công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp chuyển gen ở thực vật và các ứng dụng

CÔNG NGHỆ SINH ĐẠI CƢƠNG
(SH3014)
Giảng viên hướng dẫn: …….
BM CNSH TV – Khoa CNSH
9/3/2011
1
CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT
VÀ CÁC HƢỚNG ỨNG DỤNG
BM CNSH TV – Khoa CNSH
9/3/2011 2BM CNSHTV - KHOA CNSH
Biến nạp gen ở thực vật là gì?
• Chuyển gen /Biến nạp gen/ kỹ thuật di truyền ở thực
vật là khái niệm dùng mô tả quá trình chuyển một hoặc
một số gen ngoại bào vào trong tế bào thực vật nhằm
tạo ra một tính trạng mới mà trƣớc đó cơ thể thực vật
đó không có.
• Gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc
gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen
này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trƣng dẫn
tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển
gen
BM CNSH TV – Khoa CNSH
9/3/2011 3
• Các gen biến nạp có thể có nguồn gốc khác nhau. Nó
có thể đƣợc tách ra từ một nguồn tế bào khác có trong
tự nhiên, hoặc đƣợc tổng hợp bằng các kỹ thuật sinh
học phân tử
• Quá trình biến nạp gen đƣợc coi là thành công khi
gen biến nạp sau quá trình chuyển gen kết hợp ổn
định của ADN của hệ gen nhân của tế bào biến nạp. Tế
bào biến nạp này sau đó đƣợc tái sinh thành cây hoàn

chỉnh với sự biểu hiện của gen biến nạp, và duy trì ổn
định trong các thế hệ sau nhờ quá trình thụ tinh bình
thƣờng.
9/3/2011 4BM CNSHTV - KHOA CNSH
Biến nạp gen ở thực vật là gì?
Mục đích biến nạp gen ở thực vật
Việc biến nạp gen ở thực vật th-ờng nhằm các mục đích sau:
1. Nghiên cứu và làm sáng tỏ chức năng của một gen đ-ợc quan tâm hay
từng phần của gen đó.
2. Làm thay đổi mức độ biểu hiện của một gen nội bào.
3. Chuyển các gen quy định các tính trạng mong muốn vào tế bào để thu
nhận đ-ợc các tính trạng mới ở tế bào và cây chuyển gen.
Trong đó, các gen quy định các tính trạng mong muốn sau đ-ợc quan
tâm nghiên cứu nhiều hơn cả:
+ Các gen kháng bệnh (virus, nấm, vi khuẩn, sâu bệnh, giun tròn)
+ Gen chịu hạn, lạnh, và các diều kiện bất lợi khác của môi tr-ờng
+ Gen kháng thuốc diệt cỏ
+ Gen cải tạo các đặc tính về chất l-ợng (thay đổi thành phần axít béo, tăng
c-ờng thành phần axít không no, tăng c-ờng thành phần các axít amin
không thay thế, gen chín chậm, v.v)
+ Sn xut cỏc hp cht sinh hc nhõn to, nhiờn liu sinh hc
9/3/2011 5BM CNSHTV - KHOA CNSH
quá trình biến nạp gen ở thực vật
Giai đoạn 1. Giai đoạn chuyển gen (giai đoạn biến nạp).
Trong giai đoạn này, gen mong muốn th-ờng đ-ợc
chuyển vào tế bào hoặc mô thực vật.
Giai đoạn 2. Giai đoạn tái sinh cây.
Trong giai đoạn này, các mô tế bào đ-ợc chuyển gen đ-ợc
chọn lọc ra và cho tái sinh để phát triển thành cây.
Hai giai đoạn biến nạp và tái sinh cùng có ý nghĩa quan trọng và

quyết định thành công của một thí nghiệm biến nạp. Nếu sự biến nạp
xảy ra mà không có sự tái sinh kèm theo, hoặc sự tái sinh diễn ra mà
không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp ch-a thành công.
9/3/2011 6BM CNSHTV - KHOA CNSH
Giai đoạn Chuyển gen
Các véctơ chuyển gen
Các véctơ chuyển gen là các phân tử ADN có chứa đựng đoạn
gen cần biến nạp.
Ngoài ra chúng còn có các đoạn ADN có cấu trúc đặc thù nhằm
tăng hiệu quả các các quá trình biến nạp giúp quá trình biến
nạp có thể thực hiện đ-ợc.
Gene mc tiờu
Promoter
Gene chn lc/ ch th
9/3/2011 7BM CNSHTV - KHOA CNSH
Các véctơ mang gen biến nạp đ-ợc chuyển
vào tế bào thực vật nh- thế nào?
Các ph-ơng pháp chuyển gen
đ-ợc sử dụng phổ biến gồm có:
1. Ph-ơng pháp chuyển gen gián tiếp
- Thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens / A. rhizogens
2. Các ph-ơng pháp chuyển gen trực tiếp
- Ph-ơng pháp dùng súng bắn gen (particle inflow gun / bommbardment)
- Ph-ơng pháp chuyển gen nhờ xung điện (electroporation)
- Ph-ơng pháp chuyển gen nhờ PEG (polyethylene glycol)
- Ph-ơng pháp vi tiêm (microinjection)
9/3/2011 8BM CNSHTV - KHOA CNSH
ph-¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê
Agrobacterium
9/3/2011 9BM CNSHTV - KHOA CNSH

Agrobacterium spp là vi khuẩn đất, Gram (-) có hình
rod-shaped, thƣờng gây ra một số bệnh hại cây trồng
A. tumefaciens – bệnh nốt sần (crown gall disease)
rose grapevine
A. rhizogenes – gây hiện tƣợng rễ lông tơ (hairy root disease)
Nghiên cứu ít hơn nhƣng có đặc tính sinh học rất giống
A. tumefaciens
Giíi thiÖu vÒ vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens vµ A. rhizogens
9/3/2011 10BM CNSHTV - KHOA CNSH
Cơ chế gây bệnh của
Agrobacterium
?
-Tìm ra thành phần plasmid lớn chính là nguyên nhân gây
bệnh. Plasmid của A. tumefaciens này đƣợc gọi là Ti
(tumour inducing) plasmid (140-130 kb).
-Các plasmid này đƣợc giả thuyết là chuyển một cách chủ
động vào tế bào chủ nhƣng sự phát triển của công nghệ
lúc đó chƣa cho phép phát hiện lƣợng nhỏ ADN đƣợc
thêm vào bộ genom khá lớn của thực vật.
9/3/2011 11BM CNSHTV - KHOA CNSH
- Với sự phát triển của công nghệ ADN tái tổ hợp
(e.g.restriction enzymes; DNA-DNA blot
hybridization), các tiến bộ về hóa sinh và di truyền,
ngƣời ta đã chứng minh đƣợc rằng chỉ có một phần
nhỏ của Ti plasmid đã đƣợc chuyển vào tế bào chủ
và phần nhỏ này chính là một đoạn ADN (T-DNA, R-
DNA) đƣợc tổ hợp vào bộ genom của cây chủ.
9/3/2011 12BM CNSHTV - KHOA CNSH
9/3/2011 13BM CNSHTV - KHOA CNSH
A. Tumefaciens Ti Plasmid

9/3/2011 14BM CNSHTV - KHOA CNSH
Ti plasmid
3 vùng đóng vai trò quan trọng trong việc vận
chuyển ADN và cảm ứng hình thành khối u là:
T-DNA
T-DNA borders
Vir region
9/3/2011 15BM CNSHTV - KHOA CNSH
T-DNA chứa 2 nhóm gen:
 Oncogen: mã hóa các gen sinh tổng hợp phytohormone
(auxin and cytokinin)
 Opines: mã hóa các gen sinh tổng hợp và đồng hóa các
opines
 Các gen này chỉ được phiên mã trong giới thực vật
9/3/2011 16BM CNSHTV - KHOA CNSH
Auxin và Cytokinin
 Vùng T-DNA mã hóa cho một số gen tổng
hợp các hormon thực vật như auxin và
cytokinin
 Auxins và cytokinins kích thích sự sinh
trưởng mạnh mẽ của tế bào thực vật và gây
ra sự phát triển các khối u.
9/3/2011 17BM CNSHTV - KHOA CNSH
Vùng bờ trái và bờ phải
 Vùng bờ trái và phải của T-DNA là vùng mạch
đơn của T-DNA được cắt từ Ti plasmid
 Vùng bờ chứa một đơn vị lặp lại gồm 25 cặp
base
 vùng bờ phải đóng vai trò quan trọng trong
việc cắt T-DNA. Vùng bờ trái đóng vai trò

trong việc ghép T-ADN vào genom cây chủ.
RB: 5’ TGNCAGGATATATNNNNNNGTNANN 3’
LB: 5’ TGGCAGGATATATNNNNNTGTAAAN 3’
9/3/2011 18BM CNSHTV - KHOA CNSH
Virulence (vir) Genes
 Các phân tử nhỏ được tiết ra ở các thực vật bị
thương (i.e., acetosyringone) cảm ứng sự hoạt
động của các gen vir (là vùng chứa khoảng 35
kb bao gồm 6-9 đơn vị sao mã (virA, B, C, D,
E, F, G, H, J) mã hóa trên Ti plasmid
 Các gen vir cần thiết cho việc chuyển và tổ
hợp của T-DNA
9/3/2011 19BM CNSHTV - KHOA CNSH
Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật
Đầu tiên, là sự hình thành một vết đứt (nick) tại vị trí vùng biên phải RB của
đoạn T-ADN. Đoạn gen này sau đó đ-ợc tách ra khỏi plasmid nhờ sự hình
thành một đoạn đứt thứ hai. Đoạn đứt này th-ờng không có định đối với các
plasmid khác nhau. Trong khi các axít nucléic trống tạo ra trên plasmid
đ-ợc lấp đầy theo nguyên tắc bổ trợ của các axít nucléic thì đoạn T-ADN
đ-ợc tách ra đ-ợc bám bởi một prôtêin bám sợi đơn (SSBP - single strand
binding prôtêin). Nhờ phức hợp với SSBP này mà đoạn gen T-ADN đ-ợc
chuyển vào nhiễm sắc thể cây chủ theo một cơ chế đến nay ch-a biết rõ.
Ti
plasmid
Vùng Vir
T-ADN
Vết nứt 1
Vết nứt 2
SSPB
Chuyển vào tế

bào thực vật
Sự kết hợp của gen biến nạp
với gen nhân thực vật
9/3/2011 20BM CNSHTV - KHOA CNSH
Các hệ thống vector chuyển gen
 Các gen vir cần thiết cho quá trình chuyển và tổ hợp đoạn T-DNAhai
hệ thống vector được phát triển nhằm đảm bảo được chức năng của
các gen vir
1. Hệ thống vector đồng liên hợp
(Cointegrate vector system)
2. Hệ thống vector kép
(Binary vector system)
9/3/2011 21BM CNSHTV - KHOA CNSH
Vector đồng liên hợp
9/3/2011 22BM CNSHTV - KHOA CNSH
Vectors kép
9/3/2011 23BM CNSHTV - KHOA CNSH
Các b-ớc thực hiện ph-ơng pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium
1. Thiết kế véctơ mang gen biến nạp
2. Nhân (tách dòng cloning) véctơ nhờ Vi khuẩn E. coli
3. Chuyển véctơ mang gen biến nạp từ vi khuẩn E. coli sang Agrobacterium
4. Lây nhiễm Agrobacterium mang véctơ chứa gen biến nạp với tế bào / mô
thực vật để tiến quá trình chuyển gen biến nạp sang mô / tế bào đích
5. Chọn lọc các tế bào / mô đã đ-ợc biến nạp thành công
6. Tái sinh mô / tế bào đã đ-ợc biến nạp thành công thành cây biến nạp
hoàn chỉnh (và đánh giá sự biểu hiện của gen biến nạp)
9/3/2011 24BM CNSHTV - KHOA CNSH
Qu¸ tr×nh chuyÓn gen biÕn n¹p vµo tÕ bµo thùc vËt vµ t¸i sinh c©y
Ph-¬ng ph¸p biÕn n¹p nhê vi khuÈn Agrobacterium
Ti plasmid mang gen biÕn n¹p

TÕ bµo thùc vËt
ADN
nh©n
Gen
biÕn
n¹p
Qu¸ tr×nh
biÕn n¹p
TÕ bµo mang gen biÕn n¹p ph©n chia
C©y chuyÓn gen
9/3/2011 25BM CNSHTV - KHOA CNSH