đ ể
nh ch i ng n ho c nh ch i nách. M i đỉ ồ ọ ặ đỉ ồ ỗ nh sinh tr ngđỉ ưở nuôi c y i u ki n thích h p s t o raấ ở đề ệ ợ ẽ ạ
m t hayộ
nhi u ch i và m i ch i s phát tri n thành cây hoàn ch nh. Xét v ngu n g c c a các cây ó, ề ồ ỗ ồ ẽ ễ ỉ ề ồ ố ủ đ
có th có ba kh n ng:ể ả ă
- Cây phát tri n t ch i ng nễ ừ ồ ọ

- Cây phát tri n t ch i nách phá ngễ ừ ồ ủ
- Cây phát tri n t ch i m i phát sinh, ví d : nuôi c y o n tr h di p c a cây mãng c u ễ ừ ồ ớ ụ ấ đ ạ ụ ạ ệ ủ ầ
(Annona squamosa) s cho r t nhi u m m (buds) trên mô c y và m t s m m sau ó s phát tri n ẽ ấ ề ầ ấ ộ ố ầ đ ẽ ễ
thành ch i và sau ó s thành cây ồ đ ẽ invitro hoàn ch nh. Tuy nhiên thông th ng r t khó phân bi t ỉ ườ ấ ệ
ch i phá ng và ch i m i phát sinh. Các ph ng th c phát tri n cây hoàn ch nh t ồ ủ ố ớ ươ ứ ễ ỉ ừ nh sinh đỉ
tr ngưở nuôi c y nh sau:ấ ư
* Phát tri n cây tr c ti p:ễ ự ế
Ch y u các i t ng hai lá m m (dicotyledon) nh khoai tây, thu c lá, cam chanh, hoa ủ ế ở đố ượ ầ ư ố
cúc… Ví d : Khoai tây (ụ Solanum tuberosum):
M m ầ ( nh sinh tr ngđỉ ưở ) Ch i nách Cây→ →ồ
* Phát tri n cây thông qua giai o n protocormể đ ạ
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 24 - Biotechnology
Thí nghi m Sinh h c phân t ệ ọ ử - 25 - Biên so n : Lê Lý Thu Trâmạ ỳ
Ch y u g p các d i t ng m t lá m m (monocotyledon) nh phong lan, d a, hu … Cùng ủ ế ặ ở ố ượ ộ ầ ư ứ ệ
m t lúc ộ nh sinh tr ngđỉ ưở t o hàng lo t protocorm (proembryo) và các protocorm này có th ti p ạ ạ ể ế
t c phân chia thành các protocorm m i ho c phát tri n thành cây hoàn ch nh. B ng ph ng th c ụ ớ ặ ể ỉ ằ ươ ứ
này trong m t th i gian ng n ng i ta có th thu c hàng tri u cá thộ ờ ắ ườ ể đượ ệ ể
Ví d :Hoa lan (Orchidaceae):ụ
nh sinh tr ngĐỉ ưở Protocorm Cây→ →
Theo Champagnat (1977) và Fast (1980), các ch i non ang t ng tr ng dài 10-15cm, c a m i ồ đ ă ưở ừ ớ
nhú lá th ng c dùng làm v t li u cho vi c nuôi c y ườ đượ ậ ệ ệ ấ nh sinh tr ngđỉ ưở . t b n c d i sách Đấ ẩ đượ ộ
i vòi n c ch y và là c l t sách cho n khi th y rõ các ch i bên. Ch i non lúc này c đướ ướ ả đượ ộ đế ấ ồ ồ đượ
nhúng vào c n 70% và c kh trùng trong dung d ch kh trùng 10%(v/v). Các ch i bên c ồ đượ ử ị ử ồ đượ
l y ra và r a trong n c c t vô trùng. Sau ó, chúng c kh l i thêm 10 phút n a trong dung ấ ử ướ ấ đ đượ ử ạ ữ
d ch kh trùng 3% có ch a Tween80 và c r a l i trong n c c t vô trùng. Trong t c y vô ị ử ứ đượ ử ạ ướ ấ ủ ấ
trùng, ph n g c c a nh ngầ ố ủ ữ
ch i nh nh t c c t b và vi c c y c ti n hành. Trên các ch i l n h n, tr c h t tách b ồ ỏ ấ đượ ắ ỏ ệ ấ đượ ế ồ ớ ơ ướ ế ỏ
các lá và ph n g c b ch t do tác ng c a ch t kh trùng, sau ó c y vào môi tr ng. Ph i m t ầ ố ị ế độ ủ ấ ử đ ấ ườ ả ấ
m t th i gian t ng i dài thì protocorm m i c thành l p. Các protocorm này c c t ra và ộ ờ ươ đố ớ đượ ậ đượ ắ
c y chuy n vào môi tr ng m i. Ngày nay, ng i ta th ng c y các nh ch i l n h n (mang 3-4 ấ ề ườ ớ ườ ườ ấ đỉ ồ ớ ơ

ti n phát kh i lá) vì d thành công h n là c y các nh ch i ch có 2 ti n phát kh i lá. N u ề ở ễ ơ ấ đỉ ồ ỉ ề ở ế
protocorm không c c t kh i m u c y thì nó phát tri n thành c i và ra r ; n u c tách ra kh iđượ ắ ỏ ẫ ấ ễ ồ ễ ế đượ ỏ
m u c y thì s có s thành l p các protocorm b t nh m i t các peotocorm ban u.ẫ ấ ẽ ự ậ ấ đị ớ ừ đầ
Khi c y ấ nh sinh tr ngđỉ ưở c a ủ Cymbidium ch có vùng xung quanh ti n phát kh i lá u lên và ỉ ề ở
cu i cùng t o thành protocorm. S thành l p protocorm có th c t o ra mà không c n có ố ạ ự ậ ểđượ ạ ầ nh đỉ
sinh tr ngưở ng n. Khi c y nh sinh tr ng c a ọ ấ đỉ ưở ủ Cattleya, các mô th ng nhanh chóng hoá nâu. Vìườ
lý do ó mà đ nh sinh tr ngđỉ ưở c c t trong môi tr ng l ng ho c n c c t vô trùng và c v y đượ ắ ườ ỏ ặ ướ ấ đượ ấ
trong môi tr ng l ng, nh ó các ch t nâu d khuy ch tán vào trong môi tr ng và ít gây nh ườ ỏ ờđ ấ ễ ế ườ ả
h ng n mô c y (Fast, 1980). ưở đế ấ ỞCattleya, ng i ta th ng tách m t ch i (3-5mm) v i nhi u ườ ườ ộ ồ ớ ề
ti n phát kh i lá. Môi tr ng c y ế ở ườ ấ Cattleya th ng ph c t p h n môi tr ng c y Cườ ứ ạ ơ ườ ấ ymbidium (Fast,
1980 và Champanat,1977) ôi khi có ch a auxin, cytokinin, n c d a và peptone. S thành l p đ ứ ướ ừ ự ậ
protocorm ởCattleya m t nhi u th i gian và luôn c t o ra ph n g c c a lá già nh t; th c t ấ ề ờ đượ ạ ở ầ ố ủ ấ ự ế
Công Nghệ Sinh Học Việt Nam - 25 - Biotechnology