chiết xuất glycoside tim

CHIẾT XUẤT HỢP CHẤT
CHIẾT XUẤT HỢP CHẤT
GLYCOSIDE TIM
GLYCOSIDE TIM
ĐẠI CƯƠNG
Glycoside tim là một nhóm glycoside có cấu trúc
steroid, có tác dụng đặc biệt lên tim. Nhưng với liều
cao, chúng là những chất gây độc nên từ thời cổ xưa,
nhiều dân tộc ở nhiều nước đã biết sử dụng những
chất này để tẩm vào tên thuốc độc.
Trong cây chúng tồn tại dưới dạng glycoside hòa tan
trong các dịch tế bào. Dưới tác dụng của men hoặc
acid loãng, các glucoside thủy phân thành genin và
đường.
Glycoside tim còn được gọi là glycosidedigitalic vì
glycoside của lá cây Digitalics được dùng đầu tiên
trên lâm sàng để chữa bệnh tim.
Glycoside tim tan trong nước và cồn loãng, ít tan
trong các dung môi không phân cực. Glycoside tim
phân bố trong khoảng 10 họ thực vật, đặc biệt trong 2
học Trúc đào (Apocynaceae) và họ Thiên lý
(Asclepiadaceae).
CẤU TRÚC HÓA HỌC
Glycoside tim cũng như các glycoside khác, cấu trúc
hóa học gồm 2 phần: aglycon và phần đường.
Phần aglycon cấu tạo bởi một khung steroid. Gắn ở
C
17
là vòng lacton. Dựa vào vòng lacton, người ta chia
chúng thành 2 nhóm lớn:
Cardenoid: vòng lacton 5 cạnh, có một nối đôi.

Bufadienolid: vòng lacton 6 cạnh, có 2 nối đôi.
HO
HO
O
O
O
O
A B
C
D
Cardenolid
Bufadienolid
Phần đường được gắn vào C3. Cho đến nay người ta
biết khoảng 40 loại đường khác nhau. Ngoài những
đường thông thường như glucose, rhamnose, xylose,
fucose, còn có những đường là 2,6-desoxy.
Sự liên quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh
học của glycoside tim:
Liên hệ giữa vòng A/B: đa số glycoside tim có vòng A/B
là cis, A/B là trans ít gặp hơn. Vòng A/B có cấu tạo trans
thì hoạt tính sinh học giảm hơn so với cis.
Cấu tạo vòng lacton: phần quyết định tác dụng lên tim
là phần aglycon bao gồm nhân steroid và vòng lacton
chưa bão hòa, cả hai phần này đều rất quan trọng.
Nếu giữ lại vòng lacton, thay nhân steroid bằng nhân
benzen, naphtalen,… thì mất tác dụng.
Nếu giữ nguyên nhân steroid mà thay đổi vòng lacton
như: bão hòa nối đôi, mở vòng lacton, thay vòng lacton
bằng vòng lactam thì tác dụng mất và giảm đi rất nhiều.
Sự hấp thu qua dạ dày, tá tràng ruột non phụ thuộc

vào số lượng nhóm OH của phần aglycon hay nói cách
khác là phụ thuộc vào tính ái dầu của nó.
Nhóm OH ở vị trí C
14
rất quan trọng, không có
nhóm này thì tác dụng giảm đi rất nhiều.
Nhóm OH ở C
3
hướng α thì giảm tác dụng đi nhiều.
Qua quá trình chuyển hóa trong cơ thể, OH β ở vị trí
C
3
bị epimer hóa sang OH α để thải ra ngoài.
Nếu ở dạng aglycon thì hoạt tính của nhóm
bufadienolid mạnh hơn dẫn chất cardenolid tương
ứng.
Đối với phần đường thì tác dụng sinh học của
glycoside không những chỉ phụ thuộc vào bản chất
của đường mà còn phụ thuộc vào vị trí của phần
đường nối vào nhân steroid.
Ngoài ra, người ta thấy rằng liều chết khác nhau
tùy động vật. Đối với mèo thì liều chết gấp đôi thỏ và
khoảng 60 lần chuột cống trắng.
Ếch là động vật thích hợp để làm các thí nghiệm các
thuốc độc lên tim thì hầu như miễn dịch với các chất
này.
Thí dụ dịch chiết của hạt Strophanthus kombe đối
với mèo và chó thì độc như nhau nhưng digitoxin thì
ít độc trên chó hơn là trên mèo.
TÍNH CHẤT, ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG

1. Tính chất
Glycoside tim là những chất kết tinh, không màu, vị đắng, có
năng suất quay cực, tan trong nước, cồn, không tan trong
benzen, ether.
Những glycoside tim có đường 2-desoxy thì rất dễ bị thủy
phân khi đun với acid vô cơ 0,05N trong MeOH 30 phút,
trong khi những glycoside khác trong điều kiện đó thì không
thủy phân được.
Glucoside dễ bị phân hủy bởi các enzym. Thường thì các
enzym này có sẵn trong cây, có khả năng cắt bớt các đơn
vị đường cuối mạch (xa aglycon) để chuyển thành các
glycoside thứ cấp.
Vòng lacton dễ bị mở vòng bởi tác dụng của kiềm rồi
tạo thành dẫn chất iso không có tác dụng.
2. Các thuốc thử định tính và định lượng
Các thuốc thử định tính và định lượng chủ yếu dựa trên các thuốc
thử tạo màu ở ánh sáng thường hoặc tạo huỳnh quang dưới ánh sáng
cực tím.
Các thuốc thử chia làm 2 loại:
- Thuốc thử tác dụng lên phần đường
Thuốc thử Xanthydrol
Thuốc thử acid phosphoric đậm đặc:
Thuốc thử Kell-Kiliani:
- Thuốc thử phản ứng lên nhân steroid
Thuốc thử Liaberman-Burchard:
Thuốc thử Baljet:
Thuốc thử Kedde:
Thuốc thử Legal:
3. Các phương pháp chiết xuất để định lượng
Các phương pháp định lượng glycoside tim thường dựa

vào các phản ứng cho màu và phải qua khâu chiết xuất
glycoside toàn phần và loại tối đa các tạp chất khác lẫn
vào.
Công việc ổn định để diệt enzym trước khi chiết là cần
thiết. Thường người ta hay diệt enzym bằng cách cho tác
dụng ngay cồn sôi trên nguyên liệu.
Nói chung trong các phương pháp chiết xuất đều có giai
đoạn loại tạp bằng ether dầu hỏa, bằng acetat chì và dựa
trên tính chất glycoside có thể tan được trong CHCl
3
hoặc
CHCl
3
-cồn để tách riêng.
Phương pháp của Soos
Cân 1,5g bột nguyên liệu cho vào becher, thêm ít nước
cất để tạo thành khối nhão và để yên 15 phút.
Chuyển vào bình cầu, tráng becher bằng nước cất và
thêm nước cho đủ 151,5g. Đậy kín, lắc trong 1 giờ.
Sau đó cho thêm 15g dung dịch acetat chì 15%, lắc đều,
để lắng, lọc, bỏ tủa. Lấy 110g dịch lọc tương đương với
1g nguyên liệu, cho vào bình gạn lắc 3 lần, mỗi lần 25ml
CHCl
3
.
Dịch chloroform gộp lại, cho vào một bình cầu và làm
khan với 2g Na
2
SO
4

, lọc qua giấy lọc (đã thấm ẩm bằng
CHCl
3
) cho vào một bình định mức 250ml. Tráng bình
và giấy với một ít CHCl
3
. Bốc hơi dung dịch CHCl
3
trên
bếp cách thủy.
Cặn còn lại được hòa tan trong dung môi thích hợp cho
từng phản ứng.
Đối với những glycoside có độ tan rất lớn trong nước thì
phải thêm 8-10% NaCl vào dung dịch trước khi chiết
bằng CHCl
3
.
Phương pháp của Soos (tt)
Phương pháp của Losh-Karaer để định lượng
glycoside tim với thuốc thử picrosodic
Cân 2-10g nguyên liệu đã sấy khô tán nhỏ và rây (cỡ
rây 0,5-1mm), cho vào túi giấy thấm; đồng thời cần
định lượng độ ẩm. Các túi (10-12 mẫu) cho vào bình
miệng rộng có nút mài, thêm ether dầu hỏa hoặc
benzen và ngâm qua đêm.
Hôm sau lấy ra, đặt vào bát sứ và để khô ngoài không
khí (tốt hơn là trong tủ HOOD). Sau đó mẫu được chiết
bằng dụng cụ Soxhlet với hỗn hợp EtOH – CHCl
3
(1:9

theo thể tích). Thời gian chiết từ 14-16 giờ.
Phương pháp của Losh-Karaer (tt)
Dịch chiết 100-200ml được chuyển vào bình định
mức 200-250ml.
Tráng bình cầu và Soxhlet với hỗn hợp EtOH-
CHCl
3
, cho vào bình định mức và thêm cũng bằng
hỗn hợp đó cho đến ngấn.
Dùng ống hút chính xác lấy 25 hoặc 50 ml cho vào
chén sứ, bốc hơi trên nồi cách thủy trong tủ HOOD
cho đến khô.
Sau đó dùng một lượng cồn 15-30ml (chia thành từng phần
nhỏ 2-2,5ml) cho vào cắn, dùng đũa thủy tinh khuấy để hòa
tan và chuyển vào bình định mức 50 hoặc 100ml, trán chén
với 20-40ml nước cất và cho vào bình định mức.
Thêm vào bình định mức 6-10 giọt dung dịch acetat chì
30% (cho đến khi tủa hết tạp chất). Sau đó loại chì thừa
bằng 20-30 giọt dung dịch Na
2
SO
4
15% (cho đến khi tủa hết
chì). Thêm nước cho đến ngấn.
Lọc vào bình nón, nếu cần thì lọc 2 lần cho trong. Từ dịch
lọc này sẽ cho tác dụng với thuốc thử picro-sodic để làm
phản ứng màu.
Phương pháp của Losh-Karaer (tt)
Phương pháp của Makarevich chiết để chạy sắc ký
2g nguyên liệu khô, loại chất béo bằng ether dầu hỏa.

Sấy khô ở áp suất kém rồi sau đó chiết nóng bằng EtOH
96
o
, chiết tiếp bằng EtOH 80
o
cho đến hết hoạt chất.
Bốc hơi, hòa cặn trong 30ml nước rồi lắc với ether (4 x
30ml)
Loại ether, sau đó chiết glycoside bằng cồn và CHCl
3

(1:2), làm khô bằng Na
2
SO
4
, loại dung môi.
Hòa tan cắn vào 15-20 ml cồn thêm Al
2
O
3
độ hoạt hóa cấp
II, khuấy, lọc, rửa oxyt nhôm bằng 10-100ml cồn nóng, gộp
dịch cồn, loại dung môi đến khô.
Đánh giá bằng phương pháp sinh vật
Trong nhiều trường hợp, kết quả của phương pháp định
lượng bằng hóa học nêu ở phần trên không ăn khớp với liều
tác dụng nên Dược điển các nước và Dược điển Việt Nam
quy định đánh giá hiệu lực của glycoside tim bằng phương
pháp sinh vật.
Súc vật hay dùng là mèo hoặc ếch. Đối với mèo thì căn cứ

vào liều gây ngừng tim ở thời kỳ tâm trương, đối với ếch thì
căn cứ vào liều gây ngừng tim ở thời kỳ tâm thu.
Đối với ếch thì tiêm dưới da vào túi bạch huyết, đối với mèo
thì tiêm vào tĩnh mạch đùi, sau đó tính ra đơn vị ếch hoặc
đơn vị mèo.
Đơn vị ếch (Đ.V.Ê) là liều tối thiểu của nguyên liệu
hay của glycoside tim làm đa số ếch trong một lô ếch
thí nghiệm bị ngừng tim. Thí nghiệm được tiến hành
trong những điều kiện quy định.
Đơn vị mèo (Đ.V.M) là liều tối thiểu của nguyên liệu
hay của glycoside tim làm cho tim mèo ngừng đập,
tính theo kilogam thể trọng. Thí nghiệm được tiến
hành trong những điều kiện quy định.
CHIẾT XUẤT GLYCOSIDE TIM
CHIẾT XUẤT GLYCOSIDE TIM
Xử lý nguyên liệu
Trong nguyên liệu chứa glycoside tim thường chứa
enzym có khả năng thủy phân cắt bớt phần đường của
glycoside để cho các hợp chất artefact. Do đó việc ổn định
nguyên liệu trở thành một vấn đề quan trọng.
Bản chất của enzym là protein, không tan trong cồn,
tan trong nước, bị tủa bởi một số muối có nồng độ cao.
Enzym hoạt động thích hợp từ 20-45
o
C. Ở nhiệt độ trên
60
o
C, nói chung enzym bị phá hủy.
Những phương pháp diệt enzym đã được nhiều tác giả
đề cập đến.

Bourquelot dùng phương pháp cho nguyên liệu vào cồn
sôi.
Croris và Arnould thì sử dụng hơi nước trong nồi hấp để
ởn định nguyên liệu, hiện nay phương pháp ổn định
bằng hơi nước cũng không được sử dụng rộng rãi.
Năm 1909, Perrot Goris đã đưa ra phương pháp dùng
hơi cồn để ổn định nguyên liệu. Phương pháp này tốt
nhưng cần phải có thiết bị để tránh gây hỏa hoạn do hơi
cồn.
Hiện nay, nhiều tác giả đã dùng phương pháp đông khô
để làm khô nguyên liệu.
Để loại trừ tác dụng của enzym, có tác giả chiết xuất
bằng nước ở 0
o
C. Thông dụng hơn, có thể sử dụng các
chất ức chế enzym khác nhau để ngăn cản tác dụng của
enzym. Các chất dùng là: các muối vô cơ, các chất này
có khả năng kết tủa protid làm enzym bị biến tính.
Thực tế trong việc chiết xuất những glycoside dùng làm
thuốc, đôi khi người ta lại không ổn định nguyên liệu
trước khi chiết xuất mà lại để cho enzym hoạt động để
thu những glycoside thứ cấp.