giáo trình thực hành phân tích vi sinh thực phẩm

Trường Đại học Cơng nghiệp
thực phẩm TP.HCM

2010

THỰC HÀNH PHÂN TÍCH
VI SINH THỰC PHẨM

ThS. Lê Thùy Linh
Lưu hành nội bộ

0


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

NỘI DUNG
Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli

Trang
2

1.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
1.2. Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN

2
3

1.3. Cách tiến hành thí nghiệm

4

1.4. Cách tính kết quả

10

Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus

10

2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
2.2. Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN
2.3. Cách tiến hành và cách tính kết quả
Bài 3. Định tính Salmonella

10
10
11
14

3.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
3.2. Qui trình định tính Salmonella trong thực phẩm
Bài 4. Định lượng Bacillus cereus

14
14
20

4.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
4.2. Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc

20
20
24

5.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
5.2. Quy trình phân tích

24
26

Tài liệu tham khảo
1. Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ
phẩm, NXB Giáo dục, 2006
2.
3.
4.
5.

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 1


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Bài 1: Định lượng Coliforms và E. coli
1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
1.1.1 Định nghĩa

Hình 1: phát hiện Coliforms và E.
coli trong thực phẩm hay nước bằng
môi trường CHROMagar ECC

Coliforms là những trực khuẩn gram âm khơng sinh bào tử,
hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và
sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ. Coliforms được xem là nhóm vi
sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước
hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện
diện của các loại vi sinh vật khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là:
E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter. Tính chất sinh hóa
đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I),
Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi là IMViC.
Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi
trong khoảng 24h khi ủ ở 440C trong môi trường canh EC.
Coliforms phân (Faecal Coliforms) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh
indole khi ủ khoảng 24h ở 440C trong canh Trypton. E. coli là Coliforms phân cho kết
quả thử nghiệm IMViC là ++-- (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate -)
1.1.2 Phương pháp Most Probable Number (MPN)
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm
được lặp lại ở một số độ pha lỗng khác nhau. Thơng thường, việc định lượng này được
thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Quy trình thực hiện như sau:
Pha lỗng mẫu phân tích ở 3 nồng độ pha
lỗng bậc 10 liên tiếp.
Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng
trưởng của vi sinh vật cần kiểm định
Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính

ở từng độ pha lỗng. Tra bảng Mac Crady
Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 2


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Chú ý:
Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung dịch
được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml. Trên thực tế phân tích,
người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Lượng mẫu với các độ
pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng theo bảng MPN/100ml tính
theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu trên. Vậy số liệu của bảng MPN/100ml tính
theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml tương đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng khi
1ml của các dung dịch có độ pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3 được dùng để phân tích.
Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng
tiếp theo cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha lỗng. Ví dụ: sử dụng
1ml cho mỗi độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng mẫu ở mỗi nồng
độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3. Do vậy, trị số tra
bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10.
1.2 Quy trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN
Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ
pha lỗng 10-1, 10-2, 10-3…
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh
LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ
Ghi nhận các ống LSB (+) (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng

Cấy vào ống canh BGBL,
ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ
Số ống (+)(sinh hơi )ở
mỗi độ pha loãng

Cấy vào ống canh EC, ủ
ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ
Số ống (+) ở mỗi độ pha loãng
Cấy lên thạch EMB, ủ ở 370C,
24 giờ

Coliforms

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Xem
trang
sau

Page | 3


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Tiếp
theo

Chọn khuẩn lạc (trịn, dẹt hình đĩa và có

ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP,
SC Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ

Thử nghiệm IMViC

Đếm số ống canh EC (+) và
IMViC ++--, tra bảng MPN

E. coli
1.3 Cách tiến hành thí nghiệm
Mẫu phân tích: nước mía nguyên chất (dùng 10ml cho một tổ)
1.3.1 Pha môi trường và khử trùng dụng cụ
Bước 1: pha môi trường
Tên môi trường
SPW
(Saline
Water)

Thành phần

NaCl : 42.5g
Pepton Pepton: 5g

Tryptose: 20g
LSB
(Lauryl Sulphate Lactose: 5g
Broth)
Sodium chloride: 5g
KH2PO4: 2.75g
K2HPO4: 2.75g

Lauryl sulphate: 0.1g
BGBL

Peptone: 10g

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Tổng thể tích Ghi chú
500 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 27ml
cất
SPW (9ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi 1)
1000 ml nước Phân phối 90ml LSB cho
cất
mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)
pH 6.8 ± 0.2
trước khi khử trùng. (buổi 1)

1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho
Page | 4


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

(Brilliant
Bile

Green Lactose: 10g
Lactose Mật bị: 20g

cất
pH 7.4

mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có
chứa ống Durham) trước khi

Broth)

Brilliant green: 0.0133g

khử trùng. (buổi 1)

EC
(E.coli medium)

Trypticase or tryptose: 1000 ml nước Phân phối 90ml BGBL cho
20g
cất
mỗi tổ (10ml/ ống nghiệm có
Muối mật No.3: 1.5g
pH 6.9
chứa ống Durham) trước khi
Lactose: 5g
khử trùng. (buổi 1)
KH2PO4: 1.5g
K2HPO4: 4g
NaCl: 5g

Pancreatic digest of 1000 ml nước Phân phối 100ml EMB cho

EMB
(Eosin Methylene gelatin: 10g
cất.
mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2)
Blue Agar)
Lactose: 10g
pH 7.1 ± 0.2
K2HPO4: 2g
Eosin Y: 0.4g
Methylene blue: 65mg
Agar: 15g
Tryptone water

Tryptone
trypticase:10g

hoặc 1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 20ml, phân
cất
phối 10ml/ống nghiệm.
pH 7.2 ± 0.2
(buổi 3)

1000ml nước
MR-VP
Both Môi trường 1:
(Glucose
Buffered peptone-water cất.
Phosphate)
powder: 7g
pH 6.9 ± 0.2

Glucose: 5g
K2HPO4: 5g

Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân
phối 10ml/ống nghiệm.
Kiểm tra lại môi trường cung
cấp nào để pha môi trường.
(buổi 3)

Môi trường 2:
Casein
Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest of animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 5


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g

pH 7.5 ± 0.2
Sodium citrate: 2g
SCA
(Simmons Citrate NaCl: 5g
K2HPO4: 1g
NH4H2PO4: 1g

thoảng

MgSO4: 0.2g
Bromothymol
0.08g
Agar: 15g

Agar)

1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân
cất. Đun nóng phối 10ml/ống nghiệm.
nhẹ và thỉnh (buổi 3)
Đun sôi 1-2
blue: phút cho đến
khi hòa tan
hết. pH 6.8 ±
0.2

lắc.

Bước 2: khử trùng dụng cụ và mơi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.

1.3.2 Cách tiến hành:
Bước 3: pha loãng mẫu

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

ống
mẫu

9ml
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Độ pha lỗng
Hình 2: quy trình pha lỗng mẫu

Pha lỗng mẫu thành 3 nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3.
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 6


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Bước 4: Cấy mẫu vào canh LSB
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3
ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ.
Hình 3: Sơ đồ cấy mẫu từ các độ pha loãng

10-1

10-2

10-3

Bước 5: Định lượng Coliform và E. coli
Định lượng Coliform

Định lượng E. coli

Ghi nhận số ống có sinh hơi (+)

Ghi nhận số ống có sinh hơi (+)

Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu
từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa từ các ống LSB (+) sang môi trường canh
canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C, 48 giờ
EC, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng với
mỗi độ pha lỗng
mỗi độ pha lỗng
Tính kết quả (xem 1.4)

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống
(+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa
EMB. Ủ ở 370C, 24 giờ.
Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm
(trịn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh)
(xem hình 4), cấy vào Trypton, MR-VP, SC
Citrate, ủ ở 44.50C ± 0.20C, 24 giờ

Page | 7


Trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm TP.HCM

Hình 4: E.coli nuôi trên môi trường thạch EMB
cho khuẩn lạc màu kim xanh (theo Naowarat
Cheeptham, Thompson Rivers University,
Kamloops, BC, Canada)

Bước 6: thử nghiệm IMViC

Hình 5: Kết quả IMViC của Escherichia coli sau 24giờ ủ ở 37°C. (Anne Hanson, University of Maine, Orono)
Ống A: dương tính thử nghiệm indole trên mơi trường tryptone. Xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môi
trường sau khi nhỏ thuốc thử Kovács.
Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red.
Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự khơng thay đổi màu sau khi cho thuốc
thử Barritt’s A và Barritt’s B.
Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và khơng có khuẩn lạc trong ống
nghiệm.

a. Thử nghiệm Indol (I):
Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi sinh vật
có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol
được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa pDimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu
đỏ.
Phương pháp tiến hành: Mơi trường sử dụng cho thử nghiệm này là nước
tryptone. Sinh khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ ở nhiệt độ
370C trong 24-48 giờ. Bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống nghiệm, lắc đều để chiết

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 8


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

tách indol lên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử
vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu
đỏ trong lớp dung môi hữu cơ.
Đọc kết quả: (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt
môi trường. (-) lớp màu vàng của thuốc thử. Đôi khi có sự
xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa
của indol, tạo ra.
Hình 6: thử nghiệm Indol

b. Thử nghiệm Methyl Red (MR):
Nguyên tắc: chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ hiện diện trong môi
trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này thay đổi màu như sau: pH<4.4 đỏ;
pH 5.0-5.8 màu cam; pH>6.0 màu vàng.
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường
lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth). Dùng que vòng cấy một lượng nhỏ khuẩn lạc
trên môi trường MR-VP, ủ ở 370C trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc thử
đỏ methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo
quản ở 40C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả
ngay.
Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung
thuốc thử. (-) khi có màu vàng. Trường hợp màu cam, cần tiếp
tục ủ ống mơi trường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại

Hình 7: thử nghiệm MR

thử nghiệm.

c. Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) (xem mục 3.3, bài 3)
d. Thử nghiệm Citrate (iC)
Nguyên tắc: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kềm hóa mơi
trường. Mặt khác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất đều
có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải của muối
ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa mơi
trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi
trường.
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 9


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là mơi trường
lỏng SCA. Dùng que vịng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên
môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 350C
trong khoảng 24-48 giờ.
Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường
chuyển sang màu xanh dương. (-) khi khơng có khuẩn lạc và mơi
trường giữ ngun màu xanh lục.
1.4 Cách tính kết quả

Hình 8: thử nghiệm Citrate

Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng
MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha lỗng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật
trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.

Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus
2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý,
hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng
DNAse, phosphatease (+) có khả năng lên men và sinh acid từ
mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn
cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong mơi trường
chứa đến 15% NaCl. Một số dịng có khả năng tăng trưởng làm
Hình 9: S. aureus trên BPA tan máu trên mơi trường thạch máu. S. aureus có thể nhiễm vào
thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm.
Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và
kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến.
2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN
Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S. aureus thấp
nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao.

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 10


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ

thập phân 10-1, 10-2, 10-3…
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh
MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ
Chọn ống (+) đục ở mỗi độ pha loãng
Ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ
Chọn khuẩn lạc đặc trưng (trịn lồi, đen
bóng, có quầng trong và quầng sáng
xung quanh (đơi khi chỉ xuất hiện 1
trong 2 quầng))
Cấy vào TSA, ủ ở 370C ± 10C , 24 giờ
Thử nghiệm ngưng kết coagulase
Ghi nhận số coagulase (+) ở mỗi độ pha
loãng

Tra bảng MPN

Mật độ S.aureus
(MPN/g hoặc MPN/ml)

2.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: thịt heo sống, khối lượng 50g cho 1 lớp
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 11


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Bước 1: pha môi trường

Tên môi trường Thành phần
SPW
(Saline

NaCl : 42.5g
Pepton Pepton: 5g

Water)
MSB
(Mannitol
Broth)

Cao thịt: 1g
Salt Polypeptone: 10g
NaCl: 75g

Tổng thể tích Ghi chú
500 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 27ml
cất
SPW (9ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi 2)
1000 ml nước Phân phối 90ml MSB cho
cất
mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)
pH 7.4 ± 0.2
trước khi khử trùng. (buổi 2)

Mannitol: 10g
Phenol red: 0.025g
BPA

(Baird
Agar)

Môi trường cơ bản
Parker Tryptone:10g
Cao thịt: 5g
Cao nấm men: 1g
Sodium pyruvate: 10g
Glycine: 12g
Lithium chloride.6H2O:
5g
Agar: 20g

1000 ml nước Phân phối 100ml BPA cho
cất cho môi mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2)
trường cơ bản
pH 7.0 ± 0.2

Mơi trường hồn chỉnh
5ml Bacto EY tellurite
enrichment
(45-500C)
vào 95ml môi trường cơ
bản được làm nóng
chảy. Mơi trường hồn
chỉnh phải đục.
TSA
(Tryptone
Agar)

Trypticase peptone: 15g
Soya Phytone peptone: 5g
NaCl: 5g
Agar: 15g

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

1000 ml nước Phân phối 50ml BGBL cho
cất
mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3)
pH 7.3± 0.2

Page | 12


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Bước 2: khử trùng dụng cụ và mơi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.
Bước 3: đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu
Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dich SPW, đồng nhất mẫu
bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2)
Bước 4: Cấy mẫu vào canh MSB
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3
ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ. (xem bài 1, mục 1.3.2). Chọn các ống (+) có vi sinh vật phát
triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA
Bước 5: phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA
Dùng kỹ thuật cấy ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ.

Chọn khuẩn lạc đặc trưng :trịn lồi, đen bóng, có quầng trong và
quầng sáng xung quanh; đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng (xem
Hình 10: hình dạng S. aureus trên BPA
hình 10).
Chọn khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên BPA để thử nghiệm sinh hóa
coagulase
Bước 6: thử nghiệm sinh hóa coagulase
Nguyên tắc: các lồi thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết ra mơi trường
enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương, tạo thành các
khối đông làm đông huyết tương.
Phương pháp tiến hành: Huyết tương người hay thỏ đông khô thương phẩm được
dùng cho thử nghiệm này. Cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người hay thỏ khơng
pha lỗng, bổ sung 0.5ml dịch ni cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối khuẩn
lạc. Xoay nhẹ ống để trộn đều VSV. Ủ ống thử nghiệm ở 370C trong
4 giờ. Quan sát, ghi nhận sự ngưng kết mỗi 30 phút. Tiếp tục ủ đến
24 giờ nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ.
Đọc kết quả: (+) có sự kết tụ; (-) khơng có sự kết tụ, hỗn hợp
vẫn đồng nhất
Hình 11: thử nghiệm coagulase. Ống trên (+); ống dưới (-)

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 13


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Bài 3. Định tính Salmonella
3.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

Hình 12: Salmonella trên thạch XLD

Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kị khí tùy
ý, có khả năng di động khơng tạo bào tử, lên men glucose và
mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose,
không sinh Indole, không phân giải ure, khơng có khả năng
tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh
H2S.
Salmonella có thể phân tích định tính bằng mộ quy trình
gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng
định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương và cùng hiện
diện chung với một số lượng lớn với các lồi vi khuẩn khác thuộc họ Enterobacteriaceae
có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella.
3.2 Quy trình định tính Salmonella trong thực phẩm
Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh
BPW, ủ ở 370C, 18-24 giờ
Cấy 0.1ml dịch tăng sinh sang môi trường tăng sinh chọn
lọc RV, ủ ở 420C, 18-24 giờ
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 mơi trường chọn
lọc đặc biệt (XLD, HE, BS, SS…), ủ ở 370C, 24 giờ
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang
BHI hay TSA, ủ qua đêm
Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:
- Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/khơng H2S, sinh hơi/khơng
- Urea (-); Indol (-); VP (-); LDC (+); ODC (+); Manitol
(+); Sorbitol (+)

Salmonella dương tính/
âm tính trong 25g mẫu
Biên soạn: Lê Thùy Linh

Homepage:

Page | 14


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

3.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: cá hoặc ruột cá, khối lượng 25g cho 1 lớp
Bước 1: pha môi trường
Tên mơi trường Thành phần
Tổng thể tích Ghi chú
Pepton: 10g
BPW
(Buffered Pepton NaCl : 5g

1000 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 20ml
cất
BPW trước khi khử trùng.

Water)

pH 7.2 ± 0.2

(buổi 2)

1110 ml

Phân phối 30ml RV cho mỗi

pH 5.5 ± 0.2

tổ (10ml/ống nghiệm) trước

Na2HPO4: 3.5g
KH2PO4: 1.5g

RV
Môi trường cơ bản
(RappaportTryptone:5g
Vassiliadis Soya
NaCl: 8g
Pepton)
KH2PO4: 1.6g
Nước cất: 1000 ml

khi khử trùng. (buổi 2)

Dung dịch MgCl2
MgCl2.6H2O: 400g
Nước cất: 1000 ml
Dung dịch Malachite
green oxalate
Malachite green oxalate:
0.4g
Nước cất: 100 ml
Mơi trường hồn chỉnh
Mơi trường cơ bản:
1000ml
Dung dịch MgCl2:

100ml
Dung dịch Malachite
green oxalate: 10ml
Cao nấm men: 3g
XLD
(Xylose Lysine L-lysine: 5g
Desoxycholate)
Xylose: 3.75g
Lactose: 7.5g
Sucrose: 7.5g
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

1000 ml nước Phân phối 50ml XLD cho
cất
mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3)
pH 7.4 ± 0.2
Đun sôi môi
trường.
Page | 15


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Sodium deoxycholate:
2.5g

Không
Không

hấp.
giữ

Ferric ammonium

quá 1 ngày

citrate: 0.8g
Sodium thiosulfate: 6.8g
NaCl: 5g
Agar:15g
Phenol red: 0.08g
HE
(Hektoen
Agar)

TSA
(Tryptone
Agar)
KIA
(Kliger
Agar)

Proteose Peptone: 12.0g
Entric Yeast Extract: 3.0g
Bile Salts No. 3: 9.0g
Lactose: 12.0g
Saccharose: 12.0g
Salicin: 2.0g
Sodium Chloride: 5.0g

Sodium Thiosulfate:
5.0g
Ferric Ammonium
Citrate : 1.5g
Agar: 14.0g
Bromthymol Blue:
65.0mg
Acid Fuchsin : 0.1g
Trypticase peptone: 15g
Soya Phytone peptone: 5g
NaCl: 5g
Agar: 15g
Polypeptone peptone:
Iron 20g
Lactose: 20g
Dextrose: 1g
NaCl: 5g

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

1000 ml nước Phân phối 50ml HE cho mỗi
cất
tổ (25ml/petri) (buổi 3)
pH 7.5± 0.2
Đun sôi môi
trường.
Không hấp.

1000 ml nước Phân phối 50ml TSA cho

cất
mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 4)
pH 7.3± 0.2
1000 ml nước Phân phối 20ml KIA cho
cất
mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)
pH 7.4± 0.2
(buổi 5)

Page | 16


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Ferric ammonium
citrate: 0.5g
Sodium thiosulfate: 0.5g
Agar: 15g
Phenol red: 0.025g
MR-VP
Both Môi trường 1:
(Glucose
Buffered peptone-water
Phosphate)
powder: 7g

1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 40ml, phân
cất.
phối 10ml/ống nghiệm.
pH 6.9 ± 0.2

Kiểm tra lại môi trường cung

Glucose: 5g

cấp nào để pha môi trường.

K2HPO4: 5g

(buổi 5)

Môi trường 2:
Casein Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest of animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g
pH 7.5 ± 0.2
RSU
(Rustigian-Stuart
Urea Broth)

Dipotassium Phosphate:
9.5g

Yeast Extract: 0.1g
Urea: 20g
Monopotassium
Phosphate: 9.1g
Phenol Red: 0.01g

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

1000ml nước Mỗi tổ chỉ dùng 30ml, phân
cất.
phối 3ml/ống nghiệm.
pH 6.8 ± 0.2
(buổi 5)

Page | 17


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Bước 2: khử trùng dụng cụ và mơi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng
ở 1210C trong 15 phút.
Bước 4: Tăng sinh
Đối với các loại mẫu thông thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng,
bổ sung 225ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu bằng Stomacher trong 15 hoặc 30 giây.
Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Đối với một số loại thực phẩm (mẫu gia cầm tươi sống, sữa khô,
các gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị, casein, pho mát, bơ, sản phẩm chứa
cocoa, các sản phẩm của dừa) có chứa các chất có thể gây độc hoặc ức chế sự tăng trưởng
của Salmonella cần thực hiện quy trình tăng sinh đặc biệt (xem TLTK).

Bước 5: Tăng sinh chọn lọc
Lắc để trộn đều dịch tăng sinh, và chuyển 0.1ml sang 10ml môi trường tăng sinh
RV đã được ủ ấm 420C. Ủ ở 420C, 18-24 giờ. Khi cần thiết có thể kéo dài thời gian ủ
thêm 24 giờ.
Bước 6: Phân lập và nhận diện
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ
dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa môi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella
như XLD và HE. Biểu hiện của Salmonella trên từng môi trường như sau:
+ Môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có
hay khơng có tâm đen. Một số dịng Salmonella có thể có tâm đen
bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
Hình 14: khuẩn lạc Salmonella trên HE

Hình 13: khuẩn lạc Salmonella trên XLD

+ Mơi trường HE: khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ
xanh dương đến màu xanh lục, có hay khơng có tâm đen. Một số
dịng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần
hết khuẩn lạc.
Bước 7: Khẳng định
Từ mỗi môi trường chọn lọc phân biệt chọn và cấy chuyền ít nhất 5 khuẩn lạc nghi
ngờ sang môi trường không chọn lọc TSA. Ủ ở 370C, 18-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện
trên môi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa như sau:
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 18


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

+ Thử nghiệm sinh H2S trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar): Môi trường KIA
được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose,
lactose) và khả năng sinh H2S.
Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa 2 loại đường là 1% lactose và 0.1%
glucose. Khi cấy chủng vi sinh vật lên mơi trường này có 3 trường hợp xảy
ra đối với sự tăng trưởng của VSV: chỉ sử dụng glucose, sử dụng glucose và
lactose, không sử dụng cả hai đường này. Salmonella chỉ lên men được
đường glucose vì thế phần nghiêng của mơi trường có màu đỏ, phần sâu có
màu vàng. Thời gian ủ từ 18-24 giờ.
Về sinh hơi: đa số các dịng Salmonella đều có khả năng sinh H2S nên có
xuất hiện các vệt màu đen trong mơi trường này. Có thể thấy hiện tượng
sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch môi trường hoặc môi trường bị đẩy
lên trên tạo một khoảng không bên dưới đáy ống nghiệm.
Hình 15: thử nghiệm KIA. Ống 1: mơi trường KIA khơng có
VSV. Ống 2: xuất hiện màu vàng chứng tỏ VSV lên men
lactose tốt (lên men glucose cũng tốt). Ống 3: có sinh khí,
chứng tỏ lên men có sinh khí. Ống 4: màu đỏ trên phần thạch
nghiêng, màu vàng dưới đáy chứng tỏ VSV chỉ lên men
glucose. Ống 5: màu đen xuất hiện chứng tỏ có q trình khử
lưu huỳnh và sinh H2S.

+ Thử nghiệm urea (-): được thực hiện trên môi trường
urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Broth), chứa chỉ thị
đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là
pH 6.8-8.4). Dùng que cấy vòng cấy lượng sinh khối lớn từ
khuẩn lạc của chủng thuần vào ống chứa 3ml môi trường vô
trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 370C trong 48
giờ. Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi
pH môi trường; sau khi nuôi cấy môi trường vẫn giữ nguyên

màu vàng cam.

Hình 16: kết quả thử nghiệm Urea

+ Thử nghiệm VP (-): môi trường được sử dụng là môi
trường lỏng Clark-Lubs (môi trường MR-VP), pH 6.9. Dùng que
cấy vịng cấy vào các ống mơi trường MR-VP một ít sinh khối từ
khuẩn lạc của chủng thuần đã ủ 18-24 giờ trên môi trường KIA.
Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường.
Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn
Hình 17: kết quả thử
nghiệm VP
Biên soạn: Lê Thùy

Linh

Homepage:

Page | 19


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau
đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella
cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng khơng đổi màu trên bề mặt mơi
trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường.

Bài 4. Định lượng Bacillus cereus
4.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản

B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo
nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài
này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 50C – 500C, tối ưu ở 350C – 400C; pH dao
động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên mơi trường chọn lọc
lồi này tạo khuẩn lạc rất lớn, mọc lan, rìa nhăn.
4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc
Cân 25g mẫu, đồng nhất trong 225ml BPW, đồng
nhất bằng Stomacher, độ pha loãng 10-1
Pha loãng đến các độ pha lỗng 10-2, 10-3
Trãi 0.1ml mỗi độ pha lỗng lên mơi trường thạch
MYP, ủ ở 300C, 24 giờ
Chọn 5 khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase
dương tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc)
cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ ở 300C, 24 giờ

Nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa như: lên
men glucose, thử nghiệm VP.

Kết luận B. cereus

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 20


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

4.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: tơm khơ, khối lượng 50g cho 1 lớp

Bước 1: pha môi trường
Tên môi trường Thành phần
Tổng thể tích Ghi chú
Pepton: 10g
BPW
(Buffered Pepton NaCl : 5g
Water)
Na2HPO4: 3.5g

1000 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 50ml
cất
BPW trước khi khử trùng.
pH 7.2 ± 0.2

(buổi 4)

KH2PO4: 1.5g
MYP
(Mannitol-Egg
Yolk-Polymycin)

Môi trường cơ bản
Cao thịt: 1g
Pepton: 10g
Mannitol: 10g
NaCl: 10g
Phenol red (1% trong
ethanol 90%): 2.5ml
Agar: 15g
Nước cất: 900 ml

Môi trường Phân phối 100ml MYP cho
cơ bản đem mỗi tổ (12.5ml/petri). (buổi
khử trùng, để 4)
nguội 500C.
Sau đó trộn
các
thành
phần cịn lại

Dung dịch Polymixin
0.1%
Hịa tan 500 000 đơn vị
polymixin B sulfate
trong 50ml nước cất.
Lọc vô trùng và cất
trong tối 40C cho đến
khi dùng.
Egg yolk emulsion 50%
(sản phẩm thương mại)
Môi trường cuối cùng
Môi trường cơ bản:
225ml (ở 500C)
Dung dịch Polymixin B:
Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 21

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

2.5ml
Egg yolk emulsion (lòng
đỏ trứng): 12.5ml
Proteose peptone No. 3: 1000 ml nước Phân phối 30ml PRG cho
Red 10 g
cất
mỗi tổ (3ml/ống nghiệm)
Glucose Broth)
NaCl: 5 g
pH 7.4 ± 0.2
(buổi 4)
Beef extract (optional):
PRG
(Phenol

1g
Dextrose: 5 g
Phenol red (7.2 ml of
0.25% solution): 0.018 g
1000ml nước
MR-VP
Both Môi trường 1:
(Glucose
Buffered peptone-water cất.
pH 6.9 ± 0.2
Phosphate)
powder: 7g
Glucose: 5g

K2HPO4: 5g

Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân
phối 10ml/ống nghiệm.
Kiểm tra lại môi trường cung
cấp nào để pha môi trường.
(buổi 4)

Môi trường 2:
Casein
Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest of animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g
pH 7.5 ± 0.2

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 22


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Bước 2: khử trùng dụng cụ và mơi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút.
Bước 3: Pha loãng mẫu
Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml mơi trường BPW đồng nhất để có độ pha
loãng 10-1, đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút. Mẫu tiếp tục pha loãng thành 10-2,
10-3.
Bước 4: Phát hiện bằng mơi trường chọn lọc
Trãi 0.1ml mỗi độ pha lỗng trên môi trường thạch MYP, ủ ở
30 C, 24 giờ. Do B. cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase
và kháng polymycin nên trên môi trường này khuẩn lạc B. cereus có
màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa chứng tỏ
lecithinase được tạo thành. Chọn 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch
Hình 18: khuẩn lạc B. cereus trên MYP
nghiêng để chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định.
0

Bước 5: Các thử nghiệm khẳng định
- Nhuộm Gram: nhỏ 1 giọt nước cất lên phiến kính sạch;
dùng que cấy vịng lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn chuyển vào giọt
nước trên phiến kính, khuấy nhẹ. Cố định vệt bơi trên phiến kính
bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ vài giọt methyl violet
lên vệt bôi, giữ yên 20 giây. Rửa sạch phẩm nhuộm bằng nước.
Nhỏ vài giọt dung dịch KI/I2 lên vệt bôi, để yên 1 phút. Rửa
bằng cồn 95% đến vừa mất màu. Rửa lại bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch
safranin 30 giây. Rửa sạch bằng nước. Thấm nước dư bằng giấy lọc. Quan sát vi
khuẩn bằng vật kính 100X nhúng trong dầu, Gram dương có màu xanh tía, Gram
âm có màu đỏ hồng.
Thử nghiệm lên men glucose: cấy vi khuẩn vào 3ml canh PRG, ủ ở 350C, 24 giờ

trong điều kiện kỵ khí. Lắc ống nghiệm thật mạnh và quan sát sự phát triển thông
qua độ đục và sự chuyển màu từ đỏ sang vàng, chứng tỏ sự sinh acid từ glucose
trong điều kiện kỵ khí.

Hình 19: nhuộm gram B. cereus

-

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 23


Trường Đại học Cơng nghiệp thực phẩm TP.HCM

Hình 20: thử nghiệm lên men glucose. Ống
a: đối chứng. Ống b: không lên men
glucose. Ống c: lên men yếu. Ống d: lên
men mạnh.

-

Thử nghiệm VP (xem bài 3)

Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc
5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong
điều kiện có oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ
vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc

trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc
là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số
đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng
thực phẩm.
Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm men là
những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng
khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của
nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường.
Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm
mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát
sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm.

Biên soạn: Lê Thùy Linh
Homepage:

Page | 24