Các xét nghiệm vi sinh vật trong nước

Các xét nghiệm vi sinh vật trong nước
ThS. Trần Thị Thoa
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
1. Thao tác được cách lấy mẫu nước và xét nghiệm một số chỉ số vi sinh của mẫu
nước
2. Trình bày được nguyên tắc phát hiện, cách xác định các chỉ số Tổng Coliform,
Fecal coliform, E. Coli giả định, tổng vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kỵ khí trong nước.
3. Nhận định kết quả xét nghiệm và đánh giá được chất lượng mẫu nước về phương
diện vi sinh
NỘI DUNG
1. Các chỉ số cơ bản để đánh giá chất lượng mẫu nước về
mặt vi sinh.
Việc đánh giá nguy cơ của chất lượng nước về mặt vi sinh học là một việc làm phức
tạp. Nguy cơ lớn nhất về vi sinh vật liên quan đến việc ăn uống phải nước đã bị nhiễm
bẩn bởi phân người và súc vật. Bởi vậy có nhiều tiêu chuẩn đưa ra các phương pháp
định tính và định lượng các vi khuẩn chỉ điểm phân trong nước, bao gồm các loại vi
khuẩn:
- Vi khuẩn nha bào kỵ khí khử sunfit ( Clostridium perfringens)
- Tổng Coliform
- Coliform chịu nhiệt
- Escherichia Coli (E. coli).
Trong đó E. coli là vi khuẩn đặc hiệu nhất trong số các vi khuẩn chỉ điểm phân vì vậy
nó được giới thiệu như một loại chỉ danh về chất lượng nước uống. Coliform chịu
nhiệt có thể được sử dụng để thay thế E. coli. Loại vi khuẩn này còn được khuyến cáo
như những vi sinh vật chỉ điểm về hiệu quả của quá trình xử lý nhằm loại bỏ những tác
nhân gây bệnh đường ruột và vi khuẩn từ phân hoặc để đánh giá việc cải tạo chất
lượng nguồn nước. Nước sau xử lý không được có coliform. Sự hiện diện của loài vi
khuẩn này chứng tỏ công tác xử lý chưa đảm bảo hoặc nước bị tái nhiễm sau xử lý
hoặc chứa nhiều chất dinh dưỡng.
1

Ngoài ra còn có thể xác định thêm số lượng vi khuẩn hiếu khí sống trong nước để đánh
giá những thay đổi trong việc xử lý nước tại hệ thống cung cấp nước, trợ giúp thêm
cho việc xử lý nước tại hệ thống cung cấp nước, trợ giúp thêm cho việc đánh giá chất
lượng vi khuẩn học nguồn nước.
2. Phương pháp lấy mẫu để xét nghiệm vi khuẩn trong
nước
Tuỳ thuộc mục đích và yêu cầu kiểm nghiệm hay nghiên cứu mà xác định địa điểm và
thời gian lấy mẫu. Ví dụ: để xác định tính chất vệ sinh của nguồn cung cấp nước cho
nhà máy nước (nước ngầm, nước bề mặt) thì lấy mẫu ở nhiều địa điểm khác nhau,
nhiều thời gian khác nhau của các mùa trong năm. Để kiểm tra sự hoạt động của quy
trình sản xuất nước của nhà máy nước thì cần lấy mẫu sau mỗi công đoạn sản xuất
(nước nguồn, lắng, lọc v.v ). Hoặc đánh giá tình trạng ô nhiễm bởi vi sinh vật ở các
dòng sông ao, hồ giếng nước ở các vùng khác nhau.
2.1.Dụng cụ lấy mẫu:
Tất cả dụng cụ lấy mẫu nước để xét nghiệm vi khuẩn trong nước cần được đảm bảo vô
trùng và sấy khô 180
o
x 30 phút.
Dụng cụ :
- Quang chai và dây để lấy mẫu.
- Lọ thuỷ tinh dung tích 250-500ml có nút đậy kín.
- Thùng đựng đá, phích đá để bảo quản và vận chuyển về phòng xét nghiệm.
- Cồn 90
o
, tăm bông.
- Diêm, bút chì, sổ sách ghi chép.
2.2. Cách lấy mẫu:
2.2.1. Đối với nước máy:
Mỗi nhà máy cần lấy 3-4 mẫu của từng công đoạn sản xuất:
1 mẫu chưa xử lý

1-3 mẫu qua bể lắng - lọc
1-2 mẫu ở bể chứa
1-2 mẫu trước khi bơm vào mạng lưới đường ống. Ngoài ra 1-2 mẫu ở các vòi xa nhà
máy nước.
2
Mỗi mẫu lấy 100-500 ml. Trước khi lấy mẫu cần ghi rõ mẫu nước lấy vào nhãn chai.
Trước khi lấy mẫu khoá chặt vòi nước lại dùng tăm bông tẩm cồn để đốt miệng vòi 1-2
phút sau đó mở vòi cho nước chảy 1-2 phút. Mở nút chai lấy mẫu, dùng bông tẩm cồn
đã đốt cháy, hơ miệng chai để tiệt khuẩn. Lấy đầy 9/10 chai, đậy nút chặt.
Nếu nước ở các bể chứa, phải dùng quang chai bằng kim loại đã lắp sẵn chai vô khuẩn
để lấy mẫu nước. Nếu tiếp tục lấy mẫu bằng quang thì cần sát khuẩn quang. Khi lấy
mẫu thả quang vào bể ở độ sâu 30-40cm, kéo nắp chai cho nước vào chai. Sau đó kéo
lên và đậy nút chặt.
2.2.2. Đối với nước bề mặt (ao, hồ, sông, suối):
Căn cứ vào bề mặt rộng hay hẹp, mục đích xét nghiệm mà định ra địa điểm lấy mẫu
cho phù hợp.
- Đối với sông: Có thể lấy ở 3 vị trí: Giữa dòng và 2 mẫu ở 2 bên bờ. Khoảng cách
lấy mẫu tuỳ thuộc vào yêu cầu xét nghiệm. Dùng quang chai lắp sẵn chai vô khuẩn,
thả xuống mặt nước ở độ sâu cần thiết (thường 30-40cm) cách xa bờ 1-5m.
- Đối với ao hồ: thường lấy các mẫu xung quanh và một mẫu giữa hồ. Cách lấy mẫu
như ở sông.
Ngoài ra tuỳ thuộc vào mục đích xét nghiệm và nghiên cứu số lượng mẫu có thể tăng
hoặc giảm.
2.2.3. Đối với giếng khơi:
Dùng quang chai vô khuẩn và chai để lấy mẫu. Nguyên tắc và cách lấy mẫu như trên.
Nhưng phải thận trọng không để chai và vào thành giếng. Nếu chỉ có một quang mà
phải lấy nhiều giếng thì phải sát khuẩn lại trước khi chuyển sang lấy mẫu ở giếng
khác. Cũng có thể dùng gầu múc, nhưng đổ nước gầu đầu tiên đi.
2.2.4. Đối với nước ở các mũi khoan địa chất:
Nếu có vòi thì cũng lấy như ở nhà máy nước.

Trên mỗi lọ đựng mẫu phải ghi rõ: Thời gian, địa điểm lấy mẫu, tình hình thời tiết
(nhiệt độ, không khí, mưa, nắng ) tình hình vệ sinh nguồn nước, các nguồn có thể gây
ô nhiễm nước xung quanh nguồn nước. Yêu cầu xét nghiệm và mục đích sử dụng
nguồn nước. Cơ quan yêu cầu xét nghiệm.
3
2.3. Bảo quản và vận chuyển
Mẫu nước sau khi lấy mẫu cần được kịp thời chuyển về phòng xét nghiệm càng sớm,
càng tốt. Mẫu nước cần được kiểm nghiệm sau 2 giờ kể từ lúc lấy mẫu. Trường hợp
không có điều kiện phân tích ngay có thể để trong hòm đá, phích đá. Tủ lạnh trong 6
giờ ở nhiệt độ 0-5
o
C.
Không được gửi qua bưu điện, tốt nhất là cán bộ y tế lấy mẫu, gửi mẫu và nắm rõ lý
lịch của mẫu nước và báo cáo với phòng xét nghiệm để cùng nhau đánh giá kết quả xét
nghiệm.
3. Phương pháp nuôi cầy xác định vi khuẩn hiếu khí
Hiện nay có ba phương pháp thường được sử dụng để xác định số lượng vi khuẩn hiếu
khí trong 1ml mẫu nước: Phương pháp rót thạch, phương pháp dàn trên thạch và
phương pháp màng lọc. Phương pháp rót thạch là phương pháp đơn giản, rẻ tiền, dễ
thực hiện và cũng cho kết quả chính xác. Tuy nhiên đòi hỏi nghiêm ngặt trong việc
theo dõi nhiệt độ thạch nuôi cấy để tránh “sốc nhiệt độ” và việc cấy chuyển cũng như
nhận định khuẩn lạc mọc sâu trong thạch khó khăn hơn những khuẩn lạc phát triển
trên bề mặt thạch.
3.1. Dụng cụ, thiết bị, hoá chất, môi trường
- Tủ ấm 35-37
o
.
- Pipet 10ml, 2ml có chia độ đã khử trùng hoặc micropipét và các đầu típ tương ứng
dùng trong kỹ thuật vi sinh (các đầu típ và các giá đầu típ khử trùng được bằng
phương pháp ướt).

- Hộp lồng 57 hoặc 65cm
2
đã khử trùng.
- Đèn cồn.
- Nước muối sinh lý, đóng 9m đã khử trùng.
- Thạch dinh dưỡng, có thể có nhiều công thức. Công thức hay được sử dụng là:
+ Pepton 5g
+ Cao thịt 2,5g
+ Glucose 1g
+ Agar 15g
+ Nước cất 1lit
4
Sau sấy hấp 121
o
C/15phút, pH = 7,0 ± 0,2
3.2. Tiến hành:
- Chuẩn bị nơi làm việc: Kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí đòi hỏi thao tác vô
trùng tuyệt đối. Cần khử trùng không khí, bàn làm việc trước khi tiến hành phân tích.
- Chuẩn bị mẫu và môi trường đồng thời:
+ Đun thạch dinh dưỡng cho tan chảy, mỗi mẫu cần khoảng 100ml thạch.
+ Mỗi mẫu cần 4 hộp lồng để cấy hai đậm độ khác nhau, mỗi đậm độ 2 hộp lồng.
Cần chú ý có đối chứng dương tính và đối chứng âm tính cho thạch và cho thao tác vô
trùng. Do đó, mỗi mẫu cần 6 hộp lồng.
Ghi nhãn, ký hiệu mẫu trên mỗi hộp lồng: Ký hiệu mẫu, đậm độ pha loãng và thể tích
cấy.
+ Chọn hai đậm độ nuôi cấy thích hợp, tuỳ theo ước đoán mức độ ô nhiễm của
mẫu nước.
+ Mỗi đậm độ hút 2 ml nước, mở hé hộp lồng 1ml nước theo đúng nhãn đã ghi trên
hộp lồng.
Chuẩn bị xong hộp lồng. Lấy thạch đã đun chảy và để nguội 45

o
C rót vào từng hộp
lồng, đậy nắp và xoay tròn nhẹ nhàng từ phải sang trái rồi ngược lại để trộn đều thạch
với nước mẫu đã cấy. Cần chú ý từ khi cấy mẫu vào hộp lồng đến khi rót thạch không
quá 15 phút.
Để thạch đông lại, lập úp đĩa thạch và đem ủ ở tủ ấm 35-37
o
trong 24 giờ.
3.3. Đọc kết quả và báo cáo:
- Nếu trên hộp lồng có từ 30-300 khuẩn lạc mọc là tốt nhất. ta chỉ việc đếm số khuẩn
lạc bằng mắt thường hoặc máy đếm. và theo độ pha loãng trên đĩa thạch mà tính ra
tổng số khuẩn lạc trên 1ml mẫu nước nuôi cấy. Kết quả là trung bình cộng của 4 đĩa,
nếu 2 đĩa đối chứng đạt yêu cầu chứng dương tính và chứng âm tính.
- Nếu cả 4 đĩa không có khuẩn lạc nào mọc mà ta đã cấy ở đậm độ nguyên, tối đa
2ml mẫu nước và mẫu chứng dương có khuẩn lạc mọc, báo cáo ghi: 1 khuẩn lạc/1ml.
Ngược lại, nếu tất cả các hộp lồng đều trên 300 khuẩn lạc, ta phải pha loãng tiếp và
cấy lại. Hoặc chọn đếm từng cm
2
nếu đếm được, độ chừng 4 cm
2
đến 10 cm
2
, hoặc
chia góc: 1/4, 1/8 và nhân lên với tổng diện tích cả hộp lồng, nếu mẫu chứng âm tính
5
không có khuẩn lạc mọc. Rồi cũng từ đậm độ pha loãng mà tính ra tổng số khuẩn lạc
trong 1ml mẫu nước.
4. Xác định tổng số Coliform, Fecal Coliform và E. Coli
giả định bằng phương pháp nhiều ống (MPN)
4.1. Phạm vi áp dụng

Phương pháp này để phát hiện và đếm số lượng vi khuẩn coliform, coliform chịu nhiệt
và Escherichia coli giả định có trong nước bằng cách nuôi cấy trong một môi trường
lỏng ở một hệ gồm nhiều ống nghiệm và tính toán số có xác xuất cao nhất của chúng
có trong mẫu thử.
Phương pháp này có thể áp dụng cho mọi loại nước, kể cả các loại nước có chứa một
lượng đáng kể các chất lơ lửng
4.2.Định nghĩa:
4.2.1. Coliform là những sinh vật có khả năng sinh trưởng hiếu khí ở nhiệt độ 35 ± 0,5
o
C - 37 ± 0,5
o
C trong vòng 48 h trong môi trường nuôi cấy có lactosa sinh acid, sinh
khí. Chúng được tìm thấy trong phân người, động vật và cả trong môi trường như đất,
nước rau quả Chúng được coi là chỉ điểm vệ sinh quan trọng, nhất là với nguồn nước
được xử lý. Sự có mặt của Coliform chứng minh rằng biện pháp khử trùng chưa đạt
hiệu quả.
4.2.2. Fecal Coliform là các vi khuẩn Coliform chịu nhiệt có cùng đặc tính lên men
trong vòng 24 h ở nhiệt độ 44
0
C ± 0,2
0
C hoặc 44,5
0
C± 0,2
0
C. Chúng chỉ có trong phân
người và động vật máu nóng. Bởi vậy Fecal Coliform được coi là chỉ điểm vệ sinh
quan trọng, nhất là nguồn nước không được xử lý. Sự có mặt của vi khuẩn này ở ngoại
cảnh chứng tỏ đã có sự ô nhiễm do phân người và động vật máu nóng.
4.2.3. Escherichia coli giả định là các vi khuẩn Coliform chịu nhiệt có khả năng sinh

indol từ tryptophan trong vòng 24 h, hoặc ở nhiệt độ 44
0
C ± 0,2
0
C hoặc ở 44,5
0
C±
0,2
0
C.
4.2.4. Escherichia coli (E.coli) có thể được xem là E. coli giả định, chúng cũng cho
một kết quả dương tính trong phép thử metyl đỏ và có thể loại cacboxyl của acid
glutamic, nhưng chúng không có khả năng tạo ra metyl acetyl cacbinol, sử dụng xitrat
như nguồn cung cấp cacbon duy nhất, hoặc sinh trưởng trong canh thang kali xyanua
(KCN).
6
Việc phát hiện E.coli giả định trong nước của phương pháp này, thông thường là để
cung cấp một chứng cứ của sự ô nhiễm phân.
4.3. Nguyên tắc:
Cấy các phần mẫu thử đã được pha loãng hoặc không pha loãng vào một dãy ống
nghiệm chứa một môi trường nuôi cấy chọn lọc dạng lỏng có lactosa.
Kiểm tra các ống thử sau 24 h và 48 h nuôi ở nhiệt độ hoặc 35
0
C hoặc 37
0
C; cấy
chuyển tiếp từ mỗi ống có biểu hiện đục kèm theo sinh khí vào một môi trường khẳng
định chọn lọc hơn để tìm Coliform và Fecal Coliform và khi muốn tìm E. Coli giả định
cấy vào một môi trường mà qua đó có thể quan sát thấy sự tạo thành indol.
Nuôi các môi trường khẳng định này cho tới 48 h ở nhiệt độ hoặc 35

0
C hoặc 37
0
C để
phát hiện các vi khuẩn coliform, và ở 44
0
C trong khoảng 24h để phát hiện các loại
coliform chịu nhiệt và E. Coli giả định.
Bằng phương pháp thống kê, tính toán số xác xuất cao nhất của các dạng coliform,
coliform chịu nhiệt và E. Coli giả định có thể có mặt trong 100ml mẫu thử, từ số các
ống thử cho kết quả xác nhận dương tính.
4.4. Dung dịch pha loãng, môi trường nuôi cấy và thuốc thử
Các nguyên liệu chính:
Sử dụng các hoá chất thuộc loại phân tích để pha chế môi trường nuôi cấy và thuốc
thử, tuân theo các chỉ dẫn cách pha chế các môi trường. Nếu sử dụng các môi trường
hoàn chỉnh dạng khô và theo sát chỉ dẫn của nhà sản xuất.
Để pha chế các môi trường, sử dụng nước cất bằng dụng cụ thuỷ tinh hoặc nước đã
loại ion, không chứa các chất có thể ức chế sinh trưởng của vi khuẩn trong các điều
kiện thử.
4.4.1. Dung dịch pha loãng
Để tạo nên các độ pha loãng của mẫu thử, sử dụng một trong các dung dịch pha loãng
sau:
- Nước pepton (0,1%)
Pepton 1,0g
Nước cất 1000ml
7
Hoà tan pepton trong khoảng 950 ml nước. Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH hoặc HCl
(1 mol/l), sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,1. Thêm nước cất cho đủ 1000 ml,
phân phối thành các lượng phù hợp và khử trùng ở 121
0

C ± 1
0
C trong 15 phút.
- Dung dịch pepton- muối:
Pepton 1,0g
Natri clorua (NaCl) 8,5g
Nước cất 1000ml
Hoà tan các thành phần trên trong khoảng 950 ml nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH
bằng dung dịch NaOH hoặc HCl (1 mol/l) sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,1
Thêm nước cất cho đủ 1000 ml, phân phối thành các lượng phù hợp và khử trùng ở
121
0
C ± 1
0
C trong 15 phút.
- Dung dịch Ringer- nồng độ một phần tư
Natri clorua (NaCl) 2,25 g
Kali clorua (KCl) 0,105g
Canxi clorua khan 0,12g
Natri hidro cacbonat 0,05g
Nước cất 1000 ml
Hoà tan các thành phần trên và phân phối thành các lượng phù hợp. Khử trùng ở
121
0
C ± 1
0
C trong 15 phút. pH cuối cùng phải là 7,0 ± 0,1.
- Dung dịch đệm photphat:
Kali hidro photphat (KH
2

PO
4
) 42,5 mg
Magie clorua (MgCl
2
) 190 mg
Nước cất 1000 ml
pH cuối cùng phải là7,0 ± 0,1.
4.4.2. Môi trường phân lập
- Canh thang lactosa đặc, đóng ống 10ml, có ống sinh hơi.
Công thức:
Pepton 10g
8
Cao thịt 6g
Lactosa 10g
Bromocresol tía 0,02g
Nước cất 1000ml.
- Canh thang Lactosa loãng được pha chế bằng cách pha loãng canh thang lactosa
đặc với một thể tích nước cất tương đương hoặc có thể làm riêng bằng cách giảm một
nửa lượng các chất trong thành phần, đóng ống 5ml, có ống sinh hơi.
Sau khi đóng ống sấy hấp 121
o
/15ph sao cho pH = 6,9 ± 0,2.
Hoặc có thể sử dụng canh thang MacConkey:
- Canh thang MacConkey đặc:
Muối mật 10 g
Pepton 40 g
Lactosa 20g
Natri clorua 10 g
Bromo cresol tía

dung dịch 1% (v/v) pha trong etanol 2ml
Nước cất 1000ml
pH 7,4 ± 0,2
- Canh thang MacConkey loãng:
Chuẩn bị canh thang MacConkey loãng bằng cách pha loãng môi trường MacConkey
đặc với một thể tích nước cất tương đương, hoặc có thể làm riêng bằng cách giảm một
nửa lượng các chất trong thành phần.
Phân phối môi trường nồng độ loãng thành các lượng 5 ml/ống và môi trường nồng độ
đặc thành từng lượng 10 ml, có ống sinh hơi. Hấp ở 115
0
C trong 10 phút.
4.4.3. Môi trường khẳng định:
- Canh thang BGBL (Brilliant Green Bile lactosa ), đóng ống 5ml, có ống sinh
hơi.
Để khẳng định sự có mặt của vi khuẩn Coliform.
9
Công thức:
Pepton 10g
Lactosa 10g
Muối mật 1,5g
Brilliant Green 0,0133g
Nước cất 1000ml.
Sau khi đóng ống sấy hấp 115
o
/10ph sao cho pH = 7,2 ± 0,2.
- Môi trường EC (kiểm tra tính sinh khí).
Để khẳng định sự có mặt của vi khuẩn Coliform chịu nhiệt.
Công thức:
Tryptoza 20g
Lactosa 5g

Bilesalt mixture 1,5g
Dikali hidro photphat (K
2
HPO
4
) 4g
Kali dihidro photphat KH
2
PO
3
) 1,5g
Sodium chloride 5g
Nước cất 1000ml
pH = 6,9 ± 0,2
Khử trùng, đóng ống như canh thang BGCL.
- Nước trypton (thử phản ứng indol)
Để khẳng định sự có mặt của E.coli giả định
Một vài loại pepton cho các kết quả tốt với các phép thử ở 35
0
C hoặc 37
0
C thì lại
không thoả mãn với phép thử indol ở 44
0
C. Người ta thấy trypton thoả mãn các điều
kiện đó và kiến nghị dùng nó.
Trypton 20 g
Natri clorua 5 g
Nước cất 1000 ml
10

Hoà tan các thành phần trên và chỉnh pH đến 7,5. Phân phối vào từng lượng 5 ml và
hấp ở 115
0
C trong 10 phút
4.5. Thiết bị, dụng cụ:
Các thiết bị thông thường của phòng thí nghiệm vi sinh gồm có:
- Tủ sấy hơi nóng để khử trùng khô và nồi hấp áp lực
- Tủ ấm hoặc bể điều nhiệt có thể điều chỉnh được nhiệt độ hoặc 35
0
C ± 0,5
0
C hoặc
37
0
C ± 0,5
0
C.
- Tủ ấm hoặc bể điều nhiệt có thể điều chỉnh được nhiệt độ hoặc 44
0
C ± 0,25
0
C hoặc
44,5
0
C ± 0,25
0
C.
- pH mét
- Pipet khắc vạch 10ml –1ml vô khuẩn hoặc micropipet và các đầu típ vô khuẩn
tương ứng.

- Que cấy, đèn cồn.
- Các ống nghiệm vô khuẩn
4.6.Cách tiến hành:
4.6.1. Chuẩn bị mẫu:
Chọn đậm độ mẫu nuôi cấy tuỳ theo nguồn nước đã xử lý hay không, sạch hay bị
nhiễm bẩn.
+ Trường hợp nước đã xử lý, nước sạch nên chọn cấy phương pháp 7 ống: sắp xếp 5
ống canh thang lactosa đặc và 2 ống canh thang lactosa loãng.
+ Trường hợp nước chưa xử lý, chọn phương pháp cấy nhiều ống xếp 5 hàng, mỗi
hàng 3 hoặc 5 ống, hàng đầu là những canh thang lactosa đặc và 4 hàng sau là những
ống canh thang lactosa loãng.
4.6.2. Pha loãng mẫu:
+ Phương pháp 7 ống không cần pha loãng mẫu
+ Phương pháp nhiều ống: pha loãng bằng cách hút vô khuẩn 1ml nước nguyên cho
vào ống chứa 9ml dung dich pha loãng mẫu để có đậm độ pha loãng 10
-1
. Hút trộn lên
xuống 20-25 lần để trộn đều mẫu với dung dịch pha loãng. Từ đậm độ này, lại hút 1ml
11
chuyển sang ống chứa dung dịch pha loãng mẫu thứ 2, có đậm độ pha loãng 10
-2
. Cứ
như thế pha loãng tới đậm độ cần thiết. Mỗi đậm độ thay pipet mới.
4.6.3. Cấy mẫu bước 1 (nuôi cấy để phân lập):
a. Phương pháp cấy 7 ống:
5 ống canh thang lactosa đặc, mỗi ống cấy 10ml nước mẫu ở đậm độ nguyên chất.
1 ống canh thang lactosa loãng, cấy 1 ml nước nguyên.
1 ống canh thang lactosa loãng cấy 1ml nước ở đậm độ pha loãng 10
-1
hoặc 0,1ml

nước nguyên.
b. Phương pháp cấy nhiều ống:
Nếu có điều kiện nên nuối cấy mỗi hàng 5 ống. Nếu phải tiết kiệm môi trường có thể
mỗi hàng 3 ống:
+ Hàng thứ nhất xếp 3 ống canh thang lactosa đặc, cấy mỗi ống 10 ml nước
nguyên chất.
+ Hàng thứ 2 xếp 3 ống canh thang lactosa loãng, cấy mỗi ống 1 ml nước nguyên
chất.
+ Hàng thứ 3 xếp 3 ống canh thang lactosa loãng, cấy mỗi ống 1ml mẫu nước đậm
độ pha loãng 10
-1
.
+Hàng thứ 4,5 cứ thế cấy đến đậm độ cần thiết.
Nuôi cấy: Nuôi các ống môi trường đã cấy mẫu trong 48 h ở nhiệt độ 35
0
C ± 0,5
0
C
hoặc 37
0
C± 0,5
0
C, lấy ra đọc kết quả bước 1.
c. Đọc kết quả bước 1:
Kiểm tra các ống mẫu cấy sau 18÷24 h nuôi ấm và coi là phản ứng dương tính đối với
những ống có biểu hiện đục do vi khuẩn lên men lactosa sinh acid, chuyển màu môi
trường tím sang vàng và sinh hơi trong ống sinh hơi.
Nuôi tiếp trong tủ ấm những ống nghiệm chưa có bất kỳ dấu hiệu nào hoặc mọi biến
đổi nói trên và kiểm tra lại chúng sau 48 h để tìm phản ứng dương tính.
Ghi tất cả những ống (+) theo các đậm độ cấy.

Ví dụ phương pháp 7 ống:
+ 5 ống canh thang lactosa đặc, cấy 10ml, (+), ghi 5
12
+ 1 ống canh thang lactosa loãng (+) ghi 1
+ 1 ống canh thang lactosa loãng (+) ghi 1
Kết quả sẽ là 3 số là 5 11. Trường hợp tất cả các ống (+) như vậy, cần tiếp tục pha
loãng và cấy theo phương pháp nhiều ống, bắt đầu bằng nhắc lại đậm độ (+) loãng
nhất vừa cho, ở đây là 10
-1
và ít nhất phải cấy 2 đậm độ tiếp theo nữa là 10
-2
, 10
-3
.
Ví dụ phương pháp nhiều ống:
+ 3 ống canh thang lactosa đặc, cấy 10ml, (+) cả 3 ghi 3
+ 3 ống canh thang lactosa loãng, cấy 1ml nước nguyên, (+) cả 3 ghi 3
+ 3 ống canh thang lactosa loãng, cấy 1ml nước 10
-1
, (+) cả 3 ghi 3
+ 3 ống canh thang lactosa loãng, cấy 1ml nước 10
-2
, chỉ (+)2 ghi 2
+ 3 ống canh thang lactosa loãng, cấy 1ml nước 10
-3
, (-) cả 3 ghi 0
Kết quả 5 số là: 3 3 3 2 0
Chú ý: Trường hợp tất cả các ống cấy đều (+) cần pha loãng tiếp để cấy thêm ít nhất 2
đậm độ nữa, như đã nêu ở phương pháp cấy 7 ống.
Chọn ống cấy chuyển tiếp: chọn đậm độ pha loãng cao nhất mà tất cả các ống cấy đều

cho kết quả (+), từ đó lấy 2 đậm độ pha loãng cao hơn tiếp theo để có kết quả 3 số
Ví dụ, trường hợp trên là 3 3 3 20, chọn 3 2 0. Tất cả các ống (+) ở 3 số này đều được
cấy chuyển sang bước 2. Nếu không nắm vững lí lịch mẫu nước, nên chọn thêm một
đậm độ đặc hơn cho tất cả các ống (+) để cấy chuyển sang bước 2.
4.6.4. Cấy chuyển bước 2 (Các phép thử khẳng định):
Điều quan trọng cần lưu ý là các phản ứng dương tính trong các ống môi trường phân
lập chỉ là các kết quả giả định về coliform. Do đó, cần phải tiến hành các phép thử xác
nhận, tốt hơn hết là trên các chủng cấy thuần khiết.
a. Vi khuẩn coliform
Để khẳng định sự có mặt của coliform, dùng que cấy hoặc pipet pasteur cấy từng ống
(+) sang các ống canh thang BGBL. Mỗi ống cần thay pipet hoặc khử trùng kỹ que
cấy.
Ví dụ trường hợp trên: 3 2 0 chuyển 3 ống canh thang lactosa cấy 1ml nước đậm độ
10
-1
và 2 ống cấy 1ml đậm độ 10
-2
(+) sang 5 ống canh thang BGCL đã ghi đủ nhãn:
13
Địa điểm, thời gian, thể tích mẫu, nếu cần có thể cấy cả 3 ống canh thang lactosa (+)
đã cấy 1ml mẫu nước đậm độ nguyên sang 3 ống canh thang BGBL. Tổng cộng sẽ là 8
ống.
Để tủ ấm 35
0
C hoặc 37
0
C trong vòng 48 giờ, lấy ra kiểm tra tính sinh khí và đọc kết
quả.
b. Vi khuẩn Fecal coliform và E. Coli giả định
- Để khẳng định sự có mặt của vi khuẩn coliform chịu nhiệt, dùng que cấy hoặc pipet

pasteur cấy từng ống (+) sang các ống môi trường EC. Mỗi ống cần thay pipet hoặc
khử trùng kỹ que cấy.
Để tủ ấm 44
0
C trong vòng 24 giờ, lấy ra kiểm tra tính sinh khí và đọc kết quả.
- Để khẳng định cự có mặt của E. Coli giả định, dùng que cấy hoặc pipet pasteur cấy
từng ống (+) sang các ống trypton để tạo indol ở 44
0
C trong vòng 24 h. Sau đó thêm
0,2 ml ÷ 0,3 ml thuốc thử kovac vào ống nước trypton (đã cấy mẫu): việc xuất hiện
một màu đỏ sau khi lắc nhẹ chứng tỏ sự có mặt của indol.
4.7. Tính toán và báo cáo kết quả
- Cách chọn ống (+) và ghi kết quả tương tự như đã nêu trên. Ví dụ, cấy để khẳng định
sự có mặt của coliform với trường hợp 8 ống ở trên, trong đó:
+ 3 ống cấy chuyển từ canh thang lactosa có cấy 1 ml mẫu nguyên đều (+), ghi 3
+ 3 ống cấy chuyển từ canh thang lactosa cấy 1ml mẫu đậm độ 10
-1
đều (+), ghi 3
+ 2 ống cấy chuyển từ canh thang lactosa cấy 1 ml mẫu đậm độ 10
-2
chỉ (+)1 ống, ghi 1
Kết quả có 3 3 1, đầy đủ sẽ là 3 3 3 1 0, chọn 3 số 3 1 0. Thường có 3 bảng số để tra số
MPN cho:
1. Phương pháp cấy 7 ống
2. Phương pháp cấy nhiều ống, mỗi hàng 3 ống- còn gọi là phương pháp 9 ống.
3. Phương pháp cấy nhiều ống, mỗi hàng 5 ống.
Trường hợp cụ thể trên tra bảng phương pháp cấy 9 ống sẽ được số 43. Nhưng do đọc
kết quả số đầu tiên ở đậm độ 10
-1
mà bảng số dùng cho đậm độ đầu 10ml nước

nguyên. Tức là đã pha loãng 100 lần, nên kết quả sẽ là: Tổng số Coliform =
4300/100ml.
14
Đọc kết quả và tính toán số Fecal Coliform theo MPN, E. coli giả định giống như với
Coliform tổng số. Tra bảng MPN tương ứng và tính: số Fecal Coliform/100ml mẫu;
tính số E. Coli giả định/100 ml mẫu.
Bảng 1: Chỉ số MPN cho phương pháp cấy 7 ống: 5 ống 10ml, 1 ống 1ml, 1 ống 0,1ml.
Số ống (+) MPN/100ml Giới hạn tin cậy
000 0 0-5,9
100 2 0,05-13
110 4 0,5-14
200 5 0,5-19
210 8 1,5-19
300 9 1,6-29
310 12 3,1-30
400 15 3,3-46
410 21 6,0-53
500 38 6,4-330
501 96 12,0-370
510 200 100-3800
511 >240
Bảng 2. Chỉ số MPN cho phương pháp cấy 3 ống 10ml, 3 ống 1ml và 3 ống 0,1 ml.
Số ống (+) MPN/100ml Giới hạn tin cậy
000 0 0,5-9
010 3 0,5-13
100 4 0,5-20
110 7 1-23
120 11 3-36
200 9 1-36
210 15 3-44

15
220 21 4-47
300 23 4-120
310 43 7-210
320 93 15-380
321 150 30-440
322 210 35-470
330 240 36-1300
331 460 71-2400
332 1-100 150-4800
333 >2400
Bảng 3. Chỉ số MPN cho phương pháp cấy 5 ống 10ml, 5 ống 1 ml, và 5 ống 0,1ml.
Số ống (+) MPN/100ml Giới hạn tin cậy
000 0
100 2 0,5-7
110 2 0,5-7
200 4 0,5-11
210 5 0,5-13
210 7 1-17
220 9 2-21
300 8 1-19
310 11 2-25
320 14 4-34
330 17 5-46
400 13 3-31
410 17 5-46
420 22 7-67
16
430 27 9-80
440 34 12-96

500 23 7-70
510 33 11-93
520 49 17-126
530 79 25-187
540 130 35-302
550 240 68-754
551 348 118-1005
552 542 180-1405
553 918 303-3222
554 1609 635-5805
5. Xác định Coliform bằng kỹ thuật màng lọc
Kỹ thuật màng lọc có thể coi là kỹ thuật hàng đầu trong các kỹ thuật vi sinh- vệ sinh
môi trường, đảm bảo độ nhanh nhạy, chính xác. Kỹ thuật này rất có lợi trong việc
kiểm tra, giám sát khẩn cấp nguồn cấp nước, cũng như các nguồn nước tự nhiên sạch
như nước ngầm sâu bởi có thể thử nghiệm với một thể tích mẫu tương đối lớn.
Mặt hạn chế của kỹ thuật là khó tiến hành phân tích nguồn nước có độ đục lớn hoặc
chứa nhiều tạp khuẩn. Thêm nữa, những trang thiết bị chuyên dùng cho kỹ thuật này
không phải lúc nào cũng sẵn có.
5.1. Nguyên tắc:
Lọc một lượng mẫu thử qua màng lọc để giữ lại các vi khuẩn, đặt màng lọc lên môi
trường nuôi cấy thạch-lactosa chọn lọc hoặc một miếng đệm hấp thụ bão hoà bằng một
môi trường lỏng chọn lọc chứa lactosa.
Nuôi cấy màng lọc trong 24 h ở nhiệt độ 35
0
C hoặc 37
0
C để phát hiện vi khuẩn
coliform, hoặc ở 44
0
C để phát hiện vi khuẩn coliform chịu nhiệt.

17
Đếm trực tiếp các khuẩn lạc đặc trưng được hình thành trên màng; cấy kế tiếp một số
các khuẩn lạc này để thử nghiệm xác nhận về việc sinh khí và indol. Tính toán số vi
khuẩn coliform, coliform chịu nhiệt và E. coli giả định có trong 100 ml mẫu.
Kỹ thuật này cần phải tiến hành song song với kỹ thuật MPN để xác định khả năng áp
dụng và so sánh kết quả.
5.2. Vật liệu.
Bao gồm tất cả dụng cụ hoá chất môi trường đã nêu trong kỹ thuật MPN để xác định
Coliform và Fecal Coliform kể cả thạch Endo. Ngoài ra cần có:
- Thiết bị lọc: Có rất nhiều loại, có loại chỉ dùng được 1 lần, có loại bằng nhựa có
thể khử trùng bằng nhiệt ẩm, luộc sôi để dùng lại và cần bơm nén (syringe), có loại
bằng kim loại kèm theo quả bóp cao su hoặc máy hút chân không.
- Nguyên tắc cấu tạo chung gồm:
+ Giá đỡ để đặt giữa màng lọc vô trùng
+ Phễu lọc vô trùng và thiết bị hút hoặc thiết bị nén.
Các vật tư trang bị khác cần có:
- Màng lọc: Mỗi mẫu cần 2 đến 4 màng lọc vô trùng
- Máy đếm khuẩn lạc
- Tủ ấm, tốt nhất là tủ ấm nước, đảm bảo độ ẩm tương đối đạt 90%.
5.3. Tiến hành:
- Chuẩn bị mẫu: Kiểm tra lý lịch mẫu để dự kiến thể tích mẫu đem lọc. Nước sạch đã
xử lý khử trùng có thể lọc 100ml hoặc hơn. Nếu lọc ít hơn 200ml nên chuẩn bị nước
pha loãng vô trùng để thấm ướt đều màng lọc trước khi lọc để nước mẫu khi lọc có thể
dàn đều khắp màng lọc, tạo được các khuẩn lạc phát triển riêng rẽ. Tóm lại, chọn thể
tích mẫu để lọc sao cho có được những khuẩn lạc mọc riêng rẽ, tốt nhất là có khoảng
20-80 khuẩn lạc Coliform trên một màng lọc và tổng số các loại tạp khuẩn không vượt
quá 200 khuẩn lạc trên mỗi màng lọc.
- Lọc mẫu: Lắp đặt vô trùng màng lọc lên trên đĩa đệm của giá đỡ bằng kẹp vô trùng,
mặt kẻ ô của màng lọc quay lên trên (Không kẻ ô thì đặt mặt nhẵn lên trên) sau khi đã
tháo phễu lọc ra. Phễu lọc đã vô trùng được lắp khít lại trên mặt màng lọc, vặn chốt để

tránh nước rỉ tràn qua rìa đáy phễu, mà không lọc qua màng lọc. Rót nước mẫu vào
18
phễu theo thể tích đã chọn. Hút bằng máy hút chân không hoặc quả bóp cao su cho cạn
hết nước. Có tác giả dùng nước pha loãng vô trùng rửa tráng phễu lọc để tránh bỏ sót
vi khuẩn bám dính vào thành phễu. Như vậy, cần một màng lọc kiểm tra vô trùng nước
pha loãng như khi lọc và cấy mẫu.
- Cấy mẫu: Tháo bình chân không, tháo phễu lọc và nhanh chóng dùng kẹp lấy
màng lọc đã lọc, đặt trên đĩa môi trường thạch Endo một cách vô trùng.
- Ủ nuôi cấy:
+ Tốt nhất nếu có tủ ấm nước, các đĩa môi trường nuôi cấy đã có màng lọc vào túi
nilon buộc kính và ngâm ngập trong nước, nhiệt độ 35-37
0
C trong 22-24 giờ.
+ Tủ ấm không khí 35-37
0
C, cần theo dõi độ ẩm tương đối sao cho đạt 90%, có thể úp
ngược các đĩa môi trường nuôi cấy trong tủ (để tránh bay hơi làm khô môi trường),
cũng để 35-37
0
C trong 22-24 giờ.
- Vô trùng lại bộ phận giá đỡ và phễu lọc sau mỗi mẫu bằng luộc sôi, xông hơi, cồn
đốt nhiệt. Tuỳ điều kiện, có tác giả đem phơi chúng trong 2 phút dưới bức xạ cực tím,
thấy đạt hiệu quả diệt trùng 99,9%. Nói chung cần kiểm tra hiệu quả các biện pháp
khử trùng đó.
- Có thể trước khi cấy trên thạch Endo, đặt màng lọc trên đĩa hộp lồng có đệm hút
chứa môi trường canh thang Lauryl tryptose trong 1,5-2 giờ để khuyến khích sự phục
hồi Coliform tại nhiệt độ 35-37
0
C, độ ẩm tương đối 90%. Giai đoạn này gọi là giai
đoạn tăng sinh.

- Đếm số khuẩn lạc Coliform: Đếm tất cả những khuẩn lạc đỏ hồng có ánh kim, ánh
kim có thể điển hình, phủ toàn bộ khuẩn lạc, hoặc chỉ trên đỉnh khuẩn lạc, hoặc chỉ ở
rìa khuẩn lạc. Dùng máy đếm (nếu có) hoặc đếm bằng mắt thường.
Lưu ý là sau 24 giờ, ánh kim sẽ nhạt màu dần và rồi có thể mất hẳn.
- Xác định Coliform : Do có những trường hợp sinh ánh kim không điển hình của
các khuẩn lạc Coliform và ngược lại vi khuẩn Noncoliform cũng ngẫu nhiên sinh ánh
kim nên cần xác định Coliform. Đơn giản nhất là cấy chuyển các khuẩn lạc ánh kim
sang canh thang BGBL để kiểm tra khả năng lên men Coliform gây chuyển thành môi
trường acid và sinh hơi hoặc kiểm tra đặc tính β Galactosidase (+) và Cytocrome
Oxydase (-) của Coliform.
19
5.4. Tính toán và báo cáo kết quả:
- Tổng Coliform/100ml.
Số khuẩn lạc Coliform ánh kim đếm được
=  x 100 - % Coliform được xác nhận
Số ml nước mẫu lọc
Số khuẩn lạc Coliform được xác nhận
=  x 100 - % Coliform được kiểm tra
Số khuẩn lạc ánh kim kiểm tra
Số khuẩn lạc Coliform kiểm tra
=  x 100
Tổng số khuẩn lạc ánh kim
Trong đó:
- Số khuẩn lạc Coliform đếm được chính là số khuẩn lạc có ánh kim
- Số khuẩn lạc Coliform xác nhận là số khuẩn lạc ánh kim cấy chuyển trên canh
thang BGBL cho lactosa (+), sinh hơI, hoặc có phản ứng Cytocrome oxydase (-), β
Galactosidase (+).
- Số khuẩn lạc Coliform được kiểm tra là số khuẩn lạc có ánh kim chọn để cấy
chuyển:
Nếu màng lọc có dưới 20 khuẩn lạc, nên chọn ít nhất 5 khuẩn lạc để cấy chuyển. Tốt

nhất là cấy chuyển tất cả.
Nếu màng lọc có từ 20-80 khuẩn lạc ánh kim như mong đợi là lý tưởng nhất để đếm,
nên chọn ít nhất 10% tổng số khuẩn lạc này để cấy chuyển. Nếu màng lọc trên 80
khuẩn lạc ánh kim trong tổng số 200 khuẩn lạc hoặc mọc lan, mọc thành đám không
thể đếm được, cần cấy lại và chọn thể tích mẫu thích hợp.
Ví dụ cụ thể:
Mẫu 1: Cấy trên 3 màng lọc: màng lọc 1, lọc 100ml, đếm được 10 khuẩn lạc ánh kim;
màng lọc 2, lọc 50 ml, đếm được 4 khuẩn lạc ánh kim; màng lọc 3, lọc 10 ml, không
đếm được khuẩn lạc ánh kim.
20
(10 + 4 + 0)
Kết quả:  x 100 = tổng số Coliform/100ml.
(100 + 50 + 10)
Mẫu 2: Cũng cấy trên 3 màng lọc: Màng lọc 1, lọc 60ml, đếm được 30 khuẩn lạc ánh
kim; màng lọc 2, lọc 30 ml, đếm được 9 khuẩn lạc ánh kim; màng lọc 3, lọc 10 ml,
đếm được 9 khuẩn lạc ánh kim.
30
Kết quả :  x 100 = tổng số Coliform/100ml.
60
ở đây chỉ chọn 1 màng lọc có kết quả đếm rơI vào khoảng 20-80 khuẩn lạc như dự tính
với thể tích lọc hợp lý. Điều này cho thấy, mặc dù đây là kỹ thuật hàng đầu, số đếm là
số biểu thị trực tiếp khuẩn lạc có trên màng lọc, song không phải là số tuyệt đối.
6. Phương pháp xác định nhanh tổng số Colifform và
Fecal Colirform
Trong thực tế nhiều trường hợp cần xác định nhanh chóng chất lượng vi khuẩn học
nguồn nước (có sự cố trong hệ thống, xử lý nước, trong hệ thống phân phối ). Vì vậy
không thể thiếu phương pháp phát hiện nhanh. Yêu cầu phương pháp phát hiện nhanh
phải có độ tin cậy, độ nhạy, tương đương với những phương pháp, những kỹ thuật tiêu
chuẩn được sử dụng thường ngày. Thực tế, đây chính là những kỹ thuật thông thường
được cải tiến, đòi hỏi những thiết bị, vật liệu đặc biệt. Kỹ thuật phát hiện và định

lượng Coliform và Fecal Coliform trong 7 giờ bằng bộ kit xách tay, có thể sử dụng
ngay tại thực địa đang được ứng dụng rộng rãi, kỹ thuật này giống như các thao tác
trong kỹ thuật màng lọc.
6.1. Vật liệu
Bộ KIT để kiểm tra mẫu nước với những trang bị kèm theo, ở đây xin giới thiệu
Oxfam- Delagua của Anh mà UNICEF đã trang bị cho một số cơ sở xét nghiệm về
nước ở Việt Nam.
21
6.2. Tiến hành:
- Pha môi trường: Môi trường canh thang Lauryl sunfate dùng cho màng lọc của bộ
KIT này là môi trường khô được cung cấp kèm theo bộ KIT: Cân 76,2 g môi trường
khô này cho vào 1 lit nước cất. Hoà tan kỹ và sấy hấp 121
0
C/10 phút.
- Bảo quản môi trường đã pha chế ở nơi mát và tối, môi trường có thể giữ được hàng
tháng.
- Phân phối vô trùng vào mỗi hộp lồng nhôm một miếng đệm, khoảng 2-2,5ml.
- Khử trùng bộ lọc: Cho khoảng 1 ml Methanol vào cốc nhôm, đốt và để cháy vài
giây, rồi úp ngược phễu lọc, đậy kín và miệng cốc để khử trùng phễu lọc bằng hơi
Formaldehyt sinh ra trong quá trình cháy thiếu oxy. Sau mỗi mẫu lọc đều phải khử
trùng lại phễu lọc.
- Lọc mẫu: Tuỳ theo nguồn nước đã xử lý hay chưa, sạch hay bẩn mà chọn thể tích
cần thiết: 100ml nếu là nước đã khử trùng, nước bẩn chỉ cần lọc 10-20ml. Cần tính
toán thể tích lọc sao cho có khoảng dưới 200 khuẩn lạc các loại và dưới 80 khuẩn lạc
Coliform (như kỹ thuật màng lọc đã nêu ở trên) trên một màng lọc.
 Lắp màng lọc vào giá đỡ của phần lọc đã vô trùng, mặt có kẻ ô vuông của màng
lọc quay lên trên.
 Lăp kín các bộ phận của phễu lọc
 Rót mẫu nước vào phễu theo thể tích mẫu đã chọn.
 Dùng quả bóp cao sụ, bóp hút không khí trong phễu lọc để hút nước chảy xuống

qua màng lọc, đến khi cạn nước thì thôi.
- Cấy mẫu: Lấy màng lọc ra, đặt miếng đệm đã ngấm đủ môi trường, mặt có kẻ ô
của màng lọc quay lên trên.
- Ủ ấm ở nhiệt độ 42
0
C ± 0,5 để xác định Fecal Coliform trong 14-18 giờ, lấy ra đọc
kết quả. Nếu cần sau 7 giờ đã có khuẩn lạc mọc rõ trên màng lọc và có thể đọc kết quả
sơ bộ được
- Ủ ấm ở nhiệt độ 35-37
0
C để xác định Coliform tổng số.
Chú ý: Mẫu đầu tiên và mẫu cuối cùng sau khi cấy xong không được lệch nhau quá 5
giờ.
22
6.3. Kết quả:
Đếm tất cả những khuẩn lạc màu vàng có đường kính 1-3ml và tính toán số khuẩn lạc
trên 100 ml mẫu.
Nếu số khuẩn lạc trên 200, khó đếm chính xác được, cần cấy lại mẫu, thể tích mẫu lọc
cần ít hơn.
Kết quả:
+ Tổng số Fecal Coliform/100 ml mẫu (nếu ủ ở 42
0
C± 0,5)
+ Tổng số Coliform/100ml mẫu ( nếu ủ ấm ở 35-37
0
C).
Cần chú ý: Giống như các kỹ thuật màng lọc khác, mỗi mẫu ít nhất cần được cấy trên
2 màng lọc)
7. Phương pháp xác định Clostridium Perfringens
Clostridium Perfringens là vi khuẩn sinh H

2
S từ lâu đã được coi là một chỉ điểm vệ
sinh vì thường được phát hiện trong 90-95% tổng số các mẫu xét nghiệm phân người
và động vật.
Chúng cũng là vi khuẩn có nha bào nên chịu được nhiệt độ cao và có thể tồn tạI lâu
dàI ở ngoại cảnh.
7.1. Nguyên tắc:
Cấy các phần mẫu thử đã được pha loãng hoặc không pha loãng theo thể tích khác
nhau vào một dãy ống nghiệm chứa một môi trường nuôi cấy chọn lọc Thạch Wilson
Blair có Natri sulfit và dung dịch phèn sắt II. Sau khi diệt tạp khuẩn nuôi cấy ở nhiệt
độ 37
0
C trong vòng 34 h. Kiểm tra các ống thử. Nếu có Clostridium perfringens sẽ
sinh ra H
2
S tạo ra các khuẩn lạc đen to bằng hạt đậu xanh do tạo thành FeS.
7.2. Vật liệu
- Tủ ấm 37
0
C
- Nồi cách thuỷ
- Giá đựng ống nghiệm có nhiều lỗ
- Pipet chia độ 10-1ml vô trùng
- Dung dịch sunfat sắt II 5% vô khuẩn
- Dung dịch nước muối sinh lý 8,5%o đóng ống 9ml, tiệt trùng ở 121
0
C/15phút.
23
- Thạch Wilson-Blair đóng ống 10ml.
Công thức:

Pepton 10g
Cao thịt 5g
Dextrose 10g
Natri clorua 5g
Natri sunfite 0,5g
Agar 15g
Nước cất 1000ml.
7.3. Tiến hành
- Chuẩn bị mẫu: mẫu nước được cách thuỷ 80
0
C/5phút để diệt tạp khuẩn
- Thạch ống Wilson- Blair đun chảy hoàn toàn, ghi rõ địa điểm, thời gian lấy mẫu,
thể tích mẫu, để nguội 50-60
0
C, thêm vô trùng 5 giọt sunfat sắt II 5%.
- Tuỳ theo dự tính mức độ sạch bẩn của mẫu nước mà cấy 10ml, 5ml hay 1ml. Dùng
pipet hút mẫu nước rồi cấy xuống tận đáy ống nghiệm. Cần tránh tạo bọt khi cấy bằng
cách vừa thả mẫu từ từ vừa xoay nhẹ pipet và rút pipet lên dần dần. Trộn đều mẫu với
môi trường. Làm lạnh nhanh trong vòi nước cho đông thạch. Quấn giấy trên đầu ống
thạch. Mỗi mẫu cấy ở 2 đậm độ khác nhau.
- Ủ mẫu trong 37
0
C/34 giờ, lấy ra đọc kết quả.
- Đếm tất cả các khuẩn lạc đen, to bằng hạt đậu xanh tạo thành sunfua sắt.
7.4. Báo cáo kết quả:
- Tính toán số khuẩn lạc nuôi cấy trong 10ml mẫu nước
- Kiểm tra chứng âm tính và dương tính với mỗi loại môi trường mới được pha chế.
Tài liệu tham khảo
1. American Public Health Association, Standard Method For Examination of
Water and Waste water. Sixteenth edition.

2. Trung tâm tiêu chuẩn – Chất lượng (1996). Chất lượng nước- Phát hiện và đếm
vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform chịu nhiệt và E. Coli giả định.
24
3. Trường đại học Y Hà Nội (1999), Thực tập vệ sinh môi trường và vệ sinh lao
động, Hà Nội 1999.
4. Viện Y học lao động và Vệ sinh môi trường (2002), Thường quy kỹ thuật Y học
lao động và vệ sinh môi trường, Hà Nội
25