Nguyên lý và ứng dụng của phương pháp PCR trong phát hiện và chẩn đoán bệnh ở động vật thủy sản

Nguyên lý và ứng dụng của
phương pháp PCR trong phát
hiện và chẩn đoán bệnh ở động
vật thủy sản

Kết quả chẩn đoán bệnh phụ thuộc rất lớn vào:
2. tính sẵn có của phương pháp chẩn đoán đang
được áp dụng ở phòng thí nghiệm
3. lảnh vực nghiên cứu của người chẩn đoán
4. những phép chẩn đoán được phát triển trên cơ
sở các loài địa phương.
Chẩn đoán bệnh ở thủy sản

Nắm vững nguyên tắc của các kỹ thuật
Nắm vững nguyên tắc của các kỹ thuật
đoán và cách đọc kết quả một cách chuẩn
đoán và cách đọc kết quả một cách chuẩn
xác có ý nghĩa rất quan trọng.
xác có ý nghĩa rất quan trọng.
Chẩn đoán bệnh ở thủy sản

Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu
1. thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu là một trong những yếu tố quan
trọng ảnh hưởng đến kết quả của các phép chẩn đoán bệnh
2. thời gian thu mẫu, khoảng cách giữa các lần thu mẫu, phương pháp cố
định mẫu, nhiệt độ bảo quản mẫu, chất lượng của môi trường phân
lập, thời gian sử dụng của các dung dịch hoá chất sau khi chuẩn bị, vv,
cần được cân nhắc trong quá trình phân tích mẫu.
3. số lần mẫu được đông lạnh rồi rả đông cũng ảnh hưởng đến kết quả
phân tích

→ Giữa các phòng thí nghiệm và các phép phân tích được sử dụng phải
đồng nhất thì kết quả đạt được mới có ý nghĩa về mặt so sánh.

Các vấn đề khác
Cần phải thiết lập những giá trị giới hạn cho những phép
phân tích mà kết quả thu được có tính định lượng để xác
định kết quả âm tính và dương tính.
Giá trị giới hạn này sẽ ảnh hưởng đến kết quả âm tính và
dương tính giả cũng như kết quả âm và dương tính thật.

Tính hiệu lực của phương pháp
Một phương pháp phân tích có tính hiệu lực là phương pháp có
thể cho ra kết quả phân biệt rỏ ràng giữ kết quả dương tính và âm
tính hoặc giữa cá thể bị nhiễm bệnh và không bị nhiệm bệnh.
Tính hiệu lực của phương phá biểu hiệu qua hai đặc điểm:
–
Tính nhạy (khả năng xác định chính xác mẫu có nhiễm hay
không)
–
Tính chuyên biệt (khả năng phát hiện mẫu không có nhiễm bệnh)

Tính hiệu lực của phương pháp được xác định bằng cách so sánh
các cá thể cùng loài trong cùng một mẫu. Trong trường hợp khác
kết quả phải được kiểm định bằng các kỹ thuật mô học.

Tính ổn định của phương pháp
Một phương pháp được gọi là ổn định khi phương
pháp đó cho ra kết quả tin cậy và giống nhau sau nhiều
lần lập lại.
Hai yếu tố quyết định cho tính ổn định của phương

pháp là:
- biến động giữa các cá thể phân tích
-
biến động giữa các lần đọc kết quả

Kary Mullis
Giải Nobel hóa học
(1993)
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

PCR là phương pháp khuếch đại nhanh
và nhạy có chọn lọc môt trình tự
DNA/RNA nhất định từ một mạch khuôn
axit nucleic
Phương pháp PCR là gì?

Nguyên tắc

Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (một mồi xuôi và
một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen).
Mồi là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của
mạch khuôn, và ADN polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.
Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN thì
chỉ đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tồng hợp. Hai mồi này gồm mồi xuôi và
mồi ngược theo chiều phiên mã gen.
PCR.EXE

Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung
dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho

sự sao chép, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ
cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng,
thường là ở 92-95
oC
trong vòng 30 giây đến 1 phút.

Giai đoạn lai (hybridization): Nhiệt độ dược hạ thấp
hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với
khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động
trong khoảng 37-65
oC
tùy thuộc Tm của các mồi sử
dụng và kéo dài từ 30 giây - 1phút.

Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension):
Nhiệt độ được tăng lên đến 70-72
o
C giúp cho ADN
polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian tùy thuộc
độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo
dài từ 30 giây đến nhiều phút.

Chu kỳ gồm ba giai đoạn nói trên sẽ được lặp đi lặp
lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng gấp đôi lượng
ADN của lần trước. Sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ
là 10
6
so với lượng bản mẫu ban đầu. PCR.EXE
Các giai đoạn của PCR

90
80
70
60
50
40
Giai đoạn Biến tính

90
80
70
60
50
40
Giai đoạn lai

90
80
70
60
50
40
Giai đoạn kéo dài

Sản phẩm PCR đầu tiên

Khuếch đại trình tự mong muốn

•
Mạch khuôn (template)

•
Mồi (Primers)
•
dNTPs: dATP, dCTP, dGTP and dTTP
•
Thermostable DNA polymerase (enzym chịu
nhiệt xúc tác quá trình tổng hợp DNA)
•
PCR buffer (dung dịch PCR): có chứa Mg
2+

cần cho hoạt động của men DNA polymerase
CD
Thành phần của PCR

•
Hệ gen DNA
•
Hệ gen RNA, mRNA
•
Máu (huyết tương)
•
Các mô cơ thể (i.e. nơi bị nhiễm)
Mạch khuôn

•
Mồi thường được thiết kế có trình tự
bổ sung với mạch khuộn DNA
•
Chiều dài đoạn mồi khoảng 20-30 nt

•
Nhiệt độ nóng chảy khoảng 55-65°C
và tương thích giữa mồi xuôi và mồi
ngược
•
Mồi cần phải có xấp xỉ số bazơ nitơ
A, T, G,C và tránh các vùng
polypurines hay polypyrimidines
•
Tránh sự tạo thành hairpin loop
•
Trình tự phần đầu 3’ kết thúc (3’-end)
của mồi không bổ sung nhau
(để giảm “primer
dimer”)
A
A
A
T
T
T
G
G
C
C
5’3’
5’ 3’
5’ 3’
OH 3’
3’HO

5’
5’
Thiết kế mồi

•
GenomeWeb Primer Design at MRC
/>•
Primer 3 at the MTI Whitehead Institute
/>bin/primer/primer3_www.cgi
•
GeneFisher at Bielefeld University, Germany
/>•
Standford University’s Web Primer
/>•
NetPrimer by Premier Biosoft International
/>Web thiết kế mồi

Mồi từ 14-70 nucleotides

Tms = 81.5 + 16.6 (log10 [J+] + 0.41 (%G+C) - (600/l)

Mồi từ 20-35 nucleotides

Tm = 22 + 1.46 [2(G+C)+ (A+T)]

Mồi ngắn hơn 20 nucleotides
Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
Nhiệt độ nóng chảy (Melting Temperature-Tm)

Bước 1

Biến tính (92
o
C - 95
o
C)
tách hai mạch AND
xoắn kép thành 2 mạch đơn
Bước 2
Lai (37
o
C - 65
o
C) Mồi
lai với trình tự bổ sung trên
mạch khuộn DNA
Bước 3
Kéo dài (70
o
C- 72
o
C)
polymerase tổng hợp DNA
mới
Lai
37°C- 65°C
Kéo dài
70°C-72°C
25-35 CYCLES
Biến tính
92°C- 95°C

Biến tính
93°C - 95°C
Chu kỳ nhiệt

Exponential amplification
(khuếch đại theo cấp số nhân)

“Exponential phase” “Plateau phase”
10
5
10
7
10
9
10
11
10
13
10 20 6030 40 500
Số chu kỳ
Số bản sao được tạo ra
Sảm phẩm theo lý thuyết
Sản phẩm thực tế
Plateau Effect

Tối ưu hóa PCR
•
DNA template concentration
–
Hàm lượng: 5-100 ng

–
Tinh sạch
•
Nồng độ MgCl2 : 1.0 - 6.0 mM
•
Taq DNA polymerase: 1-5 units
•
Nhiệt độ lai
•
Số chu kỳ PCR: 25-40 cycles
•
Thể tích PCR: 13-100 µl