Tiểu luận NHÂN GIỐNG LAN VANDA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM
KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
    

LỚP 08DSH4
MÔN: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
KHOA HỌC
ĐỀ CƯƠNG:
1
    
GIÁO VIÊN HD: Ts. Nguyễn Hoài Hương

2
TÊN ĐỀ TÀI: NHÂN GIỐNG LAN VANDA
GVHD: Ts.Nguyễn Hoài Hương
Nhóm thực hiện:
 Nguyễn Thị Như Yến (MSSV: 0851110308)
 Lê Nguyễn Nhật Thanh (MSSV: 0851110226)
 Nguyễn Thị Thanh Trang (MSSV: 0851110262)
 Cao Tuấn Vũ (MSSV: 0851110303)
 Lê Hoàng Thúy Oanh (MSSV: 0851110168)
 MỤC LỤC
PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ.
1.1. Lĩnh vực nghiên cứu
1.2. Vấn đề nghiên cứu
3
1.3. Giải pháp
1.3.1. Mục đích nghiên cứu
1.3.2. Mục tiêu nghiên cứu
PHẦN II: TỒNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. TỔNG QUAN VỀ LAN VANDA
2.1.1. Nguồn gốc, xuất xứ
2.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LAN
TRONG ỐNG NGHIỆM
2.2.1. Giới thiệu
2.2.2. Lịch sử nghiên cứu
2.3. TỒNG QUAN VỂ CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÁC ĐIỀU
KIỆN NUÔI CẤY LAN TRONG ỐNG NGHIỆM
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. VẬT LIỆU
4
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Mô tả thí nghiệm
3.3.1.1. Thí nghiệm tối ưu hóa môi trường VW
3.3.1.2 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng cùa dịch chiết chuối
và dịch chiết khoai tây trong môi trường VW trong nuôi cấy lan
Vanda coerulea
3.3.1.3. Thí nghiệm tối ưu hóa cường độ ánh sáng
3.3.2. Bố trí thí nghiệm
3.4. CÁC CHỈ TIÊU THEO DÕI, ĐÁNH GIÁ
3.4.1. Các chỉ tiêu
3.4.2. Thông số chỉ tiêu khảo sát
3.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU
PHẦN IV: DỰ KIẾN KẾT QUẢ
PHẦN V: KẾ HOẠCH THỰC HIỆN
5
PHẦN VI: DỰ TRÙ KINH PHÍ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN I: PHẦN MỞ ĐẦU

1. ĐẶT VẤN ĐỀ:
1.1. Lĩnh vực nghiên cứu:
- Thị trường tiêu thụ hoa phong lan là đầy tiềm năng trong hoàn cảnh
nước ta.Việc sản xuất phong lan đã đem lại một nguồn thu nhập khá
cao cho các nhà nông.Trong đó, lan Vanda là một loại lan rừng quý
hiếm và được người tiêu dùng ưa thích.
- Vì vậy, việc tìm ra một phương pháp để có thể sản xuất lan Vanda
trên qui mô công nghiệp là điều rất quan trọng đối với các nhà vườn.
- So với phương pháp tách chiết thông thường tốc độ phát triển 1
cây/năm thì phương pháp cấy mô sẽ sản xuất một số lượng cây con
gần như không tưởng khoảng 4 triệu cây/năm. Phương pháp cấy mô
6
là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống lan trên qui mô
công nghiệp
- Do đó, muốn sản xuất hoa lan Vanda một cách nhanh chóng và với
số lượng lớn thì phải áp dụng phương pháp nuôi cấy mô thực vật
trong ống nghiệm và là vấn đề rất được quan tâm cùa các nhà nghiên
cứu về nuôi cấy mô thực vật hiện nay.
1.2. Vấn đề nghiên cứu:
- Nhiều tác giả dùng các môi trường Vacin và Went, Mu rashige và
Skoog, Heller rất tốt cho các loài lan thuộc nhóm đơn thân.
- Quá trình lai tạo, nuôi trồng cho ra hoa đối với họ lan là khá dài (tùy
theo chủng loài có thể trên dưới 120 tháng). Chúng ta cần chọn môi
trường nuôi cấy tối ưu nhất để rút ngắn quá trình sinh trưởng của cây
trong ống nghiệm đồng thời cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần
thiết để cây phát triển khỏe mạnh.
- Cùng được nuôi cấy trong một môi trường dinh dưỡng nhưng với
những điều kiện nuôi cấy khác nhau về cường độ ánh sáng,độ
pH,nhiệt độ đã cho những sự tăng trưởng rất khác nhau ở các mô cấy.
7

- Vậy việc chọn môi trường dinh dưỡng với những điều kiện nuôi cấy
tối ưu để nhân giống lan Vanda là điều đặc biệt rất quan trọng với các
nhà sản xuất lan.
1.3. Giải pháp:
1.3.1. Mục đích nghiên cứu:
+Áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật, tiến hành các thí nghiệm để
tìm ra điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất nhằm nhân giống lan Vanda.
1.3.2. Mục tiêu:
+ Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy mô lan Vanda.
+ Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy mô lan Vanda.
PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN VỀ LAN VANDA
2.1.1. Nguồn gốc, xuất xứ:
- Vanda là một loại phong lan (epiphyte) thân đơn, lá cứng và xòe
sang hai bên. Lá cây chia làm 3 loại: Dẹp (strap leave), lá tròn và
cứng (teres), hoặc pha giữa hai loại kể trên (semi teres).
8
- Trong số những loại lan cảnh phổ biến hiện nay, Vanda là một loại
lan rất đẹp và quý hiếm.Vanda là một loại lan gồm chừng 60 giống,
mọc ở miền Nam Á châu từ Ấn độ, Miến điện Thái lan, Việt Nam,
Mã lai, Nam dương, Phi luật tân v.v…
2.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LAN
TRONG ỐNG NGHIỆM:
2.2.1. Giới thiệu:
- Phương pháp cấy mô là phương pháp duy nhất hiện nay có thể
nhân giống lan trên qui mô công nghiệp, các cây lan con được sản
xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố mẹ giống tốt được lai tạo và
được xem là có giá trị sau lần trổ hoa đầu tiên.
- So với phương pháp tách chiết thông thường tốc độ phát triển 1
cây/năm thì phương pháp cấy mô sẽ sản xuất một số lượng cây con

gần như không tưởng khoảng 4 triệu cây/năm.
- Phương pháp cấy mô có nhiều ưu điểm :
+ Đây là phương pháp nhân giống vô tính vì thế nó đảm bảo hoàn
toàn đặc tính của cây cha mẹ.
9
+ Nhờ nuôi cấy mô có thể sán xuất nhanh lượng phong lan lớn trên
quy mô công nghiệp.
+ Cây con không bị nhiễm bệnh, là công cụ hữu hiệu để tạo ra nguồn
phong lan sạch bệnh
+ Mầm để cấy lúc nào cũng có sẵn không mất thời gian chờ đợi trái
chín như cây gieo hạt.
- Tuy nhiên, việc cấy mô phải được thực hiện với một qui trình thật
nghiêm túc và tỉ mỉ, điều kiện về trang thiết bị đầy đủ và mô chỉ phát
triển trên một môi trường hoàn toàn nhân tạo và vô trùng.
2.2.2. Lịch sử nghiên cứu:
+ Knudson(1922, 1924, 1946) nghiên cứu thành công nuôi cấy hạt
giống địa lan trong ống nghiệm đã cho nảy mầm thành cây con.
+ 1966 Hey và Hey sử dụng kỹ thuật nuôi cấy trong ống nghiệm để
nhân nhanh các giống lan và đem trồng trong vườn ươm.
Theo đó là các nghiên cứu thành công khác trên nhiều loại lan khác
nhau (Withner 1943,1955, Vacin và Went 1949, Poddubnaya-Arnoldi
1959, Israel 1963, Valmayor và Sagawa 1967, 1974 Valmayor,
10
Hoque cùng các cộng sự 1994, Das Gupta cùng các cộng sự 1998,
Das Gupta và Barda 1998).
2.3. TỒNG QUAN VỂ CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÁC ĐIỀU
KIỆN NUÔI CẤY LAN TRONG ỐNG NGHIỆM
+ Mặc dù yêu cầu đối với hạt giống sự nảy mầm của các loài lan khác
nhau là khác nhau (Arditti năm 1967 và Hoque cùng cộng sự 1994),
nhưng môi trường VW và KC được xem là tốt cho sự nảy mầm của

hầu hết các phong lan (Goh 1990). Tuy nhiên, nhiều nhà nghiên cứu,
đã thay đổi thành phần môi trường gốc hoặc thêm vào các chất phụ
gia phức tạp (Arditti 1977). Sự thêm vào môi trường bột chuối (1975
Ernst, Chang và Chang 2000) và nước dừa (Teo cùng các cộng sự
1973, Tokuhara và Mii 1993) để cải thiện sự phát triển của phong lan
được nuôi cấy trong ống nghiệm, dựa trên kết quả thu được từ thực
nghiệm nhưng chỉ có nồng độ của chúng được xác định bằng các thử
nghiệm khác nhau, dựa trên kết quả thu được từ thực nghiệm nhưng
chỉ có nồng độ của chúng được xác định bằng các thử nghiệm khác
11
nhau. Chồi cũng phát triển kéo dài tốt khi được cấy vào môi trường
MS ½ mà không có chất điều hòa tăng trưởng.
+ Những khía cạnh như chiều dài bước song,cường độ ánh sáng và
thời gian chiếu sáng là những yếu tố quan trọng tác động đến sự phát
triển của cây.Cường độ ánh sáng mạnh làm tăng số lượng lá to,trọng
lượng khô,hàm lượng đường và Nitrogen hấp thụ bên trong lan
Phalenopsis(Kubota,1993).Tuy nhiên cường độ ánh sáng quá mạnh sẽ
làm giảm sự phát triển của cuống lá và lá (Datta,1994).Cường độ ánh
sáng mạnh làm tăng sự tăng trưởng của cây và tăng kích thước thân
cây và tăng sức phát triển cùa cây trên đất đối với Brachiria bizantha
và Panicum maximum. Nó tác động mạnh đến số lượng tế bào cương
mô và vách tế bào dày lên ở tất cả các bộ phận của cây (Deinum cùng
cộng sự, 1996). Cường độ ánh sáng cao có nhiều màu tím hơn và bức
xạ cực tím tạo ra nhiều hợp chất phenolic đối với Zosteria marina
(Vergeeret cùng cộng sự, 1995). Trong bông, diện tích lá được tăng
lên theo cường độ ánh sáng thấp (Roussopoulos cùng cộng sự, 1998).
Hầu hết các thực vật bậc thấp như rêu và dương xỉ, cũng như một vài
12
loài hoa rừng phát triển chậm hoặc bị chểt bởi cường độ ánh sáng mặt
trời cao (Datta,1994).

PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. VẬT LIỆU
- Trái lan của Vanda coerulea (là một loài lan rừng sống bám trên
thân cây to,đơn thân,có mức tăng trưởng chậm,do đó con số của nó
trong thiên nhiên đang giảm)
- Trái lan của Vanda terres (Roxb.) Lindl.(một loại lan đơn thân, thân
tròn) được thu từ các cây trưởng thành phát triển tự nhiên trên cây
trong rừng.
- Trái lan phải vừa mới chín vàng, chưa bị nứt.
- Hóa chất:
+ Xà phòng, nước rửa chén.
+ Dung dịch HgCl 0,2%
+ Ethanol 95
0
và ethanol 70
0
.
+ BAP, Kn, IAA và NAA
+ KNO
3
, (NH4)
2
SO
4
, KH
2
PO
4
, Ca
3

(PO
4
)
2
.2H
2
O, MgSO
4
.7H
2
O,
FeEDTA, Thiamin HCL, m-inositol.
13
+ Dung dịch NaOH 1N.
+ Succharose 2%, peptone 2 g/l và agar
+ Dung dịch nước dừa 10%.
+ Dịch chiết chuối nghiền, dịch chiết khoai tây nghiền.
+ Than hoạt tính.
- Thiết bị:
+ Máy cất nước 1 lần
+ Máy cất nước 2 lần
+ Bình hấp khử trùng Autoclave.
+ Tủ sấy 60 – 200
0
C
+ Tủ cấy được khử trùng bằng đèn cực tím(laminar)
+ Cân phân tích (chính xác đến 0,0001 g)
+ Cân kỹ thuật (chính xác đến 0,01 g)
+ pH kế
+ Các giàn kệ có gắn đèn huỳnh quang màu trắng 40W (của Công ty

TNHH Phillips)
+ Máy lắc nằm ngang
+ Máy điều hòa nhiệt độ.
14
+ Quạt thông gió
+ Một đồng hồ đo diện tích am 100.
- Dụng cụ:
+ Ống nghiệm; pipette; micropipette; bình tam giác(250ml); giấy cấy
vô trùng;Bercher (cốc đốt thủy tinh) 500ml,1000ml; Forceps (kẹp),
dao cấy, đèn cồn; đĩa Petri vô trùng.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:
+ Tối ưu hóa môi trường Vanci và Went (VW) trong nuôi cấy lan
Vanda coerulea.
+ Đánh giá ảnh hưởng cùa dịch chiết khoai tây, dịch chiết chuối
nghiền trong môi trường Vanci và Went trong nuôi cấy lan Vanda
coerulea .
+ Tối ưu hóa cường độ ánh sáng trong nuôi cấy lan Vanda teres.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Mô tả thí nghiệm:
15
- Môi trường VW chuẩn với thành phần các chất khoáng như sau
(theo mg/l): KNO
3
525, (NH4)
2
SO
4
500, KH
2
PO

4
250, Ca
3
(PO
4
)
2
.
2H
2
O 200, MgSO
4
.7H
2
O 122, FeEDTA, Thiamin HCL 1, m-inositol
100.
3.3.1.1. Thí nghiệm tối ưu hóa môi trường VW:
- Mỗi môi trường nuôi cấy lan Vanda coerulea được thí nghiệm lặp
lại 3 lần, mỗi lần là 20 mẫu thử.Các thành phần kích thích tố BAP,
Kn, IAA và NAA kết hợp với các nồng độ khác nhau trong môi
trường VW với succharose 2%. Điều kiện nhiệt độ,pH, cường độ
chiếu sáng được thực hiện ở mức chuẩn đối với lan đơn thân.Cụ thể
như sau:
+ Cho 2% than hoạt tính (AC) vào môi trường. Độ pH của môi trường
đã được điều chỉnh là 5,7 trước khi thêm thạch. Môi trường cấy và
nước cất được hấp ở 1,1 kg / cm
2
trong 20 phút ở 120
0
C.

+ Môi trường đã được ủ tại cường độ ánh sáng phù hợp 4.000 lux
(Yie và Liaw, 1997) với ánh sáng đèn huỳnh quang màu trắng tại
16 / 8 h sáng / tối chế độ duy trì ở 25 ± 2
0
C.
Thay đổi tham số:
16
STT Tham số Đơn vị Giá trị
1 BAP mg/l 0,5-2,0
2 Kn mg/l 0-1,0
3 IAA mg/l 0-0,5
4 NAA mg/l 0-0,5
3.3.1.2 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng cùa dịch chiết chuối và
dịch chiết khoai tây trong môi trường VW trong nuôi cấy lan
Vanda coerulea:
- Hạt giống được cấy vào môi trường VW với các điều kiện ở mức
chuẩn thêm sucrose 2%, dung dịch nước dừa 10%, sau 1 tháng nuôi
cấy, thêm dịch chiết chuối và dịch chiết khoai tây vào môi trường
VW với nồng độ được điều chỉnh khác nhau Thí nghiệm được lặp lại
3 lần,mỗi lần 20 mẫu thí nghiệm.Cụ thể như sau:
+ Cho 2% than hoạt tính (AC) vào môi trường. Độ pH của môi trường
đã được điều chỉnh là 5,7 trước khi thêm thạch. Môi trường cấy và
nước cất được hấp ở 1,1 kg / cm
2
trong 20 phút ở 120
0
C.
+ Môi trường đã được ủ tại cường độ ánh sáng phù hợp 4.000 lux
(Yie và Liaw, 1997) với ánh sáng đèn huỳnh quang màu trắng tại
16 / 8 h sáng / tối chế độ duy trì ở 25 ± 2

0
C.
Thay đổi tham số
17
STT Tham số Đơn vị Giá trị
1 Hàm lượng dịch chiết chuối
nghiền
g/l 0-200
2 Hàm lượng dịch chiết khoai
tây
g/l 0-200
3.3.1.3. Thí nghiệm tối ưu hóa cường độ ánh sáng:
- Mỗi bình là 1 cây lan Vanda Teres con đã được nuôi cấy trong môi
trường VW chuẩn và có lá dài 2cm,được thực hiện với thiết kế hoàn
toàn ngẫu nhiên. Các mẫu cây con được chiếu sáng liên tục 16h/8h
ngày/đêmdưới ánh đèn huỳnh quang với các cường độ khác nhau.Cụ
thể là:
+ Môi trường VW bổ sung 100 g / l dịch chiết chuối, 100 g / l dịch
chiết khoai tây và 20 g/l saccharose, dung dịch nước dừa 10%. Cho
2% than hoạt tính (AC) vào môi trường.
+ Độ pH của môi trường đã được điều chỉnh là 5,7 trước khi thêm
thạch. Môi trường cấy và nước cất được hấp ở 1,1 kg / cm
2
trong 20
phút ở 120
0
C.
Thay đổi tham số:
18
+ Tham số Cường độ ánh sáng được thay đổi: 1500lux, 2000lux,

3000lux, 4000lux, 5000lux.
3.3.2. Bố trí thí nghiệm:
- TN1: Thí nghiệm tối ưu hóa môi trường VW trong nuôi cấy lan
Vanda coerulea.
- TN2: Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng cùa dịch chiết chuối và dịch
chiết khoai tây trong môi trường VW trong nuôi cấy lan Vanda
coerulea.
- TN3: Thí nghiệm tối ưu hóa cường độ ánh sáng đối với nuôi cấy
lan Vanda Teres.
3.4. CÁC CHỈ TIÊU THEO DÕI, ĐÁNH GIÁ
3.4.1. Các chỉ tiêu:
- TN1: Đánh giá ảnh hưởng của kích thích tố BAP, Kn, IAA và
NAA kết hợp với các nồng độ khác nhau trong môi trường VW với
sucrose 2%

đến sự nảy mầm và tốc độ phát triển của hạt giống lan
Vanda coerulea. Các chỉ tiêu khảo sát gồm:
+ Hiệu quả nảy mầm,hiệu quả chồi.
19
+ Thời gian hạt nảy mầm và thời gian hình thành chồi.
- TN2: Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết chuối nghiền và dịch chiết
khoai tây được thêm vào môi trường VW với các nồng độ khác nhau
đến sự tăng trưởng của chồi lan Vanda coerulea. Dữ liệu được lấy sau
60 ngày kể từ ngày thêm dịch chiết chuối nghiền và dịch chiết khoai
tây. Các chỉ tiêu khảo sát gồm:
+ Diện tích lá.
+ Bề rộng lá.
+ Chiều dài lá.
+ Trọng lượng khô của lá.
+ Số lượng lá.

+ Chiều cao cây.
- TN3: Đánh giá ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến sự tăng
trưởng của chồi lan Vanda teres dữ liệu được lấy 2 tháng sau khi cấy
trong môi trường VW. Các chỉ tiêu khảo sát gồm:
+ Diện tích lá.
+ Bề rộng lá.
+ Chiều dài lá.
20
+ Trọng lượng khô của lá.
+ Số lượng lá.
+ Chiều cao cây.
3.4.2. Thông số chỉ tiêu khảo sát:
Thông số Đơn vị tính
Hiệu quả %
Thời gian Ngày
Chiều dài mm
Đường kính mm
Diện tích mm
2
Bề rộng mm
Chiều cao mm
Trọng lượng
khô
mg
3.5. XỬ LÝ SỐ LIỆU
- Đánh giá tốc độ tăng trưởng của chồi dựa vào diện tích lá phát triển
(lá rộng, lá chiều dài và diện tích lá) được đo bởi một đồng hồ đo
diện tích am 100 (Hall và cộng sự, 1993). Ngoài ra, số lá, chiều cao
cây và toàn bộ trọng lượng khô tích lũy của các cây con cũng đã được
xác định.

21
- Sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion để xử lý số liệu: thống
kê,phân tích ANOVA và so sánh, ước lượng các giả thiết.
- Phương pháp Duncan’s New Multiple Range Test (DMRT) được sử
dụng trong phân tích thống kê (Chantalakana, 1991) nhằm kiểm tra
độ chính xác của thí nghiệm khi so sánh các cặp nghiệm thức khác
biệt có ý nghĩa hay không.
PHẦN IV: DỰ KIẾN KẾT QUẢ
- Tìm ra được các điều kiện tối ưu:môi trường tối ưu và cường độ
chiếu sáng tối ưu để nuôi cấy mô phong lan Vanda trong điều kiện vô
trùng.
- Dự đoán cường độ chiếu sáng tối ưu trong khoảng 3000- 4000 lux.
- Với những điều kiện tối ưu này, hạt giống lan Vanda sẽ có tỉ lệ nẩy
mầm cao, cây phát triển tốt, nhanh chóng,rút ngắn thời gian được phát
triển của cây.Cây sinh trưởng tốt và đầy đủ sức
sống.
PHẦN V: KẾ HOẠCH THỰC HIỆN
22
TIẾN ĐỘ THỰC HIỆN
Thời gian Nội dung công việc
Tuần 1- 3 Tìm tài liệu
Tuần 4-5 Làm đề cương
Tuần 6- 9 Thu mua hóa chất, dụng cụ, mượn
phòng thí nghiệm
Tuần 10- 30 Tiến hành các thí nghiệm
Tuần 31- 32 Xử lý số liệu thô
Tuần 33- 34 Kết luận
Tuần 35- 37 Làm báo cáo
PHẦN VI: DỰ TRÙ KINH PHÍ
- Mua hóa chất : 4.000.000

- Mua dụng cụ thí nghiệm : 2.000.000
- Thuê phòng thí nghiệm, dụng cụ : 1.000.000
- In tài liệu : 100.000
TỔNG CỘNG: 7.100.000
TÀI LIỆU THAM KHẢO
23
/> />cat=5&id=29
/> />trungdu=view&id=1059
/>

24