công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp kỹ thuật xác định trình tự DNA

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG
(SH3014)
Giảng viên hướng dẫn: …….
BM CNSH TV – Khoa CNSH
BM-CNSHTV
CHƢƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(10 TIẾT)
1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn
2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen
3. Các phương pháp lai phân tử
4. Phương pháp PCR, ứng dụng
5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA
6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA
BM CNSH TV – Khoa CNSH
BM-CNSHTV
KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH
TRÌNH TỰ DNA
BM-CNSHTV
Khái niệm
Xác định trình tự DNA là phương pháp xác định trật
tự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA.
BM-CNSHTV
Các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhau
Cho đến nay, hệ gen của hơn 100 tổ chức sinh vật
đã đƣợc giải mã trình tự
BM-CNSHTV
Maxam-Gilbert (1977)
Sanger (1977)
Các phƣơng pháp xác định trình tự
Xác định trình tự tự động
 Xác định trình tự thế hệ mới

BM-CNSHTV
Phƣơng pháp Maxam-Gilbert
• Là phương pháp phân giải hóa học
• Sử dụng hóa chất để phân hủy
DNA ở các vị trí base đặc hiệu
tạo ra các đoạn có chiều dài khác
nhau
Walter Gilbert
BM-CNSHTV
 Dimethyl sulfat methyl hóa G.
 Axit formic pH=2 gây biến đổi và loại A + G.
 Hydrazin gây biến đổi tại C và T.
 Hydrazin + NaCl nồng độ cao gây biến
đổi tại C.
 Piperidine được dùng để loại bỏ các
base sau khi bị biến đổi và cắt mạch.
Các loại hóa chất sử dụng
BM-CNSHTV
Base
specificity
Chemical used for
base alteration
Chemical used for
altered base
removal
Chemical used
for strand
cleavage
G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine
A+G Acid Acid Piperidine

C+T Hydrazine Piperidine Piperidine
C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine
A>C Alkali Piperidine Piperidine
BM-CNSHTV
G ATCTC G
ATCTC GG
CH
3
TCTCG A
TCTCG A
DNA labeled at one
end with
32
P
Base modification
Release or displace-
ment of reacted bases
Strand scission
Maxam and Gilbert
chemical method
J2 nucleic acid sequencing
BM-CNSHTV
BM-CNSHTV
BM-CNSHTV
• Các chất hoá học dùng để cắt mạch đơn không hoàn
toàn đặc trưng cho từng phản ứng riêng biệt, phản ứng
phụ sẽ diễn ra ảnh hưởng đến kết quả của sản phẩm cắt.
• Đây là phương pháp xác định trình tự trực tiếp của DNA, do
đó số lượng DNA mẫu cần dùng là rất lớn, nếu lượng
mẫu ban đầu ít thì các băng điện di kết quả bằng phóng xạ

tự ghi bị mờ, không rõ ràng, khó đọc chính xác.
• Phản ứng đòi hỏi DNA mẫu hoàn toàn là mạch đơn, do
vậy phải phân tách DNA thành các sợi đơn trước khi tiến
hành xác định trỡnh tự.
• Chỉ áp dụng xác định trình tự đoạn gen tương đối ngắn,
khoảng 250 bp
Hạn chế của phƣơng pháp
Maxam- Gilbert
BM-CNSHTV
Phƣơng pháp Sanger
• Còn gọi là phương pháp kết
thúc mạch (chain termination
method) hay phuong pháp
dideoxyribonucleotide
(dideoxyribonucleotide
method)
BM-CNSHTV
Phương pháp Sanger
(chain termination or dideoxy method)
•Phương pháp enzyme
•Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơn
được xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNA
polymerase trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ sung.
Các sợi DNA được tổng hợp mới này được kết thúc tại
các vị trí đặc hiệu.
•DNA polymerase xúc tác gắn các Nu vào mạch đơn
đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid không
có nhóm 3'OH, phản ứng tổng hợp bị dừng lại
• Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các
dideoxynucleotide (phương pháp dideoxynucleotid)

BM-CNSHTV
Cho phép kéo dài mạch ở đầu 3’
Ngăn cản sự kéo dài mạch ở đầu 3’
BM-CNSHTV
Sự kéo dài mạch DNA
BM-CNSHTV
Sự kéo dài mạch DNA
khi xuất hiện ddNTP
BM-CNSHTV
Các bƣớc thực hiện
1. Chu ẩn bị DNA khuôn sợi đơn
2. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng
3. Thực hiện phản ứng
4. Điện di kết quả
 Thu nhận kết quả giải trình tự DNA
BM-CNSHTV
Có 4 ống hỗn hợp phản ứng, mỗi ống
chứa các thành phần như sau:
− DNA khuôn mạch đơn
− Mồi được tổng hợp hóa học (có thể đánh
dấu phóng xạ)
− dNTPs
− ddNTP (mỗi ống phản ứng bổ sung 1 trong
4 loại ddNTP là ddATP, ddTTP, ddGTP,
ddCTP)
− DNA polymerase
− Dung dịch đệm thích hợp
Thành phần phản ứng
BM-CNSHTV
DNA khuôn và mồi

Mồi
DNA khuôn mạch đơn chưa biết
trình tự
Bổ sung DNA
polymerase
Các đoạn kết thúc
bằng ddG
Các đoạn kết thúc
bằng ddC
Các đoạn kết thúc
bằng ddT
Phân tách mạch mới được tổng hợp ra
khỏi mạch khuôn
Lớn
nhất
Nhỏ nhất
Chia thành 4 ống phản ứng
BM-CNSHTV
BM-CNSHTV
VD bản gel điện di xác định trình tự
theo phương pháp Sanger
BM-CNSHTV
Bài tập tại lớp
Cho biết thông tin về
trình tự DNA thông qua
bản gel điện di bên
BM-CNSHTV
• Tính ổn định cao, có thể tiến hành với quy mô
lớn.
• Phản ứng không phụ thuộc vào tính đặc trưng

hoá của các chất hoá học, không có phản ứng
phụ.
• Nếu kết hợp dùng với phản ứng PCR thì chỉ cần
lượng DNA mẫu nhỏ, đồng thời có thể giảm
được ảnh hưởng của DNA cấu trúc bậc 2.
• Xác định được trình tự đoạn gen tương đối dài,
khoảng 300 ~ 400 bp.
Ƣu điểm của phƣơng pháp Sanger
BM-CNSHTV