công nghệ sản xuất rượu vang

Tổng quan

1.1. Công nghệ sản xuất rượu vang
1.2.1. Cơ sở khoa học của quá trình lên men rượu
Lên men là quá trình cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào vi
sinh vật. Quá trình lên men rượu là quá trình oxy hoá-khử sinh học. Ethanol được tạo thành
do quá trình sinh trưởng của nấm men (Saccharomyces Cerevisiae) trong dòch lên men ở điều
kiện yếm khí. Đường đơn giản (hexose) được thẩm thấu vào bên trong màng tế bào, thông
qua các hoạt động sống của tế bào nấm men mà trong nguyên sinh chất của chúng liên tục
xảy ra các phản ứng sinh hoá rất phức tạp để chuyển hoá đường thành rượu.
Trong công nghệ sản xuất rượu vang, nấm men Saccharomyces cerevisiae là loài quan
trọng nhất. Các loài nấm men này có tốc độ lên men mạnh mẽ, có thể chòu được môi trường
18÷20% ethanol. Các loài Saccharomyces sinh sản bằng cách nảy chồi. Trong một số trường
hợp đặc biệt, nấm men có thể sinh sản bằng tiếp hợp.
Bảng 1.10: Thành phần hoá học của nấm men S.cerevisiae (Schulze, 1995).
Thành phần
(%)
khối
lượng
Acid béo Lượng %(m/m)
Protein 45,0 10:0 1.1
Glycogen 8,4 12:0 4.8
Trehalose 0,8 14:0 8.8
Mannan 13,1 16:0 26.8
Carbohydrate khác 18,4 16:1 16.6
RNA 6,3 18:0 6.1
DNA 0,4 18:1 25.7
Acid amin tự do 1,1 18:2< 10.1
Lipid 2,9
Tro 5,0
Hình 1.5: Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Bảng 1.11: Thành phần acid béo của S. cerevisiae ( Schulze, 1995).
Nấm men Saccharomyces cerevisiae sinh tổng hợp ethanol liên quan chặt chẽ đến sự
trao đổi chất bậc một và tổng hợp năng lượng. Quá trình sinh trưởng của nấm men cần
nguồn cacbon để cung cấp năng lượng, nấm men cũng cần nitơ và các chất khoáng cần thiết
cho cấu tạo tế bào và tham gia trong các enzyme.
Thời gian gần đây, có nhiều nghiên cứu tập trung vào sự phát triển sinh thái của các
loài vi sinh vật trong quá trình lên men rượu vang nho. Số lượng tế bào vi sinh vật trên quả
nho thay đổi theo vò trí đòa lý (Van der Westhuizen và cộng sự, 2000; Torija…, 2001), điều
kiện thời tiết (Fleet…, 1984; Parrish và Carrol, 1985; Longo…, 1991), tuổi của vườn nho và
giống nho (Martini…, 1980; Beltran…, 2002). Lượng nấm men trong dòch nho ép khoảng
10
3
÷10
5
CFU/ml (colony forming units), chủ yếu là các loài Hanseniaspora uvarum
(40÷72%), S.cerevisiae (0÷18%), Candida (15%), Pichia và Metschnikowia (3÷22%), các
Tổng quan
loài nấm men khác (1÷4%) [18]. Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men tự nhiên (không
bổ sung nấm men giống), các loài có hoạt tính lên men thấp (Hanseniaspora, Candida,
Pichia và Metschnikowia) phát triển nhanh chóng, sau 2 ngày số lượng bò giảm do không
chòu được môi trường lên men có nồng độ ethanol cao. Còn nấm men Saccharomyces
cerevisiae phát triển nhanh chóng và chiếm ưu thế trong môi trường do khả năng chống chòu
tốt với nồng độ ethanol trong dòch lên men. Giai đoạn cuối của quá trình lên men, trong dòch
lên men chỉ còn lại nấm men S.serevisiae (Schutz và Gafner, 1993).
Việc lên men rượu có bổ sung giống cũng là một vấn đề đang còn tranh luận. Nhiều ý
kiến cho rằng: lên men tự nhiên, do nhiều loài nấm men khác nhau cùng lên men sẽ góp
phần tạo ra hương vò và đặc tính riêng của rượu vang (Mateo , 1991; Querol…, 1992;
Fugelseng, 1996; Heard, 1999). Một số tác giả khác cho rằng việc bổ sung giống
S.cerevisiae không làm giảm mà còn cải tiến được chất lượng của rượu vang. Bổ sung giống
S.cerevisiae sẽ rút ngắn thời gian lên men, tránh được hiện tượng hư hỏng trong quá trình

lên men, giữ hương tự nhiên của từng giống nho. Ngoài ra, việc bổ sung này làm tăng lượng
glycerin mong muốn và làm giảm lượng acid acetic, ethyl acetate, rượu bậc cao cũng như
làm giảm sự hình thành H
2
S, SO
2
, hợp chất liên kết vơi SO
2
(Lemperle và Kerner, 1990).
Việc bổ sung nấm men là cần thiết trong các trường hợp dưới đây:
 Lên men dòch có nồng độ đường cao như: từ nho lạnh đông, nho quá chín hoặc nho
khô.
 Dòch lên men bò nhiễm nhiều vi sinh vật không mong muốn.
 Dòch lên men có lẫn một số chất kiềm hãm như các chất diệt nấm mốc sử dụng trong
quá trình chăm sóc nho.
 Sản xuất rượu vang từ các loại trái cây khác ngoài nho.
 Dòch nho bò thanh trùng hoặc dòch nho pha loãng từ nước nho cô đặc.
 Một số trường hợp lên men bò chậm (stuck) hoặc lên men thêm đối với rượu vang có
nồng độ ethanol thấp.
 Lên men phụ trong sản xuất rượu champagne.
 Lên men hỗn hợp nhão (phần xác nho còn lại sau khi lọc lấy dòch để sản xuất rượu
vang trắng) để chưng cất thu nhận ethanol.
Bảng 1.12: Một số đặc tính mong muốn của giống S.cerevisiae (Pretorius, 2000)[]
Khả năng lên men
 Lên men nhanh ngay từ đầu
 Hiệu suất lên men cao
 Khả năng chống chòu ethanol cao
 Chòu áp suất thẩm thấu cao
 Nhiệt độ tối ưu thấp
 Sản xuất sinh khối vừa phải

Đặc điểm tạo hương vò
 Hình thành các hợp chất sulfite,
thiol ít
 Tạo ra acid bay hơi ít
 Tạo ra lượng rượu bậc cao ít
 Tạo glycerin nhiều
 Sự tự phân tăng
Tính chất công nghệ
 Ổn đònh gen cao
 Chòu đựng sulphite cao
 Hoạt tính kết hợp với sulphite thấp
 Ít hình thành bọt
 Kết cụm và lắng nhanh
 Chòu đựng khi làm khô
 Nhu cầu về nitơ thấp
Quá trình lên men ethanol được thực hiện thông qua một chuỗi các phản ứng phức tạp.
Toàn bộ quá trình này được khái quát trong chu trình đường phân hay còn gọi là chu trình
Embden-Meyerhof-Parnas (EMP). Chu trình EMP bắt đầu bằng phản ứng phosphoryl hoá
Tổng quan
glucose, qua 10 phản ứng acid pyruvic được tạo thành. Trong điều kiện yếm khí pyruvic bò
decarboxyl hoá nhờ enzyme pyruvate decarboxylase xúc tác giải phóng CO
2
và tạo
acetaldehyde. Acetaldehyde bò khử thành ethanol nhờ NADH, được xúc tác bỡi enzyme
alcohol dehydrogenase.

Hình 1.6: Sơ đồ con đường đường phân (EMP)
Phương trình tổng quát của quá trình lên men:
Glucose
EMP

pyruvic acetaldehyde Ethanol
CO
2
alcohol
dehydrogenase
pyruvate
decarboxylase
NAD.H NAD
+

Các enzyme xúc tác các
phản ứng
Tổng quan
C
6
H
12
O
6
+ 2ADP + 2H
3
PO
4
= 2C
2
H
5
OH +2CO
2
+ 2ATP + 2H

2
O
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu
• Nhiệt độ
Nhiệt độ lên men có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Đối với nấm men
Saccharomyces nhiệt độ tối ưu gần 30
0
C. Nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng
lên men sẽ cao và kéo dài. Mặt khác, nếu có điều kiện làm lạnh dòch lên men xuống
20÷22
0
C sẽ hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn đồng thời giúp cho dòch lên men không bò
tăng nhiệt độ quá cao do nhiệt lượng giải phóng ra trong bồn lên men. Để giữ nhiệt độ thích
hợp và ổn đònh cho quá trình lên men, ta có thể sử dụng hệ thống điều nhiệt thích hợp.
Bảng 1.13: Một số thành phần rượu vang khi lên men tại các nhiệt độ khác nhau (Torija,
2003).[19]
Nồng độ (g/l) 15
0
C 20
0
C 25
0
C 30
0
C 35
0
C
Ethanol
Glyrerin
Acetaldehyde

Acid succinic
Acid acetic
93,60
6,05
0,05
0,74
0,08
93,04
6,59
0,09
0,89
0,13
90,00
6,91
0,04
0,77
0,14
89,60
7,18
0,04
0,92
0,13
79,52
7,38
0,02
0,70
0,22
Tổng 100,52 100,74 97,86 97,87 87,84
CO
2

89,53 88,99 86,08 85,70 76,06
Hiệu suất lên
men ethanol*
47,51 47,23 45,68 45,48 40,36
* Ethanol tạo ra (g/l)x100/lượng đường ban đầu (g/l).
Bảng 1.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên số lượng nấm men và tốc độ lên men (Torija…,
2003).[19]
Nhiệt độ
(
0
C)
Thời gian số
lượng tế bào đạt
tối đa (ngày)
Số lượng tế
bào đạt tối đa
(tế bào/ml)
Thời gian kết
thúc lên men
(ngày)
Tốc độ lên
men tối đa
(g/l.ngày)
15
20
25
30
35
6
3

3
3
2
1,18x10
8
1,46 x10
8
1,73 x10
8
1,95 x10
8
0,97 x10
8
15
15
15
20
20
9,41
20,87
52,87
63,23
69,69
• pH môi trường
Nồng độ ion H
+
trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men.
Chúng tác động lên thành tế bào làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng
cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong
một khoảng pH tối ưu nhất đònh.

Bảng 1.15: Ảnh hưởng của áp suất và pH đến quá trình lên men (Kunee…,1966).[31]
Số lượng tế bào ban
đầu (tế bào/ml)
pH Glucose còn lại sau 3
tuần lên men (%)
0 atm 5 atm
3x10
6
3,0 1,4 2,7
Tổng quan
3x10
6
3x10
6
3,3
3,7
0,5
0,3
2,5
2,2
Đối với nấm men rượu vang, pH tối thích để tạo ethanol là 4,0÷5,0. Trong điều kiện
lên men sản xuất, người ta điều chỉnh pH tới 3,0 ÷ 4,0 để hạn chế sự phát triển của tạp
khuẩn. Trong quá trình lên men ethanol, ở môi trường kiềm (pH khoảng 8), lượng glycerin
tạo ra tăng lên rất nhiều và trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu.[3]
• Nồng độ đường ban đầu của dòch lên men
Nồng độ dòch lên men tạo ra áp suất thẩm thấu tác động đến nấm men. Từng loài
nấm men riêng biệt có khả năng chòu đựng áp suất thẩm thấu khác nhau. Sự gia tăng nồng
độ đường sẽ dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu, làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm
men. Nấm men phát triển chậm, tổng số tế bào ít dẫn đến kéo dài thời gian lên men và
lượng đường sót tăng. Hàm lượng đường từ 10÷25% quá trình lên men diễn ra bình thường.

Để tạo ra lượng ethanol cao (13÷18%V) và tránh ảnh hưởng của nồng độ đường cao, người
ta chia nhỏ lượng đường để bổ sung vào quá trình lên men theo từng giai đoạn (quá trình lên
men gián đoạn bổ sung cơ chất).
Bảng 1.16: Lượng ethanol tạo thành (%v/v) phụ thuộc theo nồng dộ đường và nhiệt độ lên
men (Ribéreau-Gayon…, 2000).[19]
Nồng độ đường
(g/l)
Khả năng lên
men (%v/v)
Ethanol tạo ra tại
9
0
C 18
0
C 27
0
C 36
0
C
127
217
303
7,2
12,4
17,3
7,0
11,8
9,9
6,9
11,0

9,9
6,9
9,4
7,7
4,2
4,8
5,1
Trong dòch lên men, ngoài thành phần chính là nguồn cacbon được nấm men sử dụng
cho quá trình lên men. Dòch lên men còn có các thành phần protein, lipid, các chất khoáng
và các chất kích thích sinh trưởng được nấm men sử dụng cho quá trình sinh trưởng, phát
triển.
Tuỳ thuộc vào loại rượu được sản xuất mà nồng độ chất khô của dòch lên men sẽ
được điều chỉnh thích hợp.
• Lượng nấm men gieo cấy ban đầu
Lượng nấm men gieo cấy ban đầu liên quan mật thiết đến tiến trình lên men qua các
chỉ số sau: lượng sinh khối thu được, thời gian lên men, hàm lượng các sản phẩm phụ tạo
thành và tỷ lệ tương quan giữa chúng. Lượng nấm men giống chiếm 5÷10% thể tích bồn lên
men. Chất lượng nấm men giống thoả mãn các điều kiện:
Số tế bào trong 1ml chiếm 100 ÷ 120 triệu
Số tế bào nảy chồi 10 ÷15%
Số tế bào chết không quá 5%.
• Ảnh hưởng của oxy
Nấm men được xếp vào nhóm vi sinh vật yếm khí tuỳ tiện. Trong điều kiện có oxy,
hoạt động sinh sản của nấm men mạnh mẽ hơn, vì vậy sinh khối tăng nhanh. Quá trình sản
xuất rượu vang, sục khí thường được áp dụng trong quá trình nhân giống nấm men. Ở giai
đoạn lên men, độ thoáng khí sẽ gây bất lợi cho quá trình lên men rượu. Quá trình lên men
phải diễn ra ở điều kiện yếm khí hoàn toàn, ở điều kiện này sự hô hấp của nấm men bò ức
Tổng quan
chế và để đáp ứng năng lượng cần thiết, nấm men phải phân huỷ đường và quá trình này
tạo ra ethanol và CO

2
.
• Ảnh hưởng của Nitơ
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH
3
và NH
4
+
. Nấm men có
thể tổng hợp tất cả các acid amin cần thiết từ muối amôn. Nấm men phát triển nhanh và
cường độ lên men mạnh trong môi trường có đầy đủ nguồn dinh dưỡng nitơ. Trong dòch quả
nho thường có đủ nitơ cung cấp cho nhu cầu của nấm men. Tuy nhiên một số trường hợp do
giống nho, thời tiết hoặc thổ nhưỡng xấu dẫn đến quả nho thu hoạch thiếu nitơ, người ta sẽ
bổ sung thêm muối amôn để tăng khả năng lên men của nấm men.
• Muối khoáng
Muối khoáng cần thiết cho quá trình tổng hợp các thành phần tế bào và là một co-
factor tham gia vào nhiều phản ứng enzyme. Bình thường nguồn muối khoáng trong quả
cung cấp đủ nhu cầu dinh dưỡng của nấm men.
• Khí sulfuarơ (SO
2
)
Trong dung dòch nước, SO
2
kết hợp với H
2
O tạo ra các ion HSO
3
-
, SO
3

2-
. SO
2
không
phân ly xâm nhập qua màng tế bào dễ dàng hơn, như thế nó tạo ra các phản ứng ức chế bên
trong tế bào. Sự phân ly SO
2
phụ thuộc vào giá trò pH của dung dòch. Dung dòch có pH thấp,
SO
2
ít phân ly và tác động ức chế lên vi sinh vật mạnh hơn, do đó lượng SO
2
sử dụng ít hơn.
Nấm men chống chòu tốt với SO
2
, còn vi khuẩn lên men acid lactic và acid acetic dễ bò ức
chế. Do đó, người ta thường xông khí SO
2
vào thùng lên men để thanh trùng trong quá trình
sản xuất rượu vang. Tuy nhiên, với nồng độ quá cao, SO
2
có thể ức chế quá trình lên men
của nấm men.
Trong quá trình lên men, SO
2
tự do (chiếm 1÷10% lượng SO
2
hoà tan trong dòch, phụ
thuộc pH) liên kết với các chất trong quá trình trao đổi chất của nấm men như
Acetaldehyde, Pyruvate, 2-Oxoglutarate. Sự liên kết này làm giảm lượng acetaldehyde, dẫn

đến giảm được mùi không mong muốn của sản phẩm. Đồng thời SO
2
cũng là một chất
chống oxy hoá, ngăn chặn sự hoá nâu của rượu vang.[18]
• Nồng độ sản phẩm lên men
Ethanol là sản phẩm chính của quá trình lên men rượu. Khi nồng độ rượu tăng lên sẽ
phần nào ức chế sự phát triển của nấm men. Đa số nấm men chòu được nồng độ rượu trong
khoảng 14÷16% thể tích.
Khí CO
2
được tạo thành song song với sự tạo thành ethanol, một phần hoà tan trong
dòch, một phần tách lên trên bề mặt môi trường. Nồng độ CO
2
cao (30g/l) sẽ làm tăng áp
suất bề mặt, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men.
Bảng 1.17: Ảnh hưởng của áp suất và nồng độ ethanol lên sự phát triển của tế bào nấm men
(Kunee…, 1966).[31]
pH
Số tế bào đạt tối đa (tế bào/ml)
(a)
p suất (atm) Nồng độ ethanol (%v/v)
(b)
0 2,5 5 10 11 12
3,0
3,3
3,7
7x10
6
1x10
7

1,1x10
7
7x10
5
4x10
6
7x10
6
2x10
5
3x10
5
5x10
5
6x10
5
3x10
6
3x10
6
2x10
5
3x10
5
5x10
5
1,5x10
5
3x10
5

3x10
5
Tổng quan
a: Số lượng tế bào ban đầu 4x10
4
tế bào/ml.
b: Áp suất được duy trì ở 5 atm.
Acid hữu cơ là sản phẩm phụ của quá trình lên men, trong quá trình lên men pH
thường giảm nhưng không ảnh hưởng nhiều đến nấm men. Các acid hữu cơ thường được tạo
thành gồm lactic, acetic, citric, pyruvic và succinic. Trong quá trình lên men rượu vang từ
nho thường có giai đoạn lên men malo-lactic với sự tham gia của nhiều vi khuẩn lactic như
Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc oenos để chuyển acid malic thành acid lactic làm
giảm độ chua và tạo vò hài hoà cho sản phẩm rượu vang.
• Hiện tượng nhiễm vi sinh vật
Ngoài các yếu tố ảnh hưởng ở trên, hiện tượng nhiễm vi sinh vật trong quá trình lên
men sẽ ảnh hưởng đến chất lượng rượu vang. Trong đó đáng chú ý:
Vi khuẩn Acetobacter oxy hóa rượu thành acid acetic, tạo mùi khó chòu cho vang.
Vi khuẩn lên men lactic: nhóm vi khuẩn này thường gây ra một số tính chất như tạo
cho vang có mùi chua khó chòu, gây đục, quánh dính, vò đắng…
Nấm men dại: một số loài nấm men như Hanseniaspora Opuculata,
Shizosaccharomyces, Saccharomyces ludiwigu, Candida mycodena…phát triển trong quá trình
lên men sẽ làm giảm hàm lượng rượu, gây đục, ức chế nấm men.
• Các sản phẩm phụ của quá trình lên men rượu
Trong quá trình lên men rượu còn tạo ra các sản phẩm phụ như glycerin, metanol,
diacetyl, các ester, các aldehyde, acid hữu cơ và rượu cao phân tử. Các thành phần này
chiếm một lượng nhỏ nhưng ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng và giá trò cảm quan của sản
phẩm.
Hình 1.7: Sự hình thành ethanol và các sản phẩm phụ của nấm men S. cerevisiae
(Lambrechts và Pretorius, 2000).[19]
Toång quan

Phụ lục
Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Dừa
Dừa được chọn là loại dừa ta, mua ở chợ Tam Bình, Q.Thủ Đức. Loại dừa non (7÷8)
tháng tuổi được xử lý bằng cách chặt một đầu lấy nước dừa sử dụng cho quá trình lên men.
Loại dừa già (11÷12) tháng tuổi lấy nước và nước cốt dừa phối chế chung để làm dòch lên
men.
Đường saccharose được sử dụng để bổ sung và điều chỉnh hàm lượng chất khô cho dòch
lên men. Đây là thành phần cung cấp nguồn cacbon cho nấm men sử dụng, dẫn đến điều
chỉnh nồng độ ethanol tạo thành trong sản phẩm.
Sử dụng đường tinh luyện RE của công ty cổ phần đường Biên Hoà, với một số thông
số hoá lý:
- Saccharose ≥ 99,8% chất khô
- Đường khử (Rs) ≤ 0,03%
- Độ ẩm ≤ 0,05%
- Hàm lượng tro ≤ 0,03%
- Độ màu (CV) ≤ 30
0
ICUMSA
Đường glucose: sử dụng đường glucose tinh thể và xi-rô glucose.
Nước: sử dụng nước cất ở phòng thí nghiệm để làm môi trường nhân giống nấm men.
Malt: sử dụng malt để làm môi trường thạch nghiêng nhân giống nấm men và nhân
giống cấp một.
Hoá chất
Sử dụng acid citric để điều chỉnh pH dòch lên men và các hoá chất khác sử dụng cho
quá trình phân tích, chuẩn độ gồm:
Dung dòch amoniac đậm đặc, cồn, ether, NaOH, HCL, H
2

SO
4
, K
2
SO
4
, CuSO
4
,
K
3
Fe(CN)
6
, KOH, dung dòch formaldehyde, xanh methylen, phenolphtalein.
Dụng cụ và thiết bò
Các dụng cụ và thiết bò sử dụng hiện có trong phòng thí nghiệm Vi sinh, Hoá sinh của
trường Đại Học Bách Khoa. Các thiết bò chính gồm bể ổn nhiệt, tủ lạnh, máy lắc, kính hiển
vi điện tử, tủ ấm, cân phân tích, nồi hấp tiệt trùng, buồng cấy, tủ sấy, máy đo pH, bộ cất
đạm, bộ chưng cất cồn.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Phụ lục
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp lên men
Thuyết minh qui trình:
Nguyên liệu dừa: Giống dừa được chọn là loại dừa ta, nguồn cung cấp từ tỉnh Bến
Tre. Dừa non khoảng 7÷8 tháng tuổi, dừa già khoảng 12 tháng tuổi.
Xử lý lấy nước: Dừa non được lấy nước bằng cách chặt một đầu, cho nước vào dụng
cụ chứa. Dừa gia đục lỗ để lấy nước.
Điều chỉnh pH, Bx: nước dừa lên men thường có pH và nồng độ đường không đúng

với yêu cầu lên men nên phải dùng acid citric để điều chỉnh giảm giá trò pH và đường
saccharose để tăng nồng độ đường. Thời gian pha chế dòch lên men tính từ khi lấy nước dừa
ra khỏi quả tối đa khoảng 5giờ, quá thời gian trên nước dừa bò vi sinh vật xâm nhập gây hư
hỏng.
Lên men: quá trình lên men tuỳ thuộc vào điều kiện lên men. Chuẩn bò cho quá trình
lên men, giống nấm men phải được nhân giống trước. Nhân giống phải thực hiện qua 2 lần
nhân giống, thời gian nhân giống khoảng 24÷48 giờ. Thời điểm kết thúc quá trình lên men
là lúc ta không nhìn thấy sự sủi bọt khí trong dòch lên men hoặc theo dõi bằng dụng cụ đo
nồng độ chất khô thì nồng độ không thay đổi.
Chuẩn bò môi trường
-Khảo sát thành phần nguyên liệu: nước dừa, nước cốt dừa.
-Xử lý nguyên liệu, phối hợp các phụ liệu.
Khảo sát quá trình lên men từ các nguyên liệu trên khi kết hợp với các phụ
liệu. Đánh giá chọn sản phẩm thông qua điểm đánh giá cảm quan và các
phân tích hiệu quả kinh tế kỹ thuật.
Lên men sản phẩm từ nguyên liệu đã chọn: tối ưu hoá thực nghiệm quá trình
lên men với các thông số pH, nhiệt độ, nồng độ chất khô (đường), thời gian
lên men, tỷ lệ giống ban đầu.
Khảo sát động học quá trình lên men: xác đònh tốc độ sinh trưởng, tốc độ sử
dụng cơ chất, tốc độ tạo sản phẩm của nấm men.
Đề xuất qui trình sản xuất sản phẩm rượu vang dừa, kiểm tra chất lượng sản
phẩm
Phụ lục
Lắng cặn, tách men: kết thúc quá trình lên men, xác nấm men lắng xuống đáy bình.
Sau khi nấm men đã lắng hết, ta tiến hành gạn cặn loại bỏ xác nấm men. Quá trình gạn cặn
tránh chấn động để tránh rượu bò đục trở lại và có thể dùng ống xiphông để thực hiện việc
tách cặn.
 Sơ đồ qui trình sản xuất rượu vang dừa
Hình 2.2: Sơ đồ qui trình sản xuất rượu vang dừa
Lên men phụ và Tàng trữ: Trước khi lên men phụ, có thể bổ sung cồn thực phẩm để

điều chỉnh nồng độ cồn theo ý muốn, bổ sung đường, dòch quả…Quá trình lên men phụ sẽ
tạo cho rượu có mùi vò ổn đònh, êm dòu và hài hoà. Trong thời gian lên men phụ và tàng trữ
xác nấm men và cặn sẽ lắng xuống đáy. Các phần này phải được lọc bỏ trước khi chiết chai.
Dừa nguyên
liệu
Xử lý lấy nước
Điều chỉnh pH, Bx
Lên men
Lắng cặn, tách men
Chiết chai
Sản phẩm
Acid citric
Đường
saccharose
Nhân giống
Giống
nấm men
Tàng trữ
Lắng, lọc
Cặn
Cặn
Lên men phụ
Biến
Phụ lục
Chiết chai: rượu sau một thời gian tàng trữ được chiết chai hoàn thành sản phẩm.
Chai sử dụng là chai thuỷ tinh, phải được rửa sạch và thanh trùng. Sản phẩm hoàn thiện đưa
ra thò trường phải được kiểm tra chất lượng, đóng nút, dán nhãn…
 Phương pháp len men:
Quá trình lên men được thực hiện ở điều kiện phòng thí nghiệm. Dòch lên men cho
vào các bình tam giác 250ml, lượng dòch chiếm khoảng 4/5 dung tích bình, lên men tónh theo

các điều kiện thí nghiệm.
2.2.3. Phương pháp qui hoạch thực nghiệm
Phương pháp qui hoạch thực nghiệm nhằm tìm điều kiện lên men tối ưu khi ta thay
đổi đồng thời các yếu tố ảnh hưởng.
Các bước tiến hành:
 Chọn thông số tối ưu hóa và các yếu tố ảnh hưởng.
 Xác đònh mức cơ sở, khoảng biến thiên và mức biến thiên của các yếu tố.
 Lập mô hình hồi qui tuyến tính và ma trận thực nghiệm.
 Tiến hành các thí nghiệm.
 Xác đònh phương trình hồi qui (tính các hệ số hồi qui, kiểm đònh ý nghóa các hệ số hồi
qui và sự tương thích của mô hình).
 Kiểm chứng bằng thực nghiệm: để khẳng đònh tính đúng đắn và độ tin cậy của các kết
quả nghiên cứu, tiến hành thực nghiệm tại các điểm tối ưu và kiểm đònh sự phù hợp
của giá trò tối ưu xác đònh bỡi phương trình hồi qui so với kết quả thực nghiệm. Để kết
quả kiểm chứng là tin cậy về mặt thống kê, cần đánh giá mức độ trùng nhau đó theo
các chuẩn thống kê, được thành lập dựa trên phân tích phương sai.
Đặt các yếu tố ảnh hưởng bằng các biến:
X
1
: nồng độ chất khô (
0
Bx)
X
2
: nhiệt độ khảo sát (
0
C)
X
3
: pH dòch lên men

X
4
: lượng giống ban đầu (triệu tế bào/ml)
Tiến hành thí nghiệm theo phương án quay bậc hai của Box và Hunter với 4 yếu tố
tương tác như trên, cánh tay đòn α = 2; tổng số thí nghiệm là 31.[2]
Phương trình hồi qui là đa thức bậc hai có dạng:
∑∑∑
=
≠
==
+++=
k
j
jjj
k
uj
ui
ujju
k
j
jj
xbxxbxbby
1
2
1,1
0

(3.1)
Bảng 2.1: Các mức và khoảng biến thiên
Mức X

1
X
2
X
3
X
4
Mức cơ sở 18 30 4,0 6
Khoảng biến thiên 2 2 0,5 2,4
Mức trên 20 32 4,5 8,4
Mức dưới 16 28 3,5 3,6
2.2.4. Xử lý số liệu
Xử lý các số liệu thống kê thu được và xác đònh phương trình hồi qui bằng phần mềm
thống kê STATGRAPHICS version 3.0.
Phụ lục
2.3. Phương pháp phân tích
2.3.1. Các phương pháp phân tích hoá lý
 Xác đònh đường khử bằng phương pháp Graxianop
Đường khử khi đun nóng với dung dòch kiềm cùng với ferixyanua sẽ khử ferixyanua
thành feroxyanua và đường khử chuyển thành acid đường. Chất chỉ thò metylen xanh sẽ mất
màu xanh khi dung dòch hết ferixyanua.
 Xác đònh đường tổng
Sử dụng acid HCL thủy phân tinh bột và đường phức thành các đường khử, sau đó xác
đònh đường khử bằng phương pháp Graxianop.
 Xác đònh Nitơ tổng bằng phương pháp Kjeldahl.
 Xác đònh nitơ amin bằng phương pháp chuẩn độ formol
Khi cho formaldehyt vào, các nhóm amin sẽ bò metylen hóa và mất tính kiềm. Nhờ đó
acid amin trở thành acid mạnh hơn và có thể tác dụng với kiềm. Căn cứ vào lượng NaOH
tiêu hao ta tính được lượng acid và do đó tính được lượng nitơ amin có trong mẫu. Đây là
phương pháp để xác đònh nhanh lượng nitơ amin hòa tan trong dòch quả, dòch lên men hay

trong rượu vang.
 Xác đònh lipid thô trong mẫu lỏng (Phương pháp Adam-Rose-Gottlieb)
Trong môi trường amoniac và cồn, chiết lipid bằng ether và ether dầu hỏa. Cân lipid
và từ đó tính ra hàm lượng lipid trong mẫu ban đầu.
 Xác đònh hàm lượng chất khô trong dòch lên men
Đo bằng chiết quang kế cầm tay, dựa vào chỉ số đo được trên chiết quang kế (
o
Bx) để
biết tỷ lệ phần trăm chất khô hòa tan có trong dòch lên men.
 Xác đònh giá trò pH của dòch lên men
Sử dụng máy đo pH (Mettler Toledo) để xác đònh giá trò pH của dòch lên men.
 Xác đònh acid tổng số
Dựa trên phản ứng trung hòa các acid có trong mẫu bằng dung dòch kiềm NaOH 0,1N
với chất chỉ thò phenolphtalein.
Rượu vang chứa nhiều acid hữu cơ, phần lớn được hình thành trong quá trình lên men
rượu và lên men malolactic. Acid tổng là tổng các acid được chuẩn độ bằng dung dòch kiềm
khi đưa pH của rượu vang về 7. CO
2
, SO
2
tự do và liên kết không tính trong acid tổng số.
Trước khi chuẩn độ cần xử lý để tách CO
2
, SO
2
tự do bằng cách hút chân không và lắc trong
1÷2 phút hoặc dùng khí nitơ sục trong 1giờ.
 Xác đònh acid bay hơi
Trong rượu vang acid bay hơi phần lớn là acid acetic. Acid bay hơi được tách ra bằng
phương pháp chưng cất cuốn theo hơi nước. Dòch ngưng tụ được chuẩn độ bằng dung dòch

kiềm.
 Xác đònh nồng độ rượu trong rượu vang
Xác đònh độ rượu theo phương pháp chưng cất rồi đo nồng độ rượu bằng phương pháp
cân tỷ trọng. Bình tỷ trọng có nhiều loại khác nhau nhưng đều dựa trên nguyên tắc xác đònh
tỷ số giữa khối lượng của chất lỏng và nước cất có cùng thể tích. Căn cứ vào tỷ trọng tính
được, tra bảng độ rượu theo tỷ trọng dung dòch ethanol ở 20
o
C ta sẽ biết được nồng độ rượu
trong rượu vang.
2.3.2. Các phương pháp vi sinh
 Nhân giống nấm men
Phụ lục
Nấm men giống được nhân giống trong môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm và
bảo quản ở nhiệt độ 4
o
C. Khi đưa giống vào sử dụng, ta tiến hành nhân giống trong môi
trường malt lỏng, thêm một phần dòch lên men vào môi trường nhân giống để huấn luyện
thích nghi cho nấm men.
 Xác đònh số tế bào nấm men
Tổng số tế bào nấm men được xác đònh bằng phương pháp đếm dưới kính hiển vi, sử
dụng buồng đếm hồng cầu.
 Xác đònh số tế bào nấm men chết
Tế bào nấm men chết được xác đònh bằng cách nhuộm mẫu với dung dòch xanh
metylen, rồi tiến hành đếm trên kính hiển vi.
2.3.3. Phương pháp cảm quan đánh giá chất lượng sản phẩm
Ngoài một số chỉ tiêu lý hoá và vi sinh thì việc đánh giá cảm quan là một yêu cầu rất
quan trọng đối với rượu vang. Để đánh giá chất lượng rượu vang, người ta đánh giá theo
TCVN 3217-79 phương pháp cho điểm. Các chỉ tiêu cảm quan dùng hệ điểm 20, xây dựng
trên một thang 6 bậc 5 điểm và có sử dụng hệ số trọng lượng.
Bảng 2.2: Yêu cầu về cảm quan của rượu vang (TCVN 7045:2002).

Tên chỉ tiêu Yêu cầu
1. Màu sắc Đặc trưng cho từng loại vang
2.Mùi Thơm đặc trưng của nguyên liệu và sản phẩm lên men, không có mùi lạ
3. Vò Chua chát có hoặc không có vò ngọt, không có vò lạ
4. Trạng thái Trong không vẩn đục
Bảng 2.3. Bảng điểm mức chất lượng
Mức Điểm Mức Điểm
Tốt
Khá
Trung bình
18,6 ÷ 20,0
15,2 ÷ 18,5
11,2 ÷ 15,1
Kém
Rất kém
Hỏng
7,2 ÷ 11,1
4,0 ÷ 7,1
0 ÷ 3,9
Sản phẩm đạt chất lượng khi điểm trung bình chưa có trọng lượng của một chỉ tiêu bất
kỳ phải đạt nhỏ nhất là 2,8 và điểm chất lượng không nhỏ hơn 11,2.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát nguyên liệu và chọn giống nấm men
3.1.0. Thành phần nguyên liệu dừa
Nhận xét:
Nước dừa đã được biết đến là môi trường có thành phần các chất dinh dưỡng khá tốt
cho vi sinh vật phát triển, tuy nhiên so với nước nho hàm lượng đường thấp hơn, lượng
đường tổng của dừa non nhỏ hơn ½ lượng đường của nho. Hàm lượng nitơ tổng trong nước
dừa non bằng khoảng 17% lượng nitơ của nho. Và chất béo thì không khác nhau nhiều
(0,12g/100ml của dừa non so với 0,11g/100ml của nho). Trong quá trình lên men để đảm

bảo tạo ra được hàm lượng ethanol phù hợp với yêu cầu của sản phẩm, người ta bổ sung
thêm đường saccharose hoặc glucose.
Hàm lượng nitơ tổng trong nước dừa thấp hơn so với nước nho, trong quá trình lên
men có thể sẽ ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và tạo sản phẩm của nấm men. Ảnh hưởng
Phụ lục
này thường làm chậm quá trình lên men, hàm lượng nitơ phụ thuộc vào giống nho, điều kiện
thổ nhưỡng, thời tiết… Trong thực tế sản xuất rượu vang nho, khi cần thiết người ta sẽ bổ
sung thêm nitơ bằng các acid amin hoặc các muối amôn.
Chất béo tham gia vào cấu tạo của màng tế bào nấm men, chúng được tổng hợp
thành các phospholipid, sterol (ergosterol), glycerolipid… Thành phần chất béo của môi
trường lên men ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của nấm men, chủ yếu là các acid béo
không no như acid linoleic, oleic, linolenic…Tuy nhiên, lượng các acid béo này không cần
nhiều. Trong trường hợp môi trường không có các acid béo thì nấm men sẽ tự tổng hợp để
sử dụng, làm chậm tốc độ phát triển sinh khối và tốc độ lên men. Ngược lại, môi trường có
nhiều chất béo cũng gây hiện tượng ức chế sự sinh trưởng của nấm men. Ngoài ra, chất béo
khi tiếp xúc với môi trường dễ bò ôi hoá do oxy hoá và vi sinh vật phân huỷ. Trong thành
phần của sữa dừa, hàm lượng chất béo rất cao và lượng đường ít nên không phù hợp cho quá
trình lên men của nấm men.
3.1.2. Chọn giống nấm men
Giống nấm men có khả năng lên men rượu vang có nhiều loài thuộc họ
Saccharomyces. Mỗi loài sẽ thích ứng với từng môi trường lên men riêng. Chúng tôi khảo
sát khả năng lên men của 2 loài nấm men S.oviformis và S.cerevisiae (BK) được lưu giữ tại
phòng thí nghiệm vi sinh Trường Đại Học Bách Khoa và 1 loài S.cerevisiae(SG) của Trường
Đại Học Công Nghệ Sài Gòn. Loài nấm men được lựa chọn phải có khả năng thích nghi và
lên men nhanh, đồng thời phải cho sản phẩm có mùi vò tốt và chất lượng ổn đònh.
Nhân giống được tiến hành 2 lần, lần đầu nhân giống trong ống nghiệm với 10ml dòch
malt trong 16 giờ. Sau đó, nhân giống lần 2 trong bình tam giác với 150ml nước dừa non bổ
sung 5% đường saccharose, sau 24 giờ xác đònh tổng số tế bào và số tế bào chết trên kính
hiển vi.
Bảng 3.2: Kết quả nhân giống từ 3 loài nấm men Saccharomyces

S.cerevisiae(BK)
S.oviformis
S.cerevisiae(SG)
Tổng số tế bào trong 1ml
canh trường (triệu)
126 119 127
Số tế bào chết (%) 0,2 0,6 0,3
Bảng 3.3: Số lượng tế bào nấm men nuôi cấy sau 48h trong các môi trường (Sierra và
Velasco, 1976) [15]
Môi trường Chất bổ sung
vào môi trường
Lượng (g/l) Số lượng tế bào
(triệu/ml)
Nước dừa non
Nước dừa già
Nước dừa+peptone-glucose
Nước dừa +3% saccharose
Nước dừa +3% saccharose
Nước dừa +3% saccharose
Nước dừa +3% saccharose
Nước dừa +3% saccharose
Nước dừa +3% saccharose
Nước dừa +3% saccharose
-
-
-
-
NaNO
3
K

2
HPO
4
KCL
MgSO
4
.7H
2
O
FeSO
4
.7H
2
O
Muối Czapek
-
-
-
-
3,0
1,0
0,5
0,5
0,01
5,0
80,0
69,2
105
80,2
88,5

65,4
60,3
63,5
61,3
72,0
Phụ lục
Nước cất
Nước cất +3% saccharose
Nước cất + dd muối Czapek
-
-
-
-
-
-
0,18
0,71
0,69
Nhận xét:
Số lượng tế bào nhân giống đạt trung bình 124 triệu/ml lớn hơn so với tác giả Sierra
và Velasco, 1976 (80 triệu/ml). Sự khác biệt này có thể là do ở đây chúng tôi nhân giống 2
lần với môi trường malt và nước dừa nên tế bào có điều kiện sinh trưởng qua 2 lần thay đổi
môi trường, lượng chất dinh dưỡng không bò giảm nhiều như trong quá trình nuôi cấy của
tác giả Sierra và Velesco.
Để chọn giống nấm men thích hợp, chúng tôi tiếp tục sử dụng các canh trường nhân
giống này cho quá trình lên men nước dừa.
Dòch lên men được pha chế với nồng độ chất khô 20
0
Bx, pH 4,0, cho 5%v/v dòch nhân
giống từng loại giống vào ba mẫu khác nhau. Sau 7 ngày lên men tiến hành xác đònh hàm

lượng ethanol tạo thành và hàm lượng chất khô còn lại.
Bảng 3.4: Lên men nước dừa từ 3 chủng Saccharomyces
S.cerevisiae (BK)
S.oviformis
S.cerevisiae (SG)
Lượng giống cấy ban đầu
(%v/v)
5 5 5
Bx ban đầu (
0
Bx) 20 20 20
Bx sau (
0
Bx) 7,4 7,6 7,4
pH đầu 4,0 4,0 4,0
pH sau 3,64 3,56 3,62
Nồng độ ethanol (%v/v) 9,68 9,10 9,76
Điểm đánh giá cảm quan 12,6 11,3 12,8
Nhận xét:
Lượng ethanol tạo ra không có sự khác biệt đáng kể, 2 loài S.cerevisiae tạo ra lượng
ethanol lớn hơn (9,76 và 9,68 %v/v-sự sai biệt này không có ý nghóa thống kê) so với loài
S.oviformis (9,10 %v/v). pH của sản phẩm so với dòch pha chế ban đầu do loài
S.cerevisiae(BK) giảm 0,36; loài S.cerevisiae (SG) giảm 0,38 và loài S.oviformis giảm 0,44.
Việc đánh giá cảm quan sản phẩm tạo thành cho thấy các mẫu đều cho mùi đặc trưng của
rượu. Và điểm cảm quan của 3 mẫu cho thấy loài S.cerevisiae (SG) đạt 12,8 và loài
S.cerevisiae (BK) đạt 12,6 lớn hơn loài S.oviformis đạt 11,3. Từ đó, chúng tôi chọn loài
S.cerevisiae (SG) để tiếp tục nghiên cứu.
3.1.3. Khảo sát chọn nguyên liệu dừa thích hợp cho quá trình lên men
Tiến hành lên men dung dòch nước dừa non, nước dừa già, nước dừa non + nước cốt
dừa. Nước cốt dừa được phối trộn với nước dừa theo tỷ lệ 1/10. Nước cốt dừa được sử dụng

nhằm tận dụng hương và màu sắc đặc trưng của dừa. Thời gian lên men 7 ngày, kết quả
nồng độ ethanol thu được trong bảng 3.5.
Phụ lục
Bảng 3.5: Kết quả lên men các nguyên liệu khác nhau từ dừa.
Nước dừa non
7÷8 tháng
Nước dừa già Nước dừa non +
nước cốt dừa
pH đầu
pH sau
Bx đầu (
0
Bx)
Bx sau (
0
Bx)
Nồng độ ethanol (%v/v)
4,01
3,52
20
7,6
9,26
4,01
3,50
20
8,1
8,60
4,03
3,42
20

8,9
8,12
Điểm cảm quan 13,2 10,6 6,8
Nhận xét:
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy trong môi trường nước dừa non, tốc độ lên men là nhanh
nhất. Hương dừa trước và sau khi lên men có sự thay đổi đáng kể. Dòch pha chế từ nước dừa
non + nước cốt dừa trước khi lên men có mùi thơm rất đặc trưng của sữa dừa. Tuy nhiên, sau
khi lên men do lượng acid béo bò oxy hoá nên sản phẩm có mùi của chất béo bò ôi hoá. Kết
quả đánh giá cảm quan các sản phẩm thu được cho thấy dòch lên nước dừa non+nước cốt
dừa không đạt yêu cầu về mùi, sản phẩm có mùi hắc khó ngửi.
Nước dừa già trong sản xuất copra thường bò bỏ hoặc thu nhận để sản xuất thạch dừa.
Kết quả thu được từ quá trình lên men cho thấy khi sử dụng nước dừa già làm môi trường
hàm lượng rượu tạo ra đáng kể, tuy nhiên sản phẩm lại không đạt về mặt cảm quan, sản
phẩm thường có màu vàng nâu của xơ dừa và mùi hơi hắc. Việc sử dụng nước dừa già để
lên men rượu vang là không khả thi, tuy nhiên có thể tiếp tục cho lên men acetic để sản
xuất giấm ăn. Tại các nước có sản lượng dừa nhiều, cùng với quá trình sản xuất copra người
ta thường kết hợp sử dụng nước dừa già để sản xuất thạch dừa, giấm ở qui mô công nghiệp.
chúng tôi chọn nước dừa non 7÷8 tháng tuổi để tiếp tục lên men rượu.
3.1.4. Khảo sát quá trình lên men bổ sung đường glucose và saccharose
Môi trường lên men là nước dừa non, sử dụng đường glucose dạng tinh thể và dạng
xi-rô (DE 42, 70% chất khô) và saccharose để điều chỉnh
0
Bx dòch lên men, tiến hành lên
men ở điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 8 ngày lên men, nồng độ ethanol thu được thể hiện
trong bảng 3.6:
Bảng 3.6: Nồng độ ethanol thu được khi lên men trên môi trường nước dừa non bổ sung
glucose và saccharose
Môi trường lên
men bổ sung
Lượng

bổ
sung
Bx đầu
0
Bx
Bx sau
0
Bx
pH đầu pH sau Ethanol
%v/v
Điểm
cảm
quan
Glucose tinh thể
Saccharose
Xi-rô glucose
126 g/l
125 g/l
0,25 l/l
18,0
18,0
18,0
6,1
6,3
7,8
4,02
4,02
4,01
3,48
3,46

3,49
9,26
8,93
7,79
13,4
13,2
12,4
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 2 4 6 8
Th ơ ø i g ian ( ng a ø y )
glucose
saccharose
Xi-rô glucose
Phụ lục
Hình 3.1: Nồng độ ethanol tạo thành theo thời gian khi lên men trên môi trường bổ sung
glucose, xi-rô glucose và saccharose.
Nhận xét:
Trong các loại đường thường dùng trong lên men sử dụng nấm men Saccharomyces là
glucose, saccharose và maltose, đường glucose được nấm men tiêu thụ nhanh nhất. Khi bổ
sung đường glucose vào môi trường nước dừa non quá trình lên men nhanh hơn so với mẫu

bổ sung đường saccharose. Tuy nhiên, nồng độ rượu tạo ra khác biệt là không đáng kể giữa
mẫu bổ sung đường glucose (9,26%v/v) và mẫu bổ sung đường saccharose (8,93%v/v). Đánh
giá cảm quan hai sản phẩm thu được, mùi vò của rượu không thấy khác biệt.
Xi-rô glucose chứa hỗn hợp các loại đường đơn, đường đôi và một số đường đa phân
tử nên nấm men sử dụng không triệt để, do đó lượng ethanol tạo thành thấp. Từ thực tế,
đường saccharose được sử dụng phổ biến và giá rẻ hơn đường glucose tinh thể nên đường
saccharose được chọn để tiếp tục thí nghiệm và sử dụng trong sản xuất rượu vang dừa.
3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình lên men