Tiểu luận Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả

Bộ Công Thương
Trường ĐH Công Nghiệp TPHCM
Viện CN Sinh Học và Thực Phẩm
Môn: Công nghệ chế biến Nông sản

BÁO CÁO TIỂU LUẬN
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương
Lớp: ĐHTP6CLT
Nhóm: 20
SVTH: Phạm Nguyễn Khánh Toàn – 10310321 (Trưởng nhóm)
Nguyễn Chí Thịnh - 10307071
Nguyễn Văn Tình - 10309601
Nguyễn Thị Thanh Thảo - 10312621
Hà Kiều Phương Tú - 10317091
TP. Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2014
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
STT TÊN SINH VIÊN NHIỆM VỤ
1 Phạm Nguyễn Khánh Toàn - Tổng hợp bài báo cáo, làm powerpoint
2. Giới thiệu các phương pháp sản xuất enzyme
3. Giới thiệu enzyme protease và cách thu nhận
từ mủ mít
2 Nguyễn Thị Thanh Thảo 5. Giới thiệu enzyme ficin và cách thu nhận từ
sung
3 Nguyễn Văn Tình 7. Giới thiệu enzyme amylase và cách thu nhận
từ thực vật
4 Hà Kiều Phương Tú 6. Giới thiệu enzyme papain và cách thu nhận
từ đu đủ
5 Nguyễn Chí Thịnh 1. Tổng quan về enzyme
4. Giới thiệu enzyme Bromelin và cách thu nhận
từ dứa
  

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 2
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
Trang
LỜI MỞ ĐẦU 4
NỘI DUNG 6
1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME 6
1.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme 6
1.2. Khái niệm về enzyme 7
1.2.1. Bản chất sinh học của enzyme 7
1.2.2. Bản chất hóa học của enzyme 8
2. GIỚI THIỆU CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT ENZYME 9
2.1. Phương pháp tách phá vỡ tế bào 9
2.1.1. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học 9
2.1.2. Phá vỡ tế bào không phải bằng phương pháp cơ học 11
2.2. Các phương pháp tách enzyme 12
2.2.1. Các phương pháp cơ học 12
2.2.2. Phương pháp cô đặc 14
2.3. Phương pháp tinh sạch enzyme 15
3. GIỚI THIỆU ENZYME PROTEASE VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ MỦ MÍT 16
3.1. Sơ lược về enzyme protease trong mủ mít 17
3.1.1. Định nghĩa enzyme protease 17
3.1.2. Phân loại enzyme protease 17
3.2. Ứng dụng enzyme protease trong mủ mít 18
3.3. Các phương pháp tinh sạch 18
3.4. Phương pháp thu nhận 18
3.4.1. Thu nhận 18
3.4.2. Sơ đồ quy trình 18
3.4.3. Giải thích quy trình 19
3.5. Ứng dụng enzyme protease 22
4. GIỚI THIỆU ENZYME BROMELIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ DỨA 22

4.1. Đặc điển nguồn nguyên liệu và bromelin 22
4.1.1 Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu 22
4.1.2. Đặc điểm enzyme Bromelin 23
4.2. Tính chất enzyme Bromelin 24
4.2.1. Cấu tạo hóa học 24
4.2.2. Cấu trúc không gian của bromelin 26
4.2.3. Tính chất vật lý 26
4.2.4. Hoạt tính của bromelin 27
4.3. Phương pháp thu nhận và tinh sạch Bromelin 29
4.3.1. Phương pháp thu nhận 29
4.3.2. Phương pháp tinh sạch 37
4.4. Ứng dụng của bromelin 40
5. GIỚI THIỆU ENZYME FICIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ SUNG 40
5.1. Đạc điểm enzyme ficin 40
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 3
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
5.1.1. Lịch sử nghiên cứu 41
5.1.2 Đặc điểm nguồn thu nhận enzyme ficin 41
5.2. Thành phần tính chất enzyme ficin 42
5.2.1. Cấu tạo hóa học 42
5.2.2. Tính chất vật lý 44
5.2.3. Tính chất hóa học 45
5.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của ficin 46
5.2.5. Một số yếu tố khác ảnh hưởng lên khả năng thùy phân protein của ficin
47
5.3. Phương pháp thu nhận ficin 48
5.3.1. Phương pháp thu nhận ficin thô 48
5.3.2. Một số phương pháp chiết tách enzyme 48
5.3.3. Các phương pháp tinh sạch enzyme ficin 51
5.3.3.1. Phương pháplọc gel 51

5.3.3.2. Phương pháp điện di mini-gel SDS-polyacrylamide 53
6. GIỚI THIỆU ENZYME PAPAIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ ĐU ĐỦ 56
6.1.Giới thiệu về enzyme papain 56
6.1.1 Đặc điểm chung 56
6.1.2. Tính chất vật lý 57
6.1.3. Tính chất hóa học 57
6.2. Phương pháp thu nhận enzyme papain 62
6.2.1. Thu nhận nhựa đu đủ 64
6.2.2. Thu nhận papain 64
6.2.3. Phương pháp tinh sạch enzyme papain 65
6.2.4. Lọc qua Sephadex G-75 66
7. GIỚI THIỆU ENZYME AMYLASE VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ THỰC VẬT
66
7.1. Enzyme amylase là gì 66
7.2. Lịch sử phát hiện 66
7.3. Phân loại 67
7.4. Hệ enzyme amylase 68
7.4.1. Enzyme α-Amylase 68
7.4.2. Enzyme β-Amylase 70
7.4.3. Enzyme γ-Amylase 71
7.5. Thu nhận enzyme amylase từ thực vật 72
7.5.1. Nguồn thu nhận 72
7.5.2. Thu nhận enzyme amylase 72
7.6. Phương pháp tinh sạch enzyme amylase 76
7.7. Ứng dụng enzyme Amylase 76
KẾT LUẬN 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 4
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
  

Trong những năm gần đây, đất nước chúng ta có những bước chuyển mình rất
mạnh mẽ . Đặc biệt trong bối cảnh nước ta gia nhập vào tổ chức WTO, đó là điều kiện
để thúc đẩy nền kinh tế ngày càng đi lên. Cũng trong xu hướng đi lên thì các doanh
nghiệp trong nước có những thách thức rất là to lớn trong cạnh tranh thị trường.
Để phát triển theo xu hướng đó, các doanh nghiệp phải nỗ lực hết mình bằng
cách thay đổi rất nhiều từ cách làm việc, cách sản xuất, mua thêm trang thiết bị , trao
dồi và đào tạo đội ngũ cán bộ công nhân viên trong công ty. Với những thay đổi như
thế, nó không chỉ nằm giới hạn trong 1 ngành nghề nào, mà tất cả các lĩnh vực đều phải
thay đổi và tự làm mới mình trong bối cảnh kinh tế thị trường hiện nay.
Cùng với sự phát triển của xã hội thì ngành sản xuất nói chung và ngành công
nghệ thực phẩm nói riêng, các công ty thực phẩm luôn tìm kiếm cái mới và tìm ra
những cách để làm tăng năng suất và hiệu quả trong sản xuất thì “công nghệ sản xuất
enzyme” đóng vai trò rất quan trọng trong ngành sản xuất nói chung. Enzyme giúp
chúng ta làm ra những sản phẩm chất lượng và thời gian nhanh hơn, từ đó làm thay đổi
cách sản xuất truyền thống với sự có mặt của enzyme.
Để có được những thay đổi mạnh mẽ trên thì các doanh nghiệp luôn tìm kiếm
các nguồn nguyên liệu có nhiều ưu điểm, đặc biệt là các phế liệu có thể sản xuất ra
enzyme. Nước ta là 1 nước đang phát triển và có khí hậu nhiệt đới thì người Việt tự
hào rằng đất nước chúng ta rất giàu có về mặt nông sản . Vì thế các doanh nghiệp trong
nước luôn biết tận dụng ưu thế đó để làm thế mạnh của mình về làm chủ nguồn nguyên
liệu vốn có.
Dựa vào những thế mạnh đó, mà ngành nông sản đóng vai trò hết sức quan trọng
của ngành kinh tế. Để ngành nông nghiệp ngày càng phát triển thì phải có sự đóng góp
của rất nhiều thành phần trong xã hội, đặc biệt là sinh viên chúng em . Sinh viên chúng
em dựa vào những kiến thức đã học , xin góp một phần nhỏ cho sự phát triển của ngành
nông sản nói chung và ngành “ công nghệ sản xuất enzyme” nói riêng .
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 5
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
Với những kiến thức được trang bị trong trường lớp , nhóm chúng em đã chọn
ngành công nghệ enzyme là đề tài của chúng em nghiên cứu. Để có được tài liệu và

kiến thức thì chúng em phải nói đến cô Mai Hương, cô đã tận tình dạy và hướng dẫn
chúng em trong suốt trong quá trình làm bài. Nhóm chúng em sẽ cùng nhau làm bài thật
tốt và khi nghiên cứu đề tài hoàn thành thì chúng em mong có được những ứng dụng
trong sản xuất thực tiễn.
Nhóm SV thực hiện
  
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 6
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME
1.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme
- Năm 1833: Payen và Persorz tách được diatase từ malt
- Năm 1874: Hansen là người đầu tiên tách được rennet từ bao tử cừu
- Năm 1876: Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là
enzyme
- Năm 1897: Hai anh em Buchner chứng minh dich chiết từ nấm men có thể
chuyển hóa đường glucose thành cồn và CO
2
.
- Đầu năm 1900: Rohm sử dụng enzyme protease trong công nghệ thuộc da
- Năm 1913: Rohm là người đầu tiên sử dụng enzyme trong chất tẩy rửa
- Thế chiến lần thứ nhất: Weitzman sản xuất aceton ở Anh
- Năm 1917: Boidin và Effront nghiên cứu α. Amylase của B. Subtilis và ứng
dụng trong nghành dệt.
- Năm 1920 – 1928: Will Slitter tinh sạch được enzyme , Samner kết tinh được
Urease, Northrop kết tinh được Protease, Fleming phát hiện ra Penicilline
- Thế chiến lần thứ hai: Bắt đầu sản xuất theo quy mô công nghiệp, sử dụng
amyloglucosidase đường hóa tinh bột. Sử dụng penricillineacylase trong sản xuất
penicilline
- Năm 1969: Tanabe co đã xây dựng quy trình công nghiệp sản xuất amino acid.
Sử dụng glucose isomerase trong sản xuất dung dịch giàu fructose

- Năm 1972: Boyer et al đưa ra kỹ thuật di truyền. Kỹ thuật này có tác động tích
cực cho công nghệ enzyme
- Năm 1973: Tanabe co sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế bào
Winter và Ferch đưa ra công nghệ sàn xuất protein
- Năm 1984: Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acry – lamide và một loạt các quá
trình sản xuất có sự tham gia của enzyme
- Từ năm 1984 đến nay: Đã phát hiện ra hàng trăm loại enzyme khác nhau, đã
đưa vào sản xuất công nghiệp và ứng dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất và đời sống.
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 7
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
Kỹ thuật enzyme cố định, tế bào cố định đã đưa công nghệ enzyme đạt được nhiều kết
quả cao.
1.2. Khái niệm về enzyme
1.2.1 Bản chất sinh học enzyme
Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về enzyme, và đã đi đến thống nhất:
Enzyme là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên, và tham gia vào các
phản ứng sinh học.
Như vậy, bản chất sinh học của enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học,
và thực hiện các phản ứng sinh hóa trong và ngoài tế bào sinh vật. Các loại enzyme đều
có những đặc tính chung như sau:
+ Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật: Quá trình tổng hợp enzyme là một
quá trình hết sức phức tạp và được điều khiển, kiểm soát chặt chẽ.
+ Enzyme tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi enzyme được tách
khỏi tế bào sống .
+ Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa: Vì trong quá trình
sống của tế bào, enzyme được tổng hợp và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ của tế
bào và nhiệt độ của cơ thể. Nhiệt độ của cơ thể và của tế bào sinh vật thường là nhiệt độ
thấp. Phần lớn nhiệt độ cơ thể sinh vật dao động trong khoảng 30 – 40
o
C.

+ Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai
đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa
học: Quá trình chuyển hóa được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi phản ứng được xúc
tác bởi một loại enzyme. Các enzyme này lần lượt thay nhau xúc tác để các phản ứng
lần lượt xảy ra, để cuối cùng tạo thành CO
2
; H
2
O, một số chất khác và giải phóng năng
lượng. Cũng có thể chuỗi phản ứng sẽ tạo thành những chu kỳ chuyển hóa khép kín.
Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứng
trước sẽ là cơ chất cho phản ứng sau.
+ Enzyme có thể thực hiện được một phản ứng: Các phản ứng này thường xảy
ra ở ngoài tế bào (khi ta thực hiện chúng trong ống nghiệm). Trong tế bào thường
không xảy ra phản ứng enzyme đơn ( một phản ứng ) mà thường xảy ra các phản ứng
theo chuỗi phản ứng .
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 8
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
+ Phản ứng enzyme là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó,
các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học đòi hỏi năng lượng rất
lớn. Nhờ có hoạt động xúc tác của enzyme, các phản ứng sinh hóa xảy ra liên tục trong
điều kiện năng lượng ôn hòa.
+ Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết định
tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định môt phản ứng sinh hóa. Các
nhà khoa học đưa ra cơ chế như sau:
Một gen  một enzyme  một phản ứng
Như vậy, gen sẽ quyết định bản chất sinh học và bản chất hóa học của ezyme.
Cơ chế này có một ý nghĩa rất lớn trong việc điều khiển tổng hợp enzyme trong tế bào
sinh vật
1.2.2. Bản chất hóa học enzyme

Nếu tách enzyme ra khỏi tế bào và tiến hành phân tách thành phần hóa học của
chúng, ta sẽ thấy chúng thuộc hai nhóm.
 Nhóm ezyme đơn cấu tử
Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme chỉ được cấu tạo một thành phần hóa
học duy nhất là protein. Những enzyme được tạo thành chỉ từ protein duy nhất được gọi
là enzyme đơn cấu tử.
 Nhóm enzyme đa cấu tử
Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme có hai thành phần:
- Phần protein thuần được gọi là apoprotein hay apoenzyme
- Phần thứ hai là thành phần không phải protein. Phần này thường là những chất
hữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác.
Ở những enzyme đa cấu tử, phần apoenzyme đóng vai trò xúc tác nhưng nếu
thiếu thành phần thứ hai (các chất hữu cơ đặc hiệu) thì enzyme không thể hoạt động
được. Chính vì thế, chất hữu cơ đặc hiệu này còn được gọi là chất cộng tác (cofactor).
Các chất hữu cơ đặc hiệu này có thể gắn rất chặt với phần protein, cũng có thể gắn rất
lỏng lẻo với phần protein. Ta có thể dễ dàng tách chúng ra khi tiến hành thẩm tích qua
màng. Ở đây xảy ra hai hiện tượng:
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 9
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
- Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn chặt vào protein bằng liên kết đồng hóa trị
được gọi là nhóm phụ ( prosthetic ).
- Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn không chặt với protein và dễ dàng tách chúng
khỏi protein được gọi là coenzyme.
2. GIỚI THIỆU CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT ENZYME
Enzyme có thể được phân tách từ nhiều nguồn như là động vật, thực vật và vi
sinh vật. Mỗi nguồn enzyme cho một số tính chất đặc trưng, cung cấp những enzyme
đặc hiệu cho quá trình chế biến.
Do đó, mặc dù vi sinh vật đóng vai trò là nguồn cung cấp enzyme chính cho quá
trình chế biến bởi giá thành và đa dạng về chủng loại enzyme nhưng các enzyme từ
thực vật và động vật cũng góp phần làm cho ngành chiết tách enzyme trở nên đa dạng

và thêm hấp dẫn.
Ví dụ: Từ động vật chúng ta có một số enzyme, trong đó có rennin là enzyme từ
ngăn thứ 4 của dạ dày bê non giúp quá trình đông tụ casein trong sản xuất phomai. Từ
thực vật, ta cũng có một số loại enzyme được ứng dụng trong quá trình chế biến như là
bromelin từ dứa, papain từ đu đủ và ficin từ sung.
Các enzyme thuỷ phân tinh bột (invertase, amylase,Glucoseamylase)
Các enzyme thủy phân pectin (Pectin-esterase, Polygalacturonase, Pectate lyase)
Các enzyme thuỷ phân protein(bromelin, papain, ficin,…)
Enzyme oxi hoá thì chúng ta có những đại diện tiêu biểu là Poluphenoloxidase,
Catalase, peroxidase, Glucoseoxidase,lypoxygenase…)
2.1. Các phương pháp tách phá vỡ tế bào
2.1.1. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học
Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảo
được hoạt tính enzyme nội bào. Việc phá vỡ tế bào sinh vật bao gồm cả phá vỡ tế bào
động vật, thực vật và VSV. Đối với tế bào động vật, người ta thường sử dụng toàn bộ
cơ quan (hay mô bào) của động vật có chứa enzyme và cần phải loại bỏ mỡ hoặc các
thành phần khác bám theo mô bào đó, các mẫu cần được xử lý nhanh và phải được thu
nhận enzyme trong thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mỗ. Đối với tế bào và mô
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 10
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
bào thực vật, cần phải được làm sạch và phải được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhận
enzyme ngay.
Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học.
Riêng tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào có những khó khăn nhất định.
Tế bào vi sinh vật có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương pháp
nghiền nếu không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả.
Vi sinh vật là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường, đặc biệt là môi
trường lỏng có nhiều cơ chất thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tương
ứng. Các enzyme ngoại bào này được hòa tan trong môi trường và dễ dàng tách chúng
ra khỏi dung dịch nuôi cấy, do đó trong công nghiệp người ta ít khi tiến hành nghiền tế

bào (trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào). Tuy nhiên, trong thời gian gần đây,
việc nghiên cứu enzyme nội bào ở VSV ngày càng nhiều, do đó phương pháp cơ học
được ứng dụng để phá vỡ tế bào VSV ngày càng nhiều.
 Phương pháp đồng hóa áp lực cao:
Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào quy mô công
nghiệp. Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao,
chúng va chạm rất mạnh vào vành ống (máy đồng hóa maton-gaulin). Tế bào bị phá vỡ
bởi lực cắt và sức nén. Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50 – 5000 lít/giờ mà áp lực
cần có khác nhau. Mặt khác, tính chất, cấu tạo của tế bào khác nhau đòi hỏi áp lực khác
nhau.
Ví dụ đối với tế bào vi khuẩn người ta cần áp lực khoảng 550 bar. Phương pháp
đồng hóa áp lực cao thường được áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tế bào
động vật và tế bào thực vật ít khi phải dùng phương pháp này.
 Phương pháp nghiền ẩm:
Đây cũng là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất
enzyme. Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi thủy tinh có
kích thước 0.2 – 1mm để tăng quá trình phá vỡ tế bào. Trong nhiều trường hợp, người
ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh, vì hạt thủy tinh có độ
ma sát cao hơn viên bi thủy tinh nên hiệu suất nghiền tốt hơn.
2.1.2. Phá vỡ tế bào không phải bằng phương pháp cơ học
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 11
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
Ngoài hai phương pháp cơ học trên, người ta còn phá vỡ tế bào bằng phương
pháp không phải là phương pháp cơ học. Các phương pháp bao gồm phương pháp hóa
học, phương pháp nhiệt và phương pháp enzyme (ở một số tài liệu người ta còn gọi là
phương pháp hóa học, phương pháp vật lý và phương pháp sinh học).
 Phương pháp hóa học
Là phương pháp dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh, hoặc khả năng
oxy hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào. Phương pháp này không đòi
hỏi áp suất cao, nên ít chi phí và dễ thực hiện. Tuy nhiên vì trong quá trình thực hiện,

người ta sử dụng các hóa chất nên các hóa chất này thường lẫn vào trong hỗn hợp, đòi
hỏi quá trình tách rất phức tạp. Một trong những hóa chất sử dụng nhiều là acetone.
 Phương pháp - vật lý:
Là phương pháp sử dụng siêu âm, phương pháp này thường được sử dụng trong
các phòng thí nghiệm, chưa thấy sử dụng trong quy mô công nghiệp. Một phương pháp
vật lý khác cũng được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất ở dạng thử
nghiệm là tạo shock nhiệt hay shock thẩm thấu.
Nguyên tắc của phương pháp này là: khi đưa nhiệt độ của tế bào huyền phù
xuống nhiệt độ rất thấp, ngay lập tức nâng nhiệt đến 400C (thao tác nâng nhiệt rất
nhanh), khi đó thành tế bào sẽ bị phá vỡ và người ta thu được huyền phù tế bào vỡ.
Phương pháp này thường dễ thực hiện, đảm bảo được hoạt tính của enzyme nhưng hiệu
suất phá vỡ tế bào không cao.
 Phương pháp sinh học (phương pháp - enzyme):
Có hai phương pháp hiện đang được sử dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và
phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên ngoài vào. Phương pháp tự phân là
phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng phân giải cho một số
thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme có trong tế bào và
là của tế bào đó. Bình thường các enzyme này không hoạt động mạnh, nhưng nếu điều
kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mức hoạt động tối ưu của
chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm chết tế bào.
Tự phân là quá trình được áp dụng nhiều trong quá trình phá vỡ thành tế bào các loại
nấm men. Người ta thường tiến hành quá trình tự phân huyền phù tế bào nấm men ở
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 12
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
nhiệt độ 48 – 52
0
C, trong khoảng thời gian 6 – 24 giờ. Phương pháp này có nhiều
nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy
phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí các enzyme
cũng bị phá hủy. Phương pháp này hiện nay không được sử dụng nhiều trong công

nghiệp.
Một phương pháp khác đang được nghiên cứu nhiều là phương pháp sử dụng
enzyme từ ngoài tế bào. Các enzyme này được đưa vào huyền phù tế bào để tiến hành
các quá trình thủy phân có định hướng các chất nhất định trong thành tế bào. Người ta
thường sử dụng hệ enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men và thành tế bào
thực vật. Phương pháp này không gây hư hỏng các chất có trong tế bào và thực hiện dễ
dàng trong mọi điều kiện (phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm, và sản xuất công
nghiệp). Ngoài ra, người ta còn sử dụng lysozym trong các loại tế bào khác.
2.2. Các phương pháp tách enzyme
2.2.1. Các phương pháp cơ học
Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và
các thành phần khác gồm hai phương pháp:
- Phương pháp ly tâm
- Phương pháp lọc
 Phương pháp ly tâm
Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ
enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch
enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào. Enzyme nội bào nằm trong tế bào
sinh vật, muốn thu nhận enzyme nội bào ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào.
Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan. Như vậy
khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme
thô, dung dịch enzyme thô này còn chứa các thành phần sau:
- Protein có hoạt tính sinh học
- Các chất hòa tan khác
- Nước
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 13
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch.
Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì
còn chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác.

Đối với sinh khối động vật và thực vật, sau khi nghiền ta thu được hỗn hợp nhiều
thành phần. Ly tâm hỗn hợp này ta thu được dung dịch enzyme thô tương tự như ở
VSV. Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta
thường tiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người ta
thường tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp.
Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch
enzyme bằng máy ly tâm liên tục. Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm là
thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, và không gây ảnh lớn đến hoạt tính của
enzyme. Hiện nay, trong công nghệ enzyme, người ta đang sử dụng rông rãi ba kiểu ly
tâm: ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa.
Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trên, ở một số nhà máy sản xuất enzyme có sử
dụng một số kiểu ly tâm khác. Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét
đến hai yếu tố rất quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng.
 Phương pháp lọc
Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên
men, người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào,
enzyme ngoại bào hòa tan.
Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch. Lọc là một
phương pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế
bào thường rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm
cản trở quá trình lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc, độ
nhớt dịch lọc, sức đề kháng.
Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau:
- Lọc ép: Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường được sử dụng trong trường hợp
dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ. Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có
hiệu quả.
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 14
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
- Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu
và trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính. Trong đó, lọc chân không quay

được sử dụng nhiều hơn cả.
- Lọc theo dòng chảy cắt ngang: Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản
xuất enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang. Theo đó, dòng dung
dịch lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệu
lọc và đi xuống phía dưới. Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng quá trình
lọc của vật liệu chất rắn.
- Lọc thông thường: Phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay ở
một số nhà máy vẫn còn sử dụng. Phương pháp lọc này đang được thay thế dần bằng
những phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu quả hơn.
2.2.2. Phương pháp cô đặc
Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều. Để xử lý một
khối lớn dung dịch enzyme phải tốn rất nhiều công sức và chi phí cho xử lý này rất cao.
Mặt khác lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao.
Chính vì thế, người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm một số mục đích sau:
- Làm tăng hoạt tính của enzyme trong một khối lượng dung dịch enzyme
- Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này
- Tăng khả năng bảo quản enzyme
- Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản
- Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất
Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng một trong
những phương pháp sau:
 Phương pháp nhiệt
Chúng ta có thể tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp nhiệt, nhưng sử
dụng nhiệt để cô đặc enzyme thường gặp rất nhiều khó khăn vì enzyme là protein rất
nhạy cảm với nhiệt độ, nguyên nhân là hầu hết enzyme đều được tổng hợp trong tế bào
(trừ enzyme nhân tạo).
Trong cơ thể, enzyme thường hoạt động trong điều kiện nhiệt hoạt động của tế
bào sống. Trường hợp nhiệt độ vượt quá nhiệt độ hoạt động của tế bào sống, thì tế bào
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 15
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH

sẽ chết. Enzyme mất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế bào chết, là vì
khi đó các phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ không còn xảy ra nữa, sự trao đổi chất
của tế bào bị ngưng trệ, tế bào không thể tồn tại.
Khi enzyme được tách ra khỏi tế bào thường hoạt động ở nhiệt tối ưu cao hơn
nhiệt độ sinh lý của tế bào, hiện tượng này thấy ở hầu hết các loại enzyme. Tùy theo
nguồn thu nhận enzyme và tính chất của từng loại enzyme mà quyết định chế độ gia
nhiệt trong quá trình cô đặc.
Quá trình cô đặc là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dung
dịch giảm đi, hàm lượng enzyme trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính enzyme cũng
tăng cao. Tuy nhiên nếu không chú ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một
khoảng cho phép thì hoạt tính của enzyme có thể sẽ bị mất nhiều, thậm chí có thể dẫn
đến triệt tiêu hoạt tính. Do đó, việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian cần thiết
trong quá trình cô đặc là điều rất cần thiết.
Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng những phương pháp sau:
- Bốc hơi lớp mỏng
- Bốc hơi ly tâm lớp mỏng
- Bốc hơi ống dài
 Phương pháp kết tủa
Kết tủa là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme
trong phòng thí nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp.
Phương pháp kết tủa dựa trên nguyên tắc, enzyme là một phức hợp protein có khả năng
tạo kết tủa với một số dung môi. Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai thuật
ngữ: kết tủa âm và kết tủa dương.
- Kết tủa âm: là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết nằm trong dung
dịch chứ không nằm trong phần tủa.
- Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần
kết tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch.
2.3. Phương pháp tinh sạch enzyme
 Phương pháp kết tinh
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 16

Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate
để kết tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh
sạch phải rất cao là rất khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến.
 Phương pháp điện di
Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong phòng thí nghiệm. Người ta
cũng đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho
đến nay vẫn chưa được phát triển. rộng rãi.
 Phương pháp sắc ký
• Phương pháp sắc ký lọc gel
Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong cột dùng để tách
enzyme. Các loại gel được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc ký cột là:
polycryamide, ararose, vinyl polymer, dextran …Trong lọc gel, các phân tử được tách
ra dựa theo kích thước và hình dáng của chúng.
• Sắc ký trao đổi ion
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của phân tử protein.
Phương pháp trao đỏi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy mô
công nghiệp. Tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH. Từ
đó, người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation.
• Sắc ký kỵ nước
Phương pháp này dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử protein
với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá trình
phân đoạn với muối. Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những enzyme đã
được làm cô đặc trước đó bằng phương pháp kết tủa với muối ammonium sulfate.
• Sắc ký đồng hóa trị.
Liên kết đồng hóa trị được tạo thành giữa các protein ở trạng thái tĩnh.
• Sắc ký ái lực
Phương pháp này dựa trên khả năng giữ enzyme bằng những chất nền không hòa
tan, được nhồi vào trong các cột sắc ký.
3. GIỚI THIỆU ENZYME PROTEASE VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ MỦ MÍT

GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 17
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
3.1. Sơ lược về enzyme protease trong mủ mít
3.1.1. Định nghĩa enzyme protease:
Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide giữa các L-acid
amin,là liên kết chủ yếu trong phân tử protein hay peptide. Protease còn có tên gọi khác
như :proteinase hay C-N hydrolase.
3.1.2. Phân loại enzym protease:
a. Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:
- Protease động vật: pepsin, tripsin, chymotripsin
- Protease thực vật: papain, bromelin, ficin…
- Protease vi sinh vật: subtilisin, protease vi sinh vật…
b. Dựa vào sự phân bố enzyme:
- Protease nội bào (endoprotease) :các enzyme hoạt động chủ yếu bên trong tế
bào như: catepsin,…
- Protease ngoại bào(exoprotease): các enzyme này hoạt động ở các mô,các cơ
quan đặc hiệu ngoài tế bào như pepsin, chymotrypsin,…
c. Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptide trong phân tử
protein:
- Endopeptidase (proteinase):chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong
phân tử protein tạo thành những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptide
mạch ngắn, pepton…)
- Exopeptidase (polypeptidase): chủ yếu phân cắt liên kết peptide ở hai đầu
mạch.
d. Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động:
- Protease serin: Trung tâm hoạt động có nhóm (-OH) như: tripsin,
subtilopeptidase
- Protease cystein: Trung tâm hoạt động có nhóm (-SH) như papain, bromelin…
- Protease acid: trung tâm hoạt động có nhóm (-COOH) như pepsin, renin…
- Protease kim loại:trung tâm hoạt động có các nguyên tố kim loại:

cacboxypeptidase A…
e. Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease:
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 18
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
- Protease acid: pepsin, renin,… hoạt động ở vùng acid.
- Protease kiềm: Trypsin,chymotrypsin,… hoạt động ở vùng pH kiềm.
- Protease trung tính: amylase,papain,… hoạt động ở vùng pH trung tính.
3.2. Ứng dụng của enzyme protease trong mủ mít:
Khả năng thay thế renin của enzym protease mủ mít trong công nghệ chế biến
sữa:
Công nghệ chế biến các sản phẩm từ sữa không thể không sử dụng các chế phẩm
enzym. Có thể nói, các chế phẩm enzym đóng vai trò quyết định để tạo ra các sản phẩm
sữa. Thông thường để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta sử dụng enzym renin thu
nhận từ dạ dày bê. Trong 10 năm trở lại đây xu hướng sử dụng enzym protease thực vật
ngày càng phát triển như papain từ nhựa cây đu đủ, bromelin từ trái dứa hoặc ficin từ
cây sung đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới. Nhưng hiện nay enzym protease từ mủ
mít chỉ có một công trình nghiên cứu tại Ai Cập. Nơi mà có những thử nghiệm đầu tiên
và tìm thấy một vài ứng dụng của enzym protease trong lĩnh vực sản xuất bơ, phomai…
3.3. Các phương pháp tinh sạch:
-Tủa cồn
-Tủa aceton
-Tủa sunfat amon
-Sắc kí lọc gel
-Sắc kí trao đổi ion trên DEAE-cellulose
3.4. Phương pháp thu nhận
3.4.1. Thu nhận
Cách tiến hành lấy mủ: lau cuống trái ,dao và hũ nhựa đựng mủ bằng bông tẩm
cồn. Hủ nhựa để trong thùng đá, dùng dao inox cắt đứt phần cuống trái, khi hết mủ tiếp
tục cắt cách vết cắt trước khoảng 1-2cm, làm như thế cho đến khi vết cắt tiếp xúc với
ruột trái mít. Mủ thu nhận được bảo quản lạnh và đưa về phòng thí nghiệm để giữ lạnh

trong tủ đông.
3.4.2. Sơ đồ qui trình
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 19
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
3.4.3. Giải thích qui trình
 Hòa tan
- Đối với mủ tươi: cân khối lượng mủ và hoà tan đệm phosphat 0.05M pH 7.5 đã
làm lạnh theo tỉ lệ: 1g mủ: 10ml đệm. Khuấy bằng đũa khuấy trong 15 phút và thực
hiện trong tủ lạnh (2
o
C).
- Đối với mủ đông khô: hòa tan mủ bằng đệm phosphat theo tỉ lệ 20mg: 3ml đệm
phosphat 0.05M pH 7.5 .
- Đệm phosphat 0.05M pH 7.5 được pha như sau
- Dung dich mononatri orthophosphat 0.05M: cân 7.8005g NaH
2
PO
4
.12H
2
O hòa
tan và định mức đến 1000ml bằng nước cất (dung dịch a).
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 20
Mủ mít
Hòa tan
Đệm phosphat
0.05 M pH 7.5
Lọc thu dịch
trích ly
Bã

Sắc ký trao đổi ion trên DEAE-Cellulose
Enzym Protease
Tủa acetoneTủa cồn
Tủa (NH
4
)
2
SO
4
Sắc ký lọc gel
Điện di
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
- Dung dịch đinatri hydrophosphat: 17.907g NaH
2
PO
4
.12H
2
O hòa tan và định
mức đến 1000ml bằng nước cất (dung dịch b)
- Trộn 80ml dung dịch a, 420ml dung dịch b(tỉ lệ dung dịch a: dung dịch b là
16:84)và định mức đến 1000ml thu dung dịch đệm phosphat 0.05M pH7.5 (nếu đo pH
không phù hợp phải dùng dung dịch hoặc dung dịch b chỉnh pH).
 Lọc: Dùng giấy lọc thô để tách riêng phần không tan,dung dịch sau lọc tiếp tục
tinh sạch. Thực hiện trong tủ lạnh (2
o
C)
 Tinh sạch
• Tinh sạch theo phương pháp tủa sunfat amon [(NH
4

)
2
SO
4
]:
Sunfat amon là muối trung tính có khả năng gây tủa thuận nghịch thường được
sử dụng nhiều trong phòng thí nghiệm để tủa protein, enzyme nhờ khả năng không gây
biến tính và có độ hòa tan cao. Dung dịch protein và enzyme khi bổ sung (NH
4
)SO
4
các
ion NH
4
+
và SO
4
-2
sẽ trung hòa điện tích của protein hoặc enzym ,các phân tử mất điện
tích không còn đẩy nhau mà liên kết lại thành tủa.
Sau khi tủa ,protein và enzyme thu được còn giữ lại một lượng nhỏ muối (NH
4
)
2-
SO
4
do vậy phải loại muối nhờ quá trình thẩm tích qua màng bán thấm (túi cetophan).
• Tinh sạch theo phương pháp tủa cồn
Protein được bao bọc bởi lớp vỏ hydrat, cồn là dung môi hữu cơ háo nước nên
khi bổ sung cồn vào dung dịch có chứa enzym hòa tan, nó sẽ bóc lớp vỏ hydrat gây tủa

protein
Cách thực hiện: enzym rất dễ biến tính với dung môi hữu cơ nên trước khi tủa
cần làm lạnh dung dịch chứa protein và enzym, cồn ở nhiệt độ -4
0
C. Rót cồn chảy theo
thành cốc để tránh biến tính enzym. Để lạnh cho đến khi xuất hiện tủa, tiến hành ly tâm
4000v/phút trong 10 phút. Thu tủa, để bay hơi tự nhiên trong tủ lạnh.
• Tinh sạch theo phưong pháp tủa acetone
Acetone cũng là tác nhân tủa protein và enzym. Khác với muối trung
tính,acetone là dung môi hữu cơ háo nứơc, khi bổ sung acetone vào dung dịch có chứa
enzym hòa tan, nó sẽ hút lớp áo nước của phân tử enzym, do vậy cá enzym kết với nhau
tủa xuống.
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 21
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
• Sắc kí lọc gel
Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration). Cơ sở của phương
pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng của
enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra.
Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ,
không phản ứng với protein enzyme. Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với
các yếu tố về cơ học cũng như sinh học.
Tóm lại bằng phương pháp lọc rây phân tử người ta thể tách các chất có trọng
lượng phân tử khác nhau có trong hỗn hợp Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại
muối thay cho quá trình thẩm tích
 Sắc kí trao đổi ion trên DEAE-cellulose
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của
các protein enzyme. Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản
ứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác
nhân trao đổi ion
Để tách enzyme protease từ mủ mít ra khỏi hỗn hợp

Qua Sắc kí trao đổi ion các enzyme khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo
từng phần chiết khác nhau trong đó chứa phần chiết có enzyme cần thu với nồng độ cao
nhất.
 Điện di
Điện di là quá trình phần tử tích điện chuyển động nhờ một điện trường di qua
một hỗn hợp chất.
Trong điện di, chất mang được tạo thành từ nhiều chất khác nhau : giấy
Cellullose-acetate, gel poliacrylamide, gel agarose, tinh bột Và cũng có rất nhiệu loại
điện di : điện di ống, lớp mỏng hoặc tờ mỏng (trong bài này ta sử dụng điện di
poliacrylamide).
Phương pháp điện di được dùng để kiểm tra độ tinh sạch protein sau khi qua quá
trình tách chiết và tinh chế. Ngoài ra nó còn được dùng để xác định gián tiếp trọng
lượng phân tử của mẫu vừa tách.
Nguyên tắc:
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 22
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
Dưới tác dụng của điện trường, các chất có phân tử lượng khác nhau có trong
mẫu sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực
dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường.Sự di
chuyển phụ thuộc vào điện tích, hình dạng, kích thước, thành phần hóa học và lực điện
trường. Khi quá trình phận tách kết thúc,các chất có cùng phân tử lượng tập trung lại
thành dãy (vạch) ngang ở các vị trí khác nhau trên chất mang. Sau đó những vạch này
được phát hiện nhờ các phương pháp nhuộm màu, autoradiography, định lượng bằng
các phương pháp quét qua dencitometer.
Tùy thuộc vào trọng lượng phân tử của protein mà sử dụng gel có nồng độ thích
hợp.Nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn , cho phép phân tách các phân tử sinh học có
kích thước lớn,ngược lại nồng độ cao sẽ cho lỗ gel nhỏ,vì vậy chỉ có khả năng phân
tách những phân tử sinh học có kích thước nhỏ.
Quá trình điện di chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ, đệm, pH và sự ổn định của dòng
điện.

3.5. Ứng dụng của enzyme protease
Enzyme protease từ mủ mít để đông tụ sữa.
Đó là khả năng thay thế rennin trong quá trình đông tụ sữa sản xuất phomai.
Ưu điểm đáng kể của enzyme này là có nguồn gốc từ thực vật (mủ mít) không
gây vị đắng. Đây là phát hiện vô cùng quan trọng về khả năng dùng mủ mít thay thế
rennin.
4. GIỚI THIỆU ENZYME BROMELIN VÀ CÁCH THU NHẬN NHẬN TỪ DỨA
4.1. Đặc điểm nguồn nguyên liệu và bromelin
4.1.1. Đặc điềm nguồn thu nguyên liệu
Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử điệp, họ Bromeliaccac có nguồn
gốc từ Nam Mỹ. Hiện nay, ở nước ta dứa được trồng nhiều nhất là Ananas comusus
được sử dụng như nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzyme và ngoài
ra còn được sử dụng trong 1 số lĩnh vực khác như dược, mỹ phẩm… Phần thân và lá
sau khi thu hoạch quả có thể được sử dụng làm giấy, lấy sợi hoặc làm phân bón.
Trong quả dứa chín , nước chiếm đa số, hàm lượng 80-86%, phần còn lại là
cacbohydat chiếm 10-18% (trong đó có 60-70% sacharose, glucose và fructose chiếm
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 23
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
30-40%) protein 2-3%, axit hữu cơ 0.1-1.6% (trong đó axit citric chiếm 87% và 13%
còn lại là axit maleic), tro 0.3%, sắc tố 0.03-0.6% và các hợp chất phenolic (tạo màu),
các hợp chất tạo mùi, các vitamin như: vitamin A (0.3mg carotene/100g thịt quả), B1 và
C (8.5mg/100g thịt quả) và enzyme bromelin là 1 enzyme thủy phân protein. Ngoài ra,
ở lá non trong ngọn thân cây dứa co chứa rất nhiều vitamin C.
4.1.2. Đặc điểm enzyme bromelin
Bromelin là tên gọi chung nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả
năng phân giải protein được thu nhận từ họ bromelin, đặc biệt ở cây dứa (thân và trái).
Trước đây, cây dứa được sử dụng như 1 loại cây làm thuốc. Năm 1957, Heinicke nhận
thấy thân dứa có 1 lượng lớn bromelin và người ta bắt đầu tìm cách triết tách nó cà sản
xuất dưới dạng thuốc đễ chữa bệnh. Tùytheo nguồn thu nhận mà người ta phân biệt
bromelin thân hay bromelin quả và bromelin thân là nhóm enzyme có giá trị kinh tế. Ở

mỗi bộ phận khác nhau trên cây dứa, bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạo
khác nhau.
Bromelin có vai trò trong y học nên được nghiên cứu rất nhiều. Bromelin là
enzyme thủy phân protein, nó phân cắt protein trong cơ thể sinh vật. Một trong nhưng
lợi ích của nó được chú ý đến đó lá 1 chất giúp cho tiêu hóa vì nó hoạt động trong môi
trường axit trong dạ dày và cả trong môi trường kiềm ở ruột non. Bromelin có thể thay
thế được cho cả những enzyme tiêu hóa khác như pepsin và trypsin. Bromelin có tác
dụng kháng viêm, rất có hiệu quả trong chữa trị bệnh viêm thấp khớp do đó các chuyên
gia y tế đề nghị sử dụng bromelin như chất làm giảm đau kháng viêm và kháng sưng.
Hiệu quả của bromelin là làm giảm lượng protaglandin trong cơ thể gây ra đau, viêm,
và ngăn cản sự thấm các chất dinh dưỡng qua bơ bằng cách ngăn cản những tiền chất
gây viêm. Bromelin có ảnh hưởng tích cực trên các protagladin hữu dụng.
Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng thủy phân khá
mạnh và hoạt động tối ưu ở pH 6-8. Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein
tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ sung. Enzyme
bromelin có trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da , lớn gấp 1.5 lần so với papain.
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 24
Đề tài: “Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả” Nhóm SVTH
Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelin kể từ ba tháng trước khi chín, trong đó
hoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín. Khi trái chín, hoạt tính
bromelin giảm xuống như ko mất hẳn.
Bromelin còn có thể thu được từ trong thân dứa (trung bình có thể thu được 3.6
kg từ 3781 lít nước rút ra từ thân cây dứa)
4.2. Tính chất enzyme bromeline
Thành phần chủ yếu bromelin có chứa nhóm sulfhydryl thủy phân giải protein.
Trong dịch chiết bromelin còn chứa 1 ít peroxydase, phosphatase axit và chất cản
proteinase. Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl của
bromelin thì thu dược 1 enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro, nhưng lại bị bất
hoat sinh lí in vitro ở 1 số điều kiện mà bromelin có hiệu quả. Như vậy, rõ ràng rằng
phần lớn các hoạt động sinh lí của bromelin ko chỉ phụ thuộc vào phân đoạn có hoạt

tính thủy phân protein mà nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác trong bromelin.
Hiện tại người ta ghi nhận được bromelin trong thân dứa có tám thành phân cơ bản có
hoạt tính thủy phân protein. Hai thành phần chính được gọi là F4 và F5. Phân đoạn có
hoạt tính mạnh nhất là F9 chiếm khoảng 2% protein trên tổng số. Người ta ước tính
rằng khoảng 50% protein của F4 và F5 là glycosylate, trong khi đó ở F9 ko có
glycosylate. Ph tối thích của các phân đoạn F4 và F5 là 4.0-4.5 và của F9 thì gần với pH
trung tính. Dịch triết bromelin toàn phần có hoạt động trong khoảng pH 4.5-9.8.
Bromelin được chiết tách từ các phần khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân protein thì
giống nhau. Bromelin ko ổn định với nhiệt độ do đó các hoạt động sinh lí của nó sẽ
giảm đi nếu như quá trình chiết tách hay điều kiện bảo quản ko thích hợp.
Bromelin có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động vật. Nồng độ cao
nhất của bromelin được tìm thấy trong máu sau khi ăn 1 giờ, tuy nhiên hoạt động thủy
phân protein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có lẽ là do tác động của các protease nội
sinh và yếu tố α-2-macroglubuline cảu huyết thanh .
4.2.1. Cấu tạo hóa học
Bromelin thân là 1 protease nhưng nó khác với protease thực vật khác như
papain, ficin ở chỗ nó lá 1 glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2
glucosamine, 1 xylose và 1 fructose. Sợi liên kết cacbon này liên kết hoán vị với sợi
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Mai Hương Trang 25