Đề tài so sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng aspegillus niger và chủng bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài

Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
MỤC LỤC
Danh mục các bảng trang
Danh mục các hình
Danh mục chữ viết tắt
Mở đầu
Mục tiêu đề tài
Nhiệm vụ
Ý nghĩa thực tế và các vấn đề liên quan.
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
DANH MỤC BẢNG
ST
T
Số
hiệu
Tên bảng trang
1 1.1 Các phản ứng sinh hóa của B. subtilis 9
2 1.2 Phần trăm pectin trong các phần phế liệu của bưởi 11
3 2.1 Các điều kiện tiền xử lý xoài 26
4 2.2 Tiêu chuẩn quy định cấp chất lượng 27
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương SVTH: Nguyễn Đức
Tài

Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
5 2.3 Bảng điểm về vị của sữa chua xoài 27
6 2.4 Bảng điểm về mùi của sữa chua xoài 28
7 2.5 Bảng điểm cơ sở về trạng thái của sữa chua xoài 29
8 3.1
Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng vi

khuẩn B. subtilis.
31
9 3.2
Quá trình xử lý xoài với enzim pectinaza và muối
CaCl
2
.
39
11 3.3
Mô tả chất lượng cảm quan của sản phẩm phụ thuộc
tỷ lệ bổ sung xoài vào sữa chua.
41
DANH MỤC HÌNH
STT
Số
hiệu
Tên hình trang
1 1.1 Cấu tạo của vi khuẩn A. niger 6
2 1.2 Cấu tạo của chủng nấm mốc B. subtilis 8
3 1.3 Cơ chế tạo gel bằng liên kết hydro 13
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương SVTH: Nguyễn Đức
Tài

Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
4 1.4 Cơ chế tạo gel bằng liên kết với Ca
2+
14
5 1.5 Sữa chua trái cây. 17
6 1.6

Pectin trước khi bị thủy phân (a), pectin sau khi bị
thủy phân và tạo liên kết mạng với Ca
2+
(b).
18
7 3.1 Khuẩn lạc của vi khuẩn B. subtilis. 30
8 3.2 Hình ảnh ống giống của chủng B. subtilis. 32
9 3.3
Nấm mốc A. niger phát triển trên thạch đĩa
Czapek.
32
10 3.4
Chủng nấm A. niger được bảo quản trong ống
thạch nghiêng.
33
11 3.5
Ảnh hưởng của hàm lượng pectin tới hoạt lực của
enzim pectinaza.
33
12 3.6
Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến hoạt tính
pectinaza
35
13 3.7
Vòng bán kính thủy phân của (a) B.subtilis và (b)
A. subtilis.
37
14 3.8 Enzim pectinaza được tổng hợp từ chủng A. niger. 38
15 3.9 Tổng điểm đánh giá cảm quan xoài sau khi xữ lý. 39
16 3.1 Sản phẩm sữa chua xoài. 43

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
stt Ký hiệu Tên đầy đủ
1 A. niger Aspegillus niger
2 B. subtilis Bacillus subtilis
3 PEL Pectale lyaza
4 PNL Pectin lyaza
5 A. awamori Aspegillus awamori
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương SVTH: Nguyễn Đức
Tài

Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
6 HMP
High Methoxyl
Pectin
7 LMP
Low Methoxyl
Pectin
8 MI Chỉ số methoxyl
9 DE Chỉ số este hóa
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương SVTH: Nguyễn Đức
Tài

Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
MỞ ĐẦU
Ứng dụng enzim trong chế biến thực phẩm và nhiều lĩnh vực khác đã và đang là
một trong những vấn đề mang tính cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn. Hiện nay, các
nước phát triển sử dụng các chế phẩm enzim để tạo ra những sản phẩm có năng suất,
chất lượng cao với giá thành hạ. Việt Nam là nước giàu tiềm năng về nguyên liệu, nhu

cầu các loại enzim phục vụ trong chế biến thực phẩm là rất lơn. Tuy nhiên, ở Việt Nam
hoàn toàn không có xưởng sản xuất enzim, hàng năm nước ta vẫn phải nhập ngoại một
khối lượng rất lớn các chế phẩm enzim.
Hiện nay, người ta khai thác enzim chủ yếu từ vi sinh vật và được ứng dụng
nhiều trong đời sống, sản xuất. Nguồn enzim từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm như hoạt
tính enzim cao, thời gian tổng hợp ngắn, nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, có thể sản xuất
hoàn toàn theo quy mô công nghiệp.
Pectinaza là nhóm enzim thủy phân pectin, enzim này có ứng dụng rộng rãi
trong công nghiệp thực phẩm chỉ sau amylase và proteaza.
Sữa chua là một sản phẩm lên men từ sữa rất được ưa chuộng hiện nay trên thế
giới cũng như ở Việt Nam, nó có hương vị thơm ngon, bổ dưỡng và quan trọng hơn cả
là nó mạng lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người. Tuy nhiên trên thị trường hiện nay
sản phẩm sữa chua chưa phong phú và đa dạng về chủng loại.
Chính vì vậy nhằm mục đích cải thiện cấu trúc trái cây trong sữa chua, góp phần
đa
dạng hóa các sản phẩm sữa chua hiện có trên thị trường thì việc thực hiện đề tài
“Nghiên cứu sử dụng enzim pectinaza từ chủng nấm mốc Aspergillus niger và
chủng vi khuẩn B. subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua trái cây” là điều cần
thiết.
MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
5
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
Mục tiêu nghiên cứu chính của đề tài là lựa chọn chủng vi sinh vật thích hợp từ
hai chủng A.niger và B. subtilis để tổng hợp tổng hợp enzim pectinaza và ổn định cấu
trúc của xoài trong sản phẩm sữa chua xoài.
NHIỆM VỤ ĐỀ TÀI
- Hoạt hóa thành công hai chủng A. niger và B. subtilis.

- Lựa chọn một trong hai chủng A. niger và B. subtilis cho quá trình tổng hợp
enzim pectinaza phục vụ cho quá trình nghiên cứu sản xuất sữa chua xoài.
- Sinh tổng hợp enzim pectinaza từ chủng vi sinh vật được lựa chọn.
- Xác định các điều kiện thích hợp cho khả năng ổn định cấu trúc của xoài trong
sữa chua.
- Xác định được lượng xoài thích hợp bổ sung sung vào trong sữa chua.
- Sản xuất thành công sữa chua xoài dựa vào các điều kiện đã được nghiên cứu.
Ý NGHĨA THỰC TIỂN VÀ CÁC VẤN ĐỀ CÓ LIÊN QUAN.
Pectinaza là nhóm enzyme thủy phân pectin. Đây là nhóm enzyme được ứng
dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm như sản xuất rượu vang, nước giải
khát, sản xuất nước quả, mứt quả,…Ở Việt Nam, enzyme pectinase chủ yếu được nhập
ngoại nên việc ứng dụng pectinase trong sản xuất chiếm một tỉ lệ không đáng kể.
Enzyme pectinase rất phổ biến ở các loại cây có trái, vi sinh vật. Xuất phát từ nguồn vi
sinh vật rẻ tiền, phổ biến và có nhiều giá trị sử dụng đặc biệt là chủng nấm mốc A.
niger và chủng vi khuẩn B. subtilis thì việc sinh tổng hợp enzyme pectinaza sẽ đem lại
giá trị về kinh tế trong chế biến thực phẩm.
Với sản phẩm sữa chua xoài được sản xuất dựa trên công nghệ enzim sẽ đem lại một sự
mới lạ cho sản phẩm sữa chua trên thị trường, góp phần làm đa dạng sản phẩm làm
tăng lợi ích về kinh tế.
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
6
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
1.1. ENZIM PECTINAZA
1.1.1. Giới thiệu chung
Enzim pectinaza là enzim xúc tác thủy phân các polymepectin. Sự phân hủy
pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzim này vì vậy có vai
trò quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Việc kiểm soát các enzim

này trong cà chua chuyển gen là một ví dụ điển hình trong việc ứng dụng RNA đối mã
để thao tác sự biểu hiện gen. Enzim pectinaza cũng được ứng dụng nhiều trong quá
trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt
động của enzim pectinaza có thể kiểm soát được độ nhớt của sản phẩm. Enzim
pectinaza có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng.
Pectinaza: Xúc tác thủy phân của các nhóm methyleste. Enzim thường tấn công
vào các nhóm este methyl của đơn vị galaturonate nằm kề đơn vị không bị este hóa,
phân cắt các nhóm methoxy (COOCH
3
) đứng cạnh các nhóm –COOH tự do, tạo thành
các axit pectinic hoặc axit pectic và methanol. Pectinaza thu được từ các nguồn khác
nhau có giá trị PH tối ưu khác nhau. Nếu thu từ nguồn vi sinh vật thì PH tối ưu từ 4,5-
5,5, còn nếu thu từ nguồn thực vật thì có PH tối ưu từ 5,0-5,8. Pectinaza từ nấm mốc có
nhiệt độ tối ưu là 30-40
0
C và bị vô hoạt ở 55-62
0
C. Pectinaza thường được hoạt hóa bởi
các ion Ca
2+
và Mg
2+
.
Polygalacturonaza còn có tên gọi là poly-1,4-galacturoniglucanohydrolase xúc tác
sự phân cắt các mối liên kết α-1,4-glycosid. Các exo-PG (exo-poly 1,4-α-
Dgalacturonide) galacturonohydrolaza, phân cắt từ các đầu không khử và endo-PG
(endo-poly1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolaza, tấn công ngẫu nhiên vào giữa
mạch cơ chất. Polygalacturonaza ít gặp trong thực vật nhưng có chủ yêu ở một số nấm
mốc và vi khuẩn, Polygalacturonaza là một phức hệ enzim gồm có nhiều cấu tử và
thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất. Trên cơ sở tính đặc hiệu và cơ chế tác

dụng với cơ chất, enzim Polygalacturonaza được chia làm ba loại :
7
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
-Polymethylgalacturoaza tác dụng trên plygalacturonic axit đã được methoxyl hóa
(tức là pectin). Enzim này lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng
phân cắt ở trong hay cuối mạch trong phân tử pectin, đó là endo-glicosidaza-plymethyl
galacturonaza kiểu 1và exo-glucosidaza-polymethylgalacturonaza kiểu III.
-Polygalacturonaza, enzim tác dung trên pectic axit hoặc pectinic, cũng được chia
thành hai nhóm nhỏ là endo-glucosidaza-Polygalacturonaza kiểu IIvà exo-glucosidaza-
Polygalacturonaza kiểu IV. Enzim endo-glucosidaza-polymethyl-glacturonaza kiểu I là
enzim polymethylgalacturonaza dịch hóa pectin có mức độ methyl hóa càng cao thì bị
thủy phân bởi enzim này càng nhanh và càng có hiệu quả. Trong dung dịch, khi có mặt
của enzim Pectinaza thì hoạt độ của enzim này thường bị giảm. Enzim này rất phổ biến
trong các vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc A. niger, A. awamori.
-Pectale lyaza (PEL): xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị este hóa.
Cả hai enzime exo-PEL (endo-ply(1,4-α-D-galacturonide)lyaza)và endo-PEL ( endo-
poly(1,4-α-D-galacturonic)lyaza)đều tồn tại. Pectale và pectin có lượng methoxyl thấp
là các cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzim này. Nói chung, cả hai enzim này đều có
khoảng pH tối đa nằm trong khoảng từ 8,0-11, đều cần ion Ca
2+
để hoạt động. Pectale
lyaza không được tìm thấy trong cây xanh, nhưng có ở vi khuẩn và nấm các enzim vi
sinh vật ngoại bào này đóng một vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh ở thực
vật, gây ra sự phân hủy mô của thành tế bào, làm mềm và làm mục mô thực vật.
1.1.2. Phương pháp thu nhận enzim pectinaza
Hiện nay, người ta thu nhận enzim chủ yếu từ nguồn vi sinh vật. Có hai phương
pháp thu nhận enzim pectinaza.

1.1.2.1. Thu nhận chế phẩm enzim từ canh trường bề sâu
-Phương pháp hiếu khí: Sự tích tụ enzim trong môi trường được bắt đầu khi sự
phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị axit hoá mạnh và khi
lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn. pH của môi trường nuôi cấy thường đạt
từ 6-7,2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH kiềm kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự
8
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
tích lũy enzim pectinaza. pH = 4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzim pectinaza. Khi pH
dịch về phía axit, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4,5-5,0, tuy sự tạo thành sinh khối
không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzim pectinaza bị kìm hãm. Tuy nhiên, pH
của các trường nuôi cấu A. niger và A. awamori 16 có thể dịch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2,
theo thứ tự. Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với hàm lượng từ
2-10%. Đối với A. niger và A. awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong
môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử. Thời gian ủ sơ bộ thường
là 38-42h. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm
lượng các chất hoà tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%. Để
thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân không canh
trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun.
Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180
0
C và đi ra đạt 60-
70
0
C. Thời gian lưu của chế phẩm enzim trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây
và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 40
0
C. Chế phẩm thu được cần phải

được đóng gói kín để tránh hút ẩm. Có thể thu chế phẩm pectinaza tinh khiết bằng cách
kết tủa enzim trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỉ lệ
2:1 và isopropanol theo tỉ lệ 1,3:1, hoặc với muối ammonium sulfat (50-80% trong
muối kết). Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinaza trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-
90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu. Nếu kết tủa bằng muối ammonium
sulfat, cần tách muối ra khỏi enzim bằng phương pháp thẩm tích (với nước hoặc dung
dịch đệm), sau đó sấy khô. Khi độ bão hoà của (NH
4
)
2
SO
4
bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được
đoạn có hoạt độ pectinaza thấp (đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưng nếu
kết tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4
có độ bão hoà 1.0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11%
nhưng lại có hoạt độ pectinaza cao.
Phương pháp yếm khí môi trường: Dùng bã củ cải:2%; (NH
4
)
2
HPO
4
0,75%
KH

2
PO
4
:0,1%; CaCO
3
: 0,3%; nước chiết ngô: 0,5% Clostridium pectinopermentants
15 có khả năng tổng hợp pectinaza một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình
9
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối. Sự tích lũy enzim sẽ tối đa
tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h. PH ban đầu của môi trường
dinh dưỡng là 6,5-7,0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường
chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành
ở nhiệt độ 35
0
C Cl. Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinaza.
Thành phần môi trường gồm có: Lactose:2%; pectin củ cải:1%; (NH
4
)
2
HPO
4
: 0,4%;
K
2
HPO
4

: 0,7%; KH
2
PO
4
:0,3%; NaCl:0,1%; MgSO
4
: 0,025%; FeSO
4
: dạng vết; CaCO
3
:
0,5%; dịch nấm men tự phân: 0,05%; ascorbic axit: 0,5%. Có thể tiến hành thu chế
phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzim với dung môi hữu cơ hoặc với
muối ammonium sulfat. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lí
là: 6,5-6,8. Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzim trong kết tủa
đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu. Khi kết tủa bằng ammonium sulfat có độ bão hoà
bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinaza và pectintranseliminase; khi độ
bão hoà là 0,9-1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và
exoPolygalacturonaza. Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzimpectinaza
thường theo các bước cơ bản sau đây: - Khử muối bằng phương pháp lọc gel (Biogel
P100) - Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion (DEAE Biogel A), hay trao đổi
cation (CM Biogel A) - Tách enzim pectinaza bằng alginate liên kết ngang - Tinh sạch
bằng FPLC. Alginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng
tĩnh điện và thay thế pectat liên kết ngang.
1.1.3. Nguồn tổng hợp enzim
1.1.3.1. Nguồn gốc từ thực vật
Hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzim pectinaza. Enzim này thường tồn tại
dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. Pectinaza ở thực vật nói
chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ
thấp, như Ca

2+
chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzim.
10
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
Đặc điểm của pectinaza thực vật: Cà chua chứa ít nhất hai loại pectinaza, cả
pectinaza I và pectinaza II đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín. Khi bước
vào giai đoạn chín, nồng độ enzim pectinaza I giảm xuống, nhưng pectinaza II tích luỹ
dần cho đến khi trái cây có màu đặc trưng của trái chín. Pectinaza II có khối lượng
phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6. Enzim này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở 67
0
C các ion
Ca
2+
và Na
+
làm tăng hoạt độ của enzim lên tối đa ở các nồng độ 0,005M và 0,05M,
theo thứ tự.
Pectinaza của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu
tại pH gần 8. Polygalacturonic axit, sản phẩm hình thành do quá trình để methyl hoá, là
một chất ức chế cạnh tranh. Trong thịt quả chuối có hai isoenzim pectinaza. Cả hai có
cùng khối lượng phân tử là 30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau 8,8 và 9,3. Các
enzim này hoạt động ở pH tối đa là 7,5. Hoạt độ enzim tăng lên khi thêm vào dung
dịch NaCl ở nồng độ 0,2M, và đưa pH của dung dịch về 6,0. Các enzim này bị ức chế
bởi nhiều loại polyol có khối lượng phân tử thấp, như glycerol, sucroza, glucoza,
maltose và galactose.
Pectinaza trong quả cam có hai loại: đó là hai isoenzimpectinaza I và pectinaza II
có khối lượng phân tử 36kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10,05 và 11,0,

theo thứ tự. PH tối ưu của pectinaza I là 7,6, còn của pectinaza II là 8,0. Thịt quả cũng
chứa hai isoenzim, một trong hai enzim này có tính bền nhiệt hơn, còn enzim kia thì ít
mẫn cảm hơn khi bị tác động của proteaza. Độ ổn định của enzim có thể liên quan đến
mức độ glycosyl hoá của các phân tử enzim.
Enzim bền nhiệt hơn và enzim còn lại có khố i lượng là 51kD và 36kD, theo thứ
tự. Cả táo và kiwi cũng chứa hai loại isoenzim, các isoenim của kiwi có cùng khối
lượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7,3. Tuy nhiên, chúng khác nhau về
mức độ bền nhiệt.
1.1.3.2. Nguồn vi sinh vật
11
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
Hiện nay trên thế giới người ta tổng hợp enzim pectinaza từ nhiều chủng vi sinh vật
khác nhau, nhưng trong đó chủ yếu nhất vẫn là hai chủng A. niger và B. subtilis.
 Sơ lược về chủng nấm mốc A. niger
 Đặc điểm hình thái
- Quan sát đại thể
Khóm nấm mốc A. niger có đường kính 4 ¸ 5 cm trên thạch Czapek sau 5 ngày.
Khóm nấm mốc màu đen hoặc nâu đen lấm tấm như bã cà phê.
- Quan sát vi thể
Bông hình cầu có màu đen. Thể bình 1 hoặc 2 tầng, ở đa số loài thể bình 2 tầng,
Metulae dài gấp đôi tầng Phialides. Vách cuống conidi trơn. Hạt đính hình cầu đến gần
cầu, có gai rõ.
Hình 1.1. Cấu tạo của chủng nấm mốc A. niger
 Đặc điểm nuôi cấy
Quá trình nuôi cấy nấm mốc A. niger sản xuất enzim pectinaza có thể được thực
hiện theo hai phương pháp nuôi cấy bề mặt với môi trường rắn và lên men chìm. Trong
đó, trong đó phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho vi sinh vật

phát triển trên bề mặt môi trường, hay trên bề mặt vật liệu rắn, xốp, ẩm thông thường,
môi trường dạng rắn với nguyên liệu chính là bột cám mì, bã củ cải và bột bắp nghiền,
hạt thóc nảy mầm, trấu có bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác (amonium sulfat,
ammoni chloride, ammoni photphat). Phương pháp này phát triển rất mạnh từ những
năm 1970 đến nay. Đối với phương pháp nuôi cấy bề sâu, vi sinh vật sẽ được nuôi
12
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
trong môi trường lỏng có bổ sung đầy đủ thành phần dinh dưỡng và chất cảm ứng
pectin để tác động tới vi sinh vật sinh enzim petinase. pH thích hợp để nuôi cấy A.
niger [7].
A. niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu 6-8 độ C, tối đa 45-47
0
C, tối ưu
25-28
0
C. Sinh trưởng được ở độ ẩm tối thiểu 23%. Độ ẩm môi trường thích hợp để lên
men bán rắn là 60-65%. Sinh trưởng và phát triển khi có mặt O
2
, pH tối ưu 4-6,5. Tuy
nhiên, theo Patt (1981) cũng có những chủng A. niger sinh trưởng được ở pH 2.Trên
môi trường thạch Czapek, A. niger mọc thưa, đường kính khuẩn lạc khoảng 4cm. Bổ
sung 0,5% cao nấm men vào môi trường làm khuẩn lạc A. niger mọc tốt và to hơn, đạt
đường kính trung bình khoảng 6cm.
Trên môi trường thạch malt khuẩn lạc mọc tốt nhưng không to như trên môi trường
thạch Czapek-cao nấm men.
 Đặc điểm sinh hóa
Khả năng lên men đường: A. niger có khả năng đồng hóa tốt các loại đường đơn

và đường đôi như: glucoza, fructoza, maltoza, xyloza, manoza, saccharoza. A. niger
đồng hóa được galactoza, sorboza và lactoza ở mức độ kém hơn [3].
Khả năng tổng hợp enzim:
+ a-amylase: A. niger có khả năng tổng hợp a-amylaza ngoại bào để thủy phân nhanh
tinh bột tạo dextrin và một ít maltoza và glucoza.
+ Proteaza: A. niger có khả năng tạo 2 loại proteaza. Proteaza thứ nhất phân giải
protein thành polypeptid, peptonproteaza thứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm trên
thành axit amin.
13
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
+ Cellulaza: A. niger có khả năng tạo cellulaza, chủ yếu là cellulaza Cl, cellulaza Cx và
b-glucosidaza hay cellobiaza.
+ Pectinaza, Xylanaza: A. niger có khả năng tạo pectinaza, xylanaza ở nhiệt độ tối
thích 25 độ C, pH 5,6.
Ngoài ra, A. niger còn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzym khác như: lipaza,
mananaza [7].
 Sơ lược về chủng vi khuẩn B. subtilis
 Đặc điểm hình thái
B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 - 0,8µm x 1,5 –
3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12
lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước
từ 0,8 - 1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không
kháng axit, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu,
2000).
Hình 1.2.Cấu tạo của vi khuẩn B. subtilis
 Đặc điểm nuôi cấy
Nuôi cấy trong môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa

không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề
mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.
Đối môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn
sóng. Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin. Thạch khoai tây: phát
triển đều, màu vàng lấm tấm hạt. Môi trường canh TSB: B. subtilis phát triển làm đục
môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều.
14
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
Độ pH: B. subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4. Nhu cầu O
2
: B. subtilis là
vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.
Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37
0
C.
 Đặc điểm sinh hóa
Lên men không sinh hơi các loại đường: glucoza, maltoza, manitol, saccharoza,
xyloza, arabinoza.
Indo (-), nitrate (-), MR-VP (+), H
2
S (-), NH
3
(+), catalase (+), amylase (+), casein
(+), citrate (+), di động (+), hiếu khí (+).
Dung huyết: một số dòng gây dung huyết trên thạch máu ngựa và thỏ do tác động
của hemolysine [7].
Bảng 1.1.Các phản ứng sinh hóa của B. subtilis

phản ứng sinh
hóa kết quả
Hoạt tính calatase +
Sinh Indo -
MR +
VP +
Sử dụng citrate +
khử nitate +
Tan chảy gelatin +
Di động +
Phân giải tinh bột +
Abinoza +
1.1.4. Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước
 Trong nước
Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nước về enzim pectinaza, các hướng nghiên
cứu tập trung về cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng
dụng enzim pectinaza trên đối tượng chủ yếu là vi nấm, đặc biệt là từ Aspegilus.
 Ngoài nước
15
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
Pectin đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạnh rất đa dạng
trong đó việc nghiên cứu ứng dụng enzim pectinaza trong công nghiệp thực phẩm khá
phong phú và đa dạng.
Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzim pectinaza được tiến hành trên nhiều đối
tượng khác nhau như: Fusarium (Guevara, 1997), Aspegillus japonicas (Maria, 2000),
Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Penicilium viridicatum (Dênis, 2002),
trichoderma reesei (lisbeth, 2003)… Tuy nhiên đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất

vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993;
Taragano, 1997; Caltisho, 2000)
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học phân tử và công nghệ gen, đa số các
chủng vi sinh vật dùng trong nuôi cấy thu nhận enzim pectinaza đều là những chủng
đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999; Bai, 2004). Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến
hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzim pectinaza của các chủng vi sinh vật như:
Couri và cộng sự (1995) đã nghiên cứu “sự thao tác gen trên chủng Aspegillus nhằm
làm tăng sự tổng hợp các enzim phân giải pectin” hay Solis (1997) đã “cải thiện việc
sản xuất pectinaza dùng các thể lai giữa các chủng Aspegillus ”
Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môi
trường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzim
pectinaza (Leone, 1987; Solis- Pereira, 1993; Lisbeth, 2003). Enzim pectinaza được
tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường có bổ sung pectin hay axit polygalacturonic
và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu galacturonic hoặc glucoza (Aguilar,
1987; Taraagano, 1997, Guevara, 1997).
1.2. GIỚI THIỆU VỀ CƠ CHẤT PECTIN
1.2.1. Khái quát chung về Pectin
Pectin là một polyme của các axit polygalacturonic và este methyl của chúng.
Pectin có nhiều ở quả củ hoặc thân cây. Trong thực vật, pectin tồn tại dưới hai dạng:
dạng protopectin không tan, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào, và dạng hòa tan pectin tồn
tại chủ yếu ở dịch tế bào.
16
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
Pectin như một loại keo gắn chặt các tế bào thực vật với nhau, vì thế người ta gọi
chúng là chất cement trong cấu trúc tế bào thực vật. Khi quả còn xanh, protopectin
chiếm tỷ lệ khá cao, protopectin không hòa tan trong nước, giúp quả có độ cứng. Khi
quả chín dần, dưới tác dụng của enzim protopectinaza, protopectin sẽ chuyển sang

pectin hòa tan, làm giảm sự liên kết giữa các tế bào, quả trở nên mềm hơn, quá trình
này cũng xảy ra dưới tác dụng của axit và nhiệt độ trong quá trình chần ở 60-85
O
C.
Pectin tồn tại với những hàm lượng khác nhau trong quả, củ hoặc thân của một số
loài thực vật: trong táo 10-15%, quả citrus 20-50%, củ cải đường 10-20%, đài hoa
hướng dương 15-25%, pectin lấy từ các nguồn khác nhau sẽ khác nhau về khả năng tạo
gel và khác nhau ít nhiều về các nhóm thế methoxyl trong phân tử, trong cùng một loại
quả nhưng ở các phần khác nhau thì hàm lượng pectin cũng khác nhau, bản thân pectin
là một loại chất xơ hòa tan trong nước có khả năng làm tăng độ nhớt.
Bảng 1.2. Phần trăm pectin trong các phần phế liệu của bưởi [10].
Các phế liệu Khối lượng (%)
Hàm lượng
pectin (%)
Hiệu suất thu hồi
(%pectin/%chất
khô)
Vỏ xanh 8 – 10 - -
Cùi trắng 15 – 30 3,1 15,3
Vỏ múi 8 – 12 5,8 25,2
Vỏ hạt 3 – 5 5,3 12,4
Bó tép 10 -16 5,2 -
1.2.1.1. Các chỉ số đặc trưng
Pectin là phụ gia thực phẩm thuộc nhóm phụ gia tạo gel, tạo đặc, pectin còn được
sử dụng làm chất ổn định, chất nhũ hóa.
17
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài

Pectin thường bảo quản ở dạng bột màu trắng, hơi vàng nhạt, hơi nâu hoặc xám
nhẹ, độ ẩm không quá 12% (105
o
C, 2h). Mặt khác có thể bảo quản ở dạng dung dịch có
độ khô 10% chứa 4-5% pectin, nhưng chỉ bảo quản được trong thời gian ngắn [12].
Chỉ số methoxyl (MI): biểu hiện tỷ lệ methyl hóa, là phần trăm khối lượng nhóm
methoxyl (-OCH
3
) trên tổng khối lượng phân tử. Sự methyl hóa hoàn toàn tương ứng
với chỉ số methoxyl bằng 16,3%, còn các pectin tách ra từ thực vật thường có chỉ số
methoxyl từ 10-12% [12].
Chỉ số este hóa (DE): thể hiện mức độ este hóa của pectin, là phần trăm về số
lượng của các gốc axit galactoronic được este hóa trên tổng số lượng gốc axit
galacturonic có trong phân tử [12].
1.2.1.2. Cơ chế tạo gel của pectin
Tùy thuộc mức độ methoxyl hóa của phân tử mà các loại pectin khác nhau có cơ
chế tạo gel khác nhau:
 Các cơ chế tạo gel
 HMP: Tạo gel bằng liên kết hydro:
- Điều kiện tạo gel: nồng độ đường sucroza> 50%; pH = 3,1-3,5; nồng độ pectin
0,5-1%.
Hình 1.3. Cơ chế tạo gel bằng liên kết hydro
• Đường có khả năng hút ẩm, vì vậy nó làm giảm mức độ hydrat hóa của phân tử
pectin trong dung dịch.
18
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
• Ion H

+
được thêm vào hoặc đôi khi chính nhờ độ axit của quả chế biến trung hòa
các gốc COO
-
, làm giảm độ tích điện của các phân tử. Vì vậy các phân tử có thể
tiến lại gần nhau để tạo thành liên kết nội phân tử và tạo gel.
- Trong các trường hợp này liên kết các phân tử pectin có thể hydroxyl-
hydroxyl, carboxyl-carboxyl, hoặc hydroxyl-carboxyl. Kiểu liên kết này không bền, do
đó các gel tạo thành sẽ mềm dẻo do tính di động của các phân tử trong khối gel. Loại
gel này khác biệt với gel thạch hoặc gelatin.
-Cấu trúc của gel: phụ thuộc vào hàm lượng đường, hàm lượng axit, hàm lượng
pectin, loại pectin và nhiệt độ.
• 30-50% đường thêm vào là sucroza. Do đó cần duy trì pH axit để khi đun nấu sẽ
gây ra quá trình nghịch đảo đường sucroza, ngăn cản sự kết tinh của đường
sucroza. Ngoài ra đường nghich đảo có khả năng hút ẩm hơn cả sucroza nên duy
trì cho sản phẩm kết cấu mềm lỏng. Tuy nhiên cũng không nên dùng quá nhiều
axit vì pH quá thấp sẽ gây nghịch đảo một lượng lớn sucroza, gây kết tinh
glucoza và hóa gel nhanh tạo nên các vón cục.
• Khi dựng lượng pectin vượt quá lượng thích hợp sẽ gây ra gel quá cứng, do đó
khi dựng một nguyên liệu có chứa nhiều pectin cần tiến hành phân giải bớt chúng
bằng cách đun lâu hơn.
• Khi sử dụng một lượng cố định bất cứ một loại pectin nào, pH, nhiệt độ càng
giảm và hàm lượng đường càng cao thì gel tạo thành càng nhanh.
- Ứng dụng: làm mứt quả nghiền, nước quả đông…
 LMP: tạo gel bằng liên kết với ion Ca
2+
.
- Điều kiện tạo gel: khi có mặt Ca
2+
, ngay cả ở nồng độ <0,1%, miễn là chiều dài

phân tử pectin phải đạt ở mức độ nhất định, khi đó gel tạo thành ngay cả khi không
thêm đường và axit.
• Khi chỉ số của methoxyl thấp, có nghĩa là tỷ lệ các nhóm –COO
-
cao thì các liên
kết giữa những phân tử pectin sẽ là liên kết ion qua các hóa trị hai đặc biệt là
19
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
Ca
2+
. Các phân tử axit pectic tác dụng tương hổ lẫn nhau nhờ các nhóm carboxyl
tự do, các nhóm này liên kết lại nhờ các ion Ca
2+
thành khung bền vững.
Hình 1.4. Cơ chế tạo gel bằng liên kết với Ca
2+
Cấu trúc của gel: phụ thuộc vào nồng độ Ca
2+
và chỉ số methoxyl.
• Chỉ số methoxyl
 Gel pectin có chỉ số methoxyl thấp thường có tính chất đàn hồi giống như
agar-agar.
 Chiều dài phân tử pectin quyết định độ cứng của gel, chỉ có pectin có khối
lượng phân tử không bé hơn 10000 mới có khả năng tạo gel, nếu chiều dài quá
thấp thì nó không tạo gel được mặt dự dựng với liều lượng cao.
 Khi pectin có cùng khối lượng phân tử thì khả năng tạo gel phụ thuộc vào mức
độ este hóa các gốc của mạch galacturonic tại các nhóm metoxyl (-OCH

3
).
+ Nhóm methoxyl tăng từ 8 -11 % thì độ bền đông tụ của nó tăng ngược
lại khả năng đông tụ giảm. Pectin có từ 9,5 -11% nhóm (-OCH
3
) ở môi trường pH
= 3 và hàm lượng đường 35 % khả năng đông tụ tốt.
+ Khi hàm lượng methoxyl giảm xuống 5% và thấp hơn khi pectin vẫn
giữ được khả năng đông tụ tạo đông chậm, đòi hỏi thay đổi hàm lượng đương
cũng như pectin và axit.
+ Nếu pectin có hàm lượng từ 3,5 -6 % nhóm methoxyl khi có sự tham gia
của các muối kim loại nhiều hóa trị như Ca
2+
và trên 35% đường thì nó sẽ tạo ra
đông tụ bền vững.
20
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
• Ion Ca
2+
: Dạng cation và anion có ảnh hưởng đến độ bền đông tụ các cation Ca
2+
,
Al
3+
làm tăng độ bền gel còn cation hóa trị I như Na
+
ở điều kiện xác định có tác

dụng ngược lại.
- Ứng dụng: cho phép chế tạo được thịt đông có độ cứng bền ngay cả ở khí hậu nhiệt đới
(khác với đông gelatin). Hoặc làm mứt đông cho người bị tiểu đường.
1.2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến cơ chế tạo gel
 Pectin
- Nồng độ của các phân tử pectin trong dung dịch càng lớn thì sự liên kết giữa
các phân tử xảy ra càng nhanh và sự đông tụ được tạo ra càng bền.
- Nhưng không phải tất cả lượng pectin đều tham gia vào việc tạo đông tụ chính
vì vậy độ bền gel không phải xác định theo số lượng nhiều ít mà xác định theo chiều
dài mạch phân tử và mức độ methoxyl hóa.
+Nếu phân tử pectin quá ngắn sẽ không tạo được gel mặc dù sử dụng với liều
lượng cao. Nếu phân tử pectin quá dài thì gel rất cứng, khi các sợi chỉ được tạo ra
ngắn, mạng lưới giữ pha lỏng của keo kém do đó sự đĩng tụ sẽ yếu và có khả năng đưa
đến sự rữa nát (vì nhả nước).
+ Mức độ methoxyl hóa quy định cơ chế tạo gel: tùy thuộc vào chỉ số methoxyl
cao hay thấp ở phân tử pectin mà các kiểu kết hợp giữa chúng sẽ khác nhau trong việc
tạo gel [12].
 Nước
Độ ẩm của khối keo tăng thì quá trình tạo keo tụ càng nhanh (vì tăng tốc độ định
hướng của các phân tử pectin do độ nhớt của dung dịch phân tán giảm)
 Đường
Vai trò của đường trong việc tạo đông là khử nước, giảm solvat hóa của các phân
tử pectin phụ thuộc vào số lượng và chất lượng pectin mà dung lượng đường khác
nhau.
21
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
Hàm lượng pectin càng cao, chất lượng của nó càng tốt thì đòi hỏi hàm lượng

đường trong sự tao đông càng nhiều nhưng nếu:
- Cao quá so với pectin thì độ bền đông tụ giảm và giảm tốc độ tạo đông. Lượng
đường phải lớn hơn 50% thì mới có khả năng tạo gel. Thông thường người ta thường
dùng ở nồng độ 65%. Nếu hàm lượng đường cao quá có thể gây kết tinh đường trên bề
mặt hạt keo hay trong hệ keo [12].
- Thấp quá thì không đủ để tạo gel.
 Axit
- Yêu cầu của axit trong việc tạo gel pectin :
+ Axit cho vào phải có mức phân ly cao hơn axit pectic như vậy nó sẽ ngăn cản
sự phân ly của axit pectic do đo các mixen pectic mất điện tích cùng dấu, chúng được
nối lại thành sợi dài.
+ Khi cho axit vào thì ion hydro thay thế ion kim loại trong nhóm cacboxyl của
phân tử pectin sau khi đã tẩy được axit pectic ra khỏi muối của nó (muối pectat không
tham gia quá trình tạo đông) [12].
- Nồng độ tối thiểu của ion hydro để tạo ra đông tụ là 3,46. Nồng độ ion H
+
càng lớn thì
khả năng tạo gel càng cao. Nhưng nếu cao quá sẽ gây kết tinh glucoza và hóa gel
nhanh gây vón cục. Mức độ tạo gel chỉ tăng đến một giới hạn nào đó của nồng độ axit
rồi ngừng lại [12].
 Ion Ca
2+
Ca
2+
ngoài việc giúp tạo gel cùng với pectin còn giúp trung hòa bớt lượng axit
gây ra vị chua quá cho sản phẩm.
1.3. ỨNG DỤNG CỦA ENZIM TRONG SẢN XUẤT SỮA CHUA TRÁI CÂY
1.3.1. Giới thiệu về sản phẩm sữa chua trái cây
22
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương

SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
Sữa chua trái cây là một sản phẩm được kết hợp giữa sữa chua và trái cấy nhằm
làm tăng giá trị dinh dưỡng cũng như tạo ra sự đa dạng của sản phẩm sữa chua. Hiện
nay những loại trái cây người ta thường sử dụng để làm sữa chua trái cây như xoài,
dâu, chuối …
Hình 1.5. Sữa chua trái cây.
Trên thị trường hiện nay có hai dạng sữa chua trái cây chủ yếu đó là dạng pree và
dạng miếng trái cây được cắt nhỏ sau đó bổ sung vào sữa chua, nhưng đối với sản
phẩm sữa chua dạng miếng người ta chỉ chế biến và sử dụng ngay mà không thể bảo
quản được thời gian dài vì trong quá trình bảo quản các miếng trái cây sẽ bị nhũn đi
làm ảnh hưởng tới cảm quan sản phẩm [5].
1.3.2. Ứng dụng của enzim pectinaza trong sữa chua xoài
Mục đích sử dụng enzim pectinaza trong sản xuất sữa chua xoài đó là sử dụng
enzim pectinaza để thủy phân thành phần pectin có trong xoài nhằm làm tăng khả năng
lien kết của pectin với ion Ca
2+
tạo thành liên kết mạng trong phân tử pectin làm cho
cấu trúc của miếng xoài được ổn định và không bị nhũn đi trong quá trình bảo quản.
Khi pectin ở trạng thái không bị enzim pectinaza thủy phân thì trong phân tử pectin có
rất ít các cầu nối với ion Ca
2+
chính vì thể khổng thể làm cho cấu trúc của trái cây được
ổn định.
23
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài

Hình 1.6. Pectin trước khi bị thủy phân (a), pectin sau khi bị thủy phân và tạo liên kết
mạng với Ca
2+
(b).
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
24
(a)
(b)
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài
Đề tài : So sánh khả năng sinh tổng hợp enzim pectinaza của hai chủng Aspegillus
niger và chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong sản xuất sữa chua xoài
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
2.1.1. Thời gian
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 02/2014 đến tháng 06/2014
2.1.2. Địa điểm
Phòng thí nghiêm thực phẩm khoa Công nghệ Hóa học trường Cao Đẳng Công
Nghệ - Đại Học Đà Nẵng.
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
- Enzim pectinaza được tổng hợp từ chủng B. subtilis và chủng A. Niger.
- Xoài được mua từ chợ Thanh Bình – Đà nẵng, chọn các quả có độ chin đồng
đều vàng tươi không bị hư hỏng dập nát, không nên chọn quả chín quá vì sẽ có mùi
rượu ảnh hưởng tới sản phẩm.
- Sữa chua lên men từ sữa đặc có đường pha loảng theo tỷ lệ 1:2 với nước.
- Muối CaCl
2
.
2.3. THIẾT BỊ VÀ DUNG CỤ
- Thiết bị : kính hiển vi, tủ sấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), cân điện tử….
- Dụng cụ : ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, pipet,

micropipete, ống đong, nhiệt kế, giá để ống nghiệm,….tất cả các ống nghiệm khi tiến
hành được hấp tiệt trùng ở 121
0
C trong vòng 20 phút.
2.4. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
2.4.1. Môi trường hoạt hóa
2.4.1.1. Môi trường hoạt hóa vi khuẩn B. subtilis
Môi trường dùng để hoạt hóa vi khuẩn B. subtilis là môi trường thạch Czapek
nuôi vi khuẩn. Thành phần môi trường xem ở phần mục lục.
2.4.1.2. Môi trường hoạt hóa nấm mốc A. niger
Môi trường nuôi nấm mốc A. Niger là môi trường thạch Czapek nuôi nấm mốc.
Thành phần môi trường xem ở phần phụ lục.
2.4.2. Môi trường tổng hợp pectinaza
2.4.2.1. Môi trường tổng hợp pectinaza từ vi khuẩn B. subtilis
25
GVHD: ThS. Ngô Thị Minh Phương
SVTH: Nguyễn Đức Tài