bài tiểu luận-phân loại sinh học phân tử

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Bài tiểu luận:

PHÂN LOẠI SINH HỌC PHÂN TỬ

Người hướng dẫn: PGS.TS Chu Hoàng Mậu
NCS: Nguyễn Thị Thu Ngà

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
NỘI DUNG
I. Mở đầu
II. CÁC PHƢƠNG PHÁP CƠ BẢN CỦA PHÂN LOẠI
SINH HỌC PHÂN TỬ
III. Kết luận
I. Mở đầu
II. CÁC PHƢƠNG PHÁP CƠ BẢN CỦA PHÂN LOẠI
SINH HỌC PHÂN TỬ
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
I. Mở đầu
Sinh học phân tử là môn khoa học nghiên cu gii sinh vật  mc độ phân
tử.
Sinh học phân tử chủ yếu nghiên cu tương tác gia các hệ thống cấu
trúc khác nhau trong tế bào, gồm quan hệ qua lại gia quá trình tổng hp DNA,
RNA, Protein và cách thc điều hòa các mối tương tác này.
Ngày nay nhng tiến bộ trong sinh học phân tử đã m ra khả năng ng
dụng có hiệu quả trong phân loại học và nghiên cu đa dạng sinh vật.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Phân lo
ạ
i Sinh h

ọ
c phân t
ử
la
̀
ph
ươ
ng pha
́
p phân loa
̣
i sinh vâ
̣
t bă
̀
ng
đă
̣
c điê
̉
m gen

m

c đô
̣
phân t
ử
. T


c la
̀
phân loa
̣
i bă
̀
ng ca
́
c dâ
̃
n liê
̣
u so
sa
́
nh ho
́
a sinh ca
́
c phân t
ử
l
ớ
n nh
ư
DNA, RNA, protein.
Các phƣơng pháp sinh học phân tử tập trung
vào các kỹ thuật chủ yếu sau:
+ Phân tích acid nucleic
+ Phân tích protein

+ Phân tích glicolipit
+ Hóa phân loại học
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
II. CÁC PHƢƠNG PHÁP CƠ BẢN CỦA PHÂN LOẠI
SINH HỌC PHÂN TỬ
1.Phân tích và so sánh acid nucleic
1.1. Phân tích DNA plasmid (S
ử
d
ụ
ng trong phân lo
ạ
i vi sinh v
ậ
t
1.2. Phân tích ADN nhi
ễ
m s
ắ
c th
ể

1.3. Lai ADN/ADN
1.4. Lai DNA/RNA
2. K
ỹ
thu
ậ
t nhân gene PCR
2.1. K

ỹ
thu
ậ
t nhân gene PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.2. Các c
ả
i ti
ế
n c
ủ
a k
ỹ
thu
ậ
t PCR
3. Gi
ả
i trình t
ự
ADN
4. Phân tích trình t
ự
r-RNA (ribotyping)
5. So sa
́
nh Protein
s
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
1. Phân tích và so sánh acid nucleic
1.1. Phân tích DNA plasmid (S

ử
d
ụ
ng trong phân lo
ạ
i vi sinh v
ậ
t)
Phương pháp phân tích  đây
bao gồm:
+ tách plasmid
+ tinh sạch plasmid
+ xử lý bằng enzym cắt hạn
chế
+ điện di trên gel agarose
+ so sánh sự đa hình của
các phân đoạn để phân biệt các
chủng vi sinh vật vi nhau.
Di chuy
ể
n c
ủ
a plasmid m
ạ
ch
th
ẳ
ng (L) và siêu xo
ắ
n (OC)

khi đi
ệ
n di

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
1. Phân tích và so sánh acid nucleic
1.2. Phân tích ADN nhi
ễ
m s
ắ
c th
ể
Phương pháp phân tích  đây bao gồm:
+ tách ADN của nhiễm sắc thể
+ cắt bằng enzym cắt hạn chế để phân biệt gia các sinh vật vi nhau. Các
đoạn cắt nên có kích thưc nhỏ hơn hoặc bằng 50 kb.
Việc phân tách các đoạn cắt đưc thực hiện dựa vào kỹ thuật điện di trong
trường xung điện (PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis)
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
•
Kỹ thuật chnh của PFGE l: đi chiu dng đin chy qua gel
đin di, gây xung đin theo chu kỳ.
•
Ưu đim: kỹ thuật PFGE c khả năng phân tch theo kch
thưc nhng đon DNA kch thưc ti vi megabase.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
1. Phân tích và so sánh acid nucleic
1.3. Lai ADN/ADN
- Nguyên tắc đƣợc tiến hành nhƣ sau:
+ ADN tổng số đưc tách ra và xử lý vi enzym cắt hạn chế (có

trường hp không cần xử lý vi enzym cắt hạn chế)
+ điện di trên gel agarose
+ chuyển lên màng lai
+ Mẫu dò (probe) đưc chuẩn bị và lai vi màng ADN  trên.
Kết quả phép lai cho biết sự khác biệt gia các mẫu ADN khác nhau.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Phương pháp chuyển ADN lên màng cho kỹ thuật Southern Blot
Một số nhân tố tham gia vào kết quả của phép lai: mẫu dò ADN,
phương pháp đánh dấu ADN, mẫu ADN lai, điều kiện tiến hành và
phương pháp đánh giá kết quả phép lai.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
1. Phân tích và so sánh acid nucleic
1.4. Lai DNA/RNA
- Ph
ươ
ng pháp này cho phép so sánh và phân bi
ệ
t ngu
ồ
n gene c
ủ
a nh
ữ
ng sinh
v
ậ
t thu
ộ
c các taxon khác nhau có quan h
ệ

xa.

-
Trong phép lai DNA/RNA s
ử
d
ụ
ng r-RNA ho
ặ
c t-RNA.
-
K
ỹ
thu
ậ
t lai cũng g
ồ
m có các khâu c
ơ
b
ả
n t
ươ
ng t
ự
nh
ư
lai DNA/DNA.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

2. Kỹ thuật nhân gene PCR
Kỹ thuật lai ADN đã đưc sử dụng rộng rãi cho nhiều nghiên cu xác
định và phân loại trên đối tưng sinh vật. Nguồn ADN đích đôi khi
chỉ có hàm lưng ít. Khó khăn này đưc khắc phục bằng cách làm
tăng nguồn ADN đích một cách nhanh chóng bằng kỹ thuật nhân
gene PCR.
2.1. K
ỹ
thu
ậ
t nhân gene PCR
(Polymerase Chain Reaction)
•
Nguyên lý: d
ự
a trên kh
ả
năng xúc tác c
ủ
a enzyme DNA polymerase
trong ph
ả
n

ng kéo dài đo
ạ
n trình t
ự
b
ổ

sung b
ắ
t đ
ầ
u t
ừ
đo
ạ
n m
ồ
i trình
t
ự
ng
ắ
n g
ắ
n trên 2 s
ợ
i đ
ơ
n c
ủ
a đo
ạ
n DNA khuôn đ
ể
t
ạ
o phiên b

ả
n c
ủ
a
đo
ạ
n DNA c
ầ
n phân tích.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Bưc 1: biến tính ADN,
có tác dụng tách hai si
đơn từ si khuôn xoắn kép.
Bưc 2: bắt cặp hai mồi
vào hai si đơn của khuôn.
Bưc 3: kéo dài chuỗi
theo mồi, chiều 5’-3’ vi
quá trình gắn các dNTP
dọc theo si khuôn để tạo
thành phiên bản mi theo
nguyên tắc bổ sung.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
2.2. Các c
ả
i ti
ế
n c
ủ
a k
ỹ

thu
ậ
t PCR

2. Kỹ thuật nhân gene PCR
-
Nested PCR (PCR l
ồ
ng)

-
Revert transtriptase PCR

-
Asymmetric PCR (PCR m
ộ
t chi
ề
u)

-
Phân tích RFLPs v
ớ
i s
ả
n ph
ẩ
m PCR khi dùng c
ặ
p m

ồ
i đ
ặ
c hi
ệ
u

-
K
ỹ
thu
ậ
t PCR cho ribotyping (phân lo
ạ
i vi sinh v
ậ
t)

-
K
ỹ
thu
ậ
t rep-PCR

-
K
ỹ
thu
ậ

t RAPD (Random amplified of polymorphic DNA)

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Nested PCR Reaction Diagram

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Revert transtriptase PCR
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Asymmetric PCR (PCR một chiều)
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Phân tích RFLPs vi sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Kỹ thuật PCR cho ribotyping
K
ế
t qu
ả
ribotyping v
ớ
i Helicobacter pylori.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Kỹ thuật RAPD (Random amplified of polymorphic DNA)
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
3. Giải trình tự ADN
Phương pháp giải trình tự ADN theo nguyên tắc tạo
ra các đoạn ADN đưc đánh dấu tại đầu 5’ hoặc 3’. Các
đoạn có base đánh đấu đưc tách ra trên gel
polyacrylamid. Các đoạn đưc phân biệt về vị trí trên gel

vi sự sai khác chỉ vi một nucleotid. Việc tạo ra các
đoạn ADN sai khác nhau về 1 nucleotid đưc trình bày
theo 2 phương pháp:
+ Ph
ươ
ng pháp hóa h
ọ
c (Maxam & Gilbert, 1997)

+ Ph
ươ
ng pháp enzym k
ế
t thúc ph
ả
n

ng chu
ỗ
i
(Sanger, 1997)
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
+ Phƣơng pháp enzym kết thúc phản ứng chuỗi của
Sanger:
Phương pháp kết thúc phản ng chuỗi đưc thực hiện
dựa trên việc nhân ADN từ si khuôn khi có:
+ đoạn ADN mồi vi xúc tác của Klenow hay T7-ADN
polymerase
+ 4 loại deoxyribonucleotid (dNTPs).
Như vậy, có 4 phản ng đưc tiến hành đồng thời và

trong mỗi phản ng có một loại dNTP bị thay đổi bi một
dẫn xuất để làm dừng phản ng (ddNTP).

3. Giải trình tự ADN
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Phân tích trình tự DNA bằng máy tự động
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
4. Phân tích trình tự r-RNA (ribotyping)
Cấu tạo r-RNA biến đổi chậm trong quá trình tiến hóa,
trình tự nucleotide của r-RNA đa dạng, ổn định. Vì vậy
phân tích và so sánh trình tự nucleotide của r-RNA cung
cấp nhng bằng chng khách quan tin cậy làm cơ s để xác
định quan hệ tiến hóa gia các loài, gia các taxon bậc trên
loài.