TIỂU LUẬN TỔNG QUAN về sắc ký lớp MỎNG và sắc ký GIẤY

GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA THỰC PHẨM
Tiểu luận
TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀ
SẮC KÝ GIẤY
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
SVTH : PHAN HOÀNG TRUNG HIẾU
PHẠM TRUNG HIẾU
TRƯƠNG THỊ NGỌC DUYÊN
NGUYỄN TUẤN PHONG
PHẠM NGỌC XUÂN
LỚP : 07CH111
Biên hòa, tháng 4 năm 2011
SVTH : NHÓM 07CH111
1
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
I.TỔNG QUAN SẮC KÍ.
I.1. Phương pháp sắc kí.
- Sắc kí là một họ các kĩ thuật hoá học phân tích dùng để tách các chất
trong một hỗn hợp.
- Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong "pha động",
thường là dòng chảy của dung môi, di chuyển qua "pha tĩnh." Pha tĩnh trì
hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này
di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi
nhau theo thời gian, giống như các vận động viên chạy maratông. Một
cách lí tưởng, mỗi thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian
riêng biệt, gọi là "thời gian lưu."
- Trong kĩ thuật sắc kí, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc
khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của

các chất tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hay lỏng. Nhiều kĩ thuật
khác nhau đã được dùng để phân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính
khác nhau của các chất trong môi trường động khí hoặc lỏng và đối với
môi trường hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua, như giấy, gelatin hay
gel magnesium silicate.
- Sắc kí phân tích được dùng để xác định danh tính và nồng độ các phân
tử trong hỗn hợp. Sắc kí tinh chế được dùng để tinh chế các chất có trong
hỗn hợp.
I.2. Lịch sử
- Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich
Tsvet) phát minh ra kĩ thuật sắc kí vào năm 1903 khi ông đang nghiên
cứu về chlorophyll. Chữ sắc trong sắc kí có nghĩa là màu; nó vừa là tên
của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, và vừa là màu của các sắc tố thực vật
ông phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn tiếp tục được dùng dù các
phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc.
SVTH : NHÓM 07CH111
2
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
- Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington
Synge được trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc kí phân
bố.
- Kĩ thuật sắc kí phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà
nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc kí Tsvet có thể được
áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác
nhau. Đồng thời, kĩ thuật thực hiện sắc kí cũng tiến bộ liên tục, cho phép
phân tích các phân tử tương tự nhau.
I.3. Lí thuyết sắc kí
- Sắc kí là kĩ thuật phân tích chất khai thác sự khác biệt trong phân bố
giữa pha động và pha tĩnh để tách các thành phần trong hỗn hợp. Các
thành phần của hỗn hợp có thể tương tác với pha tĩnh dựa trên điện tích,

độ tan tương đối và tính hấp phụ.
I.4. Mức lưu giữ
- Mức lưu giữ đo tốc độ một chất di chuyển trong hệ thống sắc kí. Ở các
hệ thống liên tục như HPLC hay GC mà các hợp chất được chiết xuất bởi
chất chiết xuất, mức lưu giữ được đo bằng thời gian lưu R
t
hay t
R
, khoảng
thời gian giữa tiêm và phát hiện. Ở các hệ thống ngắt quãng như TLC,
mức lưu giữ được đo bằng hệ số lưu R
f
, quãng đường di chuyển của hợp
chất chia cho quãng đường di chuyển của chất chiết xuất (chạy nhanh hơn
hợp chất cần phân tích).
- Mức lưu giữ của một chất thường khác nhau đáng kể giữa các thí
nghiệm và phòng thí nghiệm do dao động của chất chiết xuất, pha tĩnh,
nhiệt độ và thiết kế của thí nghiệm. Vì vậy điều quan trọng là phải so
sánh mức lưu giữ của hợp chất muốn khảo sát với một hoặc nhiều hợp
chất chuẩn trong cùng điều kiện.
SVTH : NHÓM 07CH111
3
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
I.5. Các kĩ thuật sắc kí
- Sắc kí giấy
- Sắc kí lớp mỏng
- Sắc kí khí-lỏng
- Sắc kí trao đổi ion
- Sắc kí ái tính ion kim loại bất động
- Sắc kí lỏng hiệu năng cao

- Sắc kí thẩm thấu gel
II. SẮC KÝ GIẤY
II.1 Định nghĩa
- Sắc ký giấy là một kỹ thuật phân tích hóa học để tách và xác định các
hỗn hợp chất hoặc có thể nhuộm màu, đặc biệt là các chất sắc tố.
- Sắc ký giấy là phương pháp được sử dụng từ rất sớm nhưng ngày nay
nó đã được thay thế bằng sắc ký lớp lỏng. Nhưng sắc ký lớp mỏng không
phân tách được một số loại hợp chất mà sắc ký giấy có thể phân tách
được,đó là các ion kim loại, các amin, và mọt vài chất khác. Sắc ký giấy
lan ra bởi phân bố còn sắc ký lớp mỏng lan ra bởi mao dẫn, tuy vậy quá
trình tiến hành là giống nhau. Vì vậy ta sẽ xét nhiều tới phương pháp
thông dụng hơn để có thể hiểu rõ cho cả hai phương pháp này.
SVTH : NHÓM 07CH111
4
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
III. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG
III.1. Sắc kí lớp mỏng
- Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc
kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp
[1]
. Phương pháp sắc kí lớp
mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ, thường là
silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng
chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong
một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách
dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong
dung dịch.
- Sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: xét nghiệm
độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa.
- Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật.

- Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc nhận
biết những hóa chất trong một chất cho sẵn.
- Giám sát các phản ứng hữu cơ.
- Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa
một vài bước, làm tăng độ dung giải của sắc kí lớp mỏng và cho số liệu
chính xác hơn. Phương pháp này được gọi là sắc kí lớp mỏng hiệu năng
cao (high performance TLC - HPTLC).
III.2 Chuẩn bị bản sắc kí
- Bản sắc kí được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silicagel, với một
lượng nhỏ chất trơ để kết dính, như calcium sulfate (thạch cao), và nước.
Hỗn hợp này được trải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ,
như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa. Bản sắc kí này sẽ được để khô và kích
hoạt bằng cách nung nóng trong lò trong 30 phút ở nhiệt độ 110 °C. Độ
dày của lớp hấp phụ thường là 0.1-0.25 mm cho hóa học phân tích, và
khoảng 1-2mm cho sắc kí lớp mỏng dự bị. Trong mọi kĩ thuật sắc kí đều
bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh.
SVTH : NHÓM 07CH111
5
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
III.3 Kĩ thuật
- Sắc phổ của 10 tinh dầu được nhuộm màu bởi thuốc thử vanillin
Phương pháp tiến hành giống với sắc kí giấy với lợi thế là nhanh hơn,
tách hỗn hợp hiệu quả hơn, và có sự lựa chọn giữa các "pha tĩnh" khác
nhau. Bởi tính đơn giản và nhanh, sắc kí lớp mỏng thường được dùng để
giám sát các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của
phản ứng.
- Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc kí, khoảng
1 cm từ dưới lên. Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một dung môi thích
hợp, như ethanol hoặc nước, và được đặt vào trong một vật chứa có nắp.
Dung môi di chuyển lên bản sắc kí bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và

dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các hợp chất khác nhau trong hỗn
hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác
nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong dung môi.
- Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha
động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh. Thí dụ, nếu silicagel được
dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân cực. Cho trước 2 hợp chất có
tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực lớn hơn sẽ có sự liên
kết với silicagel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra khỏi
các chỗ liên kết. Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển
SVTH : NHÓM 07CH111
6
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
lên cao hơn trên bản sắc kí (kết quả là hệ số lưu R
f
sẽ lớn hơn). Nếu pha
động được thay bằng một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp
các dung môi, nó sẽ có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết
với silica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc kí sẽ dịch chuyển lên cao
hơn. Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn hợp ethyl acetate và
heptane như là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu R
f
cao
hơn cho tất cả các hợp chất trên bản sắc kí. Thay đổi độ phân cực của pha
động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản
sắc kí. Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên bản sắc kí, một pha tĩnh
không phân cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức năng hóa silica.
- Quá trình sắc kí lớp mỏng: một hỗn hợp của một hợp chất đỏ và một
hợp chất lam được tách biệt trong quá trình sắc kí (dung môi màu xanh
nhạt di chuyển lên trên bản sắc kí.
- Dung môi thích hợp dùng trong sắc kí lớp mỏng sẽ là một dung môi có

tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng
để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan
tròn do mao dẫn, và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để
hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòa tan
mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh
phân cực, và ngược lại.
III.4 Phân tích
SVTH : NHÓM 07CH111
7
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
- Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài
phương pháp được sử dụng để quan sát những vệt này:
- Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese-
activated zinc silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát
được những vệt này dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV
254
). Lớp hấp phụ
vì thế sẽ tự phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm tắt ánh sáng
này.
- Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau.
- Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc kí
vào, hoặc phun lên bản sắc kí.
- Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một
màng polyvinylidene fluoride (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu
hơn, chẳng hạn như khối phổ.
- Một khi đã trở nên quan sát được, hệ số lưu R
f
của mỗi vệt mẫu sẽ được
xác định bằng cách chia khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho
khoảng cách di chuyển được của dung môi. Những số liệu này phụ thuộc

vào các loại dung môi được sử dụng và các loại bản sắc kí, và không phải
là hằng số.
III.4 Ứng dụng
- Trong hóa học hữu cơ, phản ứng được giám sát chất lượng bởi sắc kí
lớp mỏng. Các mẫu thử được thấm lên bản sắc kí bằng một ống mao dẫn:
một vệt nhỏ chất ban đầu, một vệt nhỏ từ hỗn hợp phản ứng, và một vệt
nhỏ gồm cả 2 chất. Một bản sắc kí nhỏ (3 cm x 7 cm) sẽ mất khoảng
khoảng hai, ba phút để vận hành. Quá trình này phân tích chất lượng và
sẽ chỉ ra nếu chất ban đầu biến mất, sản phẩm được tạo thành, và bao
nhiêu sản phẩm được tạo thành. Đáng tiếc rằng sắc kí lớp mỏng đối với
các phản ứng xảy ra ở nhiệt độ thấp có thể cho ra kết quả không đúng, bởi
vì các mẫu thử sẽ được làm ấm lên trong mao dẫn. Một trong những phản
ứng như vậy là phản ứng khử ester bởi DIBALH thành aldehyde.
SVTH : NHÓM 07CH111
8
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
- Một ví dụ là sắc kí được áp dụng cho một phần lá xanh (ở đây là rau
chân vịt) qua 7 bước. Carotene tách ra nhanh chóng và chỉ quan sát được
cho đến bước 2. Chlorophyll A và B hiện rõ ở giữa bản sắc kí trong bước
cuối cùng và lutein là hợp chất đầu tiên nhuộm màu vàng lên bản sắc kí.
Bước 1
Bước 2
Bước 3
Bước 4
SVTH : NHÓM 07CH111
9
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
Bước 5
Bước 6
Bước 7

- Trong một nghiên cứu, sắc kí lớp mỏng đã được sử dụng để lọc phản
ứng hóa học hữu cơ
[2]
, như tổng hợp BINAP từ 2-naphtol. Trong phương
pháp này, cồn và dung dịch xúc tác (chẳng hạn như iron(III) chloride
được đặt riêng rẽ trên đường gốc, sau đó phản ứng với nhau và được phân
tích ngay lập tức.
III.5 Nguyên tắc
- Nguyên tắc: Phương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử
tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc.
- Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho
pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách.
Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích,
được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính
hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành
phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận.
SVTH : NHÓM 07CH111
10
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu
thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc
độ khác nhau. Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế
của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc
phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính
chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động.
- Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di
chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và
khoảng dịch chuyển của dung môi:
trong đó:
a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết

mẫu thử, tính bằng cm.
b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi
đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
Cách tiến hành
+ Dụng cụ
- Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù hợp
với các phiến kính cần dùng và có nắp đậy kín.
- Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng
dài 365 nm.
- Dụng cụ để phun thuốc thử.
- Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để
sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.
- Tủ hút hơi độc.
- Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần
những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.
- Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro) có thể chụp lưu giữ sắc
ký đồ ở ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30-50 cm.
SVTH : NHÓM 07CH111
11
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.
- Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản hoặc
dụng cụ thích hợp.
- Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có chất phát quang thích hợp.
- Trường hợp phòng thí nghiệm không có điều kiện trang bị các loại bản
mỏng tráng sẵn thì tự chuẩn bị lấy bản mỏng với các dụng cụ sau đây:
- Các tấm kính phẳng có kích thước phù hợp đã được xử lý trước bằng
hóa chất rồi rửa sạch bằng nước và sấy khô.
- Thiết bị trải chất hấp phụ lên tấm kính thành một lớp mỏng đồng đều, có

chiều dày thích hợp.
- Giá để xếp các tấm kính đã trải.
+ Chuẩn bị bản mỏng
- Sắp xếp các bản mỏng và chuẩn bị thiết bị: Các phiến kính phải được
lau chùi cẩn thận và tẩy sạch hoàn toàn các chất béo bằng cách ngâm
trong dung dịch sulfocromic. Sau đó, cọ kỹ bằng bàn chải dưới tia nước
máy rồi tráng nước cất và sấy khô trên giá ở nhiệt độ thường hay trong tủ
sấy.
- Ðiều chế vữa của chất hấp phụ: Chất hấp phụ được chọn lọc sao cho
phù hợp với yêu cầu phân tích như: Silicagel G, kieselguhr, cellulose,
nhôm oxyd, trong số đó silicagel G được dùng thông dụng nhất. Trộn 25g
silicagel G với 50 ml nước cất và nhào trong cối hoặc lắc mạnh trong
bình nón có dung tích 200 - 250 ml, nút kín, trong 30 - 45 giây. Dịch treo
tạo được ở dạng lỏng và đồng nhất, se lại trong vài phút sau đó, vì có bột
bó. Rót ngay vào thiết bị trải đã điều chỉnh độ dày cho bản mỏng khoảng
0,25 mm (nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng).
- Ðể nguyên các phiến kính tại chỗ khoảng 10 phút tới khi mặt trên hết
bóng, hoặc để khô tự nhiên qua đêm tại nhiệt độ phòng.
- Hoạt hóa: Cho các bản mỏng đã khô mặt vào tủ sấy và sấy ở 105 -
110
o
C trong 30 phút (nếu không có chỉ dẫn ở chuyên luận riêng). Ðể
SVTH : NHÓM 07CH111
12
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
nguội rồi bảo quản trong bình hút ẩm. Khi dùng, nếu cần thì hoạt hóa lại
bằng cách sấy ở 105-110
0
C trong 1 giờ rồi cạo bỏ một dải mỏng chất hấp
phụ dọc hai bên cạnh của tấm kính.

- Chuẩn bị bình khai triển: Các bình khai triển thường là bình thủy tinh,
hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu
cầu của các bản mỏng sử dụng. Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng
cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa
đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng
dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày
khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Ðậy kín nắp bình và để yên 1 giờ ở
nhiệt độ 20 - 25
o
C. Muốn thu được những kết quả lặp lại, ta chỉ nên dùng
những dung môi thật tinh khiết, loại dùng cho sắc ký. Những dung môi dễ
bịến đổi về hóa học chỉ nên pha trước khi dùng. Nếu sử dụng những hệ
pha động phức tạp phải chú ý đến những thành phần dễ bay hơi làm thay
đổi thành phần của hệ pha động dẫn đến hiện tượng không lặp lại của trị
số Rf.
- Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Lượng chất hoặc hỗn hợp chất đưa
lên bản mỏng có ý nghĩa quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, đặc bịệt
ảnh hưởng rất lớn đến trị số Rf. Lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký
lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng
lấp. Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạy của
thuốc thử không đủ (thông thường độ nhạy của các thuốc thử trên 0,005
mg). Lượng mẫu thông thường cần đưa lên bản mỏng là 0,1 - 50 mg ở
dạng dung dịch trong ether, c1oroform, nước hay dung môi thích hợp
khác. Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml đối với trường hợp
đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên
bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều chế. Ðối với
sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới 10 - 50 mg. Ðối với các dung
SVTH : NHÓM 07CH111
13
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG

dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng
bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm.
- Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2 cm và
cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường
kính 2 - 6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của
bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. Khi làm sắc ký lớp mỏng
bán định lượng, độ chính xác của kết quả phân tích phụ thuộc rất nhiều
vào độ chính xác của lượng chất thử đưa lên bản mỏng, tức là thể tích
dung dịch chấm lên bản mỏng. Do đó, với những trường hợp phân tích
bán định lượng phải dùng các mao quản định mức chính xác. Khi không
cần định lượng dùng micropipet hoặc ống mảo quản thường.
- Triển khai sắc ký: Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển
khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy
kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên
bản mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng
ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại
trên bản mỏng rồi hiện vết theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng.
- Đánh giá: Quan sát các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và tiến
hành định tính, phát hiện tạp chất hoặc định lượng như quy định trong
chuyên luận riêng.
- Việc sắc ký lớp mỏng được tiến hành trong điều kiện chuẩn hoá cho kết
quả có độ tin cậy cao hơn. Hiện nay người ta thường tiến hành sắc ký với
sự giúp đỡ của hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (Planar
chromatography - HPTLC).
III. 7 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
- Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được dùng để định tính,
thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất
thuốc.
SVTH : NHÓM 07CH111
14

GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
- Về nguyên tắc cơ bản không khác nhiều với sắc ký lớp mỏng thông
thường. Điểm khác chủ yếu là quá trình chấm sắc ký được điều khiển và
thực hiện bằng máy, số vết, lượng dịch chiết sẽ chấm trên bản mỏng được
xác lập trên máy vi tính. Quá trình chấm dịch chiết thực hiện với sự hỗ
trợ của máy nén khí hoặc bình khí nén N. Sau khi triển khai, sắc ký đồ
được chụp ảnh qua buồng chụp (reprostar 3) và kết quả được đánh giá
bằng phần mềm Videoscan.
Bộ phận chấm sắc ký
+ Cách tiến hành
- Dụng cụ
- Bình triển khai, thường bằng thuỷ tinh trong suốt có kích thước phù hợp
với các phiến kính cần dùng và có nắp đậy kín (Với hệ thống CAMAG
các dụng cụ này được trang bị sẵn).
- Ðèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng
dài 366 nm (Trong hệ thống).
- Dụng cụ để phun thuốc thử.
- Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để
sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.
SVTH : NHÓM 07CH111
15
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
Tủ hút hơi độc.
- Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần
những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.
- Một máy ảnh thích hợp (với ống kính Macro) có thể chụp lưu giữ sắc
ký đồ ở ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30 - 50 cm.
- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.
- Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản hoặc
dụng cụ thích hợp.

- Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ có chất phát quang thích hợp.
- Chuẩn bị bình khai triển: Các bình khai triển thường là bình thủy tinh,
hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu
cầu của các bản mỏng sử dụng. Bão hòa hơi dung môi trong bình bằng
cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa
đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng
SVTH : NHÓM 07CH111
16
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại một lớp dày
khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Ðậy kín nắp bình và để yên 1 giờ ở
nhiệt độ 20 - 25
o
C. Muốn thu được những kết quả lặp lại, ta chỉ nên dùng
những dung môi thật tinh khiết, loại dùng cho sắc ký. Những dung môi dễ
bịến đổi về hóa học chỉ nên pha trước khi dùng. Nếu sử dụng những hệ
pha động phức tạp phải chú ý đến những thành phần dễ bay hơi làm thay
đổi thành phần của hệ pha động dẫn đến hiện tượng không lặp lại của trị
số Rf.
- Chấm chất phân tích lên bản mỏng: Lượng chất hoặc hỗn hợp chất đưa
lên bản mỏng có ý nghĩa quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, đặc bịệt
ảnh hưởng rất lớn đến trị số Rf. Lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký
lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng
lấp. Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạy của
thuốc thử không đủ (thông thường độ nhạy của các thuốc thử trên 0,005
mg). Lượng mẫu thông thường cần đưa lên bản mỏng là 0,1 - 50 mg ở
dạng dung dịch trong ether, c1oroform, nước hay dung môi thích hợp
khác. Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml đối với trường hợp
đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml khi đưa mẫu lên
bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều chế. Ðối với

sắc ký điều chế thì lượng chất có thể lên tới 10 - 50 mg. Ðối với các dung
dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng
bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm.
- Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng1,5cm - 2 cm và
cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường
kính 2 - 6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của
bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. Khi làm sắc ký lớp mỏng
bán định lượng, độ chính xác của kết quả phân tích phụ thuộc rất nhiều
vào độ chính xác của lượng chất thử đưa lên bản mỏng, tức là thể tích
dung dịch chấm lên bản mỏng. Do đó, với những trường hợp phân tích
SVTH : NHÓM 07CH111
17
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
bán định lượng phải dùng các mao quản định mức chính xác. Khi không
cần định lượng dùng micropipet hoặc ống mảo quản thường.
- Triển khai sắc ký: Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển
khai, các vết chấm phải ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy
kín bình và để yên ở nhiệt độ không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên
bản mỏng được một đoạn theo quy định trong chuyên luận, lấy bản mỏng
ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại
trên bản mỏng rồi hiện vết theo chỉ dẫn trong chuyên luận riêng. Quan sát
các vết xuất hiện, tính giá trị Rf hoặc Rr và tiến hành định tính, phát hiện
tạp chất hoặc định lượng như quy định trong chuyên luận riêng. (Sắc ký
đồ một số dịch chiết dược liệu)
IV. KẾT LUẬN
- Như vậy: sắc kí lớp mỏng giúp phân tích được trong một hợp chất có
bao nhiêu chất và dự đoán được chúng bao gồm những chất gì. Nhờ thế
chúng ta biết được những tính chất vật lí, hóa học của cũng như là dễ
dang trong việc trích chiết các hợp chất.
- Được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: xét nghiệm độ tinh khiết

của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa
- Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật
- Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặcnhận
biết những hóa chất trong một chất cho sẵn
- Giám sát các phản ứng hữu cơ ….
Tài liệu tham khảo
SVTH : NHÓM 07CH111
18
GVHD : TH.S TRẦN ĐỨC TRỌNG
%BB
%9Bp_m%E1%BB%8Fng
/> />SVTH : NHÓM 07CH111
19