công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG
(SH3014)
1
BM CNSH TV – Khoa CNSH
CHƢƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(10 TIẾT)
 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn
 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng
gen
 Các phương pháp lai phân tử
 Phương pháp PCR, ứng dụng
 Kỹ thuật xác định trình tự DNA
 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA
2
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Kiến thức ôn tập
• Cấu trúc phân tử DNA
3
Thành phần cấu tạo của DNA- các bazơ
Purines Pyrimidines
4
[structure of deoxyadenosine]
Nucleoside
Nucleotide
5
ii). Structure of the
DNA double helix
6
5’
3’
Cấu trúc của chuỗi DNA

polynucleotide
7
DNA  RNA  Protein  Function
Học thuyết trung tâm “The Central Dogma”
Transcription
Replication
Translation
Work
8
Phân loại Gene
coding genes
non-coding
genes
Messenger RNA
Proteins
Structural RNA
Structural proteins Enzymes
transfer
RNA
ribosomal
RNA
other
RNA
Chromosome
(simplified)
intergenic
region
9
2.1 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME - RE)
 Khái niệm: là các endonuclease

có khả năng nhận dạng và cắt
DNA ở những vị trí đặc hiệu.
– Restriction enzymes = Restriction
endonuclease
Endo (bên trong), nuclease (cắt nucleic
acid)
– Trình tự nhận biết của RE được gọi là trình
tự giới hạn
10
BM CNSH TV – Khoa CNSH
 Ví dụ: trình tự nhận biết của EcoRI
• 1950s: một số dòng vi khuẩn có khả năng chống lại sự
xâm nhiễm của một số bacteriophages.
• 1962: phát hiện các vi khuẩn này có chứa hệ thống
enzyme có khả năng nhận biết và phá huỷ DNA của
phage, đồng thời có khả năng tự biến đổi DNA của bản
thân để tránh bị phá huỷ
• 1970s: Haminton Smith (Johns Hopkins University), Phát
hiện được enzyme HindII từ Haemophilus influenzae: có
khả năng cắt đặc hiệu đồng thời tự methyl hoá DNA của
tế bào chủ để tự bảo vệ.
11
Lịch sử phát hiện
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Restriction Endonucleases
Tại sao DNA của vi khuẩn không bị
phá hủy bởi chính các enzyme cắt
giới hạn của chúng?
12
Sự Methyl hóa (Methylation)

13
• Loại I: cắt tại điểm cách vị trí giới hạn
khoảng 1000-5000 nucleotide
• Loại II: cắt ngay tại vị trí giới hạn.
• Loại III: cắt ở vị trí cách vị trí giới hạn đó
khoảng 20 nucleotide.
14
Phân loại các RE
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Genus (Tên chi)
Species (Tên loài)
Strain (Chủng)
Thứ tự tìm ra enzyme
(số La Mã)
15
Cách gọi tên
Ví dụ: EcoRI
Escherichia
coli
R
I
BM CNSH TV – Khoa CNSH
16
Đặc điểm của trình tự nhận biết của RE loại II
Don't nod
Dogma: I am God
Never odd or even
Too bad – I hid a boot
Rats live on no evil star
No trace; not one carton

Was it Eliot's toilet I saw?
Murder for a jar of red rum
Some men interpret nine memos
Campus Motto: Bottoms up, Mac
Go deliver a dare, vile dog!
Madam, in Eden I'm Adam
Oozy rat in a sanitary zoo
Ah, Satan sees Natasha
Lisa Bonet ate no basil
Do geese see God?
God saw I was dog
Dennis sinned
Trình tự nhận biết là các
palindrome. Đây là đoạn DNA
mạch kép, 2 mạch bổ sung có
trình tự giống nhau khi đọc theo
cùng chiều 5’3’ hoặc ngược lại
Trục đối xứng
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Nếu giả thiết trình tự sắp xếp của các loại base là ngẫu
nhiên thì xác suất để một đoạn trình tự đƣợc nhận biết sẽ
là 1/4
n
(n là chiều dài (bp) của chuỗi đƣợc nhận biết).
17
Tần suất cắt
Số nucleotide của đoạn
nhận biết
Xác suất xảy ra sự kiện
phân cắt bởi RE

4 1/ 4
4
= 1/256
5 1/ 4
5
= 1/ 1024
6 1/ 4
6
= 1/ 4096
8 1/ 4
8
= 1/ 65.536
n 1/ 4
n
BM CNSH TV – Khoa CNSH
18
Các kiểu cắt
5’ overhangs
3’ overhangs
blunt ends
Tạo đầu sole
Tạo đầu bằng
BM CNSH TV – Khoa CNSH
19
Ví dụ một số RE loại II
BM CNSH TV – Khoa CNSH
• Tạo DNA tái tổ hợp
• Lập bản đồ giới hạn
20
Ứng dụng của RE loại II trong công nghệ gen

BM CNSH TV – Khoa CNSH
• DNA tái tổ hợp là các DNA được tạo thành
từ ít nhất hai đoạn DNA có nguồn gốc khác
nhau thông qua vi thao tác của con người
• Nếu như 2 (hay nhiều) DNA đều được cắt
bởi cùng một loại enzyme thì các đầu cắt
của các đoạn DNA được tạo ra hoàn toàn
khớp nhau (tương ứng theo quy tắc bổ
sung) gọi là các đầu dính và chúng rất dễ
dàng gắn lại với nhau khi có mặt enzym
ligase. Từ đây xuất hiện khả năng ghép nối
các DNA có nguồn gốc khác nhau để tạo
nên DNA tái tổ hợp
21
Tạo DNA tái tổ hợp
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Ligase
Bản đồ giới hạn
• Là bản đồ thể hiện loại enzyme giới hạn, số lượng
và kích thước các đoạn DNA bị cắt bằng enzyme
giới hạn.
• Một phân tử khi sử dụng các loại enzyme khác
nhau có thể cho nhiều đoạn cắt khác nhau hình
thành nên các bản đồ giới hạn khác nhau.
• Được sử dụng trong xác định nguồn gốc hoặc sự
khác nhau giữa các cá thể trong loài.
22
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Phƣơng pháp lập bản đồ giới hạn
• Tách chiết DNA mẫu nghiên cứu và thực hiện PCR

tạo ra một lượng DNA cần thiết.
• Lựa chọn các enzym giới hạn thích hợp, xử lý
enzym giới hạn các mẫu trong điều kiện thích hợp.
• Điện di kết quả trên gel agarose cùng với thang
DNA chuẩn, tính toán kết quả và lập bản đồ.
23
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Sử dụng enzym 1 để cắt đoạn
DNA nghiên cứu (kích thước
17kb). Kết quả cho 3 đoạn DNA
(6kb, 3kb, 8kb). Điều này chứng
tỏ enzym 1 có 2 vị trí cắt trên
đoạn ADN nhưng chưa rõ đoạn
3kb nằm ở giữa hay ở cuối sợi.
Khi cắt sợi DNA nghiên cứu
bằng enzym 2, kết quả cho 2
đoạn cắt (7kb, 10kb) chứng tỏ
enzym này chỉ có một điểm cắt
trên sợi 17kb. Khi cắt bằng tổ
hợp hai enzym 1 và 2 cho thấy
có sự xuất hiện lại đoạn 6kb và
8kb, hai đoạn này là sản phẩm
của sự hoạt động của enzym 1.
Như vậy đoạn 3kb sẽ bị cắt bởi
enzym 2 (vỡ kết quả cắt phối
hợp cho 4 đoạn (6kb, 8kb, 2kb,
1 kb). Từ đây suy ra đoạn 3kb
phải nằm ở giữa sợi.
VÍ DỤ VỀ LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN
24

Restriction enzyme animation
/>25