công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp (1)

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG
(SH3014)
Giảng viên hướng dẫn: …….
1
BM CNSH TV – Khoa CNSH
CHƢƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(10 TIẾT)
1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn
2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen
3. Các phương pháp lai phân tử
4. Phương pháp PCR, ứng dụng
5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA
6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA
2
BM CNSH TV – Khoa CNSH
PCR
Polymerase Chain Reaction
3
Sự phát minh ra kỹ thuật PCR
• Kỹ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi
trùng hợp polymerase được Kary Mullis phát minh
vào năm 1983.
• Hai năm sau (1985), phát minh này được chính
thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế.
• Với công trình này, Kary Mullis được tặng giải
thưởng Nobel hóa học năm 1993.
“Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng
được coi là một bước ngoặt hay một kỹ thuật
mang tính cách mạng thúc đẩy sự phát triển
của Công nghệ sinh học hiện đại” (J. Watson)
4

Kỹ thuật PCR là một phương pháp cho phép
nhân nhanh số lượng lớn một đoạn DNA
5
Khái niệm
Phương pháp này có độ nhạy rất cao và ngày nay đã
trở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong phần
lớn các phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và DNA
thuộc các lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi
trường, y tế, dược phẩm, pháp y …
• Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của
enzyme DNA polymerase để nhân bản
một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi
oligonucleotide (primer) tương hợp với hai
đầu 3’ ở hai mạch đơn của đoạn DNA.
Kỹ thuật này được phát minh nhờ sự phát hiện
ra Taq polymerase, là một DNA polymerase từ vi
khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước
nóng
6
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR
7
Sự tái bản DNA trong cơ thể sống
• DNA khuôn: mang trình tự cần nhân
lên
• 2 mồi tổng hợp oligonucleotide
(mồi xuôi và mồi ngược)
• dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP
• Polymerase chịu nhiệt
• Mg
2+

: cofactor của enzyme
• Dung dịch đệm: ổn định pH và lực ion
của dung dịch phản ứng cho phù hợp
với hoạt động của enzyme
8
Thành phần của PCR
Có 3 giai đoạn chính trong một phản ứng PCR và
chúng đƣợc lặp lại từ 20-40 lần. Việc này đƣợc tự
động hóa nhờ Thermo cycler, là thiết bị có khả năng
tăng và giảm nhiệt độ của ống phản ứng trong thời
gian ngắn.
1. Biến tính (denaturation): hai sợi của chuỗi xoắn kép
được duỗi xoắn và tách nhau rnhờ nhiệt cao (94-95
o
C).
2. Gắn mồi (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng được
giảm xuống (55-50
o
C) để các mồi gắn vào các sợi DNA
tương ứng theo nguyên tắc bổ sung của các base.
3. Kéo dài (extension): Phản ứng trùng hợp phân tử DNA
được thực hiện nhờ enzyme DNA polymerase (65-
75
o
C) để kéo dài mạch tổng hợp theo nguyên tắc bổ
sung với sợi khuôn từ đầu 3’ – 5.
9
Các giai đoạn trong phản ứng PCR
Chu k phn ng PCR gm 3 bc c lp i lp
li nhiu ln. Nh vy, trong vi gi ta cú th thu

c hng triu bn copy ca mt on DNA no ú,
cho cỏc mc ớch thớ nghim khỏc nhau
10
Chu k phn ng PCR
Hỗn hợp
phản ứng
PCR
GĐ
1
GĐ
2
GĐ
3
Bắt đầu chu kỳ mới
(2)
Nhắc đi nhắc lại n chu
kỳ
Thời gian (phút)
Nhiệt độ
(oC)
Chu k nhit:
Bc 1: 94
o
C, 30 giõy
Bc 2: 94
o
C, 15 giõy
Bc 3: 55
o
C, 30 giõy

Bc 4: 72
o
C, 1.5 phỳt
Bc 5: lp li t bc 2-4
trong 35 ln
Bc 6: 72
o
C, 10 min
Bc 7: 4
o
C f- bo qun
Bc 8: Kt thỳc
Thực hiện phản ứng
THERMOCYCLER
ống phản ứng PCR
Biến t ính
Gắn mồi
K éo dài
-->