công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp

23-01-14
1
CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG
(SH3014)
1
Giới thiệu các vector nhân dòng
và kỹ thuật nhân dòng gen
CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(10 TIẾT)
 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn
 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen
 Các phương pháp lai phân tử
 Phương pháp PCR, ứng dụng
 Kỹ thuật xác định trình tự DNA
 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA
2
• Nhân dòng DNA là kỹ thuật dùng để tái sản xuất
các đoạn DNA.
• Có 2 phương pháp nhân dòng DNA:
− sử dụng tế bào chủ
− dùng PCR
• Một vector là yêu cầu cần thiết để mang đoạn
DNA mục tiêu vào trong tế bào chủ.
3
1. Vector nhân dòng
1.1. Khái niệm
• Vector là các phân tử được dùng để mang các đoạn
DNA/gen đã được tách dòng.
− Trong thực tế, một đoạn DNA lạ không thể duy trì và nhân bản
trong tế bào chủ mới nếu như nó được chuyển vào tế bào chủ
mới chỉ ở dạng một đoạn DNA đơn độc.

 Do enzyme DNA polymerase làm nhiệm vụ tái bản DNA
không thể khởi đầu quá trình tái bản từ bất kỳ địa điểm nào
trên DNA mà chỉ ở những địa điểm đặc hiệu gọi là “điểm tái
bản” (origins of replication)Các đoạn DNA (hay các gen)
muốn tái bản được trong tế bào chủ mới cần phải được gắn
vào một vector(cloning vectors).
Vector nhân dòng thực chất là một phân tử DNA có gốc
tái bản và có thể nhân lên trong tế bào chủ đã chọn.
4
1. Vector nhân dòng
1.1. Khái niệm
(tiếp…)
23-01-14
2
5
• Chỉ có một điểm nhận biết cho một RE nào đó.
– Nếu như số địa điểm này lớn hơn 1 sẽ gây rối loạn cho sự nhân
dòng sau này. Một vector nhân dòng sẽ càng có ý nghĩa hơn nếu
như nó có thể được cắt nhờ nhiều loại RE và tất nhiên ứng với mỗi
loại cũng chỉ có một địa điểm nhận biết.
• Phải có một hoặc nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc
– Thí dụ như tính kháng kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng
tạo màu. Điều này cần thiết để có thể chọn lọc được các tế bào đã
được chuyển nạp, dựa trên cơ sở kháng kháng sinh, tạo phản ứng
mầu của chúng.
• Phải có điểm tái bản để đảm bảo sự nhân lên của chúng trong tế
bào chủ mới.
– Trong một số trường hợp một plasmid có thể được sử dụng làm
vector nhân dòng cho hai tế bào chủ không có liên quan với nhau
như E.coli và Bacillus subtilis. Các vector hai chức năng này phải

có số điểm tái bản lớn hơn 1.
6
1. Vector nhân dòng
1.2. Tiêu chuẩn của
vector nhân dòng
• Các loại vector nhân dòng khác nhau
được sử dụng cho các thí nghiệm nhân
dòng khác nhau.
• Việc lựa chọn vector phụ thuộc vào kích
thước và loại DNA cần nhân dòng.
BM CNSH TV – Khoa CNSH
7
1. Vector nhân dòng
1.3. Các loại vector
nhân dòng
vectors
Plasmid-based
Virus-based
Chromosome-based
Phage-based
Eukaryotic virus- based
YAC
BAC
MAC
Hybrid
(phagemid, cosmid …)
8
1. Vector nhân dòng
1.3. Các loại vector
nhân dòng

23-01-14
3
Khả năng chèn đoạn DNA ngoại lai của
một số vector nhân dòng
STT Vector
Khả n
ăng chứa đ
oạn DNA (kb)
1 Plasmid <10 kb
2 Bacteriophage 9 – 20 kb
3 Cosmid 33 – 47 kb
4 BAC 100 – 300 kb
5 YAC 100 – 1000 kb
9
• Các tế bào vi khuẩn có
thể chứa các DNA ngoài
DNA nhiễm sắc thể gọi
là các plasmid.
• Plasmid thường ở dạng
các DNA nhỏ mạch
vòng, có khả năng nhân
lên độc lập với DNA
nhiễm sắc thể.
• Một số plasmid có mặt
trong tế bào với nhiều
bản sao.
10
1. Vector nhân dòng
1.4. Vector plasmid
Một số plasmid vector

• pBR plasmid
• pUC
BM CNSH TV – Khoa CNSH
11
“p” : plasmid
“BR” : tên của hai nhà khoa học F. Bolivar và R.Rodrigues
“332”: số thứ tự.
4363bp
Nhóm plasmid pBR
12
23-01-14
4
• Đây là nhóm các plasmid được phát triển từ plasmid pBR322.
• Phần chứa gen kháng tetracyline (khoảng 40% DNA) được cắt bỏ còn
phần gen kháng ampicillin và gốc tái bản của pBR322 được giữ lại.
• Ngoài ra, các vị trí nhân dòng hay vị trí gắn các đoạn DNA ngoại lai (cũng
là các vị trí cắt của các enzym giới hạn) của pUC được phân bố tập trung
vào một vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (multiple cloning site-MCS).
Nhóm plasmid pUC
13
• Gốc tái bản
• Marker chọn lọc
• Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site –
MCS/polylinker)
Older cloning vector
Thành phần của một plasmid
14
• Là một đoạn DNA với nhiều
vị trí nhận biết duy nhất cho
các enzyme giới hạn. Việc

cắt plasmids với một trong
các RE trong vùng MCS
không ảnh hưởng gì đến
các đặc tình cần thiết khác
của vector.
• Gene cần nhân dòng được
gắn vào vector nhân dòng ở
một vị trí giới hạn trong
vùng đa nhân dòng.
Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site – MCS / polylinker)
15
16
23-01-14
5
• Kích thước nhỏ (3-20kb).
• Genome đã được giải mã.
• Số bản copy cao.
• Chứa gen chỉ thị hoặc chọn lọc.
− gen kháng kanamycin (kanR)
− gen kháng tetracycline (tetR)
− gen kháng ampicillin (ampR)
− ….
• Chứa trình tự nhận biết duy nhất cho nhiều RE.
Ưu điểm của plasmid vectors:
17
• Không nhân dòng được các đoạn DNA kích
thước lớn.
• Thường nhân đoạn 4 - 10 kb.
• Hiệu suất biến nạp thường không cao.
Hạn chế của vector plasmid

18
• Nhân dòng DNA (DNA cloning) cho phép chọn
lọc và sao chép bất kỳ một đoạn trình tự đặc thù
của DNA (hoặc RNA) và sản xuất với một lượng
không giới hạn
• Là bước đầu tiên trong một loạt các thí nghiệm
về kỹ thuật di truyền
– Tạo thư viện DNA
– PCR
– Xác định trình tự (DNA sequencing)
19
2. Nhân dòng DNA
1. Tách chiết DNA từ mẫu nghiên cứu,
cắt DNA bằng enzym cắt giới hạn để
tạo ra các đoạn DNA là nguyên liệu
cho quá trình nhân dòng (tách dòng)
2. Gắn các đoạn cắt vào một vector nhân
dòng
3. Chuyển nạp các vector nhân dòng sau
phản ứng gắn trên vào tế bào sinh vật
chủ để nhân bản các đoạn DNA đã
được gắn cùng với vector
4. Chọn lọc, tập hợp các đoạn gắn thành
từng dòng riêng hình thành thư viện
mẫu đã nhân dòng. Từ đây có thể
chọn lọc ra các trình tự cần quan tâm.
Xử lý
vector với
enzyme
cắt giới

hạn hình
thành
đoạn bổ
sung với
đoạn DNA
cần nhân
Đoạn DNA cần nhân
dòng đã được xử lý
enzyme giới hạn
Nối đoạn DNA với
vector nhờ enzyme
DNA ligase
Phân tử DNA tái tổ hợp
Chuyển vào tế bào vi khuẩn
Nhiễm sắc thể vi khuẩn
Phân tử DNA tái
tổ hợp
20
2. Nhân dòng DNA
2.1. Các bước cơ bản
của nhân dòng gen
23-01-14
6
Bước 1: Cắt DNA mẫu và plasmid bằng RE
Xử lý enzyme EcoRI
Xử lý enzyme EcoRI
21
2. Nhân dòng
DNA
2.2. Nhân dòng DNA sử

dụng vector pUC19
Bước 2: Nối mẫu DNA vào pUC19
Mẫu DNA đã
được xử lý bằng
EcoRI
Vector plasmid
được xử lý bằng
EcoRI
22
Quá trình lai thực
hiện nhờ DNA ligase
2. Nhân dòng
DNA
2.2. Nhân dòng DNA sử
dụng vector pUC19
Bước 3. Biến nạp
• Biến nạp (transformation): là quá trình chuyển DNA
ngoại sinh vào trong 1 tế bào.
• Có một số phương pháp để biến nạp DNA vào vi
khuẩn, 2 phương pháp thường sử dụng đó là:
– Phương pháp hóa học sử dụng CaCl
2
và sốc nhiệt để
thúc đẩy DNA đi vào trong tế bào.
– Dùng xung điện (electroporation) để kích thích quá trình
tế bào tiếp nhận DNA.
23
2. Nhân dòng
DNA
2.2. Nhân dòng DNA sử

dụng vector pUC19
Biến nạp theo phương pháp dùng CaCl
2
và sốc nhiệt
24
23-01-14
7
Biến nạp bằng xung điện
25
Bước 4. Chọn lọc
• Nuôi dịch khuẩn vừa biến nạp trên môi
trường chọn lọc.
26
2. Nhân dòng
DNA
2.2. Nhân dòng DNA sử
dụng vector pUC19
Các sản phẩm thu được sau biến nạp
plasmid + đoạn DNA
ngoại
Kháng ampicillin
Plasmid không mang
đoạn DNA ngoại
Kháng ampicillin
Không mang plasmid
Không kháng ampicillin
Làm thế nào để phân biệt và chọn lọc được
sản phẩm mong muốn?
27
Chọn lọc trắng xanh

Dựa vào hệ thống lac Operon (điều khiển phản ứng
đối với lactose trong tế bào E. coli)
28
23-01-14
8
 - galactosidase
Lactose Galactose + Glucose
 - galactosidase
-D-glucuronid + H2O Glucuronic acid + Glucose
 - glucuronidase
X-Gal
5-Brom-4-chlor-3-idolyl--D-galactoside
 - galactosidase
5-Brom-4-chlor-indigo
Không màu
Màu xanh sẫm
/>_cleanup1.jpg
29
LacZ gene
promotor
RNA
pol.
Gene LacZ ở trạng thái hoạt động
DNA
LacZ mRNA
Ribosome
β-galactosidase
RNA
Protein
X-gal

Khuẩn lạc xanh
Khuẩn lạc trắng
X-gal
30
31
LacZ
promotor
operator
Repressor
Mô hình sử dụng gene LacZ trong chọn lọc
LacZ
promotor
RNA
pol.
RNA
pol.
IPTG
IPTG
IPTG
LacZ
promotor
operator
IPTG
IPTG
RNA
pol.
IPTG
X-gal
beta-galactosidase
X + galactose

MÀU TRẮNG
MÀU XANH
32
23-01-14
9
X
XX
X
X
Plasmid không chứa đoạn DNA ngoại
Plasmid + đoạn DNA ngoại
Không chứa plasmid
LacZ
Insert
Khuẩn lạc TRẮNG Khuẩn lạc XANH
Mô hình sử dụng gene LacZ trong chọn lọc
P
O
33
Như vậy:
• Chỉ các vi khuẩn nào có chứa plasmid đã biến nạp thì tồn
tại được trên môi trường và hình thành khuẩn lạc (vì có
plasmid chuyển nạp thì mới có gen chịu kháng sinh).
• Do cấu trúc của plasmid, vùng gen chịu trách nhiệm sinh
màu (gen mã hoá -galactosidase) sẽ là vùng bị cắt để
gắn DNA ngoại vào, cho nên các khuẩn lạc có mầu xanh
là khuẩn lạc có chứa plasmid nhưng không gắn DNA
ngoại lai, còn khuẩn lạc có màu trắng chính là khuẩn lạc
có chứa 1 đoạn DNA cần nhân dòng được ghép vào.
34

2. Nhân dòng
DNA
2.2. Nhân dòng DNA sử
dụng vector pUC19
Bước 4:
(tiếp )
• Chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong môi trường lỏng có
bổ sung ampicillin để nhân nhanh sinh khối.
• Tách chiết plasmid và tiến hành kiểm tra kết quả nối DNA
vào plasmid (khẳng định sự có mặt của đoạn DNA mong
muốn trong plasmid) bằng các phương pháp như PCR, sử
dụng RE.
35
2. Nhân dòng
DNA
2.2. Nhân dòng DNA sử
dụng vector pUC19
Movie on making recombinant DNA
36
23-01-14
10
37
1. Vẽ sơ đồ cấu trúc và giải thích các đặc điểm chính của
vector pBR322 khi nó được sử dụng làm vector để nhân
dòng một đoạn DNA?
2. Giải thích vai trò các thành phần của một plasmid: (a) các
gen kháng kháng sinh, (b) gốc tái bản, (c) vị trí đa nhân
dòng được sử dụng như thế nào trong kỹ thuật nhân
dòng?
3. Vector nhân dòng là gì? Nêu các đặc trưng chung của

một vector dùng để nhân dòng DNA?
4. Trình bày các bước của kỹ thuật nhân dòng gen bằng
vector plasmid pUC19. Giải thích làm thế nào có thể chọn
lọc được dòng vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp?
CÂU HỎI ÔN TẬP